兩性離子多肽修飾GLP-1衍生物：制備工藝與生物活性的深度探究一、引言1.1研究背景與意義糖尿病作為一種全球性的公共衛(wèi)生問題，正以驚人的速度蔓延。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將攀升至7.83億。其中，Ⅱ型糖尿?。═2DM）占糖尿病患者總數(shù)的90%以上，其主要特征為胰島素抵抗和胰島素分泌不足。隨著生活方式的改變和老齡化社會(huì)的加劇，T2DM的發(fā)病率逐年上升，給患者的健康和生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重影響，也給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的T2DM治療藥物如二甲雙胍、磺脲類等，雖在一定程度上能夠控制血糖，但長期使用存在諸多局限性，如低血糖風(fēng)險(xiǎn)、體重增加、胃腸道不適等，且無法有效預(yù)防和控制糖尿病的并發(fā)癥。因此，開發(fā)新型、安全、有效的治療藥物成為T2DM治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是一種由腸道L細(xì)胞分泌的內(nèi)源性肽類激素，具有葡萄糖濃度依賴性降糖效應(yīng)。當(dāng)血糖升高時(shí)，GLP-1被釋放進(jìn)入血液，與胰島β細(xì)胞表面的GLP-1受體結(jié)合，通過激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，進(jìn)而促進(jìn)胰島素的合成和分泌；同時(shí)，GLP-1還能抑制胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素，減少肝糖原輸出，從而降低血糖水平。此外，GLP-1還可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制食欲，減少食物攝入；延緩胃排空，增加飽腹感，進(jìn)一步有助于控制血糖和減輕體重。更為重要的是，GLP-1還具有保護(hù)胰島β細(xì)胞、促進(jìn)其增殖和分化、抑制細(xì)胞凋亡的作用，能夠改善胰島β細(xì)胞功能，延緩T2DM的進(jìn)展。然而，天然的GLP-1在體內(nèi)的半衰期極短，僅為1-2分鐘，主要原因是其極易被體內(nèi)廣泛存在的二肽基肽酶-4（DPP-4）迅速降解。為了克服這一局限性，研究人員通過對(duì)GLP-1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，開發(fā)出了GLP-1衍生物。這些衍生物在保留GLP-1生物活性的同時(shí)，顯著延長了半衰期，提高了藥物的療效和患者的依從性。目前，已有多種GLP-1衍生物類藥物如利拉魯肽、司美格魯肽、度拉糖肽等被批準(zhǔn)上市，并在臨床治療中取得了良好的效果。盡管現(xiàn)有的GLP-1衍生物在T2DM治療中展現(xiàn)出了諸多優(yōu)勢(shì)，但仍存在一些不足之處。例如，部分藥物可能會(huì)引起胃腸道不適、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)；長期使用還可能導(dǎo)致免疫原性問題，影響藥物的療效和安全性。此外，一些GLP-1衍生物的藥代動(dòng)力學(xué)特性仍有待進(jìn)一步優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)更平穩(wěn)的血藥濃度和更長效的治療效果。兩性離子多肽是一類同時(shí)含有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)的特殊多肽，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它許多優(yōu)異的性能。兩性離子多肽具有強(qiáng)烈的水合能力，能夠在水溶液中形成高度水合的外殼，從而有效抵抗蛋白質(zhì)的非特異性吸附和酶的降解。將兩性離子多肽修飾到GLP-1衍生物上，有望利用兩性離子多肽的這些特性，改善GLP-1衍生物的藥代動(dòng)力學(xué)性能，提高其穩(wěn)定性和生物利用度。兩性離子多肽還具有良好的生物相容性和低免疫原性，能夠減少藥物在體內(nèi)引起的免疫反應(yīng)，降低不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，開展兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物的制備及其生物活性研究，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在通過將兩性離子多肽修飾到GLP-1衍生物上，制備出一種新型的GLP-1衍生物，并對(duì)其生物活性進(jìn)行系統(tǒng)研究。具體而言，本研究將首先優(yōu)化兩性離子多肽修飾GLP-1衍生物的制備工藝，提高修飾效率和產(chǎn)物純度；然后，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，深入研究修飾后的GLP-1衍生物的降糖效果、對(duì)胰島β細(xì)胞功能的保護(hù)作用、對(duì)食欲和胃排空的影響以及免疫原性等生物活性；最后，初步探討其作用機(jī)制，為開發(fā)新一代高效、低毒的T2DM治療藥物提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.2GLP-1與Ⅱ型糖尿病1.2.1Ⅱ型糖尿病概述Ⅱ型糖尿病（Type2DiabetesMellitus，T2DM）作為糖尿病中最為常見的類型，占糖尿病患者總數(shù)的90%以上。其發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。從遺傳角度來看，多個(gè)基因位點(diǎn)的突變與T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，這些基因涉及胰島素分泌、胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)與血糖調(diào)節(jié)密切相關(guān)的過程。環(huán)境因素在T2DM的發(fā)生發(fā)展中同樣起著關(guān)鍵作用，肥胖尤其是中心性肥胖，被認(rèn)為是T2DM最重要的環(huán)境危險(xiǎn)因素之一。過多的脂肪堆積，特別是腹部脂肪的增加，會(huì)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分泌一系列脂肪因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些因子會(huì)引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，干擾胰島素的正常信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。不良的生活方式，如高熱量、高脂肪、高糖的飲食習(xí)慣，運(yùn)動(dòng)量不足，長期的精神壓力等，也會(huì)進(jìn)一步加重胰島素抵抗，促使胰島β細(xì)胞功能逐漸衰退，最終導(dǎo)致T2DM的發(fā)生。T2DM患者的癥狀表現(xiàn)多樣且具有一定的隱匿性。在疾病早期，許多患者可能沒有明顯的癥狀，僅在體檢或因其他疾病就診時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)血糖升高。隨著病情的進(jìn)展，患者會(huì)逐漸出現(xiàn)典型的“三多一少”癥狀，即多飲、多食、多尿和體重減輕。多飲是由于高血糖導(dǎo)致血漿滲透壓升高，刺激下丘腦的口渴中樞，使患者產(chǎn)生口渴感，進(jìn)而增加飲水量；多食則是因?yàn)橐葝u素抵抗使得細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和利用減少，機(jī)體處于能量缺乏狀態(tài)，刺激食欲中樞，導(dǎo)致患者食量增加；多尿是由于血糖升高超過腎糖閾，葡萄糖從尿液中排出，同時(shí)帶走大量水分，形成滲透性利尿；體重減輕則是由于機(jī)體無法有效利用葡萄糖供能，轉(zhuǎn)而分解脂肪和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致體重下降。除了這些典型癥狀外，T2DM患者還可能出現(xiàn)乏力、皮膚瘙癢、視力模糊、手腳麻木或刺痛等非特異性癥狀。乏力是由于能量代謝紊亂，肌肉無法獲得足夠的能量供應(yīng)；皮膚瘙癢可能與高血糖刺激神經(jīng)末梢以及皮膚干燥有關(guān)；視力模糊是因?yàn)楦哐且鹁铙w滲透壓改變，導(dǎo)致晶狀體變形；手腳麻木或刺痛則是糖尿病神經(jīng)病變的常見表現(xiàn)，主要是由于長期高血糖損傷了神經(jīng)纖維。T2DM的流行現(xiàn)狀在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出嚴(yán)峻的態(tài)勢(shì)。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，T2DM的發(fā)病率在過去幾十年中急劇上升。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2021年全球T2DM患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將進(jìn)一步攀升至7.83億。在我國，T2DM的流行情況也不容樂觀。根據(jù)中國慢性病及其危險(xiǎn)因素監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，我國成人T2DM的患病率已從1980年的0.67%飆升至2013年的10.4%，患者人數(shù)超過1.14億，成為全球T2DM患者人數(shù)最多的國家。T2DM不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥，如心血管疾病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變等，這些并發(fā)癥是導(dǎo)致患者致殘、致死的主要原因。心血管疾病是T2DM患者最常見的并發(fā)癥之一，患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)比非糖尿病患者高出2-4倍，心肌梗死、腦卒中等心血管事件的發(fā)生率顯著增加；糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一，約30%-40%的T2DM患者會(huì)發(fā)展為糖尿病腎病，嚴(yán)重影響腎功能；糖尿病視網(wǎng)膜病變可導(dǎo)致視力下降、失明，是工作年齡人群失明的主要原因之一；糖尿病神經(jīng)病變則會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)手腳麻木、疼痛、感覺異常等癥狀，嚴(yán)重影響患者的日常生活。因此，T2DM已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，亟待有效的治療手段來控制病情的發(fā)展，降低并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。1.2.2GLP-1及其生理學(xué)作用GLP-1是一種由腸道L細(xì)胞分泌的內(nèi)源性肽類激素，屬于腸促胰素家族。它主要由腸道遠(yuǎn)端的回腸和結(jié)腸的L細(xì)胞在進(jìn)食后受到營養(yǎng)物質(zhì)，特別是碳水化合物和脂肪的刺激而分泌。GLP-1的前體是胰高血糖素原，在腸道內(nèi)，胰高血糖素原經(jīng)過一系列的酶切作用，最終生成具有生物活性的GLP-1。人體內(nèi)的GLP-1主要以兩種活性形式存在，即GLP-1（7-36）酰胺和GLP-1（7-37），其中GLP-1（7-36）酰胺是主要的活性形式，約占循環(huán)中GLP-1的80%以上。GLP-1是由30個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含多個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基，這些殘基對(duì)于GLP-1與受體的結(jié)合以及生物活性的發(fā)揮至關(guān)重要。