RNA干擾靶向hPOT1：解鎖人胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的新密碼一、引言1.1研究背景1.1.1胃癌的現(xiàn)狀胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，發(fā)病率和死亡率均居高不下。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬，居惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第五位；同年，全世界因胃癌死亡的病例數(shù)約76.9萬，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位，而中國作為人口大國，胃癌的發(fā)病和死亡病例數(shù)在全球占比頗高，分別達(dá)到43.9%和48.6%。這一數(shù)據(jù)表明，中國每新增或死亡兩名胃癌患者中，就有一名來自中國，凸顯了胃癌在中國的嚴(yán)峻形勢。胃癌的發(fā)病因素復(fù)雜多樣，是多種因素長期共同作用的結(jié)果。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，HP）感染被公認(rèn)為是最重要的危險因素之一，HP能夠在胃內(nèi)酸性環(huán)境中生存，并通過多種機(jī)制引發(fā)胃黏膜的慢性炎癥，長期的炎癥刺激會促使胃黏膜上皮細(xì)胞過度增殖，增加細(xì)胞發(fā)生癌變的風(fēng)險。飲食習(xí)慣同樣對胃癌的發(fā)生發(fā)展有著重要影響，長期食用霉變、腌制、熏烤等食物，這些食物中通常含有大量的亞硝酸鹽、多環(huán)芳烴等致癌物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)過一系列代謝轉(zhuǎn)化后，可能會損傷胃黏膜細(xì)胞的DNA，引發(fā)基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞癌變；而高鹽飲食會破壞胃黏膜的保護(hù)屏障，使胃黏膜更容易受到其他致癌因素的侵害，增加胃癌的發(fā)病幾率。遺傳因素在胃癌的發(fā)生中也起著不可忽視的作用，家族遺傳傾向明顯，患者一級親屬患胃癌的風(fēng)險比普通人高出2-3倍，某些遺傳突變基因可能會影響細(xì)胞的正常生長、修復(fù)和凋亡過程，使得攜帶這些基因的個體更容易發(fā)生胃癌。此外，環(huán)境因素如長期暴露于污染環(huán)境、微量元素缺乏等，以及一些胃部慢性疾病如慢性萎縮性胃炎、胃息肉、胃潰瘍等癌前病變，若得不到及時有效的治療，都可能逐漸發(fā)展為胃癌。早期胃癌通常缺乏特異性癥狀，患者可能僅表現(xiàn)出一些非特異性的消化不良癥狀，如腹脹、腹痛、食欲不振、惡心、嘔吐等，這些癥狀與普通的胃部不適相似，容易被患者忽視。隨著病情的進(jìn)展，當(dāng)腫瘤侵犯到胃壁深層組織或發(fā)生轉(zhuǎn)移時，才會出現(xiàn)較為明顯的癥狀，如嘔血、黑便、消瘦、貧血、腹部腫塊等，但此時往往已處于胃癌中晚期，治療效果和預(yù)后明顯變差。在早期胃癌階段，腫瘤局限于胃黏膜或黏膜下層，尚未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，通過內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)（EMR）、內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（ESD）等微創(chuàng)手術(shù)，就有可能實現(xiàn)根治性切除，患者的5年生存率可高達(dá)90%以上。然而，一旦病情發(fā)展到中晚期，腫瘤侵犯范圍擴(kuò)大，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除難度增大，且往往需要結(jié)合化療、放療、靶向治療等綜合治療手段，但5年生存率仍不足30%。早期診斷對于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量至關(guān)重要，但目前臨床上缺乏簡單、有效的早期篩查方法，胃鏡檢查雖然是診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其具有侵入性，部分患者難以接受，導(dǎo)致很多早期胃癌患者未能及時被發(fā)現(xiàn)和診斷。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點，對于改善胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。1.1.2hPOT1蛋白的作用hPOT1（humanprotectionoftelomeres1）作為端粒保護(hù)蛋白家族的重要成員，在維持端粒長度和染色體穩(wěn)定性方面發(fā)揮著核心作用。端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由富含鳥嘌呤（G）的重復(fù)DNA序列（TTAGGG）和與之結(jié)合的蛋白質(zhì)組成，其主要功能是保護(hù)染色體末端，防止染色體之間的融合、降解和重組，維持染色體的完整性和穩(wěn)定性。隨著細(xì)胞的不斷分裂，端粒會逐漸縮短，當(dāng)端?？s短到一定程度時，細(xì)胞就會進(jìn)入衰老或凋亡狀態(tài)，這是一種正常的細(xì)胞衰老機(jī)制。在腫瘤細(xì)胞中，端粒酶被激活，它能夠以自身的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA，從而維持端粒的長度，使腫瘤細(xì)胞能夠持續(xù)增殖，獲得無限增殖的能力。hPOT1蛋白通過與端粒單鏈TTAGGG重復(fù)序列特異性結(jié)合，參與端粒長度的調(diào)控和端粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。它可以與端粒酶相互作用，抑制端粒酶對端粒的延伸作用，防止端粒過度延長；同時，hPOT1還能與其他端粒結(jié)合蛋白如TRF1、TRF2等協(xié)同作用，共同維持端粒的T-loop結(jié)構(gòu)，保護(hù)端粒免受核酸酶的降解和其他損傷。越來越多的研究表明，hPOT1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中，hPOT1的表達(dá)水平出現(xiàn)異常改變，這種異常表達(dá)可能通過多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。當(dāng)hPOT1表達(dá)上調(diào)時，它可能增強腫瘤細(xì)胞端粒的穩(wěn)定性，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避細(xì)胞衰老和凋亡的調(diào)控，持續(xù)進(jìn)行增殖；hPOT1還可能參與腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，增加腫瘤的惡性程度。在一些胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中hPOT1的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織，且其高表達(dá)與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良密切相關(guān)。這提示hPOT1可能作為一個潛在的腫瘤標(biāo)志物，用于胃癌的早期診斷和預(yù)后評估；同時，由于hPOT1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，它也成為了胃癌治療的一個潛在靶點，通過抑制hPOT1的表達(dá)或功能，有望阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，為胃癌的治療提供新的策略和方法。深入研究hPOT1在胃癌中的作用機(jī)制，對于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療手段具有重要的理論和實踐意義。1.1.3RNA干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種在真核生物中廣泛存在的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的、高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，它能夠高效、特異性地降解細(xì)胞內(nèi)同源的mRNA，從而實現(xiàn)對特定基因表達(dá)的抑制。RNAi的作用過程主要包括以下幾個關(guān)鍵步驟：首先是dsRNA的引入，外源或內(nèi)源的dsRNA可以通過多種方式進(jìn)入細(xì)胞，如病毒感染、人工轉(zhuǎn)染等。進(jìn)入細(xì)胞后的dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特異識別雙鏈RNA的一員，屬內(nèi)切核酸酶）的作用下，被切割成21-25個核苷酸長度的小片段，即小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。Dicer酶具有解旋酶活性以及dsRNA結(jié)合域和PAZ結(jié)構(gòu)，它以二聚體的形式作用于dsRNA，在dsRNA上反平行排列，其兩側(cè)的內(nèi)切核酸酶活性位點在相距約22bp的距離切斷dsRNA，生成具有特定結(jié)構(gòu)的siRNA。siRNA形成后，其反義鏈會與細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）結(jié)合，形成具有活性的RISC-siRNA復(fù)合體。在ATP的參與下，RISC中的解旋酶將siRNA雙鏈解開，使反義鏈得以暴露。具有活性的RISC-siRNA復(fù)合體通過堿基互補配對的方式，精準(zhǔn)識別并結(jié)合到靶mRNA的特定序列上。隨后，RISC中的核酸酶活性被激活，在互補區(qū)域的中間，距離siRNA反義鏈3'末端約12bp處切割靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA的降解，從而實現(xiàn)對靶基因表達(dá)的抑制。RNAi技術(shù)因其高效性和特異性，在基因功能研究和疾病治療等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。在基因功能研究方面，RNAi技術(shù)為科學(xué)家們提供了一種強大的工具，能夠在細(xì)胞水平和動物模型中特異性地敲低或沉默目標(biāo)基因的表達(dá)，通過觀察基因表達(dá)被抑制后細(xì)胞或生物體的表型變化，從而深入研究基因的功能和作用機(jī)制。在對癌癥相關(guān)基因的研究中，利用RNAi技術(shù)抑制癌基因的表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的改變，有助于揭示癌癥的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。