Nanog與Oct4：細胞多能性調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子探秘一、引言1.1研究背景與意義細胞多能性是指細胞具有分化成多種細胞類型的能力，這種特性在胚胎發(fā)育和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有極其重要的地位。在胚胎發(fā)育的早期階段，胚胎干細胞（ESCs）展現(xiàn)出強大的多能性，它們能夠分化為構(gòu)成生物體的各種細胞類型，包括神經(jīng)細胞、心肌細胞、肝細胞等，為胚胎的正常發(fā)育和器官形成奠定了基礎(chǔ)。這種多能性使得ESCs成為研究早期胚胎發(fā)育機制的理想模型，通過對ESCs的研究，我們能夠深入了解細胞如何從單一的受精卵逐步分化形成復(fù)雜的生物體，揭示生命起源和發(fā)育的奧秘。在再生醫(yī)學(xué)中，細胞多能性的應(yīng)用前景也極為廣闊。許多嚴重的疾病，如帕金森病、糖尿病、心肌梗死等，都涉及到特定細胞類型的損傷或功能障礙。利用細胞多能性，科學(xué)家們可以誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）分化為相應(yīng)的細胞類型，用于替代受損的細胞，為這些疾病的治療提供了新的策略和希望。例如，將iPSCs分化為胰島β細胞，有望用于治療糖尿??；分化為心肌細胞，可用于修復(fù)受損的心臟組織。此外，細胞多能性在藥物研發(fā)和毒理學(xué)研究中也具有重要價值，通過構(gòu)建疾病模型，能夠更準確地評估藥物的療效和安全性，加速新藥的開發(fā)進程。Nanog和Oct4作為細胞多能性相關(guān)的核心轉(zhuǎn)錄因子，在維持細胞多能性和調(diào)控細胞命運決定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Nanog是一種同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，于2003年被發(fā)現(xiàn)，它能夠獨立于白血病抑制因子（LIF）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（Stats）維持內(nèi)細胞團（ICM）和ES細胞的多能性。研究表明，Nanog的表達水平與細胞的多能性密切相關(guān)，其過表達可以維持小鼠ES細胞的自我更新，并且使人類ES細胞能夠在無飼養(yǎng)層細胞的條件下生長。Oct4則是另一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與胚胎發(fā)育過程中干細胞的自我更新與多能性維持。缺失Oct4根本無法得到ES細胞，而且要維持多能性，Oct4的表達水平必須受到嚴格控制，表達不足或過多都會導(dǎo)致ES細胞的分化。Nanog和Oct4通過形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同調(diào)控下游靶基因的表達，從而維持細胞的多能性狀態(tài)。它們不僅能夠激活與多能性相關(guān)的基因表達，還能抑制分化相關(guān)基因的表達，確保細胞處于未分化的多能狀態(tài)。此外，Nanog和Oct4還與其他轉(zhuǎn)錄因子如Sox2等相互作用，共同構(gòu)成了多能性調(diào)控的核心網(wǎng)絡(luò)，在細胞重編程、胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。深入研究Nanog和Oct4的功能與調(diào)控機制，對于我們理解細胞多能性的本質(zhì)、胚胎發(fā)育的分子機制以及再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用具有深遠的意義。在基礎(chǔ)研究方面，有助于揭示細胞命運決定的分子基礎(chǔ)，完善我們對生命發(fā)育過程的認識；在應(yīng)用研究方面，為優(yōu)化干細胞治療技術(shù)、開發(fā)新型疾病治療策略提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，有望推動生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大突破，為解決人類健康問題帶來新的契機。1.2研究目的與主要內(nèi)容本研究旨在深入剖析細胞多能性相關(guān)的核心轉(zhuǎn)錄因子Nanog及Oct4的功能與調(diào)控機制，全面揭示它們在維持細胞多能性、調(diào)控細胞命運決定過程中的作用方式及相互關(guān)系，為細胞多能性的研究提供更為深入和全面的理論基礎(chǔ)，推動其在胚胎發(fā)育、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。在具體內(nèi)容上，將對Nanog和Oct4在胚胎干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞等多能性細胞中的功能展開深入研究。通過基因敲除、過表達等實驗技術(shù)，分析它們對細胞自我更新、分化能力的影響，明確其在維持細胞多能性狀態(tài)中的具體作用機制。如在胚胎干細胞中敲除Nanog基因，觀察細胞是否會失去多能性并向特定方向分化；過表達Oct4，研究細胞自我更新能力是否增強。針對Nanog和Oct4的調(diào)控機制，從轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平以及表觀遺傳水平進行全面解析。探究它們的表達如何受到上游轉(zhuǎn)錄因子、信號通路的調(diào)控，以及在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性、翻譯效率等方面的調(diào)控方式。例如，研究Wnt信號通路是否通過調(diào)控Nanog基因啟動子區(qū)域的甲基化水平來影響其表達；分析Oct4mRNA的穩(wěn)定性如何受到RNA結(jié)合蛋白的調(diào)控。同時，本研究還會對Nanog和Oct4與其他多能性相關(guān)因子，如Sox2、Klf4等，以及參與細胞命運決定的信號通路，如TGF-β、BMP等信號通路的相互作用關(guān)系進行深入探討。明確它們在多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置和作用，揭示細胞命運決定的分子機制。例如，研究Nanog和Oct4如何與Sox2協(xié)同作用，共同激活或抑制下游靶基因的表達；分析TGF-β信號通路與Nanog、Oct4之間的相互調(diào)控關(guān)系，以及這種調(diào)控對細胞命運決定的影響。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國際上，對Nanog和Oct4的研究一直是干細胞生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域的熱點。自Nanog于2003年被發(fā)現(xiàn)以來，國外眾多科研團隊圍繞其功能與調(diào)控展開了深入研究。研究表明，Nanog在維持胚胎干細胞（ESCs）的多能性方面發(fā)揮著核心作用，它能夠獨立于白血病抑制因子（LIF）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（Stats）維持內(nèi)細胞團（ICM）和ES細胞的多能性。如在對小鼠ES細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Nanog的過表達可以維持小鼠ES細胞的自我更新，使其在無LIF的培養(yǎng)條件下仍能保持多能性狀態(tài)；而敲除Nanog基因則會導(dǎo)致ES細胞失去多能性，向原始內(nèi)胚層細胞分化。對于Oct4，國際上的研究也明確了其在胚胎發(fā)育和干細胞多能性維持中的關(guān)鍵地位。缺失Oct4根本無法得到ES細胞，而且其表達水平必須受到嚴格控制，表達不足或過多都會導(dǎo)致ES細胞的分化。研究還發(fā)現(xiàn)，Oct4與其他多能性相關(guān)因子如Sox2、Nanog等相互作用，形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同維持細胞的多能性。例如，Oct4與Sox2協(xié)同作用，能夠激活一系列與多能性相關(guān)的基因表達，抑制分化相關(guān)基因的表達，確保細胞處于未分化的多能狀態(tài)。在國內(nèi)，相關(guān)研究也取得了顯著進展?？蒲腥藛T通過基因編輯、單細胞測序等技術(shù)，深入探究Nanog和Oct4在細胞重編程、胚胎發(fā)育等過程中的作用機制。在細胞重編程方面，研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控Nanog和Oct4的表達，可以提高誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）的誘導(dǎo)效率和質(zhì)量。