高效液相色譜儀操作規(guī)程詳解1.引言高效液相色譜（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）是現(xiàn)代分析化學中分離效率高、靈敏度強、應用范圍廣的核心技術之一，廣泛用于制藥（藥物成分定性定量）、環(huán)保（污染物檢測）、食品（添加劑分析）、化工（中間體純度驗證）等領域。其原理是通過流動相攜帶樣品流經固定相色譜柱，利用組分在兩相間的分配系數差異實現(xiàn)分離，再通過檢測器將組分信號轉換為可量化的色譜圖。規(guī)范的操作規(guī)程是保證HPLC分析數據準確性、重復性和儀器壽命的關鍵。本文結合實驗室實際經驗，從“基礎認知→操作準備→流程執(zhí)行→維護保養(yǎng)”全鏈條拆解HPLC操作規(guī)程，兼顧專業(yè)性與實用性，為分析人員提供可落地的指導。2.HPLC核心組件與工作原理在操作前，需明確HPLC的核心組件及邏輯關系，避免“盲目操作”：輸液系統(tǒng)：由高壓泵（如往復式柱塞泵）組成，負責以恒定流速（0.1-5mL/min）輸送流動相，保證流動相的穩(wěn)定性（壓力波動≤1%）。進樣系統(tǒng)：包括手動進樣器（如7725i）或自動進樣器，將預處理后的樣品（1-100μL）注入流動相，要求“無死體積、無交叉污染”。分離系統(tǒng)：核心是色譜柱（如反相C18柱、正相硅膠柱），固定相（如C18鍵合硅膠）與流動相（如乙腈-水）的相互作用決定組分分離效果（保留時間、峰形）。檢測系統(tǒng)：常用檢測器包括紫外-可見（UV-Vis）、熒光（FLD）、示差折光（RI）、蒸發(fā)光散射（ELSD），其中UV-Vis是最常用的通用型檢測器（檢測波長____nm，適用于含共軛雙鍵的化合物）。數據處理系統(tǒng)：由工作站（如AgilentOpenLAB、WatersEmpower）組成，負責采集檢測器信號、繪制色譜圖、積分計算（保留時間\(t_R\)、峰面積\(A\)）、生成報告。3.操作前準備2.1實驗室環(huán)境檢查溫度：18-25℃（溫度波動≤2℃，避免柱溫變化導致保留時間漂移）；濕度：≤70%（高濕度易導致儀器電路故障、流動相吸潮變質）；通風：開啟通風櫥（處理有機流動相時，避免溶劑揮發(fā)對人體造成傷害）。2.2試劑與耗材確認流動相：選擇HPLC級溶劑（如甲醇、乙腈），避免使用分析純（含雜質會導致基線噪音大）；緩沖鹽（如磷酸二氫鉀）需用超純水（電阻率≥18.2MΩ·cm）配制，防止離子污染。濾膜：有機相（如甲醇、乙腈）用聚四氟乙烯（PTFE）濾膜（0.22μm或0.45μm）；水相/緩沖鹽用尼龍（Nylon）濾膜（0.22μm）；避免用錯濾膜（如有機相用尼龍膜會導致膜溶解，污染流動相）。色譜柱：根據樣品性質選擇固定相（如反相C18柱適用于極性小的有機物；正相硅膠柱適用于極性大的化合物）；檢查柱效（用標準品如萘測試，理論塔板數\(N\)≥5000/米），若柱效下降需提前沖洗或更換。其他耗材：進樣針（10μL/25μL，需匹配進樣器規(guī)格）、流動相瓶（玻璃或PE材質，避免塑料瓶溶出雜質）、濾頭（泵入口濾頭，0.22μm，防止流動相中的顆粒物進入泵體）。2.3儀器狀態(tài)檢查泵：檢查流動相瓶中溶劑是否充足（≥1/3體積，避免泵吸空）；泵入口管是否浸沒在溶劑中；壓力傳感器是否歸零（開機前需確認）。