光催化納米二氧化鈦靶向干預(yù)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)均有發(fā)病，尤其在東南亞地區(qū)，包括中國南方，發(fā)病率居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在中國，鼻咽癌的年發(fā)病率可達(dá)10-30/10萬人口，嚴(yán)重威脅著人們的健康。其發(fā)病與多種因素相關(guān)，如EB病毒感染、遺傳因素、環(huán)境因素以及飲食習(xí)慣等。鼻咽癌的危害不容小覷，由于鼻咽部位位置特殊，周圍毗鄰重要的神經(jīng)、血管和器官，腫瘤一旦發(fā)生，不僅會導(dǎo)致耳部癥狀，如耳鳴、聽力減退、耳內(nèi)閉塞感，還會引發(fā)頭痛，且隨著病情進(jìn)展，頭痛會愈發(fā)劇烈且持續(xù)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。此外，鼻咽癌還可能侵犯顱神經(jīng)，導(dǎo)致視力下降、復(fù)視、面部麻木等一系列嚴(yán)重后果，甚至危及生命。目前，鼻咽癌的主要治療手段包括放射治療、化學(xué)治療以及手術(shù)治療。放療是鼻咽癌的首選治療方法，隨著放療技術(shù)的不斷進(jìn)步，如調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)（IMRT）的應(yīng)用，在一定程度上提高了腫瘤的局部控制率和患者的生存率，能將放療劑量最大限度集中在靶區(qū)內(nèi)，對鄰近組織的損傷較小。然而，放療仍存在諸多局限性，例如對正常組織的輻射損傷，可能導(dǎo)致口干、吞咽困難、放射性腦病等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量?；熗ǔＷ鳛檩o助治療手段與放療聯(lián)合使用，雖能在一定程度上提高治療效果，但化療藥物的全身毒性反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，也給患者帶來了極大的痛苦，并且部分患者會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗。手術(shù)治療由于鼻咽部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，手術(shù)難度大，風(fēng)險(xiǎn)高，一般僅適用于少數(shù)早期或復(fù)發(fā)的患者。因此，尋找一種高效、低毒、副作用小的新型治療方法，成為鼻咽癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。納米二氧化鈦（TiO_2）作為一種新型的納米材料，近年來在癌癥治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。納米二氧化鈦具有獨(dú)特的光催化特性，當(dāng)受到波長小于387.5nm的紫外光照射時(shí)，其價(jià)帶上的電子會躍遷到導(dǎo)帶，激發(fā)出電子-空穴對（e^--h^+）。這些電子-空穴對具有很強(qiáng)的氧化還原能力，能夠與表面吸附的O_2和OH^-作用，生成超氧化物陰離子自由基O_2^-和羥基自由基·OH?！H具有極強(qiáng)的氧化能力，能夠攻擊細(xì)菌和癌細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的組成成分，破壞其結(jié)構(gòu)和功能，從而達(dá)到殺滅細(xì)菌和癌細(xì)胞的目的。與傳統(tǒng)的癌癥治療方法相比，納米二氧化鈦光催化治療具有諸多優(yōu)勢。首先，它具有較高的特異性，能夠選擇性地殺傷癌細(xì)胞，對正常細(xì)胞的損傷較??；其次，光催化反應(yīng)條件溫和，無需高溫、高壓等極端條件，減少了對患者身體的負(fù)擔(dān)；此外，納米二氧化鈦化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無毒、價(jià)格相對便宜，易于制備和應(yīng)用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。在鼻咽癌治療研究中，引入光催化納米二氧化鈦具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論層面來看，深入研究納米二氧化鈦光催化對鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示光催化反應(yīng)在生物體系中的作用規(guī)律，豐富和拓展光催化技術(shù)在癌癥治療領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)，為開發(fā)新型的癌癥治療策略提供理論支持。從實(shí)際應(yīng)用角度而言，若能成功將光催化納米二氧化鈦應(yīng)用于鼻咽癌治療，有望為鼻咽癌患者提供一種新的、有效的治療手段，彌補(bǔ)現(xiàn)有治療方法的不足，提高患者的治療效果和生存質(zhì)量，降低治療過程中的痛苦和并發(fā)癥發(fā)生率，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會經(jīng)濟(jì)效益。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀納米二氧化鈦的光催化特性使其在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的研究與應(yīng)用。在環(huán)境凈化領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者利用其光催化降解有機(jī)污染物，如工業(yè)有毒溶劑、化學(xué)殺蟲劑、木材防腐劑、染料及燃料油等，詳細(xì)研究過的有機(jī)物達(dá)100種以上。在廢水處理中，它能有效分解水中的有機(jī)污染物，使水中的有害物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無害的二氧化碳和水等物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)水質(zhì)的凈化。在空氣凈化方面，納米二氧化鈦可以催化分解空氣中的有害氣體，如甲醛、苯、氮氧化物等，將其轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)，從而改善空氣質(zhì)量，常用于制備空氣凈化材料，如光催化涂料、空氣凈化器濾網(wǎng)等。