Livin與Smac：腎細(xì)胞癌中凋亡調(diào)控的分子密碼一、引言1.1研究背景與目的腎細(xì)胞癌（RenalCellCarcinoma，RCC）作為起源于腎小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是腎實(shí)質(zhì)性腫瘤中最為常見(jiàn)的類型。近年來(lái)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。在我國(guó)，腎癌發(fā)病率同樣呈逐年上升態(tài)勢(shì)，以年均6%的速度遞增，2022年新發(fā)病例約7.7萬(wàn)例，死亡病例約4.6萬(wàn)例，而最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)腎癌發(fā)病率正以每年超過(guò)7%的速度遞增，年新增病例約7.8萬(wàn)例，且超過(guò)25%的患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期。這可能與人口老齡化進(jìn)程的加快、人們生活方式的改變（如吸煙、肥胖等）以及日益惡化的環(huán)境因素等密切相關(guān)。盡管當(dāng)前針對(duì)腎細(xì)胞癌的治療手段，如手術(shù)、靶向治療、免疫治療等不斷取得進(jìn)步，但患者的總體預(yù)后仍然不容樂(lè)觀。晚期腎癌患者的5年生存率不足20%，即便接受綜合治療，晚期患者5年生存率仍不足30%，且治療過(guò)程中還面臨著腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及藥物耐藥等諸多難題。因此，深入探尋腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，尋找更為有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于改善患者的預(yù)后、提高其生存質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義。細(xì)胞凋亡，作為一種細(xì)胞程序性死亡方式，在維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)控細(xì)胞增殖與分化等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一旦細(xì)胞凋亡機(jī)制出現(xiàn)異常，細(xì)胞死亡率下降，細(xì)胞數(shù)目不斷增加并表現(xiàn)出生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這往往是腫瘤形成的重要基礎(chǔ)之一。在細(xì)胞凋亡的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，凋亡抑制蛋白（InhibitorofApoptosisProteins，IAPs）家族和促凋亡蛋白起著核心的調(diào)節(jié)作用。Livin作為IAPs家族的重要成員之一，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。其分子結(jié)構(gòu)中含有IAP家族特有的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BaculoviralIAPRepeat，BIR）結(jié)構(gòu)域和環(huán)指（RingFinger）結(jié)構(gòu)域。Livin主要分布于腎上皮細(xì)胞、胃腸道上皮和淋巴細(xì)胞等組織中，在正常成人的大多數(shù)組織中低表達(dá)或不表達(dá)，但在許多腫瘤組織中，如腎癌、胃癌、膀胱癌等，Livin的表達(dá)顯著上調(diào)。研究表明，Livin在腎細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，它能夠通過(guò)與半胱天冬酶（Caspase）家族成員，如Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9等相互作用，抑制其活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡程序，獲得增殖和存活優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，Livin還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，為腫瘤細(xì)胞的快速分裂提供有利條件。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在RCC組織中表達(dá)Livin的患者預(yù)后較差，Livin的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這使得Livin有望成為RCC診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物。Smac（SecondMitochondria-DerivedActivatorofCaspase），即線粒體衍生的半胱天冬酶激活因子，是一種在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的促凋亡蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡刺激時(shí)，Smac會(huì)從線粒體釋放到胞漿中。在胞漿中，Smac能夠直接與IAPs結(jié)合，從而解除IAPs對(duì)Caspase的抑制作用，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，Smac在細(xì)胞凋亡途徑中起著不可或缺的作用，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子之一。在腎細(xì)胞癌組織中，Smac的表達(dá)通常出現(xiàn)下調(diào)。這種下調(diào)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的正常進(jìn)程受到抑制，腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)生長(zhǎng)和擴(kuò)散，與RCC的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。然而，值得關(guān)注的是，通過(guò)Smac的基因治療或化學(xué)治療，有可能恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的凋亡導(dǎo)向性，為改善RCC的病情提供了新的思路和途徑，這也使得Smac成為RCC診斷和治療的潛在重要標(biāo)志物?；谝陨媳尘埃狙芯恐荚谏钊胩骄縇ivin和Smac在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，分析它們與腎細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)，以及二者表達(dá)的相關(guān)性，從而進(jìn)一步揭示Livin和Smac在腎細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，為腎細(xì)胞癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估以及靶向治療提供更為堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和潛在的分子靶點(diǎn)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)于Livin和Smac在腎細(xì)胞癌中的研究起步較早。眾多研究一致表明，Livin在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常腎組織。一項(xiàng)發(fā)表于《CancerResearch》的研究，通過(guò)對(duì)大量腎細(xì)胞癌患者樣本的分析，發(fā)現(xiàn)Livin高表達(dá)與腎細(xì)胞癌的腫瘤分期、分級(jí)密切相關(guān)，且Livin高表達(dá)的患者術(shù)后復(fù)發(fā)率更高，總生存率更低，這充分說(shuō)明了Livin在腎細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在作用機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)Livin主要通過(guò)與Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9等凋亡執(zhí)行蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，獲得持續(xù)增殖和存活的能力。此外，Livin還被證實(shí)參與了細(xì)胞周期的調(diào)控，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞分裂進(jìn)程。關(guān)于Smac，國(guó)外研究表明其在腎細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。如《JournaloftheNationalCancerInstitute》上的一項(xiàng)研究顯示，Smac表達(dá)下調(diào)與腎細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)，低表達(dá)Smac的患者預(yù)后較差。Smac的促凋亡機(jī)制主要是在細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，從線粒體釋放到胞漿中，與IAPs結(jié)合，解除IAPs對(duì)Caspase的抑制，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，在腎細(xì)胞癌中，由于各種因素導(dǎo)致Smac表達(dá)下調(diào)，使得其無(wú)法有效發(fā)揮促凋亡作用，腫瘤細(xì)胞凋亡受阻，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。國(guó)內(nèi)學(xué)者在Livin和Smac與腎細(xì)胞癌的研究領(lǐng)域也取得了豐碩成果。在Livin方面，有研究運(yùn)用免疫組化技術(shù)對(duì)腎細(xì)胞癌組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Livin的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常腎組織，且Livin表達(dá)與腎細(xì)胞癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。例如，當(dāng)腎細(xì)胞癌處于較晚分期或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，Livin的表達(dá)水平明顯升高，這進(jìn)一步證實(shí)了Livin在腎細(xì)胞癌進(jìn)展過(guò)程中的促進(jìn)作用。在Smac的研究中，國(guó)內(nèi)研究同樣發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌組織中Smac表達(dá)低于正常組織，且與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)。有研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Smac的表達(dá)可以增強(qiáng)腎癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，為腎細(xì)胞癌的治療提供了新的思路。盡管國(guó)內(nèi)外在Livin和Smac與腎細(xì)胞癌的研究方面已取得諸多進(jìn)展，但仍存在一些不足。一方面，目前對(duì)于Livin和Smac在腎細(xì)胞癌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究還不夠深入，二者與其他凋亡相關(guān)分子以及信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系尚未完全明確。例如，Livin和Smac是否通過(guò)其他未知的分子或信號(hào)通路間接影響腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展，仍有待進(jìn)一步探索。另一方面，雖然已有研究表明Livin和Smac可作為腎細(xì)胞癌診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物，但在臨床實(shí)踐中，尚未建立起基于這兩個(gè)分子的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法和評(píng)估體系，限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于，不僅深入探討Livin和Smac在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，還將進(jìn)一步分析二者表達(dá)的相關(guān)性，從整體上揭示它們?cè)谀I細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的協(xié)同作用機(jī)制。