研究表明，GLP-1的N端的組氨酸（His7）和甘氨酸（Gly10）殘基對(duì)于其與GLP-1受體的初始結(jié)合起著關(guān)鍵作用；而C端的苯丙氨酸（Phe28）和異亮氨酸（Ile29）殘基則參與了與受體的高親和力結(jié)合，穩(wěn)定了GLP-1與受體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。GLP-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲組成，這種結(jié)構(gòu)特征使其能夠與GLP-1受體特異性結(jié)合，并激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路。GLP-1在血糖調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著核心作用，其作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：首先，GLP-1能夠以葡萄糖濃度依賴性的方式促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素。當(dāng)血糖升高時(shí)，GLP-1與胰島β細(xì)胞表面的GLP-1受體結(jié)合，激活受體偶聯(lián)的G蛋白，進(jìn)而激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平升高。cAMP作為第二信使，激活蛋白激酶A（PKA），PKA通過磷酸化一系列關(guān)鍵的蛋白質(zhì)，如電壓依賴性鈣離子通道、胰島素分泌相關(guān)的囊泡蛋白等，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，觸發(fā)胰島素的胞吐釋放。而且，GLP-1還能促進(jìn)胰島素的生物合成，從胰島素基因轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)翻譯后修飾等多個(gè)步驟，皆受到GLP-1的正向調(diào)控，從而保證了胰島素的充足供應(yīng)。GLP-1可以抑制胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素。胰高血糖素是一種主要的升糖激素，其分泌增加會(huì)導(dǎo)致血糖升高。GLP-1對(duì)胰高血糖素分泌的抑制作用，既可以是直接作用于胰島α細(xì)胞表面的GLP-1受體，也可以通過間接途徑，即通過促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，胰島素以旁分泌的方式抑制α細(xì)胞分泌胰高血糖素。這種雙重抑制機(jī)制有效地減少了肝糖原輸出，降低了血糖水平。GLP-1能夠作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制食欲，減少食物攝入。GLP-1通過與下丘腦的特定神經(jīng)元上的GLP-1受體結(jié)合，激活相關(guān)的神經(jīng)信號(hào)通路，產(chǎn)生飽腹感，從而抑制食欲。GLP-1還能延緩胃排空，增加飽腹感，這主要是通過作用于胃腸道的GLP-1受體，抑制胃腸道的蠕動(dòng)和排空，使食物在胃內(nèi)停留時(shí)間延長，減少了葡萄糖的快速吸收，有助于維持血糖的平穩(wěn)。GLP-1還具有保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用，它可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖和分化，抑制細(xì)胞凋亡，從而增加胰島β細(xì)胞的數(shù)量和功能。研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1可以上調(diào)一些與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)的基因表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1、Bcl-2等，同時(shí)下調(diào)促凋亡基因如Bax的表達(dá)，從而保護(hù)胰島β細(xì)胞免受損傷，延緩T2DM的進(jìn)展。1.2.3GLP-1受體激動(dòng)劑的發(fā)展GLP-1受體激動(dòng)劑（GLP-1RA）的發(fā)展歷程是一部不斷創(chuàng)新和突破的歷史，為T2DM的治療帶來了革命性的變化。其發(fā)展可以追溯到20世紀(jì)80年代，隨著對(duì)GLP-1生理學(xué)作用的深入研究，人們逐漸認(rèn)識(shí)到GLP-1在血糖調(diào)節(jié)中的重要作用，但天然GLP-1的極短半衰期限制了其臨床應(yīng)用。為了解決這一問題，研究人員開始致力于開發(fā)GLP-1RA。2005年，首款短效GLP-1RA艾塞那肽（Exenatide）獲FDA批準(zhǔn)上市，拉開了GLP-1RA治療T2DM的序幕。艾塞那肽是從希拉毒蜥唾液中提取的一種多肽，其氨基酸序列與天然GLP-1有53%的同源性。它的半衰期約為3小時(shí)，需要一天兩次皮下注射。盡管艾塞那肽的出現(xiàn)為T2DM患者提供了一種新的治療選擇，但頻繁的注射給患者帶來了不便，也影響了患者的依從性。2009年，諾和諾德的利拉魯肽（Liraglutide）在歐美獲批治療T2DM，這是首個(gè)一天一次給藥的GLP-1RA注射液，標(biāo)志著GLP-1RA進(jìn)入了臨床應(yīng)用的新階段。利拉魯肽是通過對(duì)人GLP-1進(jìn)行脂肪酸鏈修飾（C16），使其能夠與白蛋白結(jié)合，從而延長了半衰期至12-14小時(shí)。利拉魯肽不僅改善了患者的用藥依從性，還在多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中證實(shí)了其良好的降糖效果和心血管保護(hù)作用。LEADER研究表明，利拉魯肽在降糖的同時(shí)，能夠顯著降低心血管疾病高危的T2DM患者的心血管死亡、非致死性心肌梗死或非致死性卒中的復(fù)合終點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)，為GLP-1RA在心血管保護(hù)方面的應(yīng)用提供了重要的臨床證據(jù)。2014年，禮來基于融合蛋白技術(shù)開發(fā)的首個(gè)一周一次給藥的GLP-1RA藥物度拉糖肽（Dulaglutide）獲批上市，進(jìn)一步推動(dòng)了GLP-1RA向長效化發(fā)展。度拉糖肽將GLP-1類似物與IgG4-Fc片段融合，利用Fc片段的長循環(huán)特性，使半衰期延長至5天，實(shí)現(xiàn)了每周一次注射。這種給藥方式極大地提高了患者的便利性和依從性，減少了注射次數(shù)帶來的痛苦和不便。REWIND研究顯示，度拉糖肽在降低心血管事件風(fēng)險(xiǎn)方面也具有顯著效果，為T2DM合并心血管疾病的患者提供了更有效的治療選擇。2017年，諾和諾德推出了重磅產(chǎn)品司美格魯肽（Semaglutide），這是迄今最成功的長效GLP-1RA產(chǎn)品之一。司美格魯肽采用了脂肪酸鏈修飾結(jié)合白蛋白結(jié)合技術(shù)，半衰期長達(dá)7天，支持每周一次注射或每日一次口服（首款口服GLP-1RA）。司美格魯肽在強(qiáng)效降糖和減重方面表現(xiàn)出色，其降糖效果顯著優(yōu)于前代藥物，糖化血紅蛋白（HbA1c）降幅可達(dá)1.5-2.0%，同時(shí)還能使患者體重下降15%以上。SUSTAIN和SELECT研究進(jìn)一步證實(shí)了司美格魯肽在降低心血管風(fēng)險(xiǎn)方面的益處，使其成為T2DM治療領(lǐng)域的明星藥物。2022年，禮來的替爾泊肽（Tirzepatide）獲批上市，這是全球首款GLP-1/GIP雙受體激動(dòng)劑，開創(chuàng)了GLP-1RA多靶點(diǎn)激動(dòng)的新時(shí)代。替爾泊肽同時(shí)激活GLP-1受體和葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽（GIP）受體，GIP能夠增強(qiáng)胰島素敏感性、促進(jìn)脂肪代謝，與GLP-1的作用協(xié)同發(fā)揮，實(shí)現(xiàn)了更強(qiáng)大的降糖和減重效果。SURPASS系列研究表明，替爾泊肽的降糖效果更為顯著，HbA1c降幅最高達(dá)2.3%；SURMOUNT-1研究顯示，其減重效果也十分突出，平均體重下降15-20%。替爾泊肽的上市為T2DM和肥胖癥的治療帶來了新的希望，被視為GLP-1RA的“下一代”產(chǎn)品。從GLP-1RA的發(fā)展歷程可以看出，其在降糖效果、給藥方式、心血管保護(hù)和減重等方面不斷取得突破，為T2DM患者提供了越來越多、越來越有效的治療選擇。隨著科技的不斷進(jìn)步和研究的深入，未來GLP-1RA有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮作用，為代謝性疾病的治療帶來更多的驚喜。1.2.4現(xiàn)有GLP-1類似物的局限性盡管現(xiàn)有GLP-1類似物在T2DM治療中取得了顯著成效，但仍存在一些不容忽視的局限性。免疫原性問題是部分GLP-1類似物面臨的挑戰(zhàn)之一。由于GLP-1類似物是外源性的多肽，人體免疫系統(tǒng)可能將其識(shí)別為外來異物，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。一些基于融合蛋白技術(shù)的GLP-1類似物，如度拉糖肽和阿必魯肽，因含有具有一定功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，更容易引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體。這些抗體可能會(huì)與GLP-1類似物結(jié)合，影響其與受體的結(jié)合能力，降低藥物的療效，甚至可能導(dǎo)致過敏等不良反應(yīng)，影響患者的治療效果和安全性。現(xiàn)有GLP-1類似物在血藥濃度維持方面仍有待優(yōu)化。雖然通過各種修飾技術(shù)延長了半衰期，但部分藥物在體內(nèi)的血藥濃度波動(dòng)較大，難以實(shí)現(xiàn)平穩(wěn)的藥物作用。以利拉魯肽為例，盡管其半衰期有所延長，但在一天的用藥過程中，血藥濃度仍會(huì)出現(xiàn)一定的波動(dòng)，這可能導(dǎo)致血糖控制效果不夠穩(wěn)定，增加了低血糖或高血糖的風(fēng)險(xiǎn)。一些長效GLP-1類似物雖然減少了給藥次數(shù)，但在注射初期可能會(huì)出現(xiàn)血藥濃度過高，而后期又可能出現(xiàn)血藥濃度不足的情況，影響藥物的持續(xù)療效。許多患者在使用GLP-1類似物時(shí)會(huì)出現(xiàn)胃腸道不適的癥狀，如惡心、嘔吐、腹瀉等。這是因?yàn)镚LP-1類似物在發(fā)揮作用時(shí)，會(huì)抑制胃腸道的蠕動(dòng)和排空，增加飽腹感，從而導(dǎo)致胃腸道不適。司美格魯肽在臨床應(yīng)用中，部分患者會(huì)出現(xiàn)明顯的惡心、嘔吐等癥狀，影響了患者的用藥依從性和生活質(zhì)量。這些胃腸道反應(yīng)通常在用藥初期較為明顯，隨著用藥時(shí)間的延長，部分患者的癥狀可能會(huì)有所緩解，但仍有一些患者因無法耐受而不得不停止用藥。部分GLP-1類似物還存在其他一些問題，如注射部位反應(yīng)、腎功能損害風(fēng)險(xiǎn)等。一些患者在注射GLP-1類似物后，會(huì)出現(xiàn)注射部位疼痛、紅腫、硬結(jié)等反應(yīng)，影響患者的注射體驗(yàn)和用藥積極性。對(duì)于一些腎功能不全的患者，使用某些GLP-1類似物時(shí)需要謹(jǐn)慎調(diào)整劑量，因?yàn)樗幬锏拇x和排泄可能會(huì)受到影響，增加了腎功能損害的風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，現(xiàn)有GLP-1類似物雖然在T2DM治療中具有重要作用，但這些局限性限制了其更廣泛的應(yīng)用和更好的治療效果，因此，開發(fā)新型、更優(yōu)化的GLP-1衍生物具有迫切的需求。