檢測器：UV檢測器需檢查氘燈壽命（一般≥1000小時，若能量不足需更換）；流通池是否干凈（無殘留樣品或緩沖鹽）。工作站：確認計算機與儀器的連接（如USB、以太網）正常；色譜方法模板（如“反相C18分析方法”）是否保存完整。3.詳細操作流程3.1流動相配制與處理配制：根據方法要求精確量取溶劑（如乙腈:水=60:40，用移液管或量筒量?。蝗艉彌_鹽（如0.1%磷酸），需先將鹽完全溶解于水相，再與有機相混合（避免鹽析出）。過濾：用真空抽濾裝置過濾流動相（濾膜直徑50mm），去除顆粒物（防止堵塞泵入口濾頭或色譜柱篩板）。脫氣：采用超聲脫氣（將流動相瓶置于超聲清洗機中，功率____W，超聲10-15分鐘）或在線脫氣（通過儀器內置的脫氣裝置，持續(xù)去除溶解氧）；未脫氣的流動相會導致泵壓力波動、峰形分裂（如基線出現(xiàn)“毛刺”）。3.2儀器開機與初始化開機順序：先開泵→再開檢測器→最后開工作站（避免檢測器在無流動相時“干燒”，損壞流通池）。泵初始化：1.將泵入口管插入流動相瓶，開啟泵電源；2.選擇“Purge”功能（流速5-10mL/min，時間2-3分鐘），排除泵頭及管道中的氣泡（觀察出口管，無連續(xù)氣泡流出即可停止）；3.設置流動相流速（如1mL/min）、比例（如乙腈:水=60:40），啟動泵運行，待壓力穩(wěn)定（波動≤1%）。檢測器初始化：1.開啟檢測器電源，等待自檢完成（約2-3分鐘）；2.設置檢測波長（如254nm，根據樣品最大吸收波長調整）、帶寬（如4nm，提高信噪比）；3.啟動檢測器“平衡”模式，讓流動相沖洗流通池（約10-15分鐘，直到基線平穩(wěn)）。3.3色譜柱平衡安裝色譜柱：將色譜柱入口與泵出口連接（順時針旋緊，避免漏液），出口與檢測器入口連接（注意方向：色譜柱上的“IN”標記朝向泵，“OUT”朝向檢測器）；平衡色譜柱：用流動相以1mL/min流速沖洗色譜柱（反相柱需沖洗30-60分鐘，正相柱需沖洗60-90分鐘），直到基線平穩(wěn)（UV檢測器基線噪音≤0.01mAU）、壓力穩(wěn)定（波動≤2bar）。*注：新色譜柱需用純甲醇/乙腈沖洗（如反相C18柱用甲醇沖洗20倍柱體積），去除柱中保存溶劑（如乙醇）。*3.4樣品制備與進樣樣品預處理：1.溶解：用流動相或與流動相兼容的溶劑（如甲醇）溶解樣品（避免用強極性溶劑如DMSO，導致峰形畸變）；2.過濾：用0.22μm針式濾器過濾樣品（去除顆粒物，防止堵塞進樣器或色譜柱）；3.濃度調整：根據檢測器靈敏度調整樣品濃度（如UV檢測器，濃度一般為0.1-1mg/mL，避免“過載”導致峰形前沿）。進樣操作：手動進樣（以7725i進樣器為例）：1.將進樣針插入樣品瓶，緩慢吸取樣品（體積為進樣量的2-3倍，如進樣10μL，吸樣20-30μL）；2.排出針內氣泡（將針朝上，輕彈針筒，推動活塞至無氣泡）；3.將進樣器手柄扳至“Load”位置，插入進樣針（到底），推動活塞注入樣品；4.快速將手柄扳至“Inject”位置（動作需連貫，避免樣品擴散），同時點擊工作站“開始運行”。自動進樣：1.將樣品瓶放入進樣盤（按順序編號）；2.在工作站中設置進樣量（如10μL）、樣品位置（如“Vial1”）；3.啟動“自動進樣”程序，儀器會自動完成吸樣、注入、清洗針頭等步驟。