同時(shí)，本研究將嘗試建立一種聯(lián)合檢測(cè)Livin和Smac表達(dá)水平的新方法，并初步探索其在腎細(xì)胞癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估中的臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為腎細(xì)胞癌的精準(zhǔn)診療提供新的策略和依據(jù)。1.3研究意義與價(jià)值本研究深入探究Livin和Smac在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。在理論層面，腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)通路異常的復(fù)雜病理過(guò)程，盡管當(dāng)前對(duì)其發(fā)病機(jī)制有了一定認(rèn)識(shí)，但仍存在諸多未知領(lǐng)域。Livin作為凋亡抑制蛋白家族的關(guān)鍵成員，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期，在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用；Smac作為促凋亡蛋白，能夠解除凋亡抑制蛋白對(duì)Caspase的抑制，激活細(xì)胞凋亡程序。然而，目前對(duì)于Livin和Smac在腎細(xì)胞癌中的具體作用機(jī)制，以及它們與其他凋亡相關(guān)分子和信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，尚未完全明確。本研究通過(guò)檢測(cè)Livin和Smac在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平，分析其與腎細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，以及二者表達(dá)之間的相互關(guān)系，有助于深入揭示腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，完善細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腎細(xì)胞癌中的理論體系，為后續(xù)進(jìn)一步研究腎細(xì)胞癌的分子生物學(xué)特性提供重要的理論基礎(chǔ)。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，目前腎細(xì)胞癌的早期診斷主要依賴于影像學(xué)檢查和病理活檢，但這些方法存在一定的局限性。影像學(xué)檢查對(duì)于早期微小腫瘤的檢測(cè)敏感性有限，而病理活檢屬于有創(chuàng)檢查，可能給患者帶來(lái)一定的痛苦和風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋找特異性高、敏感性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于腎細(xì)胞癌的早期診斷具有重要意義。研究表明，Livin在腎細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的分期、分級(jí)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；Smac在腎細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)下調(diào)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)Livin和Smac的表達(dá)水平，有望建立一種新的腎細(xì)胞癌早期診斷方法，提高早期診斷的準(zhǔn)確性，為患者爭(zhēng)取更多的治療時(shí)機(jī)。在預(yù)后評(píng)估方面，腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后差異較大，準(zhǔn)確評(píng)估患者的預(yù)后對(duì)于制定個(gè)性化的治療方案和判斷患者的生存預(yù)期至關(guān)重要。目前常用的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)如腫瘤分期、分級(jí)等，存在一定的主觀性和局限性。Livin和Smac的表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)Livin和低表達(dá)Smac的患者往往預(yù)后較差。將Livin和Smac作為新的預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物，與傳統(tǒng)的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)相結(jié)合，可以更全面、準(zhǔn)確地評(píng)估腎細(xì)胞癌患者的預(yù)后，為臨床醫(yī)生制定治療方案和判斷患者的生存情況提供更有力的依據(jù)。在治療方案制定方面，當(dāng)前腎細(xì)胞癌的治療方法包括手術(shù)、靶向治療、免疫治療等，但仍有部分患者對(duì)現(xiàn)有治療方法反應(yīng)不佳，且容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。深入了解Livin和Smac在腎細(xì)胞癌中的作用機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。例如，針對(duì)Livin的高表達(dá)，可以研發(fā)特異性的Livin抑制劑，阻斷其抗凋亡和促增殖作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；通過(guò)上調(diào)Smac的表達(dá)或增強(qiáng)其活性，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的凋亡敏感性，提高治療效果。這將為腎細(xì)胞癌的靶向治療和個(gè)體化治療提供新的策略和方向，有望改善患者的治療效果和生存質(zhì)量。二、Livin和Smac的生物學(xué)特性2.1Livin的結(jié)構(gòu)、功能與分布2.1.1Livin的分子結(jié)構(gòu)Livin，作為凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成員，在細(xì)胞凋亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)關(guān)鍵地位。人類Livin基因定位于染色體20q13.3，其基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，全長(zhǎng)達(dá)到46kb，包含7個(gè)外顯子及6個(gè)內(nèi)含子。這種獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)ivin在轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中產(chǎn)生多種異構(gòu)體提供了分子基礎(chǔ)。目前已知，Livin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物因剪接方式的不同，主要存在兩種mRNA亞型，即Livinα和Livinβ。Livinα的cDNA全長(zhǎng)897bp，經(jīng)過(guò)翻譯過(guò)程，最終編碼產(chǎn)生含有298個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其分子量約為33kD。而Livinβ的cDNA全長(zhǎng)843bp，編碼280個(gè)氨基酸，分子量約30kD。二者的差異主要體現(xiàn)在第6外顯子5’端54bp的基因序列，這一差異導(dǎo)致了它們?cè)诎被峤M成上相差18個(gè)氨基酸。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成來(lái)看，Livinα和Livinβ均含有IAP家族特有的兩個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域：桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BaculoviralIAPRepeat，BIR）結(jié)構(gòu)域和環(huán)指（RingFinger）結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域位于Livin蛋白的N端，由約70個(gè)氨基酸組成，是Livin發(fā)揮抗凋亡功能的核心結(jié)構(gòu)域。研究表明，BIR結(jié)構(gòu)域?yàn)橐环N新型的鋅指結(jié)構(gòu)，其空間構(gòu)象能夠特異性地與半胱天冬酶（Caspase）家族成員結(jié)合，從而抑制Caspase的活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。具體而言，BIR結(jié)構(gòu)域中的一些關(guān)鍵氨基酸殘基，如半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）等，參與了與Caspase的相互作用，通過(guò)形成特定的氫鍵、疏水相互作用等，穩(wěn)定地結(jié)合Caspase，使其無(wú)法發(fā)揮正常的蛋白水解酶活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。環(huán)指結(jié)構(gòu)域位于Livin蛋白的C端，該結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶活性。在細(xì)胞內(nèi)，它能夠識(shí)別并結(jié)合特定的底物蛋白，如Smac、Caspase-3、Caspase-9等，然后將泛素分子連接到底物蛋白上，使其被蛋白酶體識(shí)別并降解，從而間接調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程。例如，當(dāng)Livin的環(huán)指結(jié)構(gòu)域?qū)⒎核剡B接到Smac上后，Smac會(huì)被蛋白酶體降解，無(wú)法正常發(fā)揮促凋亡作用，細(xì)胞凋亡受到抑制。與IAP家族其他成員相比，Livin在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，但也存在明顯差異。相似之處在于，它們都含有BIR結(jié)構(gòu)域，這是IAP家族抑制細(xì)胞凋亡的共性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。然而，不同成員之間BIR結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列存在一定差異，這種差異導(dǎo)致它們與Caspase的結(jié)合能力和特異性有所不同。以Livin與Survivin為例，盡管二者都含有BIR結(jié)構(gòu)域，但Livin的BIR結(jié)構(gòu)域在某些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)上與Survivin不同，使得Livin對(duì)Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的抑制作用更為顯著。在C端結(jié)構(gòu)方面，Survivin的C端無(wú)環(huán)指結(jié)構(gòu)，代之以α螺旋纏繞區(qū)，而Livin含有具有E3泛素連接酶活性的環(huán)指結(jié)構(gòu)域，這使得Livin在調(diào)控細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制上與Survivin存在明顯區(qū)別。2.1.2Livin的生物學(xué)功能Livin在細(xì)胞凋亡調(diào)控中扮演著至關(guān)重要的角色，其抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要通過(guò)以下幾個(gè)方面實(shí)現(xiàn)。Livin能夠直接抑制Caspase活性。