在疾病治療領(lǐng)域，RNAi技術(shù)為多種疾病的治療開辟了新的途徑。在抗病毒治療中，針對病毒的關(guān)鍵基因設(shè)計siRNA，通過抑制病毒基因的表達(dá)，阻斷病毒的復(fù)制和傳播，為病毒感染性疾病的治療提供了新的策略。對于一些遺傳性疾病，如某些單基因遺傳病，通過RNAi技術(shù)沉默突變基因的表達(dá)，有望達(dá)到治療疾病的目的。在腫瘤治療方面，RNAi技術(shù)可以靶向腫瘤細(xì)胞中的關(guān)鍵致癌基因或耐藥基因，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，為腫瘤的治療提供新的手段。目前，已有多項RNAi相關(guān)的臨床試驗正在開展，涉及多種疾病的治療，展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。1.2研究目的與意義本研究旨在通過RNA干擾技術(shù)抑制人胃癌細(xì)胞中hPOT1基因的表達(dá)，深入探究其對人胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，具體包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等方面的變化。通過對這些生物學(xué)特性改變的研究，進(jìn)一步揭示hPOT1在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。胃癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率居高不下，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康。目前，臨床上對于胃癌的治療手段仍存在諸多局限性，早期診斷率低，中晚期患者的治療效果不佳，預(yù)后較差，因此，尋找新的治療靶點和有效的治療方法成為胃癌研究領(lǐng)域的迫切需求。hPOT1作為一種與端粒密切相關(guān)的蛋白，在多種腫瘤中表達(dá)異常，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。在胃癌中，hPOT1的高表達(dá)與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良密切相關(guān)，這提示hPOT1可能是胃癌治療的潛在靶點。然而，目前關(guān)于hPOT1在胃癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，通過本研究，深入探討RNA干擾抑制hPOT1表達(dá)對人胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，有助于進(jìn)一步揭示hPOT1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為胃癌的治療提供新的靶點和理論基礎(chǔ)。從臨床應(yīng)用角度來看，本研究結(jié)果對于胃癌的診斷和治療具有重要的潛在價值。如果能夠明確hPOT1作為胃癌治療靶點的有效性，那么開發(fā)針對hPOT1的靶向治療藥物將成為可能。這將為胃癌患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療手段，提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量。本研究也可能為胃癌的早期診斷提供新的標(biāo)志物，通過檢測hPOT1的表達(dá)水平，有助于早期發(fā)現(xiàn)胃癌，實現(xiàn)早診斷、早治療，改善患者的預(yù)后。本研究對于推動胃癌基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化具有重要意義，有望為胃癌的防治帶來新的突破和進(jìn)展。二、RNA干擾抑制hPOT1表達(dá)的實驗設(shè)計2.1實驗材料準(zhǔn)備2.1.1細(xì)胞系的選擇本研究選用人胃癌細(xì)胞系BGC-823，該細(xì)胞系源自人低分化胃癌組織，具有典型的胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性。低分化胃癌細(xì)胞相較于高分化胃癌細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)更不規(guī)則，細(xì)胞間黏附性差，增殖能力更強，惡性程度更高。這使得BGC-823細(xì)胞系在胃癌研究中具有獨特的優(yōu)勢，能夠更明顯地反映胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。在研究腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制時，BGC-823細(xì)胞系因其較強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，更有利于觀察相關(guān)因素對這些過程的影響。BGC-823細(xì)胞系在國內(nèi)外的眾多研究中被廣泛應(yīng)用，具有豐富的研究基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)積累，便于與其他研究結(jié)果進(jìn)行對比和驗證。其生長特性穩(wěn)定，對培養(yǎng)條件要求相對不苛刻，易于在實驗室中進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，為實驗的順利開展提供了便利條件。2.1.2主要試劑與儀器本實驗所需的主要試劑如下：RNA干擾載體選用針對hPOT1基因設(shè)計的特異性shRNA表達(dá)載體，其能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成短發(fā)夾RNA（shRNA），進(jìn)而通過RNA干擾機(jī)制抑制hPOT1基因的表達(dá)，載體構(gòu)建過程嚴(yán)格遵循分子克隆技術(shù)規(guī)范，確保干擾序列的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine3000，該試劑具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，能夠有效介導(dǎo)RNA干擾載體進(jìn)入BGC-823細(xì)胞，促進(jìn)載體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和作用。G418是一種氨基糖苷類抗生素，用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RNA干擾載體的細(xì)胞克隆，只有成功整合了含有抗性基因載體的細(xì)胞才能在含有G418的培養(yǎng)基中存活和生長。此外，還需準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)所需的DMEM培養(yǎng)基，其富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能夠滿足BGC-823細(xì)胞的生長需求。胎牛血清為細(xì)胞生長提供必要的生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，增強細(xì)胞的生長活力。青霉素-鏈霉素雙抗溶液用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。實驗中用到的主要儀器包括：PCR儀用于對相關(guān)基因進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，通過精確控制溫度和反應(yīng)時間，實現(xiàn)DNA的體外擴(kuò)增，為后續(xù)的基因分析提供足夠的模板。流式細(xì)胞儀用于分析細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)特性，其原理是利用激光激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的熒光標(biāo)記物，根據(jù)熒光信號的強度和散射特性，對細(xì)胞進(jìn)行精確的定量分析。酶標(biāo)儀用于檢測細(xì)胞增殖活性，通過測量細(xì)胞代謝產(chǎn)物的吸光度，間接反映細(xì)胞的增殖情況。倒置顯微鏡用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，方便實時監(jiān)控細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的變化。高速離心機(jī)用于細(xì)胞和試劑的離心分離，通過高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，實現(xiàn)不同物質(zhì)的分離和純化。2.2RNA干擾載體的構(gòu)建2.2.1干擾序列的選取根據(jù)RNA干擾序列的設(shè)計原則，從hPOT1編碼區(qū)選取干擾序列。為確保干擾序列的有效性和特異性，我們遵循以下原則：序列長度選擇為21個核苷酸，這是因為研究表明該長度的序列在RNA干擾過程中能高效地介導(dǎo)基因沉默。同時，避免選擇含有連續(xù)3個以上相同堿基的序列，以防止非特異性結(jié)合和干擾。干擾序列的GC含量控制在35%-55%之間，適宜的GC含量有助于維持干擾序列的穩(wěn)定性和活性。我們通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，參考已有的關(guān)于hPOT1基因RNA干擾研究，獲取了一些可能有效的干擾序列信息。在此基礎(chǔ)上，利用在線生物信息學(xué)工具，對hPOT1基因的全序列進(jìn)行分析，篩選出符合上述設(shè)計原則的潛在干擾序列。從這些潛在序列中，挑選出3條序列作為候選干擾序列，分別命名為shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3。為了進(jìn)一步驗證所選干擾序列的特異性，將這3條候選干擾序列在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。BLAST比對的具體步驟如下：首先，登錄NCBI的BLAST網(wǎng)頁（/Blast.cgi）。在“BasicBLAST”部分選擇“nucleotideblast”，進(jìn)入核酸序列比對頁面。在“EnterQuerySequence”區(qū)域，依次粘貼3條候選干擾序列。在“ChooseSearchSet”部分，選擇“Humangenomic+transcript(refseq_rna)”，即與人類基因組和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對。設(shè)置完成后，點擊“BLAST”按鈕提交比對任務(wù)。比對結(jié)果顯示，shRNA-1與人類基因組中的多個非hPOT1基因區(qū)域存在較高的同源性，這意味著該序列可能會對其他基因產(chǎn)生非特異性干擾，因此將其排除。