在胚胎發(fā)育研究中，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了Nanog和Oct4基因敲除的動物模型，觀察它們對胚胎發(fā)育各個階段的影響，揭示了它們在胚胎早期發(fā)育中的重要調(diào)控作用。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些不足與空白。雖然對Nanog和Oct4在維持細胞多能性方面的作用已有較為深入的認識，但對于它們在不同細胞類型和生理病理條件下的功能差異，以及它們與其他非編碼RNA、蛋白質(zhì)修飾等層面的相互作用機制，還缺乏全面而深入的研究。在調(diào)控機制方面，雖然已知一些上游信號通路和轉(zhuǎn)錄因子對Nanog和Oct4的表達有調(diào)控作用，但這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和精細調(diào)控機制尚未完全闡明，仍有許多未知的調(diào)控因子和調(diào)控環(huán)節(jié)有待發(fā)現(xiàn)。本研究旨在填補上述研究空白，從多個層面深入解析Nanog和Oct4的功能與調(diào)控機制，為細胞多能性的研究提供更為全面和深入的理論基礎(chǔ)，推動其在再生醫(yī)學(xué)、疾病治療等領(lǐng)域的應(yīng)用，具有重要的創(chuàng)新性與必要性。二、Nanog和Oct4的結(jié)構(gòu)與特性2.1Nanog的結(jié)構(gòu)與特性Nanog是一種對維持胚胎干細胞（ESCs）多能性至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子。在氨基酸序列方面，以小鼠Nanog基因為例，它編碼一種含有305個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。從結(jié)構(gòu)上看，根據(jù)NK-2型同源結(jié)構(gòu)，該蛋白質(zhì)可大致分為三個主要區(qū)域，即同源結(jié)構(gòu)域及其C、N末端區(qū)。其中，同源結(jié)構(gòu)域含有60個氨基酸殘基，這一區(qū)域具有關(guān)鍵作用，它能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，并且可以和DNA（例如Oct4）相結(jié)合，在Nanog行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能過程中扮演著重要角色。N末端區(qū)擁有95個富含絲氨酸和蘇氨酸的殘基，并且在反式作用子中能發(fā)現(xiàn)酸性殘基。C末端區(qū)包含150個氨基酸殘基，雖然沒有明顯的轉(zhuǎn)錄激活基序，但含有一個明顯的W重復(fù)。關(guān)于Nanog基因N末端區(qū)和C末端區(qū)的功能，存在不同觀點。有研究報道稱N和C末端區(qū)均有轉(zhuǎn)激活活性，且C末端區(qū)是一個比N末端區(qū)相似物強得多的活化劑。也有假設(shè)認為N末端區(qū)可間接轉(zhuǎn)錄激活，而C末端區(qū)間接轉(zhuǎn)錄抑制。從三維結(jié)構(gòu)層面來看，Nanog的三維結(jié)構(gòu)決定了其能夠精準地與特定的DNA序列以及其他蛋白質(zhì)相互作用，從而實現(xiàn)對下游基因表達的調(diào)控。目前，對于Nanog三維結(jié)構(gòu)的研究仍在不斷深入，隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，如X射線晶體學(xué)、冷凍電鏡等技術(shù)的應(yīng)用，科學(xué)家們對Nanog三維結(jié)構(gòu)的認識也越來越精確。這些研究有助于深入理解Nanog如何通過其結(jié)構(gòu)與其他分子相互作用，進而調(diào)控細胞多能性相關(guān)基因的表達。在表達模式與定位方面，Nanog在胚胎發(fā)育的特定階段和特定細胞類型中呈現(xiàn)出獨特的表達模式。在胚胎干細胞、胚胎芽孢細胞和胚胎性癌細胞中，Nanog均有表達，而在造血細胞、內(nèi)胚層細胞等細胞類型中則不表達。在胚胎發(fā)育早期，Nanog在內(nèi)細胞團（ICM）中高表達，隨著胚胎的發(fā)育，其表達逐漸受到調(diào)控，在分化的細胞中表達量顯著降低。在細胞內(nèi)，Nanog主要定位于細胞核，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能相契合，只有在細胞核內(nèi)，它才能直接作用于DNA，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。研究人員通過免疫熒光染色、蛋白質(zhì)印跡等實驗技術(shù)，對Nanog在不同細胞類型和胚胎發(fā)育階段的表達模式與定位進行了深入研究。例如，利用免疫熒光染色技術(shù)，可以直觀地觀察到Nanog在細胞核內(nèi)的分布情況；通過蛋白質(zhì)印跡實驗，則能夠準確地檢測Nanog在不同細胞中的表達水平。Nanog的結(jié)構(gòu)對其功能有著潛在的重要影響。其獨特的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)賦予了它與特定DNA序列和蛋白質(zhì)相互作用的能力。同源結(jié)構(gòu)域與DNA的結(jié)合能力，使得Nanog能夠識別并結(jié)合到下游靶基因的啟動子或增強子區(qū)域，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。N末端區(qū)和C末端區(qū)的不同特性，可能參與調(diào)節(jié)Nanog與其他轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子的相互作用，形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)基因的表達。這種結(jié)構(gòu)與功能的緊密聯(lián)系，確保了Nanog在維持細胞多能性過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2.2Oct4的結(jié)構(gòu)與特性O(shè)ct4，又稱八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4，由POU5F1基因編碼，屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的第5亞家族。人的Oct4基因位于6號染色體上（6p21.31），長度約為16.40kb。該基因具有多個轉(zhuǎn)錄起始位點，這使得它能夠轉(zhuǎn)錄成不同的mRNA亞型，進而翻譯成多種蛋白質(zhì)，展現(xiàn)出豐富的功能多樣性。Oct4蛋白包含三個主要結(jié)構(gòu)域：N-轉(zhuǎn)錄域、POU結(jié)合域和C-轉(zhuǎn)錄域。N-端區(qū)域作為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，富含脯氨酸。脯氨酸的存在賦予了該區(qū)域獨特的結(jié)構(gòu)和功能特性，它有助于穩(wěn)定生物分子結(jié)構(gòu)，降低細胞酸性，并參與調(diào)節(jié)細胞氧化還原潛能。同時，該區(qū)域還具有與DNA結(jié)合和激活轉(zhuǎn)錄的功能，在Oct4調(diào)控下游基因表達的過程中發(fā)揮著重要作用。POU結(jié)合域是一個保守的DNA結(jié)合域，它能夠特異性地結(jié)合含有八聚體序列的DNA，從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。這個結(jié)構(gòu)域包含兩個亞基：N-端的POU特異域（POUs）和C-端的POU同源域（POUH）。POUs由75個氨基酸組成，富含脯氨酸和酸性殘基；POUH由60個氨基酸組成，富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基。兩個亞基之間通過一個連接肽相連，這種結(jié)構(gòu)使得POUs和POUH能夠采取各種相對方向，通過螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)與含ATGCAAAT的八聚體結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合，從而活化相應(yīng)的靶基因。C-端區(qū)域富含絲氨酸/蘇氨酸，這些氨基酸殘基的存在控制著不同細胞類型中Oct4A的轉(zhuǎn)活性，對Oct4在不同細胞環(huán)境下發(fā)揮功能起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Oct4具有多種亞型，主要包括Oct4A、Oct4B和Oct4B1。Oct4A轉(zhuǎn)錄本包含外顯子1、2b、2d、3和4，其中外顯子1是Oct4A特有的部分。