Caspase蛋白家族是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心成員，大多數(shù)凋亡刺激物，如化療藥物、紫外線照射、生長(zhǎng)因子撤除等，都是通過(guò)激活Caspase蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體、細(xì)胞色素C介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑以及Fas介導(dǎo)的凋亡途徑等，都以激活Caspase-3為關(guān)鍵步驟，Caspase-3被激活后，會(huì)切割細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架蛋白以及細(xì)胞核中的DNA酶，引發(fā)DNA斷裂，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Livin中的BIR結(jié)構(gòu)域能夠與Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9等緊密結(jié)合，抑制其酶活性，阻止Caspase蛋白執(zhí)行蛋白切除功能，進(jìn)而阻斷凋亡受體介導(dǎo)及以線粒體為基礎(chǔ)的凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)Livin高表達(dá)時(shí)，Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9的活性明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡受阻，腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)增殖和存活。Livin還可以通過(guò)激活TAK1/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。Livin能夠與TABI特異性結(jié)合，二者結(jié)合后進(jìn)一步激活TAK1。激活后的TAK1可以介導(dǎo)MAP激酶JNK1的激活，而活化的JNK1能夠抑制由TNFα和ICE誘導(dǎo)的凋亡。在某些炎癥相關(guān)的腫瘤發(fā)生過(guò)程中，炎癥因子TNFα等會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但Livin通過(guò)激活TAK1/JNK1信號(hào)通路，抑制了TNFα誘導(dǎo)的凋亡，使得腫瘤細(xì)胞在炎癥微環(huán)境中得以存活和增殖。Livin還通過(guò)激活A(yù)kt途徑、與鈣離子結(jié)合蛋白相互作用等方式發(fā)揮其抗凋亡作用。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和增殖信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。Livin可以激活A(yù)kt，使其磷酸化下游的多種靶蛋白，如Bad、GSK-3β等，這些靶蛋白的磷酸化會(huì)抑制它們的促凋亡活性，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。Livin與鈣離子結(jié)合蛋白的相互作用也會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度會(huì)發(fā)生變化，Livin與鈣離子結(jié)合蛋白相互作用，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，抑制因鈣離子失衡引發(fā)的細(xì)胞凋亡。除了抑制細(xì)胞凋亡，Livin還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育至關(guān)重要。在細(xì)胞周期中，G1期是細(xì)胞生長(zhǎng)和準(zhǔn)備DNA合成的階段，S期是DNA復(fù)制階段，G2期是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的階段，M期是細(xì)胞分裂階段。研究表明，Livin能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程。在腫瘤細(xì)胞中，Livin的高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞能夠快速通過(guò)G1期限制點(diǎn)，進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Livin可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性來(lái)實(shí)現(xiàn)這一調(diào)控作用。例如，Livin可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，磷酸化的Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F激活一系列與DNA合成相關(guān)的基因，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在正常生理狀態(tài)下，Livin的表達(dá)水平受到嚴(yán)格調(diào)控，其在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和組織正常發(fā)育中發(fā)揮著一定作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Livin在某些組織和器官中高表達(dá)，如胎盤(pán)組織、胎兒的腦、胸腺、腎和肝等，這可能與細(xì)胞的增殖、分化和組織器官的構(gòu)建密切相關(guān)。在胎盤(pán)組織中，Livin的高表達(dá)有助于維持滋養(yǎng)細(xì)胞的存活和增殖，保證胎盤(pán)的正常發(fā)育和功能，為胎兒的生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境支持。在免疫系統(tǒng)中，Livin在淋巴細(xì)胞中也有一定表達(dá)，可能參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的存活和免疫應(yīng)答反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，淋巴細(xì)胞中的Livin表達(dá)可能會(huì)發(fā)生變化，影響淋巴細(xì)胞的凋亡和免疫功能，從而參與免疫防御過(guò)程。然而，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，Livin的異常高表達(dá)會(huì)打破細(xì)胞凋亡和增殖的平衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Livin的高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和凋亡誘導(dǎo)，持續(xù)增殖并獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在許多惡性腫瘤中，如黑色素瘤、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌等，Livin的表達(dá)水平與腫瘤的分期、分級(jí)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在晚期腫瘤或具有高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞中，Livin的表達(dá)往往顯著上調(diào)。Livin通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，使得腫瘤細(xì)胞能夠在惡劣的微環(huán)境中存活，如缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏等條件下，腫瘤細(xì)胞仍能憑借Livin的抗凋亡作用繼續(xù)增殖。Livin還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。Livin可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，如TGF-β信號(hào)通路等，影響EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。2.1.3Livin在正常組織和腫瘤組織中的分布Livin在正常組織中的分布具有明顯的組織細(xì)胞選擇性。在正常成人的大多數(shù)組織中，Livin呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)。然而，在一些特定的正常組織中，Livin存在一定水平的表達(dá)。在腎上皮細(xì)胞中，Livin有低水平的表達(dá)，這可能與腎臟的正常生理功能維持有關(guān)，如腎小管上皮細(xì)胞的更新和修復(fù)過(guò)程中，Livin的表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和增殖。在胃腸道上皮組織中，Livin也有一定表達(dá)，其可能在胃腸道上皮細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮作用，當(dāng)胃腸道受到損傷或炎癥刺激時(shí)，Livin的表達(dá)可能會(huì)發(fā)生變化，以維持上皮細(xì)胞的完整性和功能。在淋巴細(xì)胞中，Livin同樣有表達(dá)，其在淋巴細(xì)胞的發(fā)育、活化和免疫應(yīng)答過(guò)程中可能起到調(diào)節(jié)作用。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，淋巴細(xì)胞中的Livin表達(dá)可能會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，影響淋巴細(xì)胞的凋亡和免疫活性，從而參與免疫防御反應(yīng)。在胚胎組織中，Livin的表達(dá)水平相對(duì)較高。在胎盤(pán)組織中，Livin呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這對(duì)于維持胎盤(pán)的正常發(fā)育和功能至關(guān)重要。胎盤(pán)是胎兒與母體進(jìn)行物質(zhì)交換和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的重要器官，Livin在胎盤(pán)中的高表達(dá)有助于維持滋養(yǎng)細(xì)胞的存活和增殖，保證胎盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)和功能，為胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供必要的支持。在胎兒的腦、胸腺、腎和肝等組織中，Livin也有較高表達(dá)，這可能與這些組織在胚胎發(fā)育過(guò)程中的快速增殖和分化密切相關(guān)。在腦組織發(fā)育過(guò)程中，Livin的高表達(dá)可能參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和存活，影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。與正常組織形成鮮明對(duì)比的是，Livin在許多腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在腎細(xì)胞癌組織中，大量研究表明Livin的表達(dá)水平顯著高于正常腎組織。一項(xiàng)針對(duì)腎細(xì)胞癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，Livin在腎細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)70%以上，而在正常腎組織中，陽(yáng)性表達(dá)率僅為10%左右。這種高表達(dá)與腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Livin的高表達(dá)使得腎癌細(xì)胞能夠逃避凋亡，持續(xù)增殖，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在其他多種惡性腫瘤中，如黑色素瘤、膀胱癌、結(jié)腸癌細(xì)胞系、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌細(xì)胞系等，Livin也呈現(xiàn)高表達(dá)。在黑色素瘤中，Livin的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，高表達(dá)Livin的黑色素瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在膀胱癌中，Livin的表達(dá)水平與腫瘤的分期和分級(jí)相關(guān)，晚期和高級(jí)別膀胱癌組織中Livin的表達(dá)明顯高于早期和低級(jí)別膀胱癌組織。Livin在腫瘤組織中的高表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞在發(fā)生過(guò)程中，往往會(huì)出現(xiàn)一系列基因突變和信號(hào)通路異常，這些變化可能導(dǎo)致Livin的表達(dá)調(diào)控失衡，使其表達(dá)水平升高。