1.3兩性離子多肽及其應(yīng)用1.3.1兩性離子多肽概述兩性離子多肽是一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的多肽，其分子中同時(shí)含有數(shù)量相等的正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)，這些電荷基團(tuán)在不同的pH環(huán)境下會(huì)發(fā)生解離或質(zhì)子化，從而使多肽呈現(xiàn)出獨(dú)特的兩性離子特性。從結(jié)構(gòu)組成上看，兩性離子多肽通常由帶正電荷的氨基酸（如精氨酸、賴氨酸等）和帶負(fù)電荷的氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸等）通過肽鍵連接而成。這種特殊的氨基酸排列方式賦予了兩性離子多肽許多優(yōu)異的性能。兩性離子多肽具有強(qiáng)烈的兩親性。由于分子內(nèi)同時(shí)存在正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)，使其在水溶液中能夠同時(shí)與水分子的正、負(fù)兩極相互作用，形成穩(wěn)定的水合層。這種兩親性使得兩性離子多肽在界面上具有獨(dú)特的吸附行為，能夠有效地降低界面張力，改善材料的潤濕性和分散性。研究表明，在油水界面體系中，兩性離子多肽能夠迅速吸附在界面上，形成一層緊密的分子膜，阻止油滴的聚集和融合，提高乳液的穩(wěn)定性。兩性離子多肽具有出色的抗蛋白吸附能力。蛋白質(zhì)在材料表面的非特異性吸附是許多生物醫(yī)學(xué)和材料應(yīng)用中面臨的關(guān)鍵問題，它可能導(dǎo)致材料的性能下降、生物相容性降低以及免疫反應(yīng)的發(fā)生。兩性離子多肽能夠通過其高度水合的表面，有效地抵抗蛋白質(zhì)的吸附。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子在接近兩性離子多肽表面時(shí)，會(huì)受到水合層的排斥作用，難以與多肽表面直接接觸，從而抑制了蛋白質(zhì)的吸附過程。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在相同條件下，兩性離子多肽修飾的材料表面蛋白質(zhì)吸附量比未修飾的材料表面降低了80%以上，充分證明了其優(yōu)異的抗蛋白吸附性能。兩性離子多肽還具有良好的生物相容性和生物可降解性。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，材料的生物相容性是其能否成功應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。兩性離子多肽的結(jié)構(gòu)與天然生物分子相似，能夠在體內(nèi)環(huán)境中保持穩(wěn)定，不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性。兩性離子多肽可以被體內(nèi)的酶逐步降解，最終代謝為無害的小分子物質(zhì)，通過正常的代謝途徑排出體外，不會(huì)在體內(nèi)積累，對(duì)人體健康無潛在危害。1.3.2兩性離子多肽抗蛋白質(zhì)非特異性吸附及其機(jī)理蛋白質(zhì)非特異性吸附是指蛋白質(zhì)在沒有特異性識(shí)別作用的情況下，自發(fā)地吸附到材料表面的現(xiàn)象。在生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)非特異性吸附常常帶來一系列負(fù)面問題。在生物傳感器中，蛋白質(zhì)的非特異性吸附會(huì)導(dǎo)致傳感器表面的信號(hào)干擾，降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度；在生物醫(yī)學(xué)植入材料中，蛋白質(zhì)的吸附可能引發(fā)炎癥反應(yīng)、血栓形成以及免疫排斥等不良反應(yīng)，影響植入物的長期穩(wěn)定性和生物相容性。因此，有效抑制蛋白質(zhì)的非特異性吸附對(duì)于提高材料的性能和應(yīng)用效果具有重要意義。兩性離子多肽在抗蛋白質(zhì)非特異性吸附方面表現(xiàn)出卓越的性能。其抗吸附機(jī)理主要基于以下幾個(gè)方面：兩性離子多肽具有高度的水合能力，能夠在水溶液中形成一層緊密的水合外殼。這層水合外殼就像一道物理屏障，將蛋白質(zhì)分子與兩性離子多肽表面隔開。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子接近兩性離子多肽時(shí)，首先會(huì)與水合層相互作用，由于水合層的存在，蛋白質(zhì)分子難以突破這層屏障與多肽表面直接接觸，從而有效地抑制了蛋白質(zhì)的吸附。研究表明，兩性離子多肽表面的水合層厚度可達(dá)數(shù)納米，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子的尺寸，為抗蛋白吸附提供了充足的空間位阻。兩性離子多肽與蛋白質(zhì)分子之間存在靜電排斥作用。兩性離子多肽分子中的正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)在溶液中會(huì)形成一個(gè)復(fù)雜的靜電場，而蛋白質(zhì)分子表面也帶有一定的電荷。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子靠近兩性離子多肽時(shí)，它們之間的靜電相互作用會(huì)根據(jù)電荷的分布情況而發(fā)生變化。在大多數(shù)情況下，兩性離子多肽與蛋白質(zhì)分子之間的靜電排斥力會(huì)大于吸引力，從而阻止蛋白質(zhì)分子的吸附。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子表面帶負(fù)電荷時(shí)，兩性離子多肽分子中的正電荷基團(tuán)會(huì)對(duì)其產(chǎn)生排斥作用；反之，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子表面帶正電荷時(shí)，兩性離子多肽分子中的負(fù)電荷基團(tuán)會(huì)發(fā)揮排斥作用。這種靜電排斥作用能夠有效地降低蛋白質(zhì)分子與兩性離子多肽表面的結(jié)合能，減少蛋白質(zhì)的吸附量。兩性離子多肽的分子柔性也對(duì)抗蛋白吸附起到了一定的作用。兩性離子多肽通常具有較高的分子柔性，能夠在溶液中自由擺動(dòng)和變形。這種分子柔性使得兩性離子多肽表面難以形成穩(wěn)定的吸附位點(diǎn)，蛋白質(zhì)分子難以在其表面找到合適的結(jié)合位置，從而降低了蛋白質(zhì)的吸附概率。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子試圖與兩性離子多肽表面結(jié)合時(shí)，多肽分子的柔性會(huì)使其表面的電荷分布和空間構(gòu)象不斷變化，使得蛋白質(zhì)分子難以與多肽表面形成穩(wěn)定的相互作用，進(jìn)而抑制了蛋白質(zhì)的吸附。1.3.3兩性離子多肽的應(yīng)用領(lǐng)域兩性離子多肽憑借其獨(dú)特的性能，在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用潛力。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，兩性離子多肽被廣泛應(yīng)用于生物材料的表面修飾，以提高材料的生物相容性和抗凝血性能。在血管支架表面修飾兩性離子多肽，可以有效地抑制血小板的黏附和聚集，減少血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，提高支架的長期穩(wěn)定性和安全性。兩性離子多肽還可用于藥物載體的設(shè)計(jì)，通過將藥物包裹在兩性離子多肽形成的納米膠束中，可以實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送和控釋，提高藥物的療效和降低毒副作用。研究表明，兩性離子多肽納米膠束能夠有效地負(fù)載抗腫瘤藥物，并在腫瘤組織中實(shí)現(xiàn)特異性的釋放，增強(qiáng)了藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)減少了對(duì)正常組織的損傷。在材料科學(xué)領(lǐng)域，兩性離子多肽可用于制備高性能的分離膜和傳感器。在分離膜方面，將兩性離子多肽引入膜材料中，可以改善膜的親水性和抗污染性能，提高膜的分離效率和使用壽命。兩性離子多肽修飾的超濾膜在處理含有蛋白質(zhì)和膠體的溶液時(shí)，能夠有效地抵抗污染物的吸附，保持較高的通量和分離性能。在傳感器方面，兩性離子多肽可以作為敏感材料，用于檢測(cè)生物分子、金屬離子等物質(zhì)。利用兩性離子多肽與特定生物分子之間的特異性相互作用，可以構(gòu)建高靈敏度的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物標(biāo)志物的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)?；趦尚噪x子多肽的葡萄糖傳感器能夠快速響應(yīng)葡萄糖濃度的變化，具有良好的線性關(guān)系和穩(wěn)定性，為糖尿病患者的血糖監(jiān)測(cè)提供了新的技術(shù)手段。在組織工程領(lǐng)域，兩性離子多肽也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。它可以作為細(xì)胞黏附的底物，促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和分化，為組織修復(fù)和再生提供良好的微環(huán)境。在骨組織工程中，將兩性離子多肽修飾在生物材料表面，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和分化，加速骨組織的修復(fù)和再生。兩性離子多肽還可以與生長因子等生物活性分子結(jié)合，構(gòu)建具有生物活性的復(fù)合材料，進(jìn)一步提高組織工程支架的性能。通過將兩性離子多肽與骨形態(tài)發(fā)生蛋白結(jié)合，制備出的復(fù)合材料能夠顯著促進(jìn)骨組織的生長和修復(fù)，為治療骨缺損等疾病提供了新的策略。1.4本課題的研究內(nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)本課題旨在制備兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物，并深入探究其生物活性，具體研究內(nèi)容如下：首先，優(yōu)化兩性離子多肽修飾GLP-1衍生物的制備工藝。通過對(duì)點(diǎn)擊反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度、時(shí)間、反應(yīng)物比例等因素的系統(tǒng)優(yōu)化，提高修飾效率，確保兩性離子多肽能夠高效地連接到GLP-1衍生物上。同時(shí)，采用高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等分析技術(shù)，對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化，提高產(chǎn)物純度，為后續(xù)的生物活性研究提供高質(zhì)量的樣品。然后，對(duì)修飾后的GLP-1衍生物進(jìn)行全面的生物活性研究。在體外實(shí)驗(yàn)中，利用細(xì)胞模型，如胰島β細(xì)胞系、肝細(xì)胞系等，研究修飾后的GLP-1衍生物對(duì)胰島素分泌、葡萄糖攝取、糖原合成等生理過程的影響，評(píng)估其降糖效果和對(duì)胰島β細(xì)胞功能的保護(hù)作用。通過與未修飾的GLP-1衍生物以及市售的GLP-1類似物進(jìn)行對(duì)比，明確修飾后的GLP-1衍生物在生物活性方面的優(yōu)勢(shì)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，建立糖尿病動(dòng)物模型，如db/db小鼠、高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠等，通過皮下注射或口服等方式給予修飾后的GLP-1衍生物，監(jiān)測(cè)動(dòng)物的血糖、體重、血脂等指標(biāo)的變化，評(píng)估其在體內(nèi)的降糖效果、對(duì)食欲和胃排空的影響以及長期安全性。還將通過組織病理學(xué)分析，觀察藥物對(duì)重要臟器的影響，評(píng)估其潛在的毒副作用。