雜交瘤細(xì)胞的制備原理演講人：日期:目錄CONTENTS01制備原理概述02實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫處理03細(xì)胞融合操作流程04雜交瘤細(xì)胞篩選體系05單克隆細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)06技術(shù)應(yīng)用與質(zhì)量控制01制備原理概述單克隆抗體技術(shù)背景抗體是生物體對(duì)抗病原體的關(guān)鍵分子，具有高度特異性和多樣性?？贵w多樣性與特異性雜交瘤技術(shù)起源單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)雜交瘤技術(shù)是通過(guò)細(xì)胞融合將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成既能無(wú)限增殖又能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。單克隆抗體具有高度的特異性和均一性，是生物醫(yī)學(xué)研究和治療的重要工具。細(xì)胞融合基本理論細(xì)胞融合的關(guān)鍵步驟細(xì)胞融合的關(guān)鍵步驟包括細(xì)胞識(shí)別、膜融合、核融合和細(xì)胞質(zhì)融合。03細(xì)胞融合可分為自發(fā)融合和人工誘導(dǎo)融合兩種類(lèi)型。02細(xì)胞融合類(lèi)型細(xì)胞融合定義細(xì)胞融合是指在一定條件下，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并形成一個(gè)雜種細(xì)胞的過(guò)程。01技術(shù)路線(xiàn)核心步驟免疫小鼠制備B淋巴細(xì)胞01通過(guò)注射抗原刺激小鼠，使其產(chǎn)生特異性B淋巴細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的融合02將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆化03通過(guò)特定選擇性培養(yǎng)基篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。單克隆抗體的制備04將篩選出的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，收集其上清液即可獲得單克隆抗體。02實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫處理抗原選擇與制備方法抗原來(lái)源選擇具有高免疫原性、高純度、易制備的抗原，如細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)等。抗原制備根據(jù)抗原的性質(zhì)，采用適當(dāng)?shù)闹苽浞椒ǎ绯暡ㄆ扑?、反?fù)凍融、化學(xué)處理等，以釋放抗原的免疫原性。抗原純化通過(guò)離心、過(guò)濾、層析等方法，去除雜質(zhì)和無(wú)效成分，提高抗原的純度。動(dòng)物免疫方案設(shè)計(jì)免疫劑量免疫途徑免疫次數(shù)免疫佐劑根據(jù)抗原的免疫原性和動(dòng)物的體重，確定合理的免疫劑量，以保證免疫效果。根據(jù)抗原的性質(zhì)和動(dòng)物的生理特點(diǎn)，選擇合適的免疫途徑，如皮下注射、肌肉注射、腹腔注射等。根據(jù)抗原的免疫原性和動(dòng)物的免疫應(yīng)答情況，確定合理的免疫次數(shù)，以刺激動(dòng)物產(chǎn)生足夠的抗體。在免疫過(guò)程中，加入適當(dāng)?shù)淖魟玟X鹽、弗氏佐劑等，可以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫應(yīng)答，提高抗體的產(chǎn)生。免疫效果檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抗體效價(jià)檢測(cè)免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞免疫檢測(cè)攻毒實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA、間接免疫熒光等方法，檢測(cè)動(dòng)物血清中特異性抗體的效價(jià)，以評(píng)估免疫效果。通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞因子檢測(cè)等方法，檢測(cè)動(dòng)物的細(xì)胞免疫功能，以評(píng)估免疫效果。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)特異性抗體的分布和表達(dá)情況，以評(píng)估免疫效果。在免疫后一定時(shí)間內(nèi)，用病毒或細(xì)菌等攻擊動(dòng)物，觀察其發(fā)病情況，以評(píng)估免疫效果。03細(xì)胞融合操作流程骨髓瘤細(xì)胞預(yù)處理選擇適宜的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，如SP2/0或NS-1等。骨髓瘤細(xì)胞選擇將骨髓瘤細(xì)胞在特定培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，確保其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞培養(yǎng)用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌骨髓瘤細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞洗滌與計(jì)數(shù)脾細(xì)胞分離與融合條件脾細(xì)胞制備取小鼠脾臟，通過(guò)機(jī)械法或酶解法分離出脾細(xì)胞。01細(xì)胞洗滌與計(jì)數(shù)用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。02融合條件將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按一定比例混合，在適宜的溫度、pH值和離子強(qiáng)度條件下進(jìn)行細(xì)胞融合。03聚乙二醇（PEG）融合法聚乙二醇能促進(jìn)細(xì)胞融合，提高融合效率。PEG的作用PEG濃度與分子量融合操作選擇合適的PEG濃度和分子量，以達(dá)到最佳融合效果。將PEG溶液緩慢加入細(xì)胞混合物中，輕輕攪拌一定時(shí)間后，逐漸稀釋并離心去除PEG，促使細(xì)胞融合。