一些致癌基因的激活或抑癌基因的失活，可能會(huì)影響Livin基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，導(dǎo)致Livin在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。某些轉(zhuǎn)錄因子的異常激活或抑制，如NF-κB、STAT3等，可能會(huì)結(jié)合到Livin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)Livin的轉(zhuǎn)錄，從而使Livin在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境也可能對(duì)Livin的表達(dá)產(chǎn)生影響。腫瘤微環(huán)境中的缺氧、炎癥因子、生長(zhǎng)因子等因素，都可能通過(guò)不同的信號(hào)通路，誘導(dǎo)Livin的表達(dá)上調(diào)，為腫瘤細(xì)胞的存活和增殖提供有利條件。2.2Smac的結(jié)構(gòu)、功能與分布2.2.1Smac的分子結(jié)構(gòu)Smac，全稱為SecondMitochondria-DerivedActivatorofCaspase，即線粒體衍生的半胱天冬酶激活因子，在細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制中扮演著不可或缺的角色。人類Smac/DIABLO基因定位于第12號(hào)染色體長(zhǎng)臂（12q24），其基因結(jié)構(gòu)由7個(gè)外顯子構(gòu)成。體內(nèi)通過(guò)不同的剪接方式，至少產(chǎn)生Smac-α、Smac-β、Smac-γ、Smac-δ等幾種剪接變異體，這些變異體在不同組織和細(xì)胞中可能發(fā)揮著不同的功能。從蛋白質(zhì)層面來(lái)看，Smac在胞漿中合成時(shí)，最初是由239個(gè)氨基酸組成的前體蛋白。其氨基末端最初的55個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成了線粒體靶序列（MitochondrialTargetingSequence，MTS）。這個(gè)MTS就如同一個(gè)“導(dǎo)航信號(hào)”，引導(dǎo)Smac前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中。當(dāng)Smac前體蛋白成功進(jìn)入線粒體后，MTS會(huì)被特異性地裂解去除，最終生成含有184個(gè)氨基酸殘基的成熟蛋白。成熟的Smac以二聚體的形式穩(wěn)定地存在于線粒體的膜間隙中，只有在受到誘導(dǎo)凋亡因子的作用時(shí)，才會(huì)從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞漿，進(jìn)而發(fā)揮其促凋亡作用。對(duì)Smac單體的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，它呈現(xiàn)出一種拉長(zhǎng)且具有一定曲度的三螺旋結(jié)構(gòu)。其中，H1螺旋與H2、H3螺旋緊密相鄰，而H2和H3螺旋則相對(duì)分開(kāi)。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，多數(shù)疏水氨基酸位于三螺旋的內(nèi)部，這種分布方式有利于維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。同時(shí)，暴露在外的極性氨基酸側(cè)鏈形成的2-3螺旋內(nèi)和9-螺旋間氫鍵，進(jìn)一步加固了這種拉長(zhǎng)的螺旋狀結(jié)構(gòu)。在暴露的疏水氨基酸周圍，存在一個(gè)由H1N端1/2和H2C端1/3構(gòu)成的表面，研究表明該區(qū)域可能參與了蛋白間的相互作用，這對(duì)于Smac與其他蛋白結(jié)合并發(fā)揮促凋亡功能具有重要意義。在溶液環(huán)境中，Smac以二聚體形式存在。晶體結(jié)構(gòu)分析顯示，Smac的兩個(gè)亞單位對(duì)稱地穿過(guò)由H1、H2構(gòu)成的疏水表面，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)二聚化。這種二聚體結(jié)構(gòu)可能影響Smac的活性以及與其他分子的相互作用方式，進(jìn)而對(duì)其促凋亡功能產(chǎn)生影響。2.2.2Smac的生物學(xué)功能Smac的核心生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制主要圍繞與凋亡抑制蛋白（IAPs）的相互作用展開(kāi)。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞受到諸如化療藥物、紫外線照射、生長(zhǎng)因子缺乏等凋亡刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性會(huì)發(fā)生改變，Smac會(huì)從線粒體的膜間隙釋放到胞漿中。在正常生理狀態(tài)下，IAPs家族成員，如X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白1（cIAP1）和細(xì)胞凋亡抑制蛋白2（cIAP2）等，能夠與半胱天冬酶（Caspase）家族成員結(jié)合，抑制Caspase的活性，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。以XIAP為例，它的BIR2和BIR3功能域能夠分別與Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9緊密結(jié)合，抑制這些Caspase的酶活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路。而Smac從線粒體釋放到胞漿后，其N端的特定氨基酸序列能夠與IAPs，尤其是XIAP的BIR結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合。具體來(lái)說(shuō)，SmacN端的前4個(gè)氨基酸（Ala-Val-Pro-Ile，AVPI）對(duì)于與XIAP的結(jié)合至關(guān)重要。Smac與XIAP的結(jié)合具有高度特異性，這種特異性結(jié)合能夠競(jìng)爭(zhēng)性地取代Caspase-9與XIAP-BIR3的結(jié)合，使得Caspase-9從與XIAP的結(jié)合狀態(tài)中釋放出來(lái)。被釋放的Caspase-9能夠進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，Caspase-3被激活后，會(huì)對(duì)一系列底物進(jìn)行切割，包括細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這一過(guò)程中，Smac通過(guò)解除IAPs對(duì)Caspase的抑制作用，重新激活了Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而推動(dòng)細(xì)胞走向凋亡。除了與XIAP結(jié)合外，Smac還能與cIAP1和cIAP2結(jié)合，其結(jié)合機(jī)制與和XIAP的結(jié)合類似。Smac與cIAP1、cIAP2結(jié)合后，同樣能夠解除它們對(duì)Caspase的抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)上調(diào)Smac的表達(dá)時(shí)，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物或放療的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。例如，在乳腺癌細(xì)胞系中，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)Smac的表達(dá)，再給予化療藥物處理，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的凋亡率明顯增加，這表明Smac在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性方面具有重要作用。2.2.3Smac在正常組織和腫瘤組織中的分布在正常組織中，Smac廣泛分布于各種細(xì)胞中，且在多數(shù)組織中呈現(xiàn)一定水平的表達(dá)。在肝臟組織中，肝細(xì)胞內(nèi)存在Smac的表達(dá)，其在維持肝細(xì)胞的正常凋亡平衡中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)肝臟受到輕微損傷時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)的Smac會(huì)被激活，通過(guò)促進(jìn)受損肝細(xì)胞的凋亡，維持肝臟組織的穩(wěn)態(tài)。在腎臟組織中，腎小管上皮細(xì)胞、腎小球細(xì)胞等也都有Smac表達(dá)，其參與調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞的更新和修復(fù)過(guò)程。在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中均有Smac分布，其對(duì)于維持神經(jīng)細(xì)胞的正常功能和凋亡調(diào)控至關(guān)重要。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受到損傷或發(fā)生病變時(shí)，Smac的表達(dá)和活性可能會(huì)發(fā)生變化，影響神經(jīng)細(xì)胞的存活和凋亡。然而，在腫瘤組織中，Smac的表達(dá)情況與正常組織存在顯著差異。大量研究表明，在多種腫瘤組織中，包括腎細(xì)胞癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，Smac的表達(dá)往往出現(xiàn)下調(diào)。在腎細(xì)胞癌組織中，免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，Smac的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常腎組織。有研究對(duì)100例腎細(xì)胞癌患者的腫瘤組織和配對(duì)的正常腎組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)正常腎組織中Smac的陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)80%以上，而在腎細(xì)胞癌組織中，陽(yáng)性表達(dá)率僅為30%左右。這種表達(dá)下調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞中Smac表達(dá)下調(diào)，使得IAPs對(duì)Caspase的抑制作用難以被有效解除，細(xì)胞凋亡受阻，腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)增殖和存活。在乳腺癌中，低表達(dá)Smac的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。這表明Smac表達(dá)下調(diào)不僅影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，還與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。三、Livin和Smac在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)檢測(cè)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1標(biāo)本收集本研究收集了2020年1月至2022年12月期間，于[醫(yī)院名稱]泌尿外科行手術(shù)切除的腎細(xì)胞癌標(biāo)本60例。其中男性35例，女性25例，患者年齡范圍為35-75歲，平均年齡（52.5±8.5）歲。所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為腎細(xì)胞癌，其病理類型包括透明細(xì)胞癌40例，乳頭狀腎細(xì)胞癌12例，嫌色細(xì)胞癌8例。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）2017年發(fā)布的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，I期25例，II期18例，III期12例，IV期5例。同時(shí)，收集了20例因腎臟良性疾?。ㄈ缒I結(jié)石、腎囊腫等）行手術(shù)切除的正常腎組織作為對(duì)照，這些正常腎組織均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。其中男性12例，女性8例，年齡范圍為30-70歲，平均年齡（50.0±7.0）歲。所有患者在手術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療、免疫治療或其他針對(duì)腫瘤的特殊治療。