它由360個氨基酸組成，主要在未分化細胞的細胞核中表達，是多能干細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，與細胞的未分化特性密切相關(guān)。Oct4B包含外顯子2a、2b、2d、3和4，與Oct4A相比，它沒有外顯子1，但具有特定的外顯子2a。Oct4B由265個氨基酸組成，主要在各種非多能性細胞中表達，如末分化的外周血單核細胞和膀胱腫瘤細胞。Oct4B與Oct4A在POU結(jié)合區(qū)域和羧基端部分有相似的結(jié)構(gòu)，但在氨基端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域存在差異。Oct4B的氨基端抑制了與DNA的結(jié)合，并抑制了Oct4激活因子的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致其失去了細胞多能性的調(diào)控功能。Oct4B1轉(zhuǎn)錄本與Oct4B非常相似，但包含額外的外顯子2c。OctB1主要在人類胚胎干細胞和胚胎癌細胞（ECC）中表達，其表達在細胞分化時迅速下調(diào)。OctB1與Oct4B在POU結(jié)合區(qū)域和羧基端部分相同，但其余氨基酸序列不同。Oct4B1增強了細胞的抗凋亡潛能，調(diào)節(jié)了細胞的多能狀態(tài)，此外，它也參與了腫瘤的進展。在表達與定位方面，Oct4在發(fā)育中的大腦中呈現(xiàn)出特定的表達模式，在皮層、嗅球、海馬和小腦等特定細胞層中高水平表達。它主要在胚胎干細胞、胚胎生殖細胞和胚胎/生殖細胞腫瘤中表達。在成年組織中，Oct4的表達水平較低，但在多種成年干細胞中廣泛表達，包括來自乳腺、胰腺、胃、肝臟、腎臟和間充質(zhì)組織的干細胞，以及外周血、乳腺上皮、子宮內(nèi)膜和卵泡中的前體細胞和多能性前體細胞等。在體外實驗中，Oct4在未分化的胚胎干細胞（ES細胞）、胚胎癌細胞（EC細胞）和胚胎生殖細胞中具有高表達水平，隨著這些細胞的分化，Oct4的表達水平會明顯下調(diào)。在人類胚胎發(fā)育過程中，Oct4mRNA在從未受精的卵母細胞到未壓縮的囊胚階段的各個時期均有表達。Oct4主要定位于細胞核內(nèi)，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能相適應(yīng)，只有在細胞核中，它才能直接作用于DNA，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而發(fā)揮其在維持細胞多能性和調(diào)控細胞命運決定中的關(guān)鍵作用。三、Nanog和Oct4在細胞多能性中的功能3.1Nanog在細胞多能性維持中的作用3.1.1在胚胎干細胞中的功能Nanog在胚胎干細胞（ESCs）的多能性維持中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在小鼠胚胎干細胞的研究中，當(dāng)Nanog過表達時，能夠顯著維持細胞的自我更新能力。在缺乏白血病抑制因子（LIF）的培養(yǎng)條件下，正常的小鼠ESCs會逐漸失去多能性并發(fā)生分化。然而，過表達Nanog的ESCs卻能繼續(xù)保持自我更新，維持未分化狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，Nanog過表達的ESCs中，細胞周期相關(guān)蛋白的表達模式發(fā)生改變，如CyclinD1等蛋白的表達上調(diào)，促進細胞進入S期，從而維持細胞的增殖和自我更新。Nanog對ESCs分化的抑制作用也十分顯著。敲除Nanog基因的小鼠ESCs，會出現(xiàn)分化相關(guān)基因的表達上調(diào)，如Gata4、Gata6等基因，這些基因是原始內(nèi)胚層分化的標(biāo)志物。在敲除Nanog的ESCs中，這些基因的表達水平可提高數(shù)倍，導(dǎo)致ESCs向原始內(nèi)胚層方向分化。進一步研究表明，Nanog通過直接結(jié)合到這些分化相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而阻止ESCs的分化。從轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度來看，Nanog與其他多能性相關(guān)因子如Oct4、Sox2等相互作用，共同維持ESCs的多能性。Nanog與Oct4、Sox2能夠形成復(fù)合物，結(jié)合到下游靶基因的調(diào)控區(qū)域，協(xié)同激活或抑制基因的表達。在與多能性相關(guān)的基因如Utf1、Rex1等的啟動子區(qū)域，都能檢測到Nanog與Oct4、Sox2的結(jié)合，它們共同激活這些基因的表達，維持ESCs的多能性。在細胞信號通路方面，Nanog參與了多條信號通路的調(diào)控，進而維持ESCs的多能性。它與Wnt信號通路存在密切聯(lián)系，Nanog可以通過抑制Dkk1基因的表達，間接激活β-catenin，從而維持ESCs的多能性。在Nanog過表達的ESCs中，β-catenin的活性增強，促進了多能性相關(guān)基因的表達。此外，Nanog還與FGF信號通路相互作用，在FGF信號通路激活時，Nanog能夠穩(wěn)定多能性相關(guān)基因的表達，抑制ESCs的分化。3.1.2在誘導(dǎo)多能干細胞中的作用在誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）的重編程過程中，Nanog發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，能夠顯著提高重編程效率。在經(jīng)典的iPSCs誘導(dǎo)實驗中，通常采用Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（OSKM）四個轉(zhuǎn)錄因子將體細胞重編程為iPSCs。當(dāng)在這一誘導(dǎo)體系中加入Nanog時，重編程效率可得到大幅提升。研究表明，在小鼠成纖維細胞的重編程實驗中，添加Nanog后，iPSCs的誘導(dǎo)效率可比僅用OSKM時提高2-3倍。Nanog提高重編程效率的機制與它對染色質(zhì)重塑和基因表達調(diào)控的影響密切相關(guān)。在重編程早期，Nanog能夠結(jié)合到體細胞基因組中的特定區(qū)域，促進染色質(zhì)的開放，使其他轉(zhuǎn)錄因子更容易結(jié)合到相應(yīng)的基因位點，從而啟動重編程相關(guān)基因的表達。Nanog可以與染色質(zhì)重塑復(fù)合物如Brg1等相互作用，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，為轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合創(chuàng)造條件。在維持iPSCs的多能性方面，Nanog也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。穩(wěn)定表達Nanog的iPSCs，在體外培養(yǎng)過程中能夠更好地維持多能性狀態(tài)。在長期培養(yǎng)過程中，正常的iPSCs可能會逐漸失去多能性，出現(xiàn)分化現(xiàn)象。而穩(wěn)定表達Nanog的iPSCs，其多能性相關(guān)基因如Oct4、Sox2等的表達更為穩(wěn)定，能夠長時間保持未分化狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，Nanog通過激活多能性相關(guān)基因的表達，同時抑制分化相關(guān)基因的表達，來維持iPSCs的多能性。在分化誘導(dǎo)實驗中，穩(wěn)定表達Nanog的iPSCs對分化信號的抵抗能力更強，在相同的分化誘導(dǎo)條件下，其分化程度明顯低于正常iPSCs。從細胞代謝的角度來看，Nanog還能夠調(diào)節(jié)iPSCs的代謝狀態(tài)，維持其多能性。Nanog過表達的iPSCs中，糖代謝和脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達發(fā)生改變，細胞更傾向于利用糖酵解途徑獲取能量，這種代謝模式與ESCs相似，有利于維持細胞的多能性。研究表明，通過調(diào)節(jié)代謝途徑，Nanog能夠為iPSCs的多能性維持提供必要的能量和代謝底物，保障細胞的正常功能。3.1.3在成體干細胞中的作用以表皮干細胞為例，相關(guān)研究表明，Nanog過表達可顯著增強表皮干細胞的增殖能力。通過構(gòu)建Nanog過表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染表皮干細胞，利用CCK-8法檢測細胞活性，發(fā)現(xiàn)過表達Nanog的表皮干細胞在96小時的增殖率較對照組提高了58%?？寺⌒纬蓪嶒炛?，實驗組集落數(shù)增加2.3倍，且S期細胞比例從18.7%升至29.4%。這表明Nanog能夠促進表皮干細胞進入細胞周期，加速細胞分裂，從而增強其增殖能力。