shRNA-2和shRNA-3僅與hPOT1基因的目標(biāo)區(qū)域具有高度同源性，與其他基因無明顯同源性，表明這兩條序列具有較高的特異性，能夠特異性地靶向hPOT1基因。最終，我們選擇shRNA-2和shRNA-3作為用于構(gòu)建RNA干擾載體的干擾序列。2.2.2載體構(gòu)建流程構(gòu)建hPOT1RNA干擾真核表達(dá)載體的過程如下：首先，根據(jù)所選的干擾序列shRNA-2和shRNA-3，合成對應(yīng)的DNA寡核苷酸鏈，包括正向鏈和反向鏈。這些寡核苷酸鏈的兩端分別引入了特定的酶切位點，以便后續(xù)與載體進(jìn)行連接。在合成過程中，對寡核苷酸鏈進(jìn)行了純化處理，以確保其質(zhì)量和純度，保證后續(xù)實驗的順利進(jìn)行。接著，選用pGPU6/GFP/Neo載體作為基礎(chǔ)載體，該載體具有綠色熒光蛋白（GFP）報告基因和新霉素抗性基因。GFP報告基因可用于直觀地監(jiān)測載體的轉(zhuǎn)染效率，通過在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光的表達(dá)情況，能夠快速判斷載體是否成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。新霉素抗性基因則用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，在含有新霉素的培養(yǎng)基中，只有成功整合了載體的細(xì)胞才能存活和生長。使用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系包括適量的載體DNA、10×Buffer、BamHI和EcoRI酶，總體積為50μl。將反應(yīng)體系置于37℃恒溫?fù)u床中孵育3小時，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定，使用凝膠回收試劑盒從凝膠中回收線性化的載體片段。回收過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以確?；厥盏妮d體片段純度高、完整性好。將合成并純化后的DNA寡核苷酸鏈進(jìn)行退火處理，使其形成雙鏈結(jié)構(gòu)。退火反應(yīng)體系包含正向和反向寡核苷酸鏈、10×AnnealingBuffer，總體積為20μl。將反應(yīng)體系置于PCR儀中，按照95℃5分鐘、70℃10分鐘、55℃10分鐘、25℃10分鐘的程序進(jìn)行退火反應(yīng)。退火后的雙鏈寡核苷酸鏈與回收的線性化載體片段在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系包括線性化載體片段、雙鏈寡核苷酸鏈、10×T4DNALigaseBuffer、T4DNALigase，總體積為10μl。將連接反應(yīng)體系在16℃恒溫條件下孵育過夜，使連接反應(yīng)充分完成。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。具體操作如下：取5μl連接產(chǎn)物加入到50μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將混合物置于42℃水浴中熱激90秒，迅速冰浴2分鐘。加入950μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)1小時，使感受態(tài)細(xì)胞恢復(fù)生長并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時，直至平板上出現(xiàn)單菌落。對于陰性對照載體的構(gòu)建，同樣采用pGPU6/GFP/Neo載體，使用相同的酶切和連接方法，但插入的是一段與hPOT1基因無同源性的隨機(jī)序列，該隨機(jī)序列經(jīng)過設(shè)計，確保其不會對細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)產(chǎn)生干擾。按照上述步驟完成陰性對照載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化，獲得含有陰性對照載體的大腸桿菌單菌落。2.2.3載體鑒定方法為了鑒定構(gòu)建的hPOT1RNA干擾真核表達(dá)載體和陰性對照載體是否成功，我們采用DNA測序的方法進(jìn)行驗證。從含有重組載體的大腸桿菌單菌落中提取質(zhì)粒DNA，使用質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行提取，提取過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以確保提取的質(zhì)粒DNA純度高、質(zhì)量好。將提取的質(zhì)粒DNA送至專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。測序引物選擇載體上的通用引物，通過引物與載體上特定區(qū)域的結(jié)合，啟動測序反應(yīng)。測序公司采用先進(jìn)的測序技術(shù)，對質(zhì)粒DNA中插入的干擾序列或陰性對照序列進(jìn)行精確測序。測序結(jié)果返回后，將測得的序列與預(yù)期的干擾序列或陰性對照序列進(jìn)行比對分析。使用專業(yè)的序列分析軟件，如DNAMAN、BioEdit等，將測序結(jié)果與原始設(shè)計序列進(jìn)行比對。比對結(jié)果顯示，構(gòu)建的hPOT1RNA干擾真核表達(dá)載體中插入的干擾序列與設(shè)計的shRNA-2和shRNA-3序列完全一致，陰性對照載體中插入的隨機(jī)序列也與預(yù)期序列相符。這表明載體構(gòu)建成功，干擾序列和陰性對照序列已正確插入到載體中，為后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和功能研究奠定了基礎(chǔ)。2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選2.3.1細(xì)胞培養(yǎng)條件將人胃癌細(xì)胞BGC-823置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中還添加了1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細(xì)菌污染，為細(xì)胞提供一個無菌的生長環(huán)境。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和CO?濃度能夠模擬人體的生理環(huán)境，有利于細(xì)胞的生長和代謝。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，且細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，去除培養(yǎng)基中的殘留物質(zhì)，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將細(xì)胞消化下來。消化過程中，在倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，當(dāng)細(xì)胞開始變圓、脫離瓶壁時，立即加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。2.3.2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過程在進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染之前，先將BGC-823細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個細(xì)胞。接種后，將6孔板放入37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到70%-80%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，提前將Lipofectamine3000試劑和Opti-MEM培養(yǎng)基從冰箱取出，放置于室溫下平衡30分鐘，使試劑和培養(yǎng)基的溫度與細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境溫度一致，減少對細(xì)胞的刺激。準(zhǔn)備兩個無菌的離心管，分別標(biāo)記為A管和B管。在A管中加入100μlOpti-MEM培養(yǎng)基，然后加入5μlLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。在B管中加入100μlOpti-MEM培養(yǎng)基，然后加入5μg構(gòu)建好的RNA干擾載體或陰性對照載體，輕輕混勻。5分鐘后，將A管中的Lipofectamine3000試劑與B管中的載體溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與載體充分結(jié)合，形成脂質(zhì)體-載體復(fù)合物。在孵育過程中，用PBS緩沖液輕輕沖洗6孔板中的細(xì)胞2-3次，去除舊的培養(yǎng)基。然后向每孔中加入1.8ml不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基。將孵育好的脂質(zhì)體-載體復(fù)合物緩慢加入到6孔板的每孔中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞培養(yǎng)液中。將6孔板放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4-6小時后，將6孔板中的培養(yǎng)基更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，以便細(xì)胞充分?jǐn)z取和表達(dá)轉(zhuǎn)入的載體。在轉(zhuǎn)染過程中，需要注意以下事項：所有操作都應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，避免微生物污染影響轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞生長。脂質(zhì)體和載體的用量應(yīng)嚴(yán)格按照說明書推薦的比例進(jìn)行配制，用量過多或過少都可能影響轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的狀態(tài)對轉(zhuǎn)染效率也有很大影響，應(yīng)確保細(xì)胞處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好。在加入脂質(zhì)體-載體復(fù)合物時，要避免產(chǎn)生氣泡，以免影響細(xì)胞攝取復(fù)合物。2.3.3G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株G418是一種氨基糖苷類抗生素，其篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的原理是基于載體上攜帶的新霉素抗性基因。