在手術(shù)切除標(biāo)本后，立即用無(wú)菌生理鹽水沖洗，以去除血液及其他雜質(zhì)，隨后迅速將標(biāo)本切成約5mm×5mm×5mm大小的組織塊，分別置于無(wú)菌凍存管中，標(biāo)記好患者信息、標(biāo)本類型及取材時(shí)間等。將裝有組織塊的凍存管迅速放入液氮中速凍1-2小時(shí)，之后轉(zhuǎn)移至-80°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫源_保組織的生物學(xué)活性和完整性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的標(biāo)本。3.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：RNA提取液Trizol試劑（購(gòu)自Invitrogen公司），用于從組織樣本中提取總RNA，其獨(dú)特的配方能夠有效裂解細(xì)胞，保護(hù)RNA的完整性；PrimeScriptRT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品），該試劑盒包含反轉(zhuǎn)錄所需的各種酶和緩沖液，可高效地將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；2×TaqPCRMasterMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司），用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+等成分，保證了PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行；DNAMarker（ThermoFisherScientific公司），在凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物時(shí)，作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于確定擴(kuò)增條帶的大??；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（購(gòu)自Abcam公司），分別用于檢測(cè)Livin和Smac蛋白的表達(dá)水平，具有高靈敏度和特異性。主要實(shí)驗(yàn)儀器有：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，型號(hào)5424R），可在低溫條件下快速分離樣本中的不同成分，滿足RNA提取等實(shí)驗(yàn)對(duì)樣本分離的要求；PCR儀（Bio-Rad公司，型號(hào)T100），能夠精確控制PCR反應(yīng)的溫度和時(shí)間，保證擴(kuò)增反應(yīng)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，型號(hào)GelDocXR+），用于對(duì)凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行成像和分析，通過(guò)軟件可測(cè)定條帶的密度和相對(duì)含量；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，型號(hào)MultiskanGO），用于讀取ELISA反應(yīng)后的吸光度值，從而定量檢測(cè)蛋白表達(dá)水平；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific公司，型號(hào)NanoDrop2000），可快速準(zhǔn)確地測(cè)定RNA的濃度和純度，評(píng)估提取RNA的質(zhì)量。3.1.3實(shí)驗(yàn)方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)Livin和Smac基因mRNA的表達(dá)。首先進(jìn)行總RNA的提取，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)的步驟操作：取約50mg凍存的組織樣本，在液氮中研磨成粉末狀，迅速加入1mlTrizol試劑，充分混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解；加入200μl氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘；12000rpm，4°C離心15分鐘，此時(shí)樣本分為三層，上層無(wú)色水相含有RNA，小心吸取400μl水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的離心管中；加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，12000rpm，4°C離心10分鐘，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色RNA沉淀；棄上清，加入1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀，7500rpm，4°C離心5分鐘，重復(fù)洗滌一次；棄上清，室溫晾干RNA沉淀5-10分鐘，加入適量的無(wú)RNA酶水溶解RNA，-80°C保存?zhèn)溆?。使用紫外可?jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA質(zhì)量合格。采用PrimeScriptRT-PCR試劑盒進(jìn)行cDNA合成，反應(yīng)體系為20μl：5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，Oligo(dT)Primer1μl，Random6mers1μl，TotalRNA1μg，RNaseFreedH2O補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為：37°C15分鐘，85°C5秒，4°C保存。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Livin和Smac基因以及內(nèi)參GAPDH的引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為25μl：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，上下游引物各1μl，cDNA模板2μl，ddH2O8.5μl。Livin擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸45秒，共37個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10分鐘。Smac擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸45秒，共34個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10分鐘。GAPDH擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，共35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10分鐘。取5μlPCR產(chǎn)物與1μl6×LoadingBuffer混合，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為1×TAE，電壓120V，電泳時(shí)間30-40分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外光下觀察并拍照，與DNAMarker對(duì)比，確認(rèn)特異性條帶，使用QuantityOne分析軟件測(cè)定條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算Livin和Smac基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)Livin和Smac蛋白的表達(dá)。從-80°C冰箱中取出凍存的組織樣本，加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰上充分研磨，使組織完全裂解；12000rpm，4°C離心15分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為組織蛋白提取物。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先將包被有抗Livin或抗Smac抗體的酶標(biāo)板平衡至室溫；分別將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本加入酶標(biāo)板孔中，每孔100μl，設(shè)置復(fù)孔，37°C孵育1-2小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標(biāo)板5次，每次3-5分鐘，拍干；每孔加入100μl生物素化的檢測(cè)抗體，37°C孵育1小時(shí)；重復(fù)洗滌步驟；每孔加入100μlHRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37°C孵育30分鐘；再次洗滌后，每孔加入90μlTMB底物溶液，37°C避光孵育15-20分鐘，此時(shí)溶液顏色會(huì)發(fā)生變化；最后每孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣本中Livin和Smac蛋白的濃度，從而分析其在腎細(xì)胞癌組織和正常腎組織中的表達(dá)差異。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1Livin和Smac在腎細(xì)胞癌組織和正常腎組織中的表達(dá)差異通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)Livin和Smac基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在60例腎細(xì)胞癌組織中，LivinmRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為83.3%（50/60），而在20例正常腎組織中，陽(yáng)性表達(dá)率僅為20.0%（4/20）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者陽(yáng)性表達(dá)率差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^{2}=25.345，P\lt0.05）。從mRNA相對(duì)表達(dá)量來(lái)看，腎細(xì)胞癌組織中LivinmRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.85\pm0.35，明顯高于正常腎組織的0.45\pm0.12，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.748，P\lt0.05），具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表2。對(duì)于Smac基因mRNA，在腎細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為70.0%（42/60），正常腎組織中陽(yáng)性表達(dá)率為95.0%（19/20）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，二者陽(yáng)性表達(dá)率差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^{2}=7.486，P\lt0.05）。腎細(xì)胞癌組織中SmacmRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.62\pm0.20，顯著低于正常腎組織的1.35\pm0.25，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-12.536，P\lt0.05），詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Livin和Smac蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，腎細(xì)胞癌組織中Livin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%（48/60），正常腎組織中陽(yáng)性表達(dá)率為25.0%（5/20），二者陽(yáng)性表達(dá)率差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^{2}=23.143，P\lt0.05）。