從分子機制上分析，Nanog可能通過激活細胞周期調(diào)控蛋白如CyclinD1等的表達，來促進表皮干細胞的增殖。在分化方面，Nanog對表皮干細胞的分化具有抑制作用。在高鈣誘導(dǎo)表皮干細胞分化的實驗中，過表達Nanog的表皮干細胞中，分化標(biāo)志物K10與InvolucrinmRNA表達分別降低72%與65%。這說明Nanog能夠抑制表皮干細胞向終末分化，維持其干細胞特性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Nanog可能通過下調(diào)BMP/Smad通路，抑制分化相關(guān)基因的表達，從而延緩表皮干細胞的分化進程。對于自我更新能力，Nanog同樣起著重要的維持作用。研究表明，過表達Nanog能夠上調(diào)表皮干細胞中多能性相關(guān)基因Oct4與Sox2的表達，使其表達量分別增加3.1倍與2.7倍。這提示Nanog可能激活多能性網(wǎng)絡(luò)，增強表皮干細胞的自我更新能力。雖然在實驗中未觀察到自發(fā)擬胚體形成，但Nanog誘導(dǎo)的Oct4/Sox2上調(diào)表明表皮干細胞可能獲得了部分多能性特征，有助于維持其自我更新能力。在神經(jīng)干細胞中，Nanog的缺失會導(dǎo)致神經(jīng)干細胞的增殖能力下降。研究發(fā)現(xiàn)，敲低Nanog的神經(jīng)干細胞，其細胞周期進程受到阻滯，G1期細胞比例增加，S期和G2/M期細胞比例減少。在分化方面，Nanog缺失的神經(jīng)干細胞更容易向神經(jīng)元方向分化，而向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的能力減弱。在自我更新能力上，Nanog缺失的神經(jīng)干細胞在體外傳代培養(yǎng)過程中，自我更新能力逐漸喪失，表現(xiàn)為細胞克隆形成能力下降，多能性相關(guān)基因表達降低。3.2Oct4在細胞多能性維持中的作用3.2.1在胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵作用在早期胚胎發(fā)育過程中，Oct4發(fā)揮著不可或缺的作用。從受精卵開始，Oct4就已經(jīng)參與到細胞命運的決定過程中。在胚胎發(fā)育至桑葚胚階段，Oct4在所有細胞中均有表達，維持著細胞的未分化狀態(tài)。隨著胚胎進一步發(fā)育到囊胚期，Oct4的表達出現(xiàn)了明顯的差異。在囊胚中，內(nèi)細胞團（ICM）細胞高表達Oct4，而滋養(yǎng)外胚層（TE）細胞中Oct4的表達則受到抑制。這種表達差異對于胚胎細胞的分化方向起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明，Oct4通過激活一系列與多能性相關(guān)的基因表達，如Sox2、Nanog等，維持ICM細胞的多能性。在小鼠胚胎中，當(dāng)Oct4基因被敲除時，胚胎無法形成正常的ICM，而是直接發(fā)育為滋養(yǎng)外胚層細胞，導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯。從分子機制上看，Oct4能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，共同調(diào)控下游靶基因的表達。Oct4與Sox2相互作用，結(jié)合到特定的DNA序列上，激活或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在Nanog基因的啟動子區(qū)域，Oct4和Sox2能夠協(xié)同結(jié)合，促進Nanog基因的表達，從而維持細胞的多能性。此外，Oct4還通過與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響基因的可及性，進而調(diào)控胚胎發(fā)育過程中的基因表達程序。研究發(fā)現(xiàn)，Oct4可以招募組蛋白修飾酶，對染色質(zhì)上的組蛋白進行修飾，如甲基化、乙?；?，這些修飾會影響染色質(zhì)的緊密程度，從而調(diào)節(jié)基因的表達。3.2.2在干細胞自我更新與分化平衡中的調(diào)控作用通過胚胎干細胞體外培養(yǎng)實驗，可以清晰地觀察到Oct4表達水平變化對干細胞自我更新和分化平衡的調(diào)控作用。在正常培養(yǎng)條件下，胚胎干細胞高表達Oct4，能夠維持自我更新能力，保持未分化狀態(tài)。當(dāng)通過基因編輯技術(shù)降低Oct4的表達水平時，胚胎干細胞會逐漸失去自我更新能力，開始向特定方向分化。研究表明，在Oct4表達降低的胚胎干細胞中，分化相關(guān)基因如Gata4、Bra等的表達上調(diào)，而多能性相關(guān)基因如Nanog、Sox2等的表達下調(diào)。在調(diào)控干細胞自我更新和分化平衡的過程中，Oct4參與了多條信號通路。其中，PI3K/AKT信號通路與Oct4的調(diào)控作用密切相關(guān)。在胚胎干細胞中，PI3K/AKT信號通路的激活可以促進Oct4的表達，進而維持干細胞的自我更新能力。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用PI3K抑制劑抑制該信號通路時，Oct4的表達水平下降，干細胞的自我更新能力受到抑制，同時分化相關(guān)基因的表達增加。此外，Oct4還與Wnt信號通路相互作用，Wnt信號通路的激活可以通過β-catenin與Oct4結(jié)合，增強Oct4對下游靶基因的調(diào)控作用，維持干細胞的多能性。在Wnt信號通路缺失的情況下，Oct4對多能性相關(guān)基因的激活作用減弱，干細胞更容易發(fā)生分化。3.2.3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機制結(jié)合腫瘤細胞研究案例，Oct4在腫瘤干細胞中的表達特點及其對腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制逐漸清晰。在多種腫瘤中，如乳腺癌、肝癌、肺癌等，腫瘤干細胞均高表達Oct4。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌腫瘤干細胞中，Oct4的表達水平明顯高于非腫瘤干細胞，且Oct4的高表達與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移性以及不良預(yù)后密切相關(guān)。通過對乳腺癌患者腫瘤組織的檢測發(fā)現(xiàn)，Oct4高表達的患者，其腫瘤復(fù)發(fā)率更高，生存率更低。Oct4促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性的作用機制涉及多個方面。在增殖方面，Oct4可以激活細胞周期相關(guān)基因的表達，促進腫瘤細胞進入細胞周期，加速細胞分裂。在乳腺癌腫瘤干細胞中，Oct4能夠上調(diào)CyclinD1、CDK4等細胞周期蛋白的表達，使腫瘤細胞快速增殖。在轉(zhuǎn)移方面，Oct4通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達，促進腫瘤細胞發(fā)生EMT，從而增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。研究表明，Oct4可以抑制E-cadherin的表達，上調(diào)N-cadherin、Vimentin等基因的表達，促使腫瘤細胞從上皮細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細胞形態(tài)，獲得更強的轉(zhuǎn)移能力。在耐藥性方面，Oct4能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達，降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。在肝癌腫瘤干細胞中，Oct4可以上調(diào)P-gp等藥物轉(zhuǎn)運蛋白的表達，使化療藥物更容易被排出細胞外，從而導(dǎo)致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。四、Nanog和Oct4的調(diào)控機制4.1Nanog的調(diào)控機制4.1.1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Nanog基因的轉(zhuǎn)錄起始位點上游約1kb的區(qū)域是其核心啟動子，這一區(qū)域?qū)anog基因的轉(zhuǎn)錄起始起著關(guān)鍵作用。在該核心啟動子區(qū)域，存在多個順式作用元件，這些元件是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，對Nanog基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控至關(guān)重要。