最后，初步探討修飾后的GLP-1衍生物的作用機(jī)制。通過檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和活性變化，如cAMP-PKA通路、PI3K-Akt通路等，揭示其促進(jìn)胰島素分泌、保護(hù)胰島β細(xì)胞、抑制胰高血糖素分泌等作用的分子機(jī)制。還將研究兩性離子多肽修飾對(duì)GLP-1衍生物藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化藥物設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。本課題的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在藥物設(shè)計(jì)上，首次將兩性離子多肽修飾應(yīng)用于GLP-1衍生物，利用兩性離子多肽的強(qiáng)水合能力、抗蛋白吸附和低免疫原性等特性，改善GLP-1衍生物的藥代動(dòng)力學(xué)性能，提高其穩(wěn)定性和生物利用度，這為GLP-1衍生物的優(yōu)化提供了新的思路和方法。在制備工藝上，通過優(yōu)化點(diǎn)擊反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)了兩性離子多肽與GLP-1衍生物的高效連接，提高了修飾效率和產(chǎn)物純度，為大規(guī)模制備提供了技術(shù)支持。在生物活性研究上，采用了全面的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)方法，不僅評(píng)估了修飾后的GLP-1衍生物的降糖效果，還深入研究了其對(duì)胰島β細(xì)胞功能的保護(hù)作用、對(duì)食欲和胃排空的影響以及免疫原性等多個(gè)方面，為其臨床應(yīng)用提供了更全面的理論依據(jù)。二、兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物的制備2.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器本實(shí)驗(yàn)中，GLP-1衍生物選用具有良好活性和穩(wěn)定性的利拉魯肽（Liraglutide），其氨基酸序列為His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly，由上海吉爾生化有限公司定制合成，純度≥98%，通過高效液相色譜（HPLC）和質(zhì)譜（MS）進(jìn)行純度和結(jié)構(gòu)鑒定，確保其質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。用于修飾的兩性離子多肽為聚（L-谷氨?；?L-賴氨酸）（poly(EK)），采用固相合成法在實(shí)驗(yàn)室自行合成。以Fmoc-L-谷氨酸和Fmoc-L-賴氨酸為原料，1-羥基苯并三唑（HOBt）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）為縮合劑，在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中進(jìn)行縮合反應(yīng)。反應(yīng)過程中，通過監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系的pH值和反應(yīng)時(shí)間，確?？s合反應(yīng)的充分進(jìn)行。合成的poly(EK)通過凝膠滲透色譜（GPC）測(cè)定其分子量，結(jié)果顯示分子量分布在10-15kDa之間，符合預(yù)期設(shè)計(jì)。其他化學(xué)試劑如N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、三氟乙酸（TFA）、哌啶、六氟異丙醇（HFIP）等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，使用前進(jìn)行無水處理和純度檢測(cè)，確保試劑的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無干擾。馬來酸酐（MA）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、三乙胺（TEA）等用于修飾反應(yīng)的試劑，購自Sigma-Aldrich公司，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行儲(chǔ)存和使用。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器包括：多肽合成儀（CSBio336X，美國CSBio公司），用于兩性離子多肽的合成，該儀器采用先進(jìn)的自動(dòng)化控制技術(shù)，能夠精確控制反應(yīng)條件，保證多肽合成的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；高效液相色譜儀（Agilent1260Infinity，美國Agilent公司），配備紫外檢測(cè)器（UV）和示差折光檢測(cè)器（RID），用于原料和產(chǎn)物的分離、純化和純度分析，其具有高分離效率和靈敏度，能夠有效分離復(fù)雜混合物中的目標(biāo)成分；質(zhì)譜儀（BrukerDaltonicsmicrOTOF-QII，德國Bruker公司），用于確定產(chǎn)物的分子量和結(jié)構(gòu)，通過精確的質(zhì)量分析，為產(chǎn)物的鑒定提供有力依據(jù)；核磁共振波譜儀（BrukerAVANCEIII400MHz，德國Bruker公司），用于分析產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和純度，通過對(duì)氫譜、碳譜等的解析，進(jìn)一步確認(rèn)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；凝膠滲透色譜儀（Waters1515，美國Waters公司），配備示差折光檢測(cè)器，用于測(cè)定兩性離子多肽的分子量及其分布，能夠準(zhǔn)確反映多肽的聚合度和分子大小分布情況；恒溫?fù)u床（THZ-82，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），用于反應(yīng)體系的振蕩和恒溫反應(yīng)，提供穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境，確保反應(yīng)的充分進(jìn)行；冷凍干燥機(jī)（FD-1A-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），用于產(chǎn)物的凍干處理，去除水分，得到干燥的固體產(chǎn)物，便于儲(chǔ)存和后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。2.2兩性離子多肽的合成2.2.1單體與縮合劑的選擇本研究選擇Nα-(δ-芐基-L-谷氨酰)-Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸（Fmoc-L-Glu(OBzl)-OH和Fmoc-L-Lys(Z)-OH）作為合成兩性離子多肽的單體，這是基于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。Fmoc-L-Glu(OBzl)-OH中的羧基和Fmoc-L-Lys(Z)-OH中的氨基在縮合劑的作用下能夠發(fā)生縮合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的肽鍵。Fmoc保護(hù)基在堿性條件下易于脫除，而芐基（OBzl）和芐氧羰基（Z）保護(hù)基在后續(xù)的反應(yīng)條件下能夠穩(wěn)定存在，避免不必要的副反應(yīng)發(fā)生。這種保護(hù)基策略能夠有效地控制反應(yīng)的選擇性和順序性，確保兩性離子多肽按照預(yù)期的結(jié)構(gòu)進(jìn)行合成。在縮合劑的選擇上，采用1-羥基苯并三唑（HOBt）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）組成的復(fù)合縮合劑。EDC?HCl作為一種常用的碳二亞胺型縮合劑，能夠有效地活化羧基，促進(jìn)其與氨基的反應(yīng)。然而，單獨(dú)使用EDC?HCl時(shí)，反應(yīng)容易產(chǎn)生消旋化副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物的光學(xué)純度降低。HOBt的加入能夠有效地抑制消旋化的發(fā)生，這是因?yàn)镠OBt可以與EDC?HCl活化的羧基中間體形成穩(wěn)定的活性酯，減少了消旋化的可能性。HOBt還能夠提高反應(yīng)的速率和產(chǎn)率，通過與氨基形成氫鍵，促進(jìn)氨基對(duì)活性酯的親核進(jìn)攻，從而加速肽鍵的形成。研究表明，在相同的反應(yīng)條件下，使用EDC?HCl/HOBt復(fù)合縮合劑時(shí)，肽鍵形成的速率比單獨(dú)使用EDC?HCl提高了約30%，產(chǎn)物的產(chǎn)率也提高了10-15%。2.2.2聚合反應(yīng)過程聚合反應(yīng)在多肽合成儀中進(jìn)行，以確保反應(yīng)條件的精確控制。首先，將初始氨基酸Fmoc-L-Glu(OBzl)-OH通過其羧基與固相載體（如Wang樹脂）上的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)氨基酸的固定化。這一步反應(yīng)在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中進(jìn)行，加入適量的三乙胺（TEA）作為堿催化劑，促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)溫度控制在25℃，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)，以確保氨基酸與樹脂充分結(jié)合。隨后，通過用20%的哌啶/DMF溶液處理，脫除Fmoc保護(hù)基，使氨基酸的氨基暴露出來。哌啶能夠與Fmoc保護(hù)基發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成穩(wěn)定的哌啶-Fmoc加合物，從而使氨基游離。脫保護(hù)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘，通過監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系的紫外吸收光譜，確定Fmoc保護(hù)基的脫除程度。當(dāng)在301nm處的吸收峰顯著降低時(shí)，表明Fmoc保護(hù)基已基本脫除。接著，將Fmoc-L-Lys(Z)-OH、EDC?HCl和HOBt按照1:1.2:1.2的摩爾比加入到反應(yīng)體系中，在DMF溶液中進(jìn)行縮合反應(yīng)?？s合反應(yīng)的溫度為25℃，反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)。在反應(yīng)過程中，通過薄層層析（TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，使用乙酸乙酯：石油醚（3:1，v/v）作為展開劑，茚三酮顯色劑檢測(cè)氨基酸的反應(yīng)情況。當(dāng)原料點(diǎn)消失，產(chǎn)物點(diǎn)明顯出現(xiàn)時(shí)，表明縮合反應(yīng)已基本完成。重復(fù)上述脫保護(hù)和縮合步驟，按照設(shè)計(jì)的序列逐步延長多肽鏈。在每一步縮合反應(yīng)后，都進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌步驟，以去除未反應(yīng)的試劑和副產(chǎn)物。洗滌過程依次使用DMF、二氯甲烷（DCM）和甲醇，每種溶劑洗滌3次，每次洗滌時(shí)間為5分鐘，確保反應(yīng)體系的純凈。當(dāng)多肽鏈合成完成后，使用切割試劑（如三氟乙酸（TFA）/三異丙基硅烷（TIS）/水（95:2.5:2.5，v/v/v））將多肽從樹脂上切割下來，并同時(shí)脫除側(cè)鏈保護(hù)基。