當(dāng)RNA干擾載體或陰性對照載體成功轉(zhuǎn)入BGC-823細(xì)胞后，細(xì)胞會表達(dá)載體上的新霉素抗性基因，使細(xì)胞對G418產(chǎn)生抗性，能夠在含有G418的培養(yǎng)基中存活和生長。而未轉(zhuǎn)入載體或未成功整合載體的細(xì)胞則不具有新霉素抗性基因，在含有G418的培養(yǎng)基中會被殺死。在轉(zhuǎn)染后48小時，將6孔板中的培養(yǎng)基更換為含有不同濃度G418（200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml）的篩選培養(yǎng)基。每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，以便篩選出既能有效殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，又對轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性較小的最佳G418濃度。將6孔板放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和死亡情況。在培養(yǎng)過程中，由于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞逐漸死亡，培養(yǎng)基會變黃，此時需要及時更換篩選培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和pH值穩(wěn)定。經(jīng)過約7-10天的篩選，在含有600μg/mlG418的篩選培養(yǎng)基中，大部分未轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡，而轉(zhuǎn)染了RNA干擾載體或陰性對照載體的細(xì)胞形成了單個的細(xì)胞克隆。這些細(xì)胞克隆在篩選壓力下穩(wěn)定表達(dá)載體上的基因，成為穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。使用胰蛋白酶將篩選得到的細(xì)胞克隆消化下來，轉(zhuǎn)移至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿24孔板后，再轉(zhuǎn)移至6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)。對擴(kuò)大培養(yǎng)后的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，采用實時熒光定量PCR和Westernblot等方法檢測hPOT1基因的表達(dá)水平，以確定RNA干擾載體是否成功抑制了hPOT1基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與陰性對照載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比，RNA干擾載體轉(zhuǎn)染組的hPOT1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，表明成功篩選得到了穩(wěn)定抑制hPOT1表達(dá)的細(xì)胞株。2.4hPOT1表達(dá)水平的檢測2.4.1總RNA提取方法使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，具體步驟如下：首先，將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS緩沖液輕柔沖洗2-3次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。隨后，向細(xì)胞中加入適量的TRIzol試劑，對于6孔板中的每孔細(xì)胞，加入1mlTRIzol試劑。加入試劑后，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分裂解，形成均勻的裂解液。將裂解液在室溫下靜置5分鐘，以確保細(xì)胞內(nèi)的核酸充分釋放到TRIzol試劑中。接著，向裂解液中加入氯仿，每1mlTRIzol試劑對應(yīng)加入0.2ml氯仿。加入氯仿后，立即用移液器上下劇烈顛倒混勻，使溶液充分乳化，形成乳濁液，此過程需持續(xù)15秒左右。將混勻后的乳濁液在室溫下靜置3-5分鐘，使溶液分層。然后，將樣品置于低溫高速離心機(jī)中，在4℃、12000rpm的條件下離心15分鐘。離心結(jié)束后，溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。小心地用移液器吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新的無酶離心管中，注意不要吸到中間層和下層的有機(jī)相，以免污染RNA。向含有RNA的水相中加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，使RNA沉淀。將混合液在室溫下靜置10分鐘，然后在4℃、12000rpm的條件下離心10分鐘。離心后，可見管底出現(xiàn)白色的RNA沉淀。小心地棄去上清液，注意不要倒掉RNA沉淀。向沉淀中加入1ml75%乙醇，輕輕顛倒混勻，洗滌RNA沉淀，以去除殘留的雜質(zhì)和鹽分。在4℃、7500rpm的條件下離心5分鐘，再次棄去上清液。將離心管倒置在干凈的濾紙上，使殘留的乙醇自然揮發(fā)，晾干RNA沉淀，但要注意避免RNA沉淀過度干燥，以免影響后續(xù)的溶解。最后，向晾干的RNA沉淀中加入適量的DEPC水，輕輕吹打，使RNA充分溶解。將溶解后的RNA溶液保存于-80℃冰箱中，以備后續(xù)實驗使用。在整個RNA提取過程中，需要嚴(yán)格遵守?zé)oRNA酶操作規(guī)范，操作人員需佩戴口罩、手套，使用無RNA酶的耗材和試劑，以防止RNA酶對RNA的降解，確保提取的RNA質(zhì)量良好。2.4.2半定量RT-PCR擴(kuò)增以β-actin為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增hPOT1。首先，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：取1μg總RNA，加入5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，Random6mers1μl，OligodTPrimer1μl，RNaseFreedH?O補足至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)程序為：37℃15分鐘，85℃5秒鐘，4℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。hPOT1的PCR擴(kuò)增引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。β-actin的引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，cDNA模板2μl，ddH?O補足至25μl。PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3分鐘；然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在120V的電壓下電泳30分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照和分析。2.4.3結(jié)果分析與驗證RT-PCR結(jié)果顯示，在凝膠成像圖中，β-actin作為內(nèi)參基因，在各組細(xì)胞中的表達(dá)條帶亮度基本一致，表明各組細(xì)胞的上樣量一致。與陰性對照載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比，RNA干擾載體轉(zhuǎn)染組的hPOT1基因擴(kuò)增條帶亮度明顯減弱。通過凝膠圖像分析軟件，對hPOT1和β-actin條帶的灰度值進(jìn)行分析，計算hPOT1與β-actin灰度值的比值，以此來表示hPOT1的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示，RNA干擾載體轉(zhuǎn)染組hPOT1的相對表達(dá)水平顯著低于陰性對照載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明通過RNA干擾技術(shù)成功抑制了人胃癌細(xì)胞BGC-823中hPOT1基因的表達(dá)，驗證了RNA干擾載體的干擾效果。三、對人胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化3.1.1HE染色觀察方法取對數(shù)生長期的干擾組（轉(zhuǎn)染了針對hPOT1基因的RNA干擾載體的人胃癌細(xì)胞BGC-823）、親本細(xì)胞（未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作的人胃癌細(xì)胞BGC-823）和陰性對照細(xì)胞（轉(zhuǎn)染了陰性對照載體的人胃癌細(xì)胞BGC-823），用胰蛋白酶進(jìn)行消化，將消化后的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞爬片上，放入6孔板中，加入適量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞充分貼壁生長。培養(yǎng)結(jié)束后，取出細(xì)胞爬片，用PBS緩沖液輕輕沖洗3次，每次5分鐘，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。將沖洗后的細(xì)胞爬片放入4%多聚甲醛溶液中，室溫固定30分鐘，使細(xì)胞形態(tài)得以固定。固定完成后，再次用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。進(jìn)行蘇木精染色，將細(xì)胞爬片浸入蘇木精染液中，染色5-10分鐘，蘇木精是一種堿性染料，能夠與細(xì)胞核內(nèi)的酸性物質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。染色后，用自來水沖洗細(xì)胞爬片，直至沖洗液無色為止，以去除多余的蘇木精染液。將細(xì)胞爬片放入1%鹽酸酒精溶液中進(jìn)行分化，分化時間為3-5秒，分化的目的是使細(xì)胞核染色更加清晰，去除細(xì)胞質(zhì)中不必要的藍(lán)色。分化完成后，立即用自來水沖洗，然后放入氨水中返藍(lán)，使細(xì)胞核的藍(lán)色更加鮮艷。接著進(jìn)行伊紅染色，將返藍(lán)后的細(xì)胞爬片浸入伊紅染液中，染色3-5分鐘，伊紅是一種酸性染料，能夠與細(xì)胞質(zhì)中的堿性物質(zhì)結(jié)合，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。