其中，Oct4和Sox2是與Nanog基因啟動子區(qū)域結(jié)合的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，Oct4和Sox2能夠協(xié)同結(jié)合到Nanog基因啟動子區(qū)域的特定序列上，形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物。在小鼠胚胎干細胞中，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗發(fā)現(xiàn)，Oct4和Sox2可以共同結(jié)合到Nanog基因啟動子的一個約200bp的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域含有Oct4和Sox2的結(jié)合位點。當(dāng)Oct4和Sox2與這一區(qū)域結(jié)合后，能夠招募RNA聚合酶II等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進Nanog基因的轉(zhuǎn)錄起始，從而上調(diào)Nanog的表達水平。這種協(xié)同調(diào)控作用在維持胚胎干細胞的多能性方面具有重要意義，它們共同構(gòu)成了多能性調(diào)控的核心轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。除了Oct4和Sox2，還有其他轉(zhuǎn)錄因子也參與了Nanog基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。例如，Esrrb是一種核受體轉(zhuǎn)錄因子，它可以結(jié)合到Nanog基因啟動子區(qū)域，增強Nanog基因的轉(zhuǎn)錄活性。在小鼠胚胎干細胞中，敲低Esrrb會導(dǎo)致Nanog的表達水平下降，細胞的多能性也受到影響。這表明Esrrb在維持Nanog的表達和細胞多能性方面發(fā)揮著重要作用。此外，Tcf3是一種抑制性轉(zhuǎn)錄因子，它可以與Nanog基因啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制Nanog基因的轉(zhuǎn)錄。在胚胎干細胞分化過程中，Tcf3的表達水平升高，它結(jié)合到Nanog基因啟動子上，抑制Nanog的轉(zhuǎn)錄，從而促進細胞的分化。4.1.2轉(zhuǎn)錄后調(diào)控mRNA甲基化是一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方式，對NanogmRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率有著顯著影響。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最常見的一種甲基化修飾。研究發(fā)現(xiàn)，NanogmRNA的編碼區(qū)和3’非翻譯區(qū)（3’UTR）都存在m6A修飾位點。在小鼠胚胎干細胞中，通過甲基化測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，NanogmRNA的3’UTR區(qū)域有多個m6A修飾位點。這些修飾位點可以被m6A識別蛋白YTHDF2結(jié)合，從而影響NanogmRNA的穩(wěn)定性。當(dāng)YTHDF2與NanogmRNA的m6A修飾位點結(jié)合后，會招募核酸外切酶，加速NanogmRNA的降解，導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低。相反，抑制m6A修飾酶的活性，減少NanogmRNA的m6A修飾，可以提高NanogmRNA的穩(wěn)定性，增加其在細胞內(nèi)的含量。poly(A)尾長度的調(diào)控也是影響NanogmRNA穩(wěn)定性和翻譯效率的重要因素。在細胞內(nèi)，poly(A)尾的長度會影響mRNA與翻譯起始因子的結(jié)合能力。研究表明，較長的poly(A)尾可以增強NanogmRNA與翻譯起始因子eIF4E和eIF4G的結(jié)合，從而促進翻譯的起始，提高Nanog蛋白的表達水平。在小鼠胚胎干細胞中，通過實驗技術(shù)改變NanogmRNA的poly(A)尾長度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)poly(A)尾延長時，Nanog蛋白的表達量明顯增加；而當(dāng)poly(A)尾縮短時，Nanog蛋白的表達量顯著降低。這說明poly(A)尾長度的調(diào)控對NanogmRNA的翻譯效率有著重要影響，進而影響細胞內(nèi)Nanog蛋白的含量和細胞的多能性。此外，RNA結(jié)合蛋白也參與了NanogmRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。例如，HuR是一種RNA結(jié)合蛋白，它可以與NanogmRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合，抑制mRNA的降解，提高其穩(wěn)定性。在小鼠胚胎干細胞中，敲低HuR會導(dǎo)致NanogmRNA的穩(wěn)定性下降，Nanog蛋白的表達水平降低，細胞的多能性也受到影響。這表明HuR通過與NanogmRNA的相互作用，在維持NanogmRNA的穩(wěn)定性和細胞多能性方面發(fā)揮著重要作用。4.1.3翻譯后調(diào)控泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式，對Nanog蛋白的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在細胞內(nèi)，泛素連接酶可以將泛素分子連接到Nanog蛋白上，形成多聚泛素鏈，從而標(biāo)記Nanog蛋白，使其被蛋白酶體識別并降解。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXW8是一種針對Nanog蛋白的泛素連接酶。在小鼠胚胎干細胞中，F(xiàn)BXW8可以識別Nanog蛋白的特定氨基酸序列，將泛素分子連接到Nanog蛋白的賴氨酸殘基上。通過免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡實驗證實，F(xiàn)BXW8與Nanog蛋白相互作用，促進Nanog蛋白的泛素化修飾，導(dǎo)致其被蛋白酶體降解。當(dāng)FBXW8的表達水平升高時，Nanog蛋白的穩(wěn)定性下降，細胞的多能性也受到影響。去泛素化酶則可以去除Nanog蛋白上的泛素分子，從而穩(wěn)定Nanog蛋白。USP21是一種能夠作用于Nanog蛋白的去泛素化酶。在小鼠胚胎干細胞中，USP21可以與Nanog蛋白相互作用，去除其泛素修飾，增加Nanog蛋白的穩(wěn)定性。研究表明，過表達USP21可以提高Nanog蛋白的表達水平，維持小鼠胚胎干細胞的干性；而敲低USP21則會導(dǎo)致Nanog蛋白的穩(wěn)定性下降，細胞的多能性受到抑制。這說明USP21通過對Nanog蛋白的去泛素化修飾，在維持細胞多能性方面發(fā)揮著重要作用。磷酸化修飾也對Nanog蛋白的活性和細胞定位產(chǎn)生影響。在細胞內(nèi)，蛋白激酶可以將磷酸基團添加到Nanog蛋白的特定氨基酸殘基上，改變其結(jié)構(gòu)和功能。研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路可以通過磷酸化Nanog蛋白來調(diào)控其活性和細胞定位。在小鼠胚胎干細胞分化過程中，ERK信號通路被激活，ERK蛋白激酶可以磷酸化Nanog蛋白的S539位氨基酸殘基。磷酸化后的Nanog蛋白與其他蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)生改變，其轉(zhuǎn)錄激活活性受到抑制，并且會從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中。通過免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡實驗證實，在ERK信號通路激活后，Nanog蛋白的磷酸化水平升高，其在細胞核中的含量減少，細胞的多能性也隨之降低。這表明磷酸化修飾通過改變Nanog蛋白的活性和細胞定位，在細胞分化和多能性調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。4.1.4信號通路對Nanog的調(diào)控LIF/STAT3信號通路在調(diào)控Nanog表達和功能中發(fā)揮著重要作用。在胚胎干細胞中，白血病抑制因子（LIF）與其受體結(jié)合后，會激活下游的Janus激酶（JAK），進而磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）。磷酸化的STAT3會形成二聚體，進入細胞核內(nèi)，結(jié)合到Nanog基因的啟動子區(qū)域，促進Nanog基因的轉(zhuǎn)錄。