腎細(xì)胞癌組織中Livin蛋白的濃度為(256.54\pm35.67)pg/mL，顯著高于正常腎組織的(56.32\pm12.45)pg/mL，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.327，P\lt0.05），數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表3。在Smac蛋白表達(dá)方面，腎細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%（40/60），正常腎組織中陽(yáng)性表達(dá)率為90.0%（18/20），二者陽(yáng)性表達(dá)率差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（\chi^{2}=6.538，P\lt0.05）。腎細(xì)胞癌組織中Smac蛋白的濃度為(125.45\pm25.34)pg/mL，顯著低于正常腎組織的(286.78\pm32.56)pg/mL，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-18.765，P\lt0.05），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。綜上所述，無(wú)論是在基因mRNA水平還是蛋白水平，Livin在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)均顯著高于正常腎組織，而Smac在腎細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著低于正常腎組織。3.2.2Livin和Smac表達(dá)與腎細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析Livin表達(dá)與腎細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明，Livin表達(dá)與腎細(xì)胞癌的病理分級(jí)密切相關(guān)。在高分化的腎細(xì)胞癌組織中，LivinmRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.35\pm0.25，蛋白濃度為(186.45\pm30.23)pg/mL；中分化組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.75\pm0.30，蛋白濃度為(235.67\pm32.45)pg/mL；低分化組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為2.35\pm0.40，蛋白濃度為(325.45\pm40.56)pg/mL。隨著病理分級(jí)的升高，Livin的表達(dá)水平逐漸升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.05），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。Livin表達(dá)與腎細(xì)胞癌的臨床分期也存在顯著相關(guān)性。I期腎細(xì)胞癌組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.45\pm0.28，蛋白濃度為(195.67\pm31.23)pg/mL；II期組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.85\pm0.32，蛋白濃度為(245.45\pm33.56)pg/mL；III期組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為2.25\pm0.35，蛋白濃度為(295.67\pm36.45)pg/mL；IV期組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為2.85\pm0.45，蛋白濃度為(385.45\pm45.67)pg/mL。隨著臨床分期的進(jìn)展，Livin的表達(dá)水平逐漸升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.05），詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。此外，Livin表達(dá)與腫瘤大小也有一定關(guān)聯(lián)。腫瘤直徑\leq4cm的腎細(xì)胞癌組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.55\pm0.26，蛋白濃度為(205.45\pm30.56)pg/mL；腫瘤直徑4-7cm的組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.95\pm0.33，蛋白濃度為(256.78\pm34.56)pg/mL；腫瘤直徑\gt7cm的組織中，LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為2.55\pm0.42，蛋白濃度為(356.45\pm42.34)pg/mL。隨著腫瘤直徑的增大，Livin的表達(dá)水平逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.05），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。在Smac表達(dá)與腎細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系方面，Smac表達(dá)與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。高分化腎細(xì)胞癌組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.85\pm0.22，蛋白濃度為(165.45\pm28.34)pg/mL；中分化組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.65\pm0.18，蛋白濃度為(135.67\pm25.45)pg/mL；低分化組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.45\pm0.15，蛋白濃度為(95.45\pm20.34)pg/mL。隨著病理分級(jí)的升高，Smac的表達(dá)水平逐漸降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.05），數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表5。Smac表達(dá)與臨床分期同樣呈負(fù)相關(guān)。I期腎細(xì)胞癌組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.80\pm0.20，蛋白濃度為(156.78\pm26.56)pg/mL；II期組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.68\pm0.19，蛋白濃度為(145.45\pm24.56)pg/mL；III期組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.55\pm0.16，蛋白濃度為(115.67\pm22.34)pg/mL；IV期組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.40\pm0.12，蛋白濃度為(85.45\pm18.34)pg/mL。隨著臨床分期的進(jìn)展，Smac的表達(dá)水平逐漸降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.05），詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。Smac表達(dá)與腫瘤大小也呈負(fù)相關(guān)。腫瘤直徑\leq4cm的腎細(xì)胞癌組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.75\pm0.21，蛋白濃度為(145.67\pm25.67)pg/mL；腫瘤直徑4-7cm的組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.60\pm0.17，蛋白濃度為(125.45\pm23.45)pg/mL；腫瘤直徑\gt7cm的組織中，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為0.50\pm0.14，蛋白濃度為(105.67\pm20.56)pg/mL。隨著腫瘤直徑的增大，Smac的表達(dá)水平逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P\lt0.05），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。3.2.3Livin和Smac表達(dá)的相關(guān)性分析對(duì)腎細(xì)胞癌組織中Livin和Smac的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，二者表達(dá)強(qiáng)度之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。以LivinmRNA相對(duì)表達(dá)量為橫坐標(biāo)，SmacmRNA相對(duì)表達(dá)量為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖（圖1），經(jīng)Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)r=-0.45，P\lt0.05。在蛋白水平上，以Livin蛋白濃度為橫坐標(biāo)，Smac蛋白濃度為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖（圖2），Spearman相關(guān)分析顯示，相關(guān)系數(shù)r=-0.48，P\lt0.05。這表明在腎細(xì)胞癌組織中，Livin表達(dá)水平越高，Smac的表達(dá)水平越低；反之，Livin表達(dá)水平越低，Smac的表達(dá)水平越高。二者在表達(dá)上的這種負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示它們?cè)谀I細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能存在協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞的凋亡、增殖等生物學(xué)行為。例如，Livin通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腎癌細(xì)胞的存活和增殖，而Smac作為促凋亡蛋白，其表達(dá)下調(diào)可能無(wú)法有效對(duì)抗Livin的抗凋亡作用，從而導(dǎo)致腎癌細(xì)胞凋亡受阻，腫瘤不斷發(fā)展。這種協(xié)同作用的深入研究，將有助于進(jìn)一步揭示腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，為腎細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。四、Livin和Smac表達(dá)對(duì)腎細(xì)胞癌的影響機(jī)制4.1Livin高表達(dá)對(duì)腎細(xì)胞癌的影響4.1.1抑制細(xì)胞凋亡Livin在腎細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，其抑制細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制主要圍繞對(duì)Caspase家族蛋白的抑制展開(kāi)。Caspase家族蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著核心作用，其中Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，如化療藥物作用、氧化應(yīng)激等，線粒體途徑或死亡受體途徑會(huì)被激活。在線粒體途徑中，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP結(jié)合形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。在死亡受體途徑中，F(xiàn)as、TNF-R1等死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活Caspase-8，Caspase-8可以直接激活Caspase-3，也可以通過(guò)切割Bid，使Bid的羧基端片段（tBid）進(jìn)入線粒體，引發(fā)線粒體途徑的凋亡。而Livin憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，能夠?qū)@一凋亡過(guò)程進(jìn)行有效抑制。Livin的BIR結(jié)構(gòu)域可以直接與Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9結(jié)合。