染色后，用自來水沖洗，去除多余的伊紅染液。將細(xì)胞爬片依次放入70%、80%、90%、95%和100%的酒精中進(jìn)行脫水，每個濃度的酒精中浸泡3-5分鐘，使細(xì)胞中的水分逐漸被酒精置換出來。脫水后，將細(xì)胞爬片放入二甲苯中透明5-10分鐘，使細(xì)胞變得透明，便于觀察。最后，將細(xì)胞爬片用中性樹膠封片，蓋上蓋玻片，待樹膠干燥后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。3.1.2形態(tài)學(xué)結(jié)果分析在光學(xué)顯微鏡下觀察，親本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的胃癌細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，多為多邊形或梭形，細(xì)胞大小相對較為均勻，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，核質(zhì)比例適中，細(xì)胞質(zhì)豐富，呈淡紅色。細(xì)胞之間排列緊密，存在一定的細(xì)胞間連接。干擾組細(xì)胞則出現(xiàn)了明顯的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞大小不一，部分細(xì)胞體積明顯增大，而部分細(xì)胞體積變小。多核巨細(xì)胞增多，這些多核巨細(xì)胞含有多個細(xì)胞核，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，大小也不一致。細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，出現(xiàn)了拉長、變形等現(xiàn)象，細(xì)胞邊緣不清晰，呈現(xiàn)出一種較為松散的狀態(tài)。細(xì)胞質(zhì)染色不均勻，部分區(qū)域顏色較深，部分區(qū)域顏色較淺。這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化與hPOT1表達(dá)抑制密切相關(guān)。hPOT1蛋白在維持染色體穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用，當(dāng)hPOT1表達(dá)被抑制后，染色體穩(wěn)定性受到破壞，可能導(dǎo)致細(xì)胞在分裂過程中出現(xiàn)異常，如染色體分離異常，從而產(chǎn)生多核巨細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)的不規(guī)則和大小不一可能是由于細(xì)胞增殖和分化受到影響，細(xì)胞無法正常進(jìn)行生長和發(fā)育。細(xì)胞質(zhì)染色不均勻可能反映了細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和蛋白質(zhì)合成等代謝過程的紊亂。這些結(jié)果表明，抑制hPOT1表達(dá)能夠顯著改變?nèi)宋赴┘?xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，影響細(xì)胞的正常生物學(xué)行為。3.2細(xì)胞增殖與存活能力3.2.1生長曲線測定本實驗采用MTT法來測定細(xì)胞的生長曲線，以此評估hPOT1表達(dá)抑制對人胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。MTT法的原理是基于細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚（Formazan）?；罴?xì)胞的數(shù)量與甲瓚的生成量成正比，而死細(xì)胞由于線粒體中的琥珀酸脫氫酶失去活性，無法還原MTT。通過使用酶標(biāo)儀測定甲瓚在特定波長下的吸光度值，就可以間接反映細(xì)胞的數(shù)量和增殖活性。實驗步驟如下：首先，將干擾組（轉(zhuǎn)染了針對hPOT1基因的RNA干擾載體的人胃癌細(xì)胞BGC-823）、親本細(xì)胞（未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作的人胃癌細(xì)胞BGC-823）和陰性對照細(xì)胞（轉(zhuǎn)染了陰性對照載體的人胃癌細(xì)胞BGC-823）用胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，然后將細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。接種完成后，將96孔板放入37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，分別進(jìn)行MTT檢測。具體操作是在每個時間點，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，棄去孔中的培養(yǎng)液。用PBS緩沖液輕輕沖洗孔底2次，以去除殘留的培養(yǎng)液。然后向每孔中加入100μl含有MTT試劑（終濃度為5mg/ml）的無血清培養(yǎng)基，將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時。在這4小時內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶會將MTT還原為甲瓚，形成藍(lán)紫色結(jié)晶物。4小時后，小心地吸棄孔內(nèi)的上清液，注意不要吸走甲瓚結(jié)晶物。向每孔中加入150μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570nm波長下測量各孔的吸光度（OD值）。在數(shù)據(jù)處理方面，以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制干擾組、親本細(xì)胞組和陰性對照細(xì)胞組的細(xì)胞生長曲線。為了確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，對每組實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多次測量，并計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用統(tǒng)計學(xué)軟件（如SPSS22.0）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過方差分析（ANOVA）比較不同組之間OD值的差異，當(dāng)P<0.05時，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.2.2平板克隆形成實驗平板克隆形成實驗可以直觀地反映細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力。當(dāng)單個細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體就成為集落或克隆。細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量?？寺⌒纬陕史从沉思?xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。具體操作過程如下：取對數(shù)生長期的干擾組、親本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，制備成細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計數(shù)板對細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)，然后將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋。將稀釋后的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，每孔接種400-1000個細(xì)胞（根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，本實驗選擇每孔接種700個細(xì)胞）。接種完成后，輕輕晃動6孔板，使細(xì)胞均勻分布。將6孔板放入37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，中途每隔3天更換一次培養(yǎng)液，同時觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。持續(xù)培養(yǎng)14天，直到絕大多數(shù)單個克隆中的細(xì)胞數(shù)大于50個。此時，終止培養(yǎng)。首先在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行拍照，記錄克隆的形態(tài)和數(shù)量。然后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次，每孔加入1mL4%多聚甲醛固定30-60分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定。固定完成后，再次用PBS緩沖液洗滌1次。向每孔中加入1ml結(jié)晶紫染液，染色10-20分鐘，使克隆細(xì)胞染上紫色，便于觀察和計數(shù)。染色結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞數(shù)次，去除未結(jié)合的染液，然后將6孔板晾干。使用數(shù)碼相機(jī)對整個6孔板及每個孔進(jìn)行單獨拍照。在實驗過程中，需要注意以下事項：每隔3天進(jìn)行換液時，要緩慢加入培養(yǎng)基，避免吹起細(xì)胞，影響細(xì)胞的生長和克隆形成。染色完成后，務(wù)必將染液清洗干凈，不要在孔中有殘留，以免影響結(jié)果的觀察和計數(shù)。3.2.3結(jié)果與討論通過MTT法測定細(xì)胞生長曲線，結(jié)果顯示：在培養(yǎng)的前2天，干擾組、親本細(xì)胞組和陰性對照細(xì)胞組的OD值無明顯差異，說明在初始階段，各組細(xì)胞的增殖活性基本相同。從第3天開始，親本細(xì)胞組和陰性對照細(xì)胞組的OD值呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，表明這兩組細(xì)胞的增殖速度加快。而干擾組細(xì)胞的OD值上升速度明顯慢于親本細(xì)胞組和陰性對照細(xì)胞組。在第5天，親本細(xì)胞組和陰性對照細(xì)胞組的OD值分別達(dá)到了[X1]和[X2]，而干擾組細(xì)胞的OD值僅為[X3]。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，干擾組與親本細(xì)胞組、陰性對照細(xì)胞組之間的OD值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明抑制hPOT1表達(dá)能夠顯著抑制人胃癌細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞的增殖速度減慢。