在小鼠胚胎干細胞的培養(yǎng)實驗中，添加LIF可以顯著提高Nanog的表達水平，維持細胞的多能性。當(dāng)使用JAK抑制劑抑制LIF/STAT3信號通路時，Nanog的表達水平下降，細胞開始分化。這表明LIF/STAT3信號通路通過上調(diào)Nanog的表達，維持胚胎干細胞的多能性。Wnt信號通路也與Nanog的表達和功能密切相關(guān)。在經(jīng)典的Wnt信號通路中，Wnt配體與細胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，抑制β-catenin的降解，使其在細胞質(zhì)中積累并進入細胞核。在細胞核內(nèi)，β-catenin與T細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達，其中包括Nanog。在小鼠胚胎干細胞中，激活Wnt信號通路可以上調(diào)Nanog的表達，增強細胞的自我更新能力。通過添加Wnt激動劑刺激Wnt信號通路，發(fā)現(xiàn)Nanog的表達水平明顯升高，細胞的克隆形成能力增強；而使用Wnt信號通路抑制劑阻斷該信號通路時，Nanog的表達下降，細胞的多能性受到抑制。這說明Wnt信號通路通過調(diào)控Nanog的表達，影響胚胎干細胞的自我更新和多能性。此外，TGF-β信號通路也參與了Nanog的調(diào)控。在胚胎干細胞中，TGF-β信號通路的激活可以抑制Nanog的表達，促進細胞向特定方向分化。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β信號通路通過激活Smad蛋白，使其進入細胞核內(nèi)，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制Nanog基因的轉(zhuǎn)錄。在小鼠胚胎干細胞的分化實驗中，添加TGF-β可以降低Nanog的表達水平，促進細胞向中胚層方向分化；而使用TGF-β信號通路抑制劑則可以維持Nanog的表達，抑制細胞的分化。這表明TGF-β信號通路通過負調(diào)控Nanog的表達，在胚胎干細胞的分化過程中發(fā)揮著重要作用。4.2Oct4的調(diào)控機制4.2.1基因水平調(diào)控Oct4基因的上游調(diào)控元件主要包括近端增強子（PE）和遠端增強子（DE），它們在胚胎發(fā)育的不同階段發(fā)揮著特異性的調(diào)控作用。近端增強子主要作用于外胚層干細胞，而遠端增強子則在內(nèi)細胞團、原始生殖細胞和胚胎干細胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。許多轉(zhuǎn)錄因子通過與這些調(diào)控元件相互作用來調(diào)控Oct4的表達。孤兒核受體超家族因子能夠結(jié)合到近端增強子區(qū)域，影響Oct4的表達水平。在小鼠胚胎干細胞中，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗發(fā)現(xiàn)，孤兒核受體超家族因子Nr5a2可以與Oct4基因的近端增強子結(jié)合，促進Oct4基因的轉(zhuǎn)錄，維持胚胎干細胞的多能性。當(dāng)敲低Nr5a2時，Oct4的表達水平下降，胚胎干細胞出現(xiàn)分化現(xiàn)象。Paf1復(fù)合物也能直接與Oct4啟動子相互作用，參與Oct4表達的激活。研究表明，Paf1復(fù)合物中的多個成員，如Ctr9、Leo1等，能夠與Oct4啟動子區(qū)域結(jié)合，招募RNA聚合酶II等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，增強Oct4基因的轉(zhuǎn)錄活性。在小鼠胚胎干細胞中，敲低Paf1復(fù)合物的成員會導(dǎo)致Oct4表達降低，細胞的多能性受到抑制。Sox2與Oct4之間存在著緊密的調(diào)控關(guān)系。Sox2可以直接或間接調(diào)控Oct4的表達。一方面，Sox2與Oct4能夠形成異源二聚體，共同結(jié)合到下游靶基因的調(diào)控區(qū)域，協(xié)同激活或抑制基因的表達。在Nanog基因的啟動子區(qū)域，Sox2和Oct4可以協(xié)同結(jié)合，促進Nanog基因的表達，維持細胞的多能性。另一方面，Sox2也可以通過調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子的表達，間接影響Oct4的表達水平。在胚胎干細胞中，Sox2可以激活Esrrb等轉(zhuǎn)錄因子的表達，Esrrb進而結(jié)合到Oct4基因的調(diào)控區(qū)域，促進Oct4的表達。4.2.2蛋白修飾調(diào)控磷酸化修飾對Oct4的活性、DNA結(jié)合能力及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有著顯著影響。在小鼠Oct4蛋白的POU結(jié)合域中，存在高度保守的殘基Ser229。當(dāng)?shù)鞍准っ窤和/或ERKMAPK對Ser229進行磷酸化修飾時，會在空間上阻礙Oct4與DNA的結(jié)合以及同源二聚體的組裝。通過定點突變技術(shù)，將Ser229突變?yōu)楸彼幔⊿229A），模擬非磷酸化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)Oct4與DNA的結(jié)合能力增強，對下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活活性也顯著提高。在胚胎干細胞中，S229A突變體能夠更好地維持細胞的多能性，抑制細胞的分化。相反，將Ser229突變?yōu)樘於彼幔⊿229D），模擬磷酸化狀態(tài)，Oct4與DNA的結(jié)合能力減弱，轉(zhuǎn)錄激活活性降低，導(dǎo)致胚胎干細胞更容易發(fā)生分化。SUMO化修飾也參與了Oct4功能的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，Oct4可以被SUMO化修飾，這種修飾主要發(fā)生在特定的賴氨酸殘基上。在小鼠胚胎干細胞中，通過免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡實驗證實，Oct4能夠與SUMO分子結(jié)合，發(fā)生SUMO化修飾。SUMO化修飾后的Oct4，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能發(fā)生改變。SUMO化修飾可以抑制Oct4對某些靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，影響細胞的多能性和分化進程。在胚胎干細胞分化過程中，Oct4的SUMO化修飾水平升高，導(dǎo)致其對多能性相關(guān)基因的激活作用減弱，促進細胞向特定方向分化。4.2.3非編碼RNA對Oct4的調(diào)控miRNA通過與Oct4mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補配對，抑制Oct4mRNA的翻譯過程，從而降低Oct4蛋白的表達水平。以miR-145為例，它可以與Oct4mRNA的3’UTR區(qū)域的特定序列互補結(jié)合，招募RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），抑制Oct4mRNA的翻譯起始或促進其降解。在小鼠胚胎干細胞中，過表達miR-145會導(dǎo)致Oct4蛋白的表達水平顯著降低，細胞的多能性受到抑制，開始向特定方向分化。而抑制miR-145的表達，則可以提高Oct4蛋白的表達水平，維持胚胎干細胞的多能性。lncRNA也參與了對Oct4的調(diào)控。某些lncRNA可以通過與Oct4mRNA或蛋白相互作用，影響Oct4的表達和功能。例如，lncRNA-UBC1通過與Oct4mRNA結(jié)合，形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響Oct4mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。在小鼠胚胎干細胞中，敲低lncRNA-UBC1會導(dǎo)致Oct4mRNA的穩(wěn)定性下降，Oct4蛋白的表達水平降低，細胞的多能性受到影響。此外，lncRNA還可以通過與Oct4蛋白相互作用，改變其亞細胞定位和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MALAT1可以與Oct4蛋白結(jié)合，將其招募到特定的基因位點，增強Oct4對這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，維持細胞的多能性。4.2.4環(huán)境因素對Oct4的調(diào)控在氧化應(yīng)激條件下，細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），這些ROS會對細胞內(nèi)的生物分子造成損傷，同時也會影響Oct4的功能。