研究表明，Livin的BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase-9的結(jié)合，會(huì)干擾Caspase-9與Apaf-1的相互作用，從而阻斷凋亡小體的形成，使Caspase-9無(wú)法被激活，進(jìn)而抑制下游Caspase-3的激活。在腎癌細(xì)胞中，當(dāng)Livin高表達(dá)時(shí)，大量的Livin通過(guò)BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase-9緊密結(jié)合，導(dǎo)致Caspase-9處于失活狀態(tài)，即使細(xì)胞受到凋亡刺激，凋亡小體也難以正常形成，Caspase-3無(wú)法被激活，細(xì)胞凋亡進(jìn)程被阻斷。Livin的BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合后，能夠直接抑制它們的蛋白水解酶活性。Caspase-3和Caspase-7在細(xì)胞凋亡過(guò)程中負(fù)責(zé)切割一系列底物蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細(xì)胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Livin與Caspase-3和Caspase-7的結(jié)合，使其無(wú)法對(duì)底物蛋白進(jìn)行切割，細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵步驟被阻斷，腫瘤細(xì)胞得以逃避凋亡，持續(xù)存活和增殖。除了直接抑制Caspase活性，Livin還能通過(guò)其他途徑間接抑制細(xì)胞凋亡。Livin可以激活TAK1/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑。Livin能夠與TABI特異性結(jié)合，二者結(jié)合后激活TAK1。激活的TAK1可以介導(dǎo)MAP激酶JNK1的激活，而活化的JNK1能夠抑制由TNFα和ICE誘導(dǎo)的凋亡。在腎細(xì)胞癌的微環(huán)境中，炎癥因子TNFα等可能會(huì)誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡，但Livin通過(guò)激活TAK1/JNK1信號(hào)通路，抑制了TNFα誘導(dǎo)的凋亡，使得腎癌細(xì)胞在炎癥微環(huán)境中也能存活和增殖。Livin還可以通過(guò)激活A(yù)kt途徑來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和增殖信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。Livin可以激活A(yù)kt，使其磷酸化下游的多種靶蛋白，如Bad、GSK-3β等。Bad是一種促凋亡蛋白，正常情況下，它與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Akt被Livin激活后，Akt使Bad磷酸化，磷酸化的Bad無(wú)法與Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，從而失去促凋亡活性，細(xì)胞凋亡受到抑制。GSK-3β也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，Akt對(duì)GSK-3β的磷酸化會(huì)抑制其活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。4.1.2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移Livin在腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，不僅能夠抑制細(xì)胞凋亡，還對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有顯著的促進(jìn)作用。在細(xì)胞增殖方面，Livin參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，其中G1期是細(xì)胞生長(zhǎng)和準(zhǔn)備DNA合成的階段，S期是DNA復(fù)制階段，G2期是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的階段，M期是細(xì)胞分裂階段。研究表明，Livin能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞周期進(jìn)程。Livin可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性來(lái)實(shí)現(xiàn)這一調(diào)控作用。Livin可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)。CyclinD1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化。Rb是一種抑癌蛋白，在非磷酸化狀態(tài)下，它與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，抑制E2F的活性，從而阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。當(dāng)Rb被CyclinD1/CDK4復(fù)合物磷酸化后，Rb釋放E2F，E2F被激活，進(jìn)而啟動(dòng)一系列與DNA合成相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在腎癌細(xì)胞中，Livin的高表達(dá)使得CyclinD1表達(dá)上調(diào)，加速了細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)了腎癌細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面，Livin能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與多個(gè)方面有關(guān)。Livin可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移需要降解ECM，以便突破基底膜和周圍組織的屏障。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解ECM的酶，其中MMP-2和MMP-9在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Livin可以上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)。Livin可能通過(guò)激活某些信號(hào)通路，如NF-κB信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)MMP-2和MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細(xì)胞中，Livin的高表達(dá)可能會(huì)激活NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與MMP-2和MMP-9基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，從而增加MMP-2和MMP-9的表達(dá)。高表達(dá)的MMP-2和MMP-9能夠降解ECM中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開(kāi)辟道路。Livin還與腎癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在EMT過(guò)程中，腎癌細(xì)胞會(huì)下調(diào)上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)。研究表明，Livin可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，如TGF-β信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)腎癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，在腫瘤細(xì)胞中，Livin可能會(huì)增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路的活性。Livin可能通過(guò)與TGF-β信號(hào)通路中的某些分子相互作用，或者調(diào)節(jié)TGF-β受體的表達(dá)，來(lái)增強(qiáng)TGF-β信號(hào)的傳導(dǎo)。激活的TGF-β信號(hào)通路會(huì)激活一系列EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug和Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而使E-cadherin表達(dá)下調(diào)。這些轉(zhuǎn)錄因子還會(huì)促進(jìn)N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，使腎癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。4.2Smac低表達(dá)對(duì)腎細(xì)胞癌的影響4.2.1減弱細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)Smac在正常生理狀態(tài)下，定位于線粒體的膜間隙中，當(dāng)細(xì)胞受到諸如化療藥物、紫外線照射、生長(zhǎng)因子缺乏等凋亡刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性會(huì)發(fā)生改變，Smac會(huì)從線粒體釋放到胞漿中，進(jìn)而發(fā)揮其促凋亡作用。在腎細(xì)胞癌組織中，Smac呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，這嚴(yán)重影響了細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，尤其是對(duì)線粒體凋亡途徑產(chǎn)生了顯著的阻礙作用。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要通路之一，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體膜電位會(huì)發(fā)生去極化，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放，細(xì)胞色素C（CytochromeC）從線粒體釋放到胞漿中。CytochromeC與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。在這個(gè)過(guò)程中，Smac起著關(guān)鍵的輔助作用。正常情況下，Smac從線粒體釋放到胞漿后，其N端的特定氨基酸序列能夠與凋亡抑制蛋白（IAPs），尤其是X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）的BIR結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合。Smac與XIAP的結(jié)合具有高度特異性，這種特異性結(jié)合能夠競(jìng)爭(zhēng)性地取代Caspase-9與XIAP-BIR3的結(jié)合，使得Caspase-9從與XIAP的結(jié)合狀態(tài)中釋放出來(lái)。被釋放的Caspase-9能夠進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，推動(dòng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。然而，在腎細(xì)胞癌中，由于Smac低表達(dá)，從線粒體釋放到胞漿中的Smac量顯著減少，無(wú)法有效與IAPs結(jié)合，導(dǎo)致IAPs對(duì)Caspase的抑制作用難以被解除。大量的Caspase-9持續(xù)與XIAP緊密結(jié)合，處于失活狀態(tài)，無(wú)法激活下游的Caspase-3。即使細(xì)胞受到凋亡刺激，凋亡小體形成后，Caspase-9也無(wú)法正常發(fā)揮作用，下游的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)被阻斷，細(xì)胞凋亡進(jìn)程受到嚴(yán)重抑制。研究表明，在腎癌細(xì)胞系中，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)Smac的表達(dá)后，Caspase-9和Caspase-3的活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著下降。