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會計學(xué)1課題(kètí)分解纖維素的微生物的分離第一頁,共39頁。植物的根、莖、葉等器官中都含有(hányǒu)大量的纖維素,麻、棉花、麥稈、稻草、甘蔗渣等,都是纖維素的豐富來源。一般木材中,纖維素占40~50%。麻棉花第1頁/共39頁第二頁,共39頁。植物纖維素第2頁/共39頁第三頁,共39頁。纖維素是一種重要的碳水化合物,土壤(tǔrǎng)中的某些微生物能將其分解利用。纖維素分解(fēnjiě)細(xì)菌第3頁/共39頁第四頁,共39頁。這些微生物之所以能夠?qū)⒗w維素分解利用(lìyòng),是因?yàn)樗麄兡軌虍a(chǎn)生纖維素酶。為了能更好的應(yīng)用這些(zhèxiē)微生物造福人類,我們首先要將他們從土壤環(huán)境中種類眾多的微生物中分離出來。第4頁/共39頁第五頁,共39頁。我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了怎樣(zěnyàng)從土壤中分離分解尿素的細(xì)菌,你能自己動手設(shè)計從土壤中分離分解纖維素微生物的方法嗎?想一想第5頁/共39頁第六頁,共39頁。課題3分解(fēnjiě)纖維素的微生物的分離專題2微生物的培養(yǎng)(péiyǎng)與應(yīng)用第6頁/共39頁第七頁,共39頁。從土壤中分離(fēnlí)分解維生素的微生物。重點(diǎn)與難點(diǎn)第7頁/共39頁第八頁,共39頁。一、基礎(chǔ)知識(一)纖維素與纖維素酶1、纖維素(cellulose)組成(zǔchénɡ):纖維素是由葡萄糖組成(zǔchénɡ)的大分子多糖。第8頁/共39頁第九頁,共39頁。纖維素結(jié)構(gòu)式淀粉結(jié)構(gòu)式第9頁/共39頁第十頁,共39頁。分布:纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一類多糖(duōtánɡ),占植物界碳含量的50%以上。棉花中纖維素的含量接近100%,是最純的天然纖維素來源。第10頁/共39頁第十一頁,共39頁。作用:纖維素在造紙業(yè)中大量使用,是重要的造紙原料。纖維素可以(kěyǐ)制成甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、微晶纖維素等衍生物。食物中的纖維素(即膳食纖維)對人體的健康也有著重要的作用。第11頁/共39頁第十二頁,共39頁。纖維素纖維二糖C1酶、Cx酶2、纖維素酶纖維素酶是一種(yīzhǒnɡ)復(fù)合酶組成纖維素酶包括三種(sānzhǒnɡ)組成:外切酶(C1酶)、內(nèi)切酶(Cx酶)葡萄糖苷酶纖維二糖葡萄糖葡萄糖苷酶第12頁/共39頁第十三頁,共39頁。作用:內(nèi)切酶作用于無定形的纖維(xiānwéi)素區(qū)域,使纖維(xiānwéi)素斷裂成片段;外切酶作用于纖維(xiānwéi)素的結(jié)晶區(qū)域或小片段纖維(xiānwéi)素,產(chǎn)生纖維(xiānwéi)二糖;纖維(xiānwéi)二糖再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。葡萄糖苷酶內(nèi)切酶外切酶內(nèi)切酶葡萄糖第13頁/共39頁第十四頁,共39頁。(二)纖維素分解(fēnjiě)菌的篩選1、剛果紅染色法在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅,在培養(yǎng)基表面生長的纖維素分解菌周圍會產(chǎn)生以菌落(jūnluò)為中心透明圈。纖維素分解細(xì)菌在剛果紅板上形成透明圈第14頁/共39頁第十五頁,共39頁。方法(fāngfǎ)一:先培養(yǎng)微生物,再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn):這樣(zhèyàng)顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。缺點(diǎn):操作繁瑣,加入剛果紅溶液會使菌落(jūnluò)之間發(fā)生混雜。第15頁/共39頁第十六頁,共39頁。方法(fāngfǎ)二:在倒平板時加入剛果紅。優(yōu)點(diǎn):操作簡便(jiǎnbiàn),不存在菌落混雜問題。缺點(diǎn)1:由于在纖維素粉和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì),可以(kěyǐ)使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。缺點(diǎn)2:有些微生物具有降解色素的能力,他們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅而形成明顯的透明圈,與纖維素分解菌不易區(qū)分。第16頁/共39頁第十七頁,共39頁。2、剛果紅染色法的原理(yuánlǐ)剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物,而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生此反應(yīng)。當(dāng)在含有纖維素的培養(yǎng)集中加入剛果紅時,剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后,剛果紅——纖維素的復(fù)合物就無法形成,培養(yǎng)基中會出現(xiàn)(chūxiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。第17頁/共39頁第十八頁,共39頁。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋分離分解纖維素微生物實(shí)驗(yàn)流程示意圖挑選產(chǎn)生透明圈的菌落第18頁/共39頁第十九頁,共39頁。討論(tǎolùn)本實(shí)驗(yàn)的流程與課題(kètí)2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同?答:課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上,直接分離得到菌落(jūnluò)。本實(shí)驗(yàn)通過選擇培養(yǎng),使纖維素分解菌得到繁殖后,再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。第19頁/共39頁第二十頁,共39頁。