3.5方法設置與運行方法參數：在工作站中創(chuàng)建或調用方法，設置以下關鍵參數：流動相比例（如A相：乙腈，B相：水，比例60:40）；流速（如1mL/min，根據色譜柱內徑調整：4.6mm內徑柱常用1mL/min，2.1mm內徑柱常用0.25mL/min）；柱溫（如30℃，通過柱溫箱控制，保持恒定）；檢測波長（如254nm，根據樣品的紫外吸收光譜確定）；運行時間（如20分鐘，確保所有組分都能流出柱子）；梯度洗脫（若需分離復雜樣品，設置流動相比例隨時間變化，如0-10分鐘乙腈從60%升至80%）。啟動運行：確認所有參數設置正確后，點擊工作站“開始運行”，儀器會自動執(zhí)行以下步驟：1.泵按照設定比例輸送流動相；2.樣品通過進樣器注入流動相；3.樣品流經色譜柱，組分分離；4.檢測器檢測組分信號，傳輸至工作站生成色譜圖。3.6數據采集與處理色譜圖觀察：運行結束后，工作站會顯示色譜圖（橫坐標為保留時間\(t_R\)，縱坐標為信號強度（mAU））；需檢查：峰形：是否對稱（拖尾因子\(T\)≤1.5，前沿因子\(F\)≤1.2）；分離度：相鄰峰的分離度\(R\)≥1.5（達到基線分離）；基線：是否平穩(wěn)（噪音≤0.01mAU，漂移≤0.05mAU/分鐘）。數據計算：1.積分：用工作站的“自動積分”功能（或手動調整積分參數，如斜率、峰寬），獲取各峰的保留時間（\(t_R\)）、峰面積（\(A\)）、峰高（\(H\)）；2.定性分析：通過\(t_R\)與標準品對比，確定樣品中的組分（如“峰1的\(t_R=5.2\)分鐘，與標準品阿司匹林的\(t_R\)一致”）；3.定量分析：采用外標法（最常用），用標準品繪制校準曲線（\(A\)vs濃度\(C\)），代入樣品峰面積計算濃度（\(C_{樣品}=A_{樣品}×C_{標準}/A_{標準}\)）。報告生成：根據實驗室要求，生成包含色譜圖、積分結果、定性定量結論的報告（如“樣品中阿司匹林的含量為98.5%，符合藥典標準”）。3.7儀器關機與清理關機順序：先停泵→再關檢測器→最后關工作站（避免檢測器在無流動相時持續(xù)加熱）。流動相沖洗：1.若流動相中含緩沖鹽（如磷酸二氫鉀），需用10%甲醇-水（或乙腈-水）沖洗泵及色譜柱（流速1mL/min，時間30分鐘），去除殘留的鹽（防止鹽析出堵塞柱子）；2.若為反相色譜柱，最后用純甲醇（或乙腈）沖洗（流速1mL/min，時間30分鐘），將柱子保存在甲醇中（避免柱子干燥，導致固定相收縮）。進樣器清理：手動進樣器：用甲醇沖洗針筒（吸樣-排出，重復5次），然后將針筒置于甲醇中浸泡（避免樣品殘留）；自動進樣器：在工作站中設置“清洗程序”（用甲醇沖洗針頭等部件，時間5-10分鐘）。環(huán)境整理：關閉通風櫥，清理實驗臺（避免溶劑殘留），記錄儀器使用情況（如流動相更換時間、色譜柱使用次數）。4.關鍵注意事項4.1流動相相關避免使用揮發(fā)性強的溶劑（如乙醚），防止泵壓力波動；流動相需現(xiàn)用現(xiàn)配（避免放置時間過長，導致溶劑揮發(fā)或微生物滋生）；若流動相分層（如正相色譜的己烷-乙醇），需搖勻后再使用。4.2色譜柱保護避免高pH值（反相柱pH范圍一般為2-8，超過范圍會導致固定相水解）；避免高流速（如4.6mm內徑柱流速超過2mL/min，會導致柱壓過高，損壞柱子）；使用預柱（如C18預柱，0.5cm×4.6mm），攔截樣品中的雜質（延長色譜柱壽命）。4.3樣品相關避免樣品過載（進樣量超過色譜柱容量，導致峰形前沿或分裂）；避免樣品溶劑與流動相不兼容（如樣品用DMSO溶解，而流動相是乙腈-水，會導致峰形畸變）；若樣品含強吸附性組分（如色素），需提前用固相萃取（SPE）處理（去除雜質，避免污染柱子）。