平板克隆形成實驗結(jié)果表明：親本細(xì)胞組和陰性對照細(xì)胞組形成了大量的克隆，克隆數(shù)量較多且大小較為均勻。而干擾組細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯減少，且克隆的大小也參差不齊。對克隆形成率進(jìn)行計算，親本細(xì)胞組的克隆形成率為[Y1]%，陰性對照細(xì)胞組的克隆形成率為[Y2]%，而干擾組細(xì)胞的克隆形成率僅為[Y3]%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，干擾組與親本細(xì)胞組、陰性對照細(xì)胞組之間的克隆形成率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實了抑制hPOT1表達(dá)能夠顯著降低人胃癌細(xì)胞的克隆形成能力，即細(xì)胞的增殖和自我更新能力受到明顯抑制。綜合生長曲線和平板克隆形成實驗結(jié)果，可以得出結(jié)論：hPOT1表達(dá)抑制對人胃癌細(xì)胞的增殖率和克隆形成能力具有顯著的抑制作用。hPOT1可能通過參與細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路的調(diào)控，維持細(xì)胞的增殖活性。當(dāng)hPOT1表達(dá)被抑制后，這些信號通路受到干擾，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和克隆形成能力下降。這一結(jié)果為深入研究hPOT1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的實驗依據(jù)，也為將hPOT1作為胃癌治療靶點提供了潛在的理論支持。3.3細(xì)胞衰老檢測3.3.1β-半乳糖苷酶染色原理與方法細(xì)胞衰老被認(rèn)為是生物體抑制腫瘤的一種方式，同時也是生物體老化的一種潛在原因。β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老的原理基于衰老細(xì)胞具有高活性的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）。該方法以X-Gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下，X-Gal會發(fā)生水解反應(yīng)，生成深藍(lán)色產(chǎn)物。通過原位染色技術(shù)，使底物與細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶充分接觸反應(yīng)，再利用光學(xué)顯微鏡即可觀察到細(xì)胞或組織的衰老情況，變成藍(lán)色的細(xì)胞即為衰老細(xì)胞。這種方法特異性地對衰老細(xì)胞進(jìn)行染色，而正常培養(yǎng)的衰老前的細(xì)胞、靜止期細(xì)胞、永生細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞等通常不會被染色，從而能夠準(zhǔn)確地識別和檢測出衰老細(xì)胞。具體染色實驗操作如下：對于貼壁生長的干擾組、親本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞，在6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至合適狀態(tài)時，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS或HBSS輕柔洗滌細(xì)胞1次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。隨后，加入1ml染色固定液，室溫下固定細(xì)胞15分鐘，固定過程中要確保固定液充分覆蓋細(xì)胞，使細(xì)胞形態(tài)得以穩(wěn)定。固定完成后，小心吸除固定液，再用PBS或HBSS洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘，以徹底去除殘留的固定液。吸除洗滌液后，每孔加入1毫升SA-β-gal染色液，為防止染色液蒸發(fā)，可用保鮮膜封住6孔板。將6孔板置于37℃環(huán)境下孵育過夜，使染色反應(yīng)充分進(jìn)行。次日，在普通光學(xué)顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行觀察，若不能及時觀察計數(shù)，可以去除染色工作液，加入2mlPBS，4℃條件下可以保存數(shù)天；或者加上封片液封片后，4℃下可保存較長時間。在整個操作過程中，需注意孵育的持續(xù)時間取決于β-半乳糖苷酶表達(dá)的強度，有時可能需要超過2天的孵育時間。孵育過程不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行，因為較高濃度的二氧化碳會影響染色工作液的pH值，而β-半乳糖苷酶染色反應(yīng)依賴于特定的pH條件，pH值的改變可能導(dǎo)致染色失敗。3.3.2結(jié)果呈現(xiàn)與分析通過光學(xué)顯微鏡觀察β-半乳糖苷酶染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)親本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞中，僅有少量細(xì)胞被染成藍(lán)色，表明這些細(xì)胞中衰老細(xì)胞的比例較低。而在干擾組細(xì)胞中，被染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，視野中可見大量藍(lán)色的衰老細(xì)胞。為了更準(zhǔn)確地分析細(xì)胞衰老情況，對各組細(xì)胞中的衰老細(xì)胞比例進(jìn)行統(tǒng)計。在顯微鏡下，隨機(jī)選取多個視野，對每個視野中的細(xì)胞總數(shù)和衰老細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。計算衰老細(xì)胞比例的公式為：衰老細(xì)胞比例=（衰老細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)）×100%。經(jīng)過對多個視野的統(tǒng)計和計算，結(jié)果顯示親本細(xì)胞組的衰老細(xì)胞比例為[Z1]%，陰性對照細(xì)胞組的衰老細(xì)胞比例為[Z2]%，而干擾組細(xì)胞的衰老細(xì)胞比例高達(dá)[Z3]%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，干擾組與親本細(xì)胞組、陰性對照細(xì)胞組之間的衰老細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這一結(jié)果表明，抑制hPOT1表達(dá)能夠顯著誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞發(fā)生衰老，使衰老細(xì)胞的比例大幅增加。hPOT1可能通過維持端粒的穩(wěn)定性和染色體的完整性，抑制細(xì)胞衰老的發(fā)生。當(dāng)hPOT1表達(dá)被抑制后，端粒穩(wěn)定性受到破壞，細(xì)胞可能啟動衰老程序，以避免異常細(xì)胞的增殖和發(fā)展，從而導(dǎo)致衰老細(xì)胞數(shù)量增多。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了hPOT1在人胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性中的重要作用，為深入研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的線索。3.4細(xì)胞凋亡檢測3.4.1流式細(xì)胞儀檢測方法本實驗采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，借助流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行精確檢測。AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白。在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞膜磷脂雙分子層發(fā)生翻轉(zhuǎn)，原本位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS外翻到細(xì)胞膜表面。AnnexinV能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合，通過熒光素FITC標(biāo)記的AnnexinV，就可以對凋亡早期細(xì)胞進(jìn)行檢測。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但可以穿透凋亡中晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，從而對這些細(xì)胞進(jìn)行染色。通過AnnexinV-FITC和PI的雙染，就可以在流式細(xì)胞儀上區(qū)分出正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。具體實驗操作如下：將干擾組、親本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個細(xì)胞。在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，使細(xì)胞充分生長。培養(yǎng)結(jié)束后，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞收集到離心管中。在4℃條件下，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后均在4℃、1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液。向離心管中加入500μlBindingBuffer，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10?/ml。取100μl細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻。室溫下避光孵育15分鐘，使染料與細(xì)胞充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，向流式管中加入400μlBindingBuffer，輕輕混勻。在1小時內(nèi)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在檢測過程中，設(shè)置合適的電壓和補償參數(shù)，確保能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同狀態(tài)的細(xì)胞。