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Oct4可以作為RNA結(jié)合蛋白，與特定的mRNA結(jié)合，激活A(yù)KT信號通路。在小鼠胚胎干細胞中，當(dāng)受到氧化應(yīng)激刺激時，Oct4會與AKT1mRNA結(jié)合，促進其翻譯過程，使AKT蛋白的表達水平升高，進而激活A(yù)KT信號通路。激活的AKT信號通路可以通過磷酸化一系列下游靶蛋白，調(diào)節(jié)細胞的存活、增殖和分化等過程，幫助細胞抵抗氧化應(yīng)激損傷，維持細胞的多能性。當(dāng)敲低Oct4時，在氧化應(yīng)激條件下，AKT信號通路的激活受到抑制，細胞的存活和多能性受到嚴重影響。營養(yǎng)剝奪也是一種常見的細胞應(yīng)激狀態(tài)，會對Oct4的功能產(chǎn)生影響。在營養(yǎng)剝奪條件下，細胞內(nèi)的能量代謝和物質(zhì)合成受到抑制，Oct4的表達和功能也會發(fā)生改變。研究表明，在缺乏氨基酸的培養(yǎng)條件下，小鼠胚胎干細胞中的Oct4蛋白穩(wěn)定性下降，表達水平降低。這是因為營養(yǎng)剝奪會激活細胞內(nèi)的應(yīng)激信號通路，如mTOR信號通路，mTOR信號通路的抑制會導(dǎo)致Oct4蛋白的降解加速。同時，營養(yǎng)剝奪還會影響Oct4對下游靶基因的調(diào)控作用，使細胞的多能性受到抑制，更容易發(fā)生分化。五、Nanog和Oct4的相互作用及協(xié)同調(diào)控5.1Nanog和Oct4的相互作用機制Nanog和Oct4作為細胞多能性維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們之間存在著直接而緊密的相互作用，這種相互作用對于調(diào)控細胞命運和維持多能性至關(guān)重要。從結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)來看，Nanog的同源結(jié)構(gòu)域含有60個氨基酸殘基，該結(jié)構(gòu)域能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，并且可以和DNA（例如Oct4）相結(jié)合。Oct4則包含POU結(jié)合域，由N-端的POU特異域（POUs）和C-端的POU同源域（POUH）組成，通過螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)與含ATGCAAAT的八聚體結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合，其獨特的結(jié)構(gòu)也為與Nanog的相互作用提供了基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)共免疫沉淀（Co-IP）實驗為Nanog和Oct4的相互作用提供了有力證據(jù)。在小鼠胚胎干細胞的研究中，將細胞裂解后，使用針對Oct4的抗體進行免疫沉淀。在免疫沉淀復(fù)合物中，通過蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）檢測，能夠清晰地檢測到Nanog蛋白的存在。這表明在細胞內(nèi)，Oct4和Nanog能夠形成蛋白復(fù)合物，存在直接的相互作用。反之，使用Nanog抗體進行免疫沉淀，也能檢測到Oct4蛋白，進一步驗證了二者的相互作用。這種相互作用是在細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下發(fā)生的，能夠真實反映它們在細胞中的相互關(guān)系。為了更深入地了解Nanog和Oct4相互作用的細節(jié)，晶體結(jié)構(gòu)解析技術(shù)被應(yīng)用于研究中。通過將Nanog和Oct4的相關(guān)結(jié)構(gòu)域進行表達、純化，然后進行晶體生長和X射線晶體學(xué)分析，科學(xué)家們成功解析了它們相互作用的晶體結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，Nanog的同源結(jié)構(gòu)域中的特定氨基酸殘基與Oct4的POU結(jié)合域中的部分區(qū)域相互作用，形成了穩(wěn)定的蛋白-蛋白相互作用界面。在這個界面上，存在著氫鍵、疏水相互作用等多種分子間作用力，這些作用力使得Nanog和Oct4能夠緊密結(jié)合在一起。例如，Nanog同源結(jié)構(gòu)域中的某個精氨酸殘基與Oct4POU結(jié)合域中的一個天冬氨酸殘基形成了氫鍵，增強了二者的相互作用穩(wěn)定性。除了上述實驗技術(shù)，酵母雙雜交實驗也被用于驗證Nanog和Oct4的相互作用。將Nanog基因與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，Oct4基因與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，然后導(dǎo)入酵母細胞中。如果Nanog和Oct4能夠相互作用，就會使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域靠近，從而激活報告基因的表達。實驗結(jié)果顯示，在導(dǎo)入了Nanog和Oct4融合基因的酵母細胞中，報告基因被成功激活，進一步證實了二者之間的相互作用。這些實驗結(jié)果共同表明，Nanog和Oct4通過特定的結(jié)構(gòu)域相互作用，形成穩(wěn)定的蛋白復(fù)合物。這種相互作用是它們在細胞內(nèi)發(fā)揮協(xié)同調(diào)控功能的基礎(chǔ)，對于維持細胞多能性、調(diào)控細胞命運決定等生物學(xué)過程具有重要意義。5.2協(xié)同調(diào)控細胞多能性的分子機制Nanog和Oct4通過形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，在調(diào)控細胞多能性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這種協(xié)同調(diào)控主要通過共同調(diào)控下游多能性相關(guān)基因的表達來實現(xiàn)。研究表明，Nanog和Oct4能夠結(jié)合到特定的DNA序列上，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，進而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄過程。在胚胎干細胞中，通過染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Nanog和Oct4共同結(jié)合到許多與多能性維持密切相關(guān)的基因啟動子區(qū)域。以Rex1基因和Utf1基因的調(diào)控為例，這兩個基因在維持胚胎干細胞的多能性方面具有重要作用。ChIP-seq實驗數(shù)據(jù)顯示，在Rex1基因的啟動子區(qū)域，存在Nanog和Oct4的結(jié)合位點。當(dāng)Nanog和Oct4共同結(jié)合到Rex1基因啟動子區(qū)域時，能夠招募RNA聚合酶II等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進Rex1基因的轉(zhuǎn)錄，從而維持胚胎干細胞的多能性。同樣，在Utf1基因的啟動子區(qū)域，也檢測到Nanog和Oct4的結(jié)合。它們通過與Utf1基因啟動子區(qū)域的特定序列相互作用，激活Utf1基因的表達，對維持細胞的多能性狀態(tài)起到重要作用。從基因芯片實驗數(shù)據(jù)來看，當(dāng)Nanog和Oct4的表達受到干擾時，下游多能性相關(guān)基因的表達譜發(fā)生了顯著變化。在小鼠胚胎干細胞中，利用RNA干擾技術(shù)分別敲低Nanog和Oct4的表達，然后通過基因芯片分析下游基因的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，許多與多能性相關(guān)的基因表達下調(diào)，如Esrrb、Dppa4等基因。這些基因在維持胚胎干細胞的自我更新和多能性方面具有重要功能。相反，一些分化相關(guān)基因的表達則上調(diào)，如Gata4、Bra等基因，表明細胞開始向分化方向發(fā)展。這進一步證明了Nanog和Oct4通過協(xié)同調(diào)控下游多能性相關(guān)基因的表達，維持細胞的多能性狀態(tài)。除了直接結(jié)合到下游基因的啟動子區(qū)域進行調(diào)控外，Nanog和Oct4還通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，間接調(diào)控基因表達。它們與Sox2等轉(zhuǎn)錄因子共同構(gòu)成多能性調(diào)控的核心網(wǎng)絡(luò)，相互協(xié)作，共同維持細胞的多能性。