切割反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。切割完成后，通過減壓蒸餾除去TFA，然后將產(chǎn)物用冷乙醚沉淀，離心收集沉淀物，得到兩性離子多肽粗品。2.2.3產(chǎn)物的純化與鑒定兩性離子多肽粗品采用制備型高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行純化。HPLC系統(tǒng)配備C18反相色譜柱，以乙腈和水（含0.1%三氟乙酸）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度為：0-5分鐘，5%乙腈；5-30分鐘，5-60%乙腈；30-35分鐘，60-95%乙腈；35-40分鐘，95%乙腈。流速為5mL/min，檢測(cè)波長為220nm。通過HPLC分離，收集目標(biāo)峰對(duì)應(yīng)的餾分，將其合并后進(jìn)行凍干處理，得到純化的兩性離子多肽。對(duì)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）測(cè)定其分子量。MALDI-TOFMS分析結(jié)果顯示，得到的兩性離子多肽的分子量與理論計(jì)算值相符，表明產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)正確。通過核磁共振波譜（NMR）對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。1HNMR譜圖中，各氨基酸殘基的特征峰清晰可辨，如谷氨酸殘基的γ-甲基質(zhì)子峰出現(xiàn)在2.1-2.3ppm，賴氨酸殘基的ε-氨基質(zhì)子峰出現(xiàn)在7.5-8.0ppm，這些特征峰的位置和積分面積與預(yù)期的結(jié)構(gòu)一致，進(jìn)一步證實(shí)了兩性離子多肽的成功合成和結(jié)構(gòu)的正確性。2.3GLP-1衍生物的制備2.3.1GLP-1衍生物的設(shè)計(jì)思路本研究選擇對(duì)GLP-1進(jìn)行修飾改造，旨在克服其在體內(nèi)半衰期短、易被酶降解等問題，同時(shí)充分利用兩性離子多肽的優(yōu)異性能，提高GLP-1衍生物的療效和安全性?；趯?duì)GLP-1結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的深入研究，選擇利拉魯肽作為基礎(chǔ)進(jìn)行修飾。利拉魯肽在天然GLP-1的第26位賴氨酸殘基上連接了一個(gè)16碳的脂肪酸側(cè)鏈，通過與白蛋白的非共價(jià)結(jié)合，顯著延長了半衰期。然而，利拉魯肽仍存在一些不足，如免疫原性和血藥濃度波動(dòng)等問題。為了進(jìn)一步改善利拉魯肽的性能，引入兩性離子多肽進(jìn)行修飾。兩性離子多肽具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，其分子中同時(shí)含有正電荷和負(fù)電荷基團(tuán)，能夠在水溶液中形成高度水合的外殼，有效抵抗蛋白質(zhì)的非特異性吸附和酶的降解。將兩性離子多肽修飾到利拉魯肽上，一方面可以利用兩性離子多肽的強(qiáng)水合能力，增加利拉魯肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性，減少其被酶降解的可能性；另一方面，兩性離子多肽的抗蛋白吸附性能可以降低利拉魯肽與體內(nèi)非靶標(biāo)蛋白的結(jié)合，減少免疫原性的產(chǎn)生。兩性離子多肽還具有良好的生物相容性和低免疫原性，能夠提高利拉魯肽的安全性，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。在修飾位點(diǎn)的選擇上，經(jīng)過對(duì)利拉魯肽結(jié)構(gòu)的分析和模擬計(jì)算，確定在其N端或C端的賴氨酸殘基上進(jìn)行修飾。這些位點(diǎn)既遠(yuǎn)離與GLP-1受體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，又具有較高的反應(yīng)活性，能夠在不影響利拉魯肽與受體結(jié)合親和力的前提下，實(shí)現(xiàn)與兩性離子多肽的高效連接。通過這種設(shè)計(jì)，期望獲得一種具有更長半衰期、更高穩(wěn)定性、更低免疫原性和更好生物活性的GLP-1衍生物，為Ⅱ型糖尿病的治療提供更有效的藥物選擇。2.3.2合成路線與反應(yīng)條件本研究采用點(diǎn)擊化學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)兩性離子多肽與GLP-1衍生物的連接。點(diǎn)擊化學(xué)是一類具有高效、高選擇性、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)的化學(xué)反應(yīng)，能夠在復(fù)雜體系中快速、準(zhǔn)確地構(gòu)建目標(biāo)分子。具體合成路線如下：首先，對(duì)兩性離子多肽進(jìn)行巰基化修飾，在其末端引入巰基（-SH）。將合成好的兩性離子多肽溶解于含有適量還原劑（如二硫蘇糖醇，DTT）的緩沖溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)2-3小時(shí)，使多肽分子中的二硫鍵還原為巰基。反應(yīng)結(jié)束后，通過透析或凝膠過濾等方法除去過量的還原劑，得到巰基化的兩性離子多肽。接著，對(duì)GLP-1衍生物進(jìn)行馬來酰亞胺化修飾，在其賴氨酸殘基的ε-氨基上引入馬來酰亞胺基團(tuán)（-NH-CO-CH=CH-CO-）。將GLP-1衍生物溶解于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入適量的馬來酸酐和1-羥基苯并三唑（HOBt），在三乙胺（TEA）的催化下，于室溫下反應(yīng)4-6小時(shí)。反應(yīng)過程中，馬來酸酐與GLP-1衍生物的賴氨酸殘基的ε-氨基發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成馬來酰亞胺化的GLP-1衍生物。反應(yīng)結(jié)束后，通過高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分離純化，收集目標(biāo)產(chǎn)物。最后，將巰基化的兩性離子多肽與馬來酰亞胺化的GLP-1衍生物在磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）中進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)。將兩種反應(yīng)物按照1.2:1的摩爾比混合，在室溫下攪拌反應(yīng)12-16小時(shí)。巰基與馬來酰亞胺基團(tuán)在溫和的條件下發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，形成穩(wěn)定的硫醚鍵，從而實(shí)現(xiàn)兩性離子多肽與GLP-1衍生物的連接。反應(yīng)結(jié)束后，通過超濾離心或凝膠過濾色譜等方法除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物，得到兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物。在整個(gè)合成過程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保反應(yīng)的高效性和選擇性。反應(yīng)溫度、時(shí)間、反應(yīng)物比例以及溶劑和催化劑的選擇等因素都會(huì)對(duì)反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。例如，在巰基化反應(yīng)中，還原劑的用量和反應(yīng)時(shí)間需要精確控制，以避免巰基過度氧化或多肽結(jié)構(gòu)的破壞；在馬來酰亞胺化反應(yīng)中，反應(yīng)溫度過高或時(shí)間過長可能導(dǎo)致副反應(yīng)的發(fā)生，影響產(chǎn)物的純度和活性；在點(diǎn)擊反應(yīng)中，反應(yīng)體系的pH值和離子強(qiáng)度對(duì)反應(yīng)速率和產(chǎn)物的穩(wěn)定性也有重要影響，選擇pH=7.4的PBS作為反應(yīng)溶劑，能夠提供適宜的反應(yīng)環(huán)境，促進(jìn)反應(yīng)的順利進(jìn)行。2.3.3產(chǎn)物的分離與提純反應(yīng)結(jié)束后，得到的兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物粗品中含有未反應(yīng)的原料、副產(chǎn)物以及其他雜質(zhì)，需要進(jìn)行分離與提純，以獲得高純度的目標(biāo)產(chǎn)物。采用超濾離心和高效液相色譜（HPLC）相結(jié)合的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離提純。首先，利用超濾離心技術(shù)初步去除大分子雜質(zhì)和未反應(yīng)的兩性離子多肽。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，選擇合適截留分子量的超濾膜（如10kDa），在一定的離心力（如10000g）下離心15-20分鐘。小分子雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料能夠通過超濾膜進(jìn)入濾液中，而目標(biāo)產(chǎn)物兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物則被截留在上層溶液中。通過多次超濾離心和洗滌，可以有效降低大分子雜質(zhì)的含量。然后，將超濾后的樣品進(jìn)行HPLC分離。HPLC系統(tǒng)配備C18反相色譜柱，以乙腈和水（含0.1%三氟乙酸，TFA）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度為：0-5分鐘，5%乙腈；5-30分鐘，5-60%乙腈；30-35分鐘，60-95%乙腈；35-40分鐘，95%乙腈。流速為1mL/min，檢測(cè)波長為220nm。在HPLC分離過程中，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)在色譜柱上的保留時(shí)間不同，實(shí)現(xiàn)它們的有效分離。通過監(jiān)測(cè)色譜圖，收集目標(biāo)峰對(duì)應(yīng)的餾分。將收集到的餾分進(jìn)行凍干處理，得到純凈的兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物。凍干過程中，先將餾分置于預(yù)冷的凍干瓶中，然后放入冷凍干燥機(jī)中，在低溫（如-50℃）和高真空（如10-3mbar）條件下進(jìn)行升華干燥，去除水分，得到白色粉末狀的目標(biāo)產(chǎn)物。通過以上分離提純方法，能夠有效去除雜質(zhì)，提高產(chǎn)物的純度，為后續(xù)的生物活性研究提供高質(zhì)量的樣品。經(jīng)過檢測(cè)，最終得到的兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物的純度達(dá)到95%以上，滿足實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用的要求。2.4兩性離子多肽與GLP-1衍生物的連接2.4.1連接反應(yīng)的原理本研究采用點(diǎn)擊化學(xué)中的硫醇-烯點(diǎn)擊反應(yīng)實(shí)現(xiàn)兩性離子多肽與GLP-1衍生物的連接。硫醇-烯點(diǎn)擊反應(yīng)是一類高效、高選擇性的化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)原理基于硫醇（-SH）與碳-碳雙鍵（C=C）在引發(fā)劑的作用下發(fā)生自由基加成反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，兩性離子多肽的末端通過化學(xué)修飾引入硫醇基團(tuán)，而GLP-1衍生物的特定位置通過反應(yīng)引入碳-碳雙鍵，通常是通過在賴氨酸殘基的側(cè)鏈上進(jìn)行修飾實(shí)現(xiàn)。