具體(jùtǐ)操作步驟:1、土樣采集方法與課題2類似。土樣采集要在富含纖維素的環(huán)境中進(jìn)行,如果找不到適合的環(huán)境,可以(kěyǐ)將濾紙埋在土壤中,過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。第20頁/共39頁第二十一頁,共39頁。思考為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找(xúnzhǎo)纖維素分解菌?答:由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系,在富含纖維素的環(huán)境中,纖維素分解菌的含量相對(xiāngduì)提高,因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。第21頁/共39頁第二十二頁,共39頁。思考將濾紙埋在土壤(tǔrǎng)中有什么作用?你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤(tǔrǎng)多深?答:將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集,實(shí)際上是人工設(shè)置(shèzhì)纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm的腐殖土壤中。第22頁/共39頁第二十三頁,共39頁。2、選擇培養(yǎng)稱取土樣20g,在無菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基的搖瓶中。30℃震蕩培養(yǎng)1-2天,至培養(yǎng)基變渾濁。進(jìn)行(jìnxíng)梯度稀釋和涂布平板。第23頁/共39頁第二十四頁,共39頁。纖維素粉5.0gNaNO31.0gKH2PO40.9gNa2HPO4·7H2O1.2gMgSO4·7H200.5gKCl0.5g水解酪素0.5g酵母膏0.5g蒸餾水1000mL纖維素分解菌的選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)基配方第24頁/共39頁第二十五頁,共39頁。鑒別纖維素分解(fēnjiě)菌的培養(yǎng)基配方CMC-Na5-10gKH2PO40.25g瓊脂15g土豆汁100mL酵母膏0.5g蒸餾水1000mL第25頁/共39頁第二十六頁,共39頁。3、剛果紅染色法分離纖維素分解菌將滅菌后的固體培養(yǎng)(péiyǎng)基熔化,按無菌操作要求,在無菌培養(yǎng)(péiyǎng)皿中倒入15-20mL培養(yǎng)(péiyǎng)基,凝固后待用。將選擇培養(yǎng)(péiyǎng)后的培養(yǎng)(péiyǎng)基進(jìn)行梯度稀釋至106。將稀釋好的菌懸液涂布在培養(yǎng)(péiyǎng)基上,進(jìn)行培養(yǎng)(péiyǎng)至有菌落長出。同時設(shè)置對照。第26頁/共39頁第二十七頁,共39頁。三、操作(cāozuò)提示1、復(fù)習(xí)(fùxí)微生物技術(shù)a培養(yǎng)基的配制(pèizhì)b無菌操作技術(shù)c稀釋涂布平板法d選擇培養(yǎng)基的作用e土壤取樣第27頁/共39頁第二十八頁,共39頁。2、選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)的操作方法土樣選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)基培養(yǎng)(péiyǎng)吸取部分培養(yǎng)液新鮮的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)稀釋涂布第28頁/共39頁第二十九頁,共39頁。想一想為什么選擇(xuǎnzé)培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物?答:在選擇培養(yǎng)(péiyǎng)條件下,可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖,而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制,因此可以起到“濃縮”的作用。第29頁/共39頁第三十頁,共39頁。視頻(shìpín)一:分解(fēnjiě)纖維素的微生物的分離1第30頁/共39頁第三十一頁,共39頁。視頻(shìpín)二:分解(fēnjiě)纖維素的微生物的分離2第31頁/共39頁第三十二頁,共39頁。視頻(shìpín)三:分解(fēnjiě)纖維素的微生物的分離3第32頁/共39頁第三十三頁,共39頁。四、結(jié)果(jiēguǒ)分析與評價1、培養(yǎng)基的制作(zhìzuò)是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落?對照的培養(yǎng)(péiyǎng)基在培養(yǎng)(péiyǎng)過程中沒有菌落長出說明培養(yǎng)(péiyǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落,則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。第33頁/共39頁第三十四頁,共39頁。2、分離的結(jié)果是否(shìfǒu)一致?由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量,因此最容易分離得到(dédào)的是細(xì)菌。由于所取土樣的環(huán)境不同,可能得到(dédào)真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。第34頁/共39頁第三十五頁,共39頁。五、課題(kètí)延伸纖維素酶發(fā)酵(fājiào)方法:液體(yètǐ)發(fā)酵固體發(fā)酵纖維素酶測定方法:
對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量測定第35頁/共39頁第三十六頁,共39頁。基礎(chǔ)知識實(shí)驗(yàn)設(shè)計纖維素組成(zǔchénɡ)纖維素酶操作(cāozuò)提示復(fù)習(xí)(fùxí)微生物技術(shù)分布組成作用剛果紅法作用實(shí)驗(yàn)流程圖纖維素酶測定方法選擇培養(yǎng)的操作方法分解
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