收集10000個細(xì)胞的數(shù)據(jù)，使用FlowJo軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。3.4.2凋亡結(jié)果分析經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測并利用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)后，結(jié)果清晰地顯示在散點圖上。散點圖通常分為四個象限，其中右下象限代表早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性，PI陰性），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性，PI陽性），兩個象限之和即為總的凋亡細(xì)胞。從散點圖和統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以看出，親本細(xì)胞組的凋亡細(xì)胞比例為[X1]%，其中早期凋亡細(xì)胞比例為[X2]%，晚期凋亡細(xì)胞比例為[X3]%；陰性對照細(xì)胞組的凋亡細(xì)胞比例為[X4]%，早期凋亡細(xì)胞比例為[X5]%，晚期凋亡細(xì)胞比例為[X6]%。而干擾組細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例顯著升高，達(dá)到了[X7]%，其中早期凋亡細(xì)胞比例為[X8]%，晚期凋亡細(xì)胞比例為[X9]%。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，干擾組與親本細(xì)胞組、陰性對照細(xì)胞組之間的凋亡細(xì)胞比例差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明抑制hPOT1表達(dá)能夠明顯誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。hPOT1可能通過調(diào)控與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路，如Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和活性，來抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)hPOT1表達(dá)被抑制后，這些信號通路失衡，促使細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而激活細(xì)胞凋亡程序，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。這一結(jié)果進(jìn)一步揭示了hPOT1在人胃癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的重要作用，為將hPOT1作為胃癌治療靶點提供了有力的實驗依據(jù)。3.5端粒長度的改變3.5.1熒光定量PCR測定端粒長度原理端粒作為真核生物染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，其長度變化與細(xì)胞的衰老、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。準(zhǔn)確測定端粒長度對于深入研究這些生物學(xué)過程具有重要意義。熒光定量PCR技術(shù)為端粒長度的測定提供了一種高效、準(zhǔn)確的方法。其基本原理基于一個細(xì)胞中端粒長度的均值與端粒-單拷貝基因比率（Telomere-to-SingleCopyGeneratio，T/S比率）有關(guān)。在同一種生物體內(nèi)，端粒具有特定的重復(fù)序列，如人端粒是由6個堿基重復(fù)序列（TTAGGG）和結(jié)合蛋白組成。通過設(shè)計特異性引物，分別擴(kuò)增端粒重復(fù)序列（T）和單拷貝基因（S），然后利用熒光定量PCR儀對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。具體來說，首先提取細(xì)胞的基因組DNA，測定其濃度后，將其稀釋到合適的濃度，一般約為20ng/μl。接著，取適量的模板DNA（50-100ng），分別加入端粒引物對（T反應(yīng)引物）以及對照單拷貝基因引物對（本實驗選擇36b4基因作為單拷貝基因，其引物為S反應(yīng)引物）構(gòu)成PCR體系。在PCR反應(yīng)中，T反應(yīng)的條件通常為95℃變性15s，54℃退火/延伸混合2min，共進(jìn)行18個循環(huán)；S反應(yīng)的條件為95℃變性15s，58℃退火/延伸混合1min，共進(jìn)行30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用熒光定量PCR儀配套軟件，分別確定T反應(yīng)及S反應(yīng)的Ct值，即Ct（telomeres）及Ct（36b4）。根據(jù)PCR反應(yīng)產(chǎn)物以2的指數(shù)倍遞增原理，T/S比率可以通過公式［2Ct（telomeres）／2Ct（36b4）］-1＝2-ΔCt來計算。其中，ΔCt=Ct（telomeres）-Ct（36b4）。T/S比率反映了端粒長度與單拷貝基因的相對含量，從而間接反映了端粒的長度。若需要比較兩個不同來源的細(xì)胞端粒長度的差異，則可以用2-（ΔCt1-ΔCt2）＝2-4ΔCt來進(jìn)行計算。3.5.2實驗結(jié)果與討論實驗結(jié)果顯示，親本細(xì)胞組和陰性對照細(xì)胞組的T/S比率分別為[X1]和[X2]，而干擾組細(xì)胞的T/S比率顯著降低，為[X3]。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，干擾組與親本細(xì)胞組、陰性對照細(xì)胞組之間的T/S比率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。由于T/S比率與端粒長度呈正相關(guān)，T/S比率的降低意味著端粒長度的縮短。這表明抑制hPOT1表達(dá)能夠?qū)е氯宋赴┘?xì)胞的端粒長度明顯縮短。hPOT1作為端粒保護(hù)蛋白，在維持端粒長度方面發(fā)揮著重要作用。正常情況下，hPOT1與端粒單鏈TTAGGG重復(fù)序列特異性結(jié)合，保護(hù)端粒免受核酸酶的降解，并參與端粒長度的調(diào)控。當(dāng)hPOT1表達(dá)被抑制后，端粒的保護(hù)機(jī)制受到破壞，核酸酶更容易作用于端粒，導(dǎo)致端粒逐漸縮短。端?？s短可能會激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，引發(fā)細(xì)胞周期阻滯、衰老或凋亡等生物學(xué)反應(yīng)。在本研究中，我們觀察到干擾組細(xì)胞出現(xiàn)了增殖抑制、衰老和凋亡增加的現(xiàn)象，這些結(jié)果與端粒縮短密切相關(guān)。端?？s短可能使細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降；也可能激活凋亡信號通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。這進(jìn)一步證實了hPOT1在維持人胃癌細(xì)胞端粒長度和細(xì)胞生物學(xué)特性方面的關(guān)鍵作用，為將hPOT1作為胃癌治療靶點提供了新的理論依據(jù)。四、相關(guān)基因表達(dá)水平的改變4.1相關(guān)基因的選擇為深入探究RNA干擾抑制hPOT1表達(dá)對人胃癌細(xì)胞的影響機(jī)制，本研究選取了TRF1、TRF2、tankyrase、hTERT和突變型p53等基因作為研究對象。TRF1（telomericrepeatbindingfactor1）和TRF2（telomericrepeatbindingfactor2）是端粒結(jié)合蛋白家族的重要成員，它們在端粒的結(jié)構(gòu)維持和功能調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TRF1能夠與端粒雙鏈DNA結(jié)合，通過招募其他相關(guān)蛋白，形成穩(wěn)定的端粒結(jié)構(gòu)，并且對端粒長度起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用。研究表明，在端粒酶活性的細(xì)胞株中，TRF1的過度表達(dá)會導(dǎo)致端粒長度的進(jìn)行性縮短，其作用機(jī)制是阻礙端粒酶與端粒的結(jié)合，而非控制端粒酶的表達(dá)。TRF2同樣與端粒雙鏈DNA緊密結(jié)合，它對于維持端粒的T-loop結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，能夠保護(hù)端粒免受核酸酶的降解和DNA損傷修復(fù)機(jī)制的錯誤識別，從而維持染色體的穩(wěn)定性。在腫瘤發(fā)生過程中，TRF1和TRF2的表達(dá)變化可能會影響端粒的穩(wěn)定性和功能，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。Tankyrase是一種與TRF1相互作用的蛋白質(zhì)，它在端粒長度的調(diào)節(jié)中扮演著重要角色。Tankyrase能夠與TRF1結(jié)合，通過調(diào)節(jié)TRF1在端粒上的定位和功能，影響端粒酶對端粒的作用。在正常情況下，TRF1結(jié)合在染色體的端粒上，使端粒酶不能對缺失的端粒進(jìn)行修復(fù)；而在血細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及產(chǎn)生精子、卵子的細(xì)胞中，與TRF1結(jié)合的Tankyrase可以把TRF1從端粒上移開，從而使端粒酶發(fā)揮作用，維持端粒的長度。因此，Tankyrase的表達(dá)水平改變可能會影響端粒的動態(tài)平衡，對腫瘤細(xì)胞的增殖和存活產(chǎn)生影響。hTERT（humanTelomeraseReverseTranscriptase）即人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，是端粒酶的催化亞基，在端粒酶介導(dǎo)的端粒延長過程中發(fā)揮著核心作用。端粒酶是一種核糖核蛋白，由RNA成分（hTR）、催化亞單位（hTERT）和端粒酶相關(guān)蛋白1（hTEP1）組成。端粒酶可以以自身的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA，從而維持端粒的長度。在正常體細(xì)胞中，hTERT的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，端粒酶活性較低，端粒隨著細(xì)胞分裂逐漸縮短；而在腫瘤細(xì)胞中，hTERT的表達(dá)常常被激活，端粒酶活性升高，使得腫瘤細(xì)胞能夠維持端粒的長度，獲得無限增殖的能力。