04雜交瘤細(xì)胞篩選體系HAT培養(yǎng)基篩選原理原理篩選方法利用骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不能合成次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的缺陷，加入氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培養(yǎng)基，只有融合后的雜交瘤細(xì)胞才能存活并繁殖。將融合后的細(xì)胞懸液接種在含有HAT的培養(yǎng)基中，只有雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)并形成克隆。陽(yáng)性克隆初篩與復(fù)檢利用專(zhuān)一性抗體與抗原的反應(yīng)，篩選出能夠產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。初篩將初篩陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，并再次檢測(cè)其抗體產(chǎn)生能力，確保篩選出的雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定產(chǎn)生特異性抗體。復(fù)檢特異性抗體檢測(cè)技術(shù)間接免疫熒光法利用熒光標(biāo)記的抗原或抗體與雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體結(jié)合，通過(guò)熒光顯微鏡觀察雜交瘤細(xì)胞是否產(chǎn)生特異性抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）放射免疫測(cè)定法（RIA）將雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體與固相抗原結(jié)合，再加入酶標(biāo)二抗，通過(guò)底物顯色反應(yīng)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體的數(shù)量。利用放射性同位素標(biāo)記的抗原或抗體與雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體結(jié)合，通過(guò)測(cè)定放射性強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗體的數(shù)量。12305單克隆細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)有限稀釋法克隆化通過(guò)將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)箚蝹€(gè)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中分散生長(zhǎng)，從而獲得單克隆細(xì)胞株。原理操作步驟優(yōu)點(diǎn)將雜交瘤細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓蠓謩e接種到含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，挑選出單克隆細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。操作簡(jiǎn)單、成本低、可獲得高純度的單克隆細(xì)胞株。細(xì)胞株穩(wěn)定性驗(yàn)證驗(yàn)證周期需要經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)，觀察雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性。03通過(guò)ELISA、免疫熒光等技術(shù)手段檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體是否與目標(biāo)抗原特異性結(jié)合。02驗(yàn)證方法驗(yàn)證內(nèi)容驗(yàn)證雜交瘤細(xì)胞是否保持親代細(xì)胞的特性，如分泌特異性抗體等。01凍存與復(fù)蘇操作規(guī)范將雜交瘤細(xì)胞懸液加入凍存液中，然后放入液氮罐中長(zhǎng)期保存。凍存將凍存的雜交瘤細(xì)胞取出，放入37℃水浴中快速解凍，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。復(fù)蘇凍存和復(fù)蘇過(guò)程中需要注意溫度控制，避免細(xì)胞損傷。注意事項(xiàng)06技術(shù)應(yīng)用與質(zhì)量控制將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)特異性抗體篩選獲得能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。將篩選出的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，以達(dá)到足夠數(shù)量。通過(guò)親和層析、離子交換等方法將抗體從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化出來(lái)，去除雜質(zhì)和非特異性蛋白。包括活性、效價(jià)、特異性等多項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，確保抗體質(zhì)量符合要求。單抗規(guī)模化生產(chǎn)流程細(xì)胞融合細(xì)胞培養(yǎng)抗體純化抗體檢測(cè)細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)防控原材料控制無(wú)菌操作細(xì)胞監(jiān)測(cè)廢棄物處理嚴(yán)格篩選和檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)所需的原材料，避免外源微生物和有害物質(zhì)的污染。在細(xì)胞融合、培養(yǎng)、純化等過(guò)程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止細(xì)菌、真菌等微生物的污染。定期對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)等監(jiān)測(cè)，確保細(xì)胞未被污染或發(fā)生變異。對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物和污染物進(jìn)行無(wú)害化處理，防止對(duì)環(huán)境和人員造成危害?？贵w效價(jià)評(píng)估純度評(píng)估通過(guò)ELISA、放射免疫分析等方法測(cè)定抗體的效價(jià)，即抗體與抗原結(jié)合的能力，確?？贵w具有足夠的免疫活性。采用SDS、HPLC