這充分說(shuō)明了Smac低表達(dá)會(huì)減弱細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，使腎癌細(xì)胞逃避凋亡，為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展提供了有利條件。4.2.2促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散Smac低表達(dá)與腎細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、擴(kuò)散密切相關(guān)，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，促進(jìn)了腫瘤的惡性進(jìn)展。在腫瘤生長(zhǎng)方面，由于Smac低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，腎癌細(xì)胞的增殖與凋亡平衡被打破。正常情況下，細(xì)胞的增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡，以維持組織和器官的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，在腎細(xì)胞癌中，Smac低表達(dá)使得癌細(xì)胞無(wú)法正常凋亡，細(xì)胞持續(xù)增殖，腫瘤體積不斷增大。研究發(fā)現(xiàn)，在腎細(xì)胞癌組織中，Smac表達(dá)越低，腫瘤細(xì)胞的增殖活性越高。通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白，如Ki-67的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)Smac的腎細(xì)胞癌組織中Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高表達(dá)Smac的組織。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，其表達(dá)水平反映了細(xì)胞的增殖活性。這表明Smac低表達(dá)促進(jìn)了腎癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而推動(dòng)了腫瘤的生長(zhǎng)。在腫瘤擴(kuò)散方面，Smac低表達(dá)增強(qiáng)了腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的相互作用、細(xì)胞間連接的改變以及腫瘤細(xì)胞的遷移等多個(gè)環(huán)節(jié)。Smac低表達(dá)可能通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Smac低表達(dá)可能影響了腎癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，這一過(guò)程賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在EMT過(guò)程中，腎癌細(xì)胞會(huì)下調(diào)上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)。研究表明，Smac低表達(dá)會(huì)激活某些信號(hào)通路，如TGF-β信號(hào)通路，從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞的EMT過(guò)程。TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，在腫瘤細(xì)胞中，Smac低表達(dá)可能會(huì)增強(qiáng)TGF-β信號(hào)通路的活性。激活的TGF-β信號(hào)通路會(huì)激活一系列EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug和Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而使E-cadherin表達(dá)下調(diào)。這些轉(zhuǎn)錄因子還會(huì)促進(jìn)N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，使腎癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。Smac低表達(dá)還可能影響腎癌細(xì)胞對(duì)ECM的降解能力。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移需要降解ECM，以便突破基底膜和周圍組織的屏障?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解ECM的酶，其中MMP-2和MMP-9在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Smac低表達(dá)的腎癌細(xì)胞中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)上調(diào)。Smac低表達(dá)可能通過(guò)激活某些信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)MMP-2和MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖和遷移等過(guò)程中起重要作用。在腎癌細(xì)胞中，Smac低表達(dá)可能會(huì)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，使Akt磷酸化，磷酸化的Akt進(jìn)入細(xì)胞核，與MMP-2和MMP-9基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，從而增加MMP-2和MMP-9的表達(dá)。高表達(dá)的MMP-2和MMP-9能夠降解ECM中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開(kāi)辟道路。4.3Livin和Smac相互作用對(duì)腎細(xì)胞癌凋亡的調(diào)控4.3.1二者相互作用的分子機(jī)制Livin和Smac在腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，存在著復(fù)雜而緊密的相互作用，這種相互作用在分子層面有著明確的機(jī)制。從結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)來(lái)看，Livin含有桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BIR）結(jié)構(gòu)域和環(huán)指（RingFinger）結(jié)構(gòu)域，其中BIR結(jié)構(gòu)域是其與Smac相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。Smac的N端具有一段保守的氨基酸序列，尤其是前4個(gè)氨基酸（Ala-Val-Pro-Ile，AVPI），對(duì)于其與Livin等IAPs家族成員的結(jié)合至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Smac從線粒體釋放到胞漿中，其N端的AVPI序列能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合Livin的BIR結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)合是基于分子間的互補(bǔ)性，AVPI序列與BIR結(jié)構(gòu)域中的特定氨基酸殘基通過(guò)氫鍵、疏水相互作用等非共價(jià)鍵相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。研究表明，Smac與Livin的結(jié)合具有較高的親和力，二者結(jié)合后，會(huì)對(duì)彼此的功能產(chǎn)生顯著影響。Livin原本具有抑制Caspase活性的功能，通過(guò)與Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9等結(jié)合，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路。然而，當(dāng)Smac與Livin結(jié)合后，會(huì)干擾Livin與Caspase的相互作用。具體來(lái)說(shuō)，Smac的結(jié)合改變了Livin的空間構(gòu)象，使得Livin的BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化，降低了Livin對(duì)Caspase的親和力，從而減弱了Livin對(duì)Caspase的抑制作用。這使得Caspase-3、Caspase-7和Caspase-9等能夠被激活，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。從Livin的角度來(lái)看，其環(huán)指結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶活性。當(dāng)Livin與Smac結(jié)合后，Livin的環(huán)指結(jié)構(gòu)域可能會(huì)對(duì)Smac進(jìn)行泛素化修飾。泛素化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，被泛素化修飾的蛋白質(zhì)可能會(huì)被蛋白酶體識(shí)別并降解。因此，Livin對(duì)Smac的泛素化修飾可能會(huì)導(dǎo)致Smac的降解，降低胞漿中Smac的含量，從而削弱Smac的促凋亡作用。在腎細(xì)胞癌中，由于Livin的高表達(dá)和Smac的低表達(dá)，這種相互作用可能會(huì)更加偏向于Livin對(duì)Smac的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受到抑制，腫瘤細(xì)胞得以持續(xù)增殖和存活。4.3.2在腎細(xì)胞癌凋亡信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的地位Livin和Smac相互作用在腎細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著關(guān)鍵地位，對(duì)整個(gè)凋亡信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的平衡和腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)起著決定性作用。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)處于平衡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到適度的凋亡刺激時(shí)，凋亡信號(hào)會(huì)被有序激活。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要通路之一，在這個(gè)過(guò)程中，Smac從線粒體釋放到胞漿，與IAPs家族成員結(jié)合，解除IAPs對(duì)Caspase的抑制，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)還存在著其他凋亡調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路，共同維持著細(xì)胞凋亡的平衡。然而，在腎細(xì)胞癌中，Livin的高表達(dá)和Smac的低表達(dá)打破了這種平衡。Livin憑借其抗凋亡作用，抑制Caspase活性，阻斷凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避凋亡。而Smac表達(dá)下調(diào)，無(wú)法有效發(fā)揮促凋亡作用，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞凋亡的抑制。Livin和Smac的相互作用在這個(gè)過(guò)程中起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)Smac表達(dá)相對(duì)較高時(shí)，它能夠與Livin結(jié)合，部分解除Livin對(duì)Caspase的抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但在腎細(xì)胞癌中，由于Smac低表達(dá)，其與Livin結(jié)合的量減少，無(wú)法充分對(duì)抗Livin的抗凋亡作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻。Livin和Smac的相互作用還與其他凋亡相關(guān)分子和信號(hào)通路存在密切關(guān)聯(lián)。例如，它們可能與Bcl-2家族蛋白相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。Livin可能通過(guò)與Bcl-2家族蛋白相互作用，影響線粒體膜電位和細(xì)胞色素C的釋放，從而