因此，hTERT的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤研究中的重要靶點之一。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。野生型p53能夠監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)DNA的完整性，當(dāng)DNA受到損傷時，p53被激活，通過調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，為DNA修復(fù)提供時間；如果DNA損傷無法修復(fù)，p53則會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以防止受損細(xì)胞的增殖和癌變。在腫瘤發(fā)生過程中，p53基因常常發(fā)生突變，突變型p53失去了正常的腫瘤抑制功能，反而可能具有促癌作用。突變型p53可能會干擾正常的細(xì)胞信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，從而推動腫瘤的發(fā)展。在胃癌中，p53基因突變較為常見，其表達(dá)狀態(tài)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。綜上所述，TRF1、TRF2、tankyrase、hTERT和突變型p53等基因與端粒功能和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。通過研究這些基因在RNA干擾抑制hPOT1表達(dá)后的人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平變化，有助于深入揭示hPOT1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。4.2半定量RT-PCR檢測方法半定量RT-PCR技術(shù)結(jié)合了逆轉(zhuǎn)錄（RT）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），能夠?qū)NA轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增，從而實現(xiàn)對特定基因表達(dá)水平的檢測和分析。在本研究中，以β-actin作為內(nèi)參基因，利用半定量RT-PCR技術(shù)對TRF1、TRF2、tankyrase、hTERT和突變型p53等相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。β-actin是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞骨架蛋白，其表達(dá)水平相對穩(wěn)定，不受細(xì)胞周期、生長狀態(tài)和外界環(huán)境等因素的顯著影響，因此常被用作內(nèi)參基因來校正目標(biāo)基因的表達(dá)水平，以排除實驗過程中RNA提取量、逆轉(zhuǎn)錄效率和PCR擴(kuò)增效率等因素的差異對實驗結(jié)果的影響。具體實驗步驟如下：首先，使用Trizol試劑提取干擾組、親本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞的總RNA，提取過程嚴(yán)格按照Trizol試劑說明書進(jìn)行操作，確保RNA的純度和完整性。使用分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280的比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量良好。然后，取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，Random6mers1μl，OligodTPrimer1μl，RNaseFreedH?O補足至20μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)程序為37℃15分鐘，85℃5秒鐘，4℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中TRF1、TRF2、tankyrase、hTERT、突變型p53和β-actin的基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物序列如下：TRF1上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；TRF2上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；tankyrase上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；hTERT上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；突變型p53上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；β-actin上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，cDNA模板2μl，ddH?O補足至25μl。PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3分鐘，使模板DNA完全解鏈；然后進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈解鏈；58℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30秒，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3'端開始延伸，合成新的DNA鏈。最后72℃延伸5分鐘，使所有的PCR產(chǎn)物都能充分延伸。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在120V的電壓下電泳30分鐘。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照和分析。4.3結(jié)果分析與討論半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，在干擾組細(xì)胞中，TRF1基因的表達(dá)水平較親本細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞明顯升高，其擴(kuò)增條帶亮度顯著增強。通過凝膠圖像分析軟件對條帶灰度值進(jìn)行分析，計算TRF1與β-actin灰度值的比值，結(jié)果顯示干擾組TRF1的相對表達(dá)量為[X1]，而親本細(xì)胞組為[X2]，陰性對照細(xì)胞組為[X3]，干擾組與親本細(xì)胞組、陰性對照細(xì)胞組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。TRF2基因的表達(dá)水平在干擾組細(xì)胞中也呈現(xiàn)出升高的趨勢，干擾組TRF2的相對表達(dá)量為[X4]，親本細(xì)胞組為[X5]，陰性對照細(xì)胞組為[X6]，差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Tankyrase基因的表達(dá)水平在干擾組細(xì)胞中明顯降低，其擴(kuò)增條帶亮度減弱。干擾組tankyrase的相對表達(dá)量為[X7]，親本細(xì)胞組為[X8]，陰性對照細(xì)胞組為[X9]，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，干擾組與親本細(xì)胞組、陰性對照細(xì)胞組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。hTERT基因的表達(dá)水平在干擾組細(xì)胞中顯著下降，干擾組hTERT的相對表達(dá)量為[X10]，親本細(xì)胞組為[X11]，陰性對照細(xì)胞組為[X12]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對于突變型p53基因，其表達(dá)水平在干擾組細(xì)胞中明顯降低，干擾組突變型p53的相對表達(dá)量為[X13]，親本細(xì)胞組為[X14]，陰性對照細(xì)胞組為[X15]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。hPOT1表達(dá)抑制導(dǎo)致TRF1和TRF2表達(dá)升高，可能是細(xì)胞對端粒穩(wěn)定性受到破壞的一種代償性反應(yīng)。當(dāng)hPOT1表達(dá)被抑制后，端粒的保護(hù)機(jī)制受損，細(xì)胞為了維持端粒的結(jié)構(gòu)和功能，上調(diào)TRF1和TRF2的表達(dá)，以增強對端粒的保護(hù)作用。Tankyrase表達(dá)降低可能與hPOT1抑制后，端粒酶活性受到抑制有關(guān)，因為tankyrase通過調(diào)節(jié)TRF1與端粒的結(jié)合，影響端粒酶對端粒的作用，tankyrase表達(dá)減少可能導(dǎo)致端粒酶無法正常發(fā)揮作用，從而影響端粒長度的維持。hTERT表達(dá)下降進(jìn)一步證實了hPOT1抑制對端粒酶活性的抑制作用，hTERT是端粒酶的關(guān)鍵催化亞基，其表達(dá)降低會導(dǎo)致端粒酶活性降低，進(jìn)而使端粒長度無法維持，細(xì)胞增殖能力受到抑制。突變型p53表達(dá)降低可能與hPOT1抑制后，細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制被激活有關(guān)，突變型p53失去了正常的腫瘤抑制功能，反而可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。當(dāng)hPOT1表達(dá)被抑制，端粒縮短，細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷增加，可能會促使突變型p53的降解，從而降低其表達(dá)水平。這些基因表達(dá)水平的改變相互關(guān)聯(lián)，共同影響著人胃癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，進(jìn)一步揭示了hPOT1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用機(jī)制。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過RNA干擾技術(shù)成功抑制了人胃癌細(xì)胞BGC-823中hPOT1基因的表達(dá)，并深入探究了其對細(xì)胞生物學(xué)特性及相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，抑制hPOT1表達(dá)后，人胃癌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生顯著改變，細(xì)胞大小不一，多核巨細(xì)胞增多，