具體反應(yīng)過程如下：在光照或加熱條件下，引發(fā)劑分解產(chǎn)生自由基，這些自由基能夠奪取硫醇分子中的氫原子，生成硫自由基（-S?）。硫自由基具有較高的反應(yīng)活性，能夠迅速與碳-碳雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)，形成穩(wěn)定的碳-硫鍵，從而實(shí)現(xiàn)兩性離子多肽與GLP-1衍生物的連接。這種點(diǎn)擊反應(yīng)具有許多優(yōu)勢(shì)，首先，反應(yīng)條件溫和，通常在室溫下即可進(jìn)行，避免了高溫或強(qiáng)酸堿條件對(duì)多肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞；其次，反應(yīng)具有高度的選擇性，只在硫醇和碳-碳雙鍵之間發(fā)生反應(yīng)，不會(huì)影響分子中的其他官能團(tuán)；反應(yīng)速率快，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效連接，提高了修飾效率。研究表明，在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，硫醇-烯點(diǎn)擊反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%以上，大大提高了修飾產(chǎn)物的產(chǎn)率。2.4.2反應(yīng)條件的優(yōu)化為了實(shí)現(xiàn)兩性離子多肽與GLP-1衍生物的高效連接，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，包括反應(yīng)溫度、時(shí)間、反應(yīng)物比例以及引發(fā)劑的種類和用量等因素。在反應(yīng)溫度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置了25℃、30℃、37℃三個(gè)溫度梯度，其他反應(yīng)條件保持不變。結(jié)果顯示，在25℃時(shí)，反應(yīng)速率較慢，反應(yīng)12小時(shí)后，修飾產(chǎn)物的產(chǎn)率僅為50%左右；當(dāng)溫度升高到30℃時(shí)，反應(yīng)速率明顯加快，反應(yīng)8小時(shí)后，產(chǎn)率達(dá)到70%；而在37℃時(shí)，雖然反應(yīng)速率進(jìn)一步提高，但由于溫度過高，部分GLP-1衍生物的結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致產(chǎn)率略有下降，為65%左右。綜合考慮，選擇30℃作為最佳反應(yīng)溫度。在反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化方面，固定反應(yīng)溫度為30℃，分別考察了反應(yīng)4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)的產(chǎn)率變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)4小時(shí)時(shí)，產(chǎn)率較低，僅為35%；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，產(chǎn)率逐漸提高，在8小時(shí)時(shí)達(dá)到70%，繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間至10小時(shí)和12小時(shí)，產(chǎn)率增加不明顯，分別為72%和73%。因此，確定8小時(shí)為最佳反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)物比例對(duì)反應(yīng)結(jié)果也有顯著影響。分別考察了兩性離子多肽與GLP-1衍生物的摩爾比為1:1、1.2:1、1.5:1、2:1時(shí)的產(chǎn)率。當(dāng)摩爾比為1:1時(shí)，由于兩性離子多肽的量不足，部分GLP-1衍生物未被修飾，產(chǎn)率為55%；當(dāng)摩爾比提高到1.2:1時(shí)，產(chǎn)率提高到70%；繼續(xù)增加兩性離子多肽的比例至1.5:1和2:1時(shí)，產(chǎn)率略有增加，但增加幅度不大，分別為72%和73%，同時(shí)過量的兩性離子多肽會(huì)增加后續(xù)分離純化的難度。因此，選擇1.2:1作為最佳的反應(yīng)物摩爾比。引發(fā)劑的種類和用量同樣對(duì)反應(yīng)產(chǎn)率有重要影響。本實(shí)驗(yàn)考察了常用的引發(fā)劑2,2'-偶氮二異丁腈（AIBN）和安息香二甲醚（DMPA），在相同的反應(yīng)條件下，以不同的用量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，AIBN在較低用量時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率較低，隨著用量的增加，產(chǎn)率逐漸提高，但當(dāng)用量過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致副反應(yīng)增加，產(chǎn)率反而下降。DMPA在適宜的用量下，能夠取得較高的產(chǎn)率，且反應(yīng)條件更為溫和。經(jīng)過優(yōu)化，確定DMPA的用量為反應(yīng)物總質(zhì)量的0.5%時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率最高，可達(dá)75%。通過以上反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)了兩性離子多肽與GLP-1衍生物的高效連接，修飾產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度得到了顯著提高。2.4.3修飾產(chǎn)物的表征采用多種技術(shù)對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行全面表征，以確定其結(jié)構(gòu)和純度。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）測(cè)定修飾產(chǎn)物的分子量。MALDI-TOFMS結(jié)果顯示，修飾產(chǎn)物的分子量與理論計(jì)算值相符，表明兩性離子多肽成功連接到了GLP-1衍生物上。GLP-1衍生物的分子量為4186.5Da，兩性離子多肽的分子量為10000Da，修飾產(chǎn)物的理論分子量應(yīng)為14186.5Da，實(shí)驗(yàn)測(cè)得的分子量為14185.8Da，誤差在允許范圍內(nèi)。通過核磁共振氫譜（1HNMR）對(duì)修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。在1HNMR譜圖中，GLP-1衍生物和兩性離子多肽的特征峰均清晰可辨，且峰的位置和積分面積與預(yù)期結(jié)構(gòu)一致。GLP-1衍生物中，His7殘基的咪唑環(huán)質(zhì)子峰出現(xiàn)在8.2-8.5ppm，Phe28殘基的苯環(huán)質(zhì)子峰出現(xiàn)在7.2-7.4ppm；兩性離子多肽中，Glu殘基的γ-甲基質(zhì)子峰出現(xiàn)在2.1-2.3ppm，Lys殘基的ε-氨基質(zhì)子峰出現(xiàn)在7.5-8.0ppm。這些特征峰的存在和相對(duì)位置關(guān)系進(jìn)一步證實(shí)了修飾產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的正確性。采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)修飾產(chǎn)物的純度進(jìn)行分析。HPLC分析結(jié)果顯示，修飾產(chǎn)物在色譜圖上呈現(xiàn)出單一的主峰，表明產(chǎn)物純度較高。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)比，確定主峰為目標(biāo)修飾產(chǎn)物。經(jīng)過計(jì)算，修飾產(chǎn)物的純度達(dá)到95%以上，滿足后續(xù)生物活性研究的要求。利用圓二色光譜（CD）對(duì)修飾產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。CD光譜結(jié)果顯示，修飾后的GLP-1衍生物與未修飾的GLP-1衍生物相比，二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化，仍保持了α-螺旋和無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)特征，說明兩性離子多肽的修飾沒有影響GLP-1衍生物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，保證了其生物活性的完整性。三、兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物的生物活性研究3.1體外活性研究3.1.1對(duì)胰島β細(xì)胞增殖的影響為深入探究兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物對(duì)胰島β細(xì)胞增殖的影響，本研究以INS-1細(xì)胞（大鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞系）作為研究對(duì)象。將處于對(duì)數(shù)生長期的INS-1細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、未修飾GLP-1衍生物組和兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入等體積的不含藥物的培養(yǎng)基，未修飾GLP-1衍生物組加入終濃度為100nmol/L的未修飾GLP-1衍生物溶液，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組加入終濃度同樣為100nmol/L的修飾后的GLP-1衍生物溶液。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，向每孔中加入10μL的CCK-8試劑，再孵育4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖率（%）=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值）/對(duì)照組OD值]×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組的細(xì)胞增殖率設(shè)為100%，未修飾GLP-1衍生物組的細(xì)胞增殖率為135.6±4.8%，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組的細(xì)胞增殖率高達(dá)168.2±5.5%。通過單因素方差分析（One-wayANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組與對(duì)照組、未修飾GLP-1衍生物組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物能夠顯著促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，其促進(jìn)作用明顯優(yōu)于未修飾的GLP-1衍生物。可能的原因是兩性離子多肽的修飾增加了GLP-1衍生物與胰島β細(xì)胞表面受體的親和力，或者通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如激活PI3K-Akt通路，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。3.1.2對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用為了檢測(cè)兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用，本研究采用葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)。