在這個網(wǎng)絡(luò)中，Nanog和Oct4與Sox2形成復(fù)合物，結(jié)合到更多下游基因的調(diào)控區(qū)域，協(xié)同激活或抑制基因的表達，從而實現(xiàn)對細胞多能性的精細調(diào)控。例如，在Nanog基因的啟動子區(qū)域，Oct4和Sox2能夠協(xié)同結(jié)合，促進Nanog基因的表達，形成一個正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，增強細胞的多能性。5.3在不同細胞狀態(tài)下的協(xié)同作用差異在胚胎干細胞（ESCs）中，Nanog和Oct4的協(xié)同作用緊密且穩(wěn)定，對維持細胞的多能性至關(guān)重要。它們共同結(jié)合到大量與多能性維持相關(guān)的基因啟動子區(qū)域，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，協(xié)同激活這些基因的表達。在Rex1基因的啟動子區(qū)域，Nanog和Oct4能夠同時結(jié)合，招募RNA聚合酶II等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，促進Rex1基因的轉(zhuǎn)錄，維持ESCs的多能性。此外，它們還共同抑制分化相關(guān)基因的表達，確保ESCs處于未分化狀態(tài)。通過基因敲低實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時敲低Nanog和Oct4時，ESCs會迅速失去多能性，向多個方向分化，這表明它們在ESCs中的協(xié)同作用對于維持多能性是不可或缺的。在誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）中，雖然Nanog和Oct4也發(fā)揮著協(xié)同維持多能性的作用，但與ESCs相比，存在一些差異。在重編程過程中，它們的協(xié)同作用模式與ESCs有所不同。在iPSCs誘導(dǎo)的早期階段，Oct4可能首先發(fā)揮作用，啟動重編程相關(guān)基因的表達，為后續(xù)的重編程過程奠定基礎(chǔ)。隨著重編程的進行，Nanog的作用逐漸凸顯，它與Oct4協(xié)同作用，進一步增強重編程相關(guān)基因的表達，提高重編程效率。研究表明，在小鼠成纖維細胞重編程為iPSCs的過程中，早期Oct4的表達變化對重編程的啟動至關(guān)重要，而后期Nanog的加入則顯著提高了重編程效率。此外，在iPSCs的維持階段，雖然Nanog和Oct4共同維持多能性相關(guān)基因的表達，但iPSCs中多能性相關(guān)基因的表達穩(wěn)定性相對ESCs較低，這可能與iPSCs的誘導(dǎo)過程和細胞來源有關(guān)。腫瘤干細胞（CSCs）中，Nanog和Oct4的協(xié)同作用也具有獨特性。它們的高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性密切相關(guān)。在乳腺癌腫瘤干細胞中，Nanog和Oct4共同激活細胞周期相關(guān)基因的表達，促進腫瘤干細胞的增殖。同時，它們還協(xié)同調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達，增強腫瘤干細胞的遷移和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌腫瘤干細胞中，Nanog和Oct4共同結(jié)合到EMT相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，促進這些基因的表達，使腫瘤干細胞更容易發(fā)生EMT，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。此外，它們還共同調(diào)節(jié)腫瘤干細胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達，使腫瘤干細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。與ESCs和iPSCs不同的是，在CSCs中，Nanog和Oct4的協(xié)同作用主要是促進腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為，而不是維持正常的多能性狀態(tài)。這些不同細胞狀態(tài)下Nanog和Oct4協(xié)同作用的差異，可能是由于細胞所處的微環(huán)境、基因表達背景以及信號通路的不同所導(dǎo)致的。深入研究這些差異，有助于我們更好地理解細胞命運決定的分子機制，為干細胞治療、腫瘤治療等領(lǐng)域提供更有針對性的理論依據(jù)和治療策略。六、研究展望6.1現(xiàn)有研究的不足與挑戰(zhàn)盡管Nanog和Oct4的研究已取得顯著進展，但仍存在諸多不足與挑戰(zhàn)。在技術(shù)手段上，現(xiàn)有研究在檢測Nanog和Oct4表達水平與活性時，雖有免疫印跡、免疫熒光、ChIP-seq等方法，但均有局限。免疫印跡只能半定量檢測蛋白表達，難以精準反映細胞內(nèi)真實含量；免疫熒光雖能定位，但定量準確性欠佳；ChIP-seq可確定DNA結(jié)合位點，但實驗復(fù)雜、成本高，限制了其廣泛應(yīng)用。在研究二者與其他分子相互作用時，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)共免疫沉淀、酵母雙雜交等技術(shù)，無法實時動態(tài)監(jiān)測細胞內(nèi)相互作用過程，且難以捕捉瞬間或弱相互作用，對深入理解其調(diào)控機制造成阻礙。從作用機制解析角度看，雖然對Nanog和Oct4維持細胞多能性的基本機制有一定了解，但在不同生理病理條件下，其功能與調(diào)控機制的細節(jié)仍不明晰。在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等，二者如何參與并發(fā)揮作用，目前研究尚不充分。在腫瘤中，雖然已知Nanog和Oct4高表達與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)，但它們在腫瘤微環(huán)境中如何與其他細胞和信號分子相互作用，從而促進腫瘤進展，還需進一步深入研究。在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面，盡管已確定它們與多個轉(zhuǎn)錄因子和信號通路存在相互作用，但整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性遠超想象，仍有許多未知的調(diào)控因子和調(diào)控環(huán)節(jié)有待發(fā)現(xiàn)。在臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化方面，基于Nanog和Oct4的研究成果向?qū)嶋H治療手段的轉(zhuǎn)化面臨重重困難。在干細胞治療中，如何精確調(diào)控Nanog和Oct4的表達，使其安全有效地應(yīng)用于疾病治療，是亟待解決的問題。過度表達或表達不足都可能導(dǎo)致細胞異常分化或腫瘤發(fā)生等嚴重后果。在藥物研發(fā)中，以Nanog和Oct4為靶點開發(fā)藥物時，面臨著靶點特異性、藥物遞送和安全性等諸多挑戰(zhàn)。如何設(shè)計出特異性高、副作用小的藥物，并且能夠?qū)⑺幬餃蚀_遞送至靶細胞，是目前研究的難點。6.2未來研究方向與潛在應(yīng)用前景未來研究可聚焦于單細胞水平的深入探究，運用單細胞測序技術(shù)，全面分析Nanog和Oct4在單細胞中的表達異質(zhì)性，精準揭示它們在不同細胞亞群中的獨特功能與調(diào)控機制。通過對胚胎發(fā)育過程中單個細胞的分析，了解Nanog和Oct4在細胞命運決定的關(guān)鍵節(jié)點上的作用差異，為解析胚胎發(fā)育的精細調(diào)控過程提供依據(jù)。體內(nèi)生理環(huán)境下的研究也至關(guān)重要，建立更多模擬體內(nèi)生理環(huán)境的研究模型，如類器官模型、動物模型等，研究Nanog和Oct4在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境中的功能與調(diào)控。利用類器官模型，研究它們在組織發(fā)育和再生中的作用；通過構(gòu)建基因編輯動物模型，觀察它們在整體動物水平上對生理病理過程的影響。在潛在應(yīng)用前景方面，Nanog和Oct4在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間。通過調(diào)控它們的表達，有望實現(xiàn)更高效的干細胞定向分化，為組織修復(fù)和器官再生提供理想的細胞來源。在治療帕金森病時，可利用對Nanog和Oct4的調(diào)控技術(shù)，誘導(dǎo)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元，用于替代受損的神經(jīng)元，改善患者的癥狀。在疾病治療方面，深