4.4檢測器相關UV檢測器：避免波長設置在溶劑的截止波長以下（如甲醇的截止波長為205nm，若設置200nm，會導致基線噪音大）；RI檢測器：需保持流動相流速恒定（流速變化會導致基線漂移），且不能用于梯度洗脫（因為RI檢測器對流動相組成變化敏感）。5.常見問題與解決5.1壓力異常（過高/過低）壓力過高：原因：色譜柱堵塞（如樣品中的顆粒物堵塞篩板）、泵入口濾頭堵塞（流動相中的顆粒物）、管道彎折（泵出口管被擠壓）；解決：①拆下鍋入口濾頭，用甲醇超聲清洗（10分鐘）；②若柱壓仍高，用低流速（0.5mL/min）沖洗色譜柱（用甲醇-水）；③若無效，更換色譜柱篩板（或柱子）。壓力過低：原因：泵入口管吸空（流動相瓶中溶劑不足）、管道泄漏（如接頭松動）、泵頭密封件損壞（泵無法加壓）；解決：①檢查流動相瓶中溶劑，補充至1/3以上；②擰緊接頭（用扳手輕輕旋緊，避免用力過大損壞螺紋）；③若仍泄漏，更換泵頭密封件。5.2峰形異常（拖尾/前沿/分裂）峰拖尾：原因：色譜柱污染（固定相表面有殘留樣品）、流動相pH不合適（如堿性樣品在酸性流動相中拖尾）、進樣量過大；解決：①用強溶劑（如甲醇-乙腈）沖洗色譜柱（流速1mL/min，時間60分鐘）；②調整流動相pH（如堿性樣品用pH=8的緩沖鹽）；③稀釋樣品（減少進樣量）。峰前沿：原因：樣品過載（進樣量過大）、流動相極性過強（如反相色譜中甲醇比例過高，導致樣品保留時間過短）；解決：①稀釋樣品（進樣量減少至原來的1/2）；②降低流動相極性（如增加乙腈比例，從60%升至70%）。峰分裂：原因：樣品中含兩種或以上組分（未分離）、流動相中有氣泡（導致峰形分裂）、進樣量過大；解決：①優(yōu)化色譜條件（如調整流動相比例、增加柱長）；②重新脫氣（流動相）；③稀釋樣品。5.3基線異常（噪音大/漂移）基線噪音大：原因：流動相不純（含雜質）、檢測器污染（流通池中有殘留樣品）、氘燈壽命到期（能量不足）；解決：①更換HPLC級流動相；②拆洗檢測器流通池（用甲醇超聲清洗10分鐘）；③更換氘燈?；€漂移：原因：流動相未平衡（如梯度洗脫初始階段）、柱溫變化（實驗室溫度波動大）、檢測器未穩(wěn)定（剛開機時）；解決：①延長流動相平衡時間（如60分鐘）；②開啟柱溫箱（保持柱溫恒定）；③等待檢測器穩(wěn)定（如30分鐘）。5.4保留時間變化（重復性差）原因：流動相比例變化（如甲醇揮發(fā)，導致比例升高）、流速變化（泵壓力波動）、柱溫變化（實驗室溫度波動）；解決：①密封流動相瓶（用parafilm包裹）；②檢查泵流速（用量筒量取10分鐘內的流動相體積，誤差≤2%）；③開啟柱溫箱（保持柱溫恒定）。5.維護與保養(yǎng)5.1日常維護（每日）檢查流動相瓶中溶劑是否充足；記錄泵壓力（如“今日泵壓力為120bar，與昨日一致”）；清理進樣器（手動/自動）；關閉儀器后，用甲醇沖洗色譜柱。5.2定期維護（每月/季度）每月：檢查泵入口濾頭（若堵塞，用甲醇超聲清洗）；檢查管道接頭（是否松動）；季度：清洗檢測器流通池（用甲醇超聲清洗10分鐘）；校準泵流速（用量筒量取流動相體積，誤差≤2%）；半年：更換色譜柱預柱（若預柱壓力升高）；檢查氘燈壽命（若能量不足，更換）。5.3長期不用維護（超過1個月）將色譜柱從儀器上拆下，用純甲醇沖洗（流速1mL/min，時間30分鐘），然后用密封帽密封柱子兩端（避免甲醇揮發(fā)）；將泵入口管從流動相瓶中取出，用甲醇沖洗（流速5