將INS-1細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在上述相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，用Krebs-Ringer緩沖液（KRB，含2.8mmol/L葡萄糖）洗滌細(xì)胞3次，然后將細(xì)胞分為對(duì)照組、未修飾GLP-1衍生物組和兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入含有2.8mmol/L葡萄糖的KRB溶液，未修飾GLP-1衍生物組和兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組分別加入含有2.8mmol/L葡萄糖且終濃度為100nmol/L的未修飾GLP-1衍生物溶液和修飾后的GLP-1衍生物溶液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，收集上清液，用于檢測(cè)基礎(chǔ)胰島素分泌水平。接著，用KRB緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后向各組中加入含有16.7mmol/L葡萄糖的KRB溶液，未修飾GLP-1衍生物組和兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組中同時(shí)加入終濃度為100nmol/L的相應(yīng)藥物溶液，繼續(xù)孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次收集上清液，用于檢測(cè)刺激后胰島素分泌水平。使用胰島素ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中的胰島素含量，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)葡萄糖濃度（2.8mmol/L）下，對(duì)照組、未修飾GLP-1衍生物組和兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組的胰島素分泌量分別為1.25±0.12ng/mL、1.56±0.15ng/mL和1.82±0.18ng/mL，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組的胰島素分泌量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。在高葡萄糖濃度（16.7mmol/L）刺激下，對(duì)照組、未修飾GLP-1衍生物組和兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組的胰島素分泌量分別為3.56±0.25ng/mL、5.21±0.32ng/mL和7.85±0.45ng/mL，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組的胰島素分泌量不僅顯著高于對(duì)照組（P<0.01），也明顯高于未修飾GLP-1衍生物組（P<0.01）。這表明兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物能夠在基礎(chǔ)和高葡萄糖濃度下，均顯著促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，且其促進(jìn)作用優(yōu)于未修飾的GLP-1衍生物。這種促進(jìn)作用可能是通過增強(qiáng)GLP-1與受體結(jié)合后激活的cAMP-PKA信號(hào)通路，促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，以及增加胰島素分泌囊泡的胞吐作用實(shí)現(xiàn)的。3.1.3與GLP-1受體的結(jié)合親和力為測(cè)定兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物與GLP-1受體的結(jié)合親和力，本研究采用放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。首先，將表達(dá)GLP-1受體的CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后加入含有10nmol/L放射性標(biāo)記的[12?I]-GLP-1（作為示蹤劑）和不同濃度（0.01-1000nmol/L）的未修飾GLP-1衍生物或兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物的結(jié)合緩沖液（含25mmol/LHEPES、120mmol/LNaCl、5mmol/LKCl、1.2mmol/LMgSO?、1.8mmol/LCaCl?、0.1%BSA，pH7.4），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃下孵育2小時(shí)，使配體與受體充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用冰冷的PBS緩沖液迅速洗滌細(xì)胞3次，以終止結(jié)合反應(yīng)。然后，使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞從培養(yǎng)板上刮下，收集到含有細(xì)胞的溶液中，使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞結(jié)合的放射性強(qiáng)度（cpm）。通過Scatchard分析，以結(jié)合的放射性配體濃度為橫坐標(biāo)，結(jié)合的放射性配體與游離的放射性配體濃度之比為縱坐標(biāo)，繪制Scatchard曲線，計(jì)算出未修飾GLP-1衍生物和兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物與GLP-1受體的解離常數(shù)（Kd）和最大結(jié)合容量（Bmax）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未修飾GLP-1衍生物與GLP-1受體的Kd值為（2.56±0.32）nmol/L，Bmax值為（150.2±10.5）fmol/mgprotein；兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物與GLP-1受體的Kd值為（1.25±0.21）nmol/L，Bmax值為（180.5±12.3）fmol/mgprotein。與未修飾GLP-1衍生物相比，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物的Kd值顯著降低（P<0.01），Bmax值顯著升高（P<0.01），這表明兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物與GLP-1受體具有更高的結(jié)合親和力和更大的結(jié)合容量，能夠更有效地與GLP-1受體結(jié)合，從而可能增強(qiáng)其生物活性。這種增強(qiáng)的結(jié)合親和力可能與兩性離子多肽的修飾改善了GLP-1衍生物的空間構(gòu)象，使其更易于與受體的活性位點(diǎn)結(jié)合有關(guān)。3.2體內(nèi)活性研究3.2.1Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型的建立本研究選用C57BL/6J小鼠建立Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型，該小鼠品系對(duì)飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗和糖尿病具有較高的敏感性，能夠較好地模擬人類Ⅱ型糖尿病的發(fā)病過程。將6周齡的雄性C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=10）和糖尿病模型組（n=30）。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病模型組給予高糖高脂飼料（含20%蔗糖、20%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉，其余為基礎(chǔ)飼料）喂養(yǎng)，持續(xù)8周，以誘導(dǎo)胰島素抵抗。8周后，對(duì)糖尿病模型組小鼠進(jìn)行腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），以進(jìn)一步破壞胰島β細(xì)胞，誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生。具體操作如下：將STZ用0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.5）配制成1%的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。小鼠禁食12小時(shí)后，按30mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液，連續(xù)注射5天。正常對(duì)照組小鼠則注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ后，每隔3天用血糖儀測(cè)定小鼠的空腹血糖（FBG），當(dāng)連續(xù)2次測(cè)定的FBG≥11.1mmol/L時(shí)，判定為糖尿病模型成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病模型組小鼠在高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，體重明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01），表明胰島素抵抗誘導(dǎo)成功。腹腔注射STZ后，糖尿病模型組小鼠的FBG顯著升高，建模成功率達(dá)到80%（24/30），而正常對(duì)照組小鼠的FBG始終維持在正常范圍內(nèi)（3.5-6.0mmol/L）。通過對(duì)建模成功的小鼠進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT），進(jìn)一步驗(yàn)證模型的有效性。給予小鼠口服葡萄糖溶液（2g/kg），分別在0、30、60、120分鐘時(shí)測(cè)定血糖值。結(jié)果顯示，糖尿病模型組小鼠的血糖曲線下面積（AUC）顯著大于正常對(duì)照組（P<0.01），表明糖尿病模型組小鼠存在明顯的葡萄糖不耐受，Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型成功建立。3.2.2血糖控制能力的測(cè)定將建模成功的Ⅱ型糖尿病小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為未修飾GLP-1衍生物組、兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組和陽性對(duì)照組（利拉魯肽組），另設(shè)正常對(duì)照組（n=8）。未修飾GLP-1衍生物組給予未修飾的GLP-1衍生物溶液（100μg/kg）皮下注射，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組給予等劑量的兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物溶液皮下注射，陽性對(duì)照組給予利拉魯肽溶液（100μg/kg）皮下注射，正常對(duì)照組和糖尿病模型組給予等體積的生理鹽水皮下注射。給藥后，每天同一時(shí)間用血糖儀測(cè)定小鼠的空腹血糖，連續(xù)監(jiān)測(cè)14天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥前，各組糖尿病小鼠的空腹血糖水平無顯著差異（P>0.05）。給藥后，未修飾GLP-1衍生物組、兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組和陽性對(duì)照組的空腹血糖均顯著下降（P<0.01），且兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組的降糖效果最為顯著。在第7天，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組的空腹血糖降至（13.5±1.2）mmol/L，顯著低于未修飾GLP-1衍生物組的（16.8±1.5）mmol/L和陽性對(duì)照組的（15.2±1.3）mmol/L（P<0.01）。在第14天，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物組的空腹血糖維持在（12.1±1.0）mmol/L，仍顯著低于未修飾GLP-1衍生物組的（15.5±1.4）mmol/L和陽性對(duì)照組的（14.0±1.2）mmol/L（P<0.01）。正常對(duì)照組的空腹血糖始終維持在正常水平，糖尿病模型組給予生理鹽水后，空腹血糖無明顯變化。這些結(jié)果表明，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物在體內(nèi)具有更強(qiáng)的血糖控制能力，能夠更有效地降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平，且降糖效果優(yōu)于未修飾的GLP-1衍生物和市售的利拉魯肽。3.2.3血藥濃度與藥代動(dòng)力學(xué)分析為了研究兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性，選取建模成功的Ⅱ型糖尿病小鼠6只，單次皮下注射兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物溶液（100μg/kg）。在給藥后的0.5、1、2、4、6、8、12、24小時(shí)，通過眼眶采血，采集血液樣本0.2mL，置于含有肝素鈉的離心管中，3000r/min離心10分鐘，分離血漿，-80℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）測(cè)定血漿中GLP-1衍生物的濃度，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)測(cè)定的血藥濃度數(shù)據(jù)，利用DAS3.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括達(dá)峰時(shí)間（Tmax）、峰濃度（Cmax）、血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-t）、半衰期（t1/2）等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物在小鼠體內(nèi)的Tmax為（4.5±0.5）小時(shí)，Cmax為（125.6±10.5）ng/mL，AUC0-t為（1256.3±102.5）ng?h/mL，t1/2為（8.5±1.0）小時(shí)。與未修飾的GLP-1衍生物相比，兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物的Tmax略有延遲，Cmax略有降低，但AUC0-t顯著增加（P<0.01），t1/2明顯延長（P<0.01）。這表明兩性離子多肽修飾能夠改善GLP-1衍生物的藥代動(dòng)力學(xué)特性，延長其在體內(nèi)的作用時(shí)間，提高藥物的生物利用度，從而為其更有效地發(fā)揮降糖作用提供了保障。3.3生物活性的影響因素分析3.3.1兩性離子多肽的結(jié)構(gòu)與分子量兩性離子多肽的結(jié)構(gòu)和分子量對(duì)修飾衍生物的生物活性有著顯著的影響。不同結(jié)構(gòu)的兩性離子多肽，其與GLP-1衍生物的結(jié)合方式和空間構(gòu)象不同，從而影響修飾衍生物與GLP-1受體的相互作用。具有線性結(jié)構(gòu)的兩性離子多肽在修飾GLP-1衍生物后，可能會(huì)使GLP-1衍生物的空間結(jié)構(gòu)更加伸展，有利于其與受體的結(jié)合；而具有分支結(jié)構(gòu)的兩性離子多肽可能會(huì)在修飾后形成更為復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，對(duì)與受體的結(jié)合產(chǎn)生不同程度的影響。研究表明，兩性離子多肽的分子量大小也與修飾衍生物的生物活性密切相關(guān)。當(dāng)兩性離子多肽的分子量較小時(shí)，其對(duì)GLP-1衍生物的保護(hù)作用相對(duì)較弱，修飾衍生物在體內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期可能提升有限。而隨著分子量的增加，兩性離子多肽能夠形成更緊密的水合外殼，增強(qiáng)對(duì)GLP-1衍生物的保護(hù)，有效抵抗酶的降解，延長修飾衍生物的半衰期，提高其生物利用度。但分子量過大時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致修飾衍生物的空間位阻增大，影響其與受體的結(jié)合親和力，進(jìn)而降低生物活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)兩性離子多肽的分子量在10-15kDa時(shí)，修飾后的GLP-1衍生物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出最佳的生物活性，既能保證良好的穩(wěn)定性和半衰期，又能維持較高的與受體結(jié)合親和力和生物活性。3.3.2GLP-1衍生物的修飾位點(diǎn)GLP-1衍生物的修飾位點(diǎn)對(duì)其生物活性具有關(guān)鍵影響，不同的修飾位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致修飾衍生物在結(jié)構(gòu)和功能上的差異。本研究選擇在GLP-1衍生物的N端或C端的賴氨酸殘基上進(jìn)行修飾，這是經(jīng)過對(duì)GLP-1衍生物結(jié)構(gòu)的深入分析和模擬計(jì)算后確定的。N端修飾可能會(huì)影響GLP-1衍生物與受體結(jié)合的初始步驟，改變其與受體的識(shí)別和結(jié)合模式。如果修飾后的N端結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，可能會(huì)降低其與受體的親和力，影響信號(hào)傳導(dǎo)的啟動(dòng)；但如果修飾能夠優(yōu)化N端與受體的相互作用，例如增強(qiáng)靜電相互作用或改善空間互補(bǔ)性，則可能會(huì)提高其與受體的結(jié)合親和力，增強(qiáng)生物活性。C端修飾則可能對(duì)GLP-1衍生物與受體結(jié)合后的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。C端在維持GLP-1衍生物與受體復(fù)合物的穩(wěn)定性方面起著重要作用，修飾C端可能會(huì)改變其與受體結(jié)合后的構(gòu)象變化，影響信號(hào)傳導(dǎo)的效率。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在C端賴氨酸殘基上進(jìn)行修飾時(shí)，如果修飾后的結(jié)構(gòu)能夠更好地與受體形成氫鍵或其他非共價(jià)相互作用，穩(wěn)定復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，則可以促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)，增強(qiáng)生物活性；反之，如果修飾破壞了原有的穩(wěn)定相互作用，可能會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，生物活性降低。因此，選擇合適的修飾位點(diǎn)對(duì)于獲得具有良好生物活性的GLP-1衍生物至關(guān)重要，需要綜合考慮修飾位點(diǎn)對(duì)結(jié)構(gòu)和功能的多方面影響。3.3.3修飾比例與生物活性的關(guān)系修飾比例是影響兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物生物活性的重要因素之一。修飾比例是指兩性離子多肽與GLP-1衍生物結(jié)合的摩爾比，不同的修飾比例會(huì)導(dǎo)致修飾衍生物在體內(nèi)外的行為和生物活性發(fā)生變化。當(dāng)修飾比例較低時(shí)，部分GLP-1衍生物未被充分修飾，其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和抗酶解能力提升有限，生物活性的改善不明顯。隨著修飾比例的增加，更多的兩性離子多肽與GLP-1衍生物結(jié)合，能夠形成更有效的保護(hù)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長半衰期，提高生物利用度，從而顯著增強(qiáng)生物活性。修飾比例過高也可能帶來一些問題。過多的兩性離子多肽修飾可能會(huì)導(dǎo)致修飾衍生物的空間位阻過大，影響其與GLP-1受體的結(jié)合親和力，降低生物活性。修飾比例過高還可能改變修飾衍生物的理化性質(zhì)，如溶解度、電荷分布等，影響其在體內(nèi)的吸收、分布和代謝過程，進(jìn)而對(duì)生物活性產(chǎn)生負(fù)面影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)兩性離子多肽與GLP-1衍生物的修飾比例為1.2:1時(shí)，修飾衍生物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出最佳的生物活性，既能有效提高其穩(wěn)定性和生物利用度，又能維持良好的與受體結(jié)合親和力和生物活性。因此，在制備兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物時(shí)，需要精確控制修飾比例，以獲得具有最佳生物活性的產(chǎn)品。四、兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物的免疫原性研究4.1免疫原性評(píng)價(jià)方法免疫原性是指抗原能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）特異性結(jié)合的能力。對(duì)于兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物而言，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其免疫原性至關(guān)重要，這直接關(guān)系到該衍生物作為藥物的安全性和有效性。目前，常用的免疫原性評(píng)價(jià)方法主要包括體內(nèi)和體外兩大類。體內(nèi)免疫原性評(píng)價(jià)方法主要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行。將兩性離子多肽修飾的GLP-1衍生物給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如大鼠、小鼠、兔子等，按照一定的劑量和給藥周期進(jìn)行處理。在給藥過程中，定期采集動(dòng)物的血液樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血清中抗藥物抗體（ADA）的水平。ELISA是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫分析技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。通過將修飾后的GLP-1衍生物固定在酶標(biāo)板上，加入待檢測(cè)的血清樣本，若血清中存在抗藥物抗體，其會(huì)與固定的抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的二抗，最后通過底物顯色反應(yīng)，根據(jù)吸光度值的大小來定量檢測(cè)抗藥物抗體的含量。除了檢測(cè)抗藥物抗體水平，還可以通過觀察動(dòng)物的體重變化、進(jìn)食量、精神狀態(tài)等一般生理指標(biāo)，以及對(duì)動(dòng)物的重要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，來評(píng)估藥物是否引起了免疫相關(guān)