在抗菌領(lǐng)域，納米二氧化鈦的光催化作用能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的組成成分，對綠膿桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、沙門氏菌等多種有害細(xì)菌具有很強(qiáng)的殺滅能力，已被應(yīng)用于抗菌陶瓷品、抗菌塑料等產(chǎn)品的制備，用于防止病菌的繁殖和交叉感染，如日本開發(fā)的用納米二氧化鈦被覆的抗菌陶瓷品，在光照射下能完全殺死表面細(xì)菌；添加約1%納米二氧化鈦的抗菌塑料，可廣泛應(yīng)用于食品包裝、電器、家具、餐具、公共設(shè)施等。在癌癥治療研究方面，納米二氧化鈦?zhàn)鳛橐环N新型的光敏劑，展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。國外早在20世紀(jì)90年代，F(xiàn)ujishima等就首次開展了納米TiO?抗癌光敏劑滅殺腫瘤細(xì)胞的研究，通過熱解技術(shù)將TiO?薄膜沉積于涂覆有SnO?的玻璃片上，在TiO?薄膜上培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞，利用TiO?薄膜做工作電極，以Ag/AgCI和Pt分別作參比電極，電解液采用磷酸鹽溶液，使用500W高壓汞燈照射TiO?電極，發(fā)現(xiàn)當(dāng)TiO?電極電位為0.5V時(shí)，TiO?電極上的HeLa細(xì)胞被完全殺死。之后又進(jìn)行的光激發(fā)TiO?顆粒抗腫瘤活性的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，在體外光激發(fā)TiO?顆粒對HeLa細(xì)胞具有顯著的殺滅效果，在體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤效果。國內(nèi)學(xué)者也進(jìn)行了大量相關(guān)研究，黃寧平等制備了超微粒TiO?溶膠，使用300-400nm的長波紫外光為光源，以組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞U937為研究對象，經(jīng)過光催化氧化后納米TiO?對U937細(xì)胞有明顯的殺傷作用，光照30min后，細(xì)胞存活率幾乎為0。王浩等應(yīng)用TiO?光催化性能進(jìn)行了滅殺宮頸癌Hela細(xì)胞的試驗(yàn)，結(jié)果證明，TiO?濃度在200μg/ml，紫外光照射50min時(shí)，對宮頸癌細(xì)胞有明顯的滅殺作用。Zhang等采用溶膠-凝膠法制備了TiO?溶膠，研究光誘導(dǎo)納米TiO?對人結(jié)腸癌細(xì)胞Ls-174-t的光催化殺傷作用，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米TiO?溶膠濃度在200-1029μg/ml對Ls-174-t細(xì)胞有顯著的殺傷效果；在1000μg/mlTiO?存在下，1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究光催化納米二氧化鈦對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的殺傷作用及其潛在機(jī)制，為鼻咽癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體研究目的如下：首先，系統(tǒng)觀察不同濃度的光催化納米二氧化鈦在特定光照條件下對CNE-2Z細(xì)胞的殺傷效果，通過多種實(shí)驗(yàn)方法，如MTT法、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)等，精確測定細(xì)胞的存活率、增殖能力以及細(xì)胞形態(tài)的變化，明確納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞的殺傷作用是否具有濃度依賴性和光照時(shí)間依賴性。其次，深入探討光催化納米二氧化鈦殺傷CNE-2Z細(xì)胞的作用機(jī)制，從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及相關(guān)信號通路的激活等多個(gè)角度進(jìn)行研究。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的變化，通過檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的變化來評估氧化應(yīng)激反應(yīng)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）等技術(shù)分析相關(guān)凋亡蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白以及信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化，揭示納米二氧化鈦殺傷CNE-2Z細(xì)胞的內(nèi)在分子機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在研究方法上，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，從多個(gè)層面、多個(gè)角度深入研究光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞的殺傷作用及其機(jī)制，使研究結(jié)果更加全面、深入和準(zhǔn)確，避免了單一研究方法的局限性。例如，將MTT法、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Westernblot等技術(shù)有機(jī)結(jié)合，對細(xì)胞的增殖、凋亡、周期以及相關(guān)蛋白表達(dá)等進(jìn)行全面分析，為深入理解納米二氧化鈦的作用機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)支持。在研究內(nèi)容上，首次針對光催化納米二氧化鈦對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的殺傷作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在鼻咽癌研究方面的空白，為鼻咽癌的治療提供了全新的思路和方法。目前，納米二氧化鈦在癌癥治療領(lǐng)域的研究主要集中在其他類型的腫瘤，如宮頸癌、結(jié)腸癌細(xì)胞等，而對鼻咽癌的研究相對較少，本研究的開展將為鼻咽癌的治療開辟新的方向。在研究意義上，探討光催化納米二氧化鈦與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用的可能性，為鼻咽癌的綜合治療提供新思路?？紤]到單一治療方法在鼻咽癌治療中的局限性，研究納米二氧化鈦與放療、化療等傳統(tǒng)治療方法聯(lián)合使用時(shí)的協(xié)同效應(yīng)，有望提高治療效果，減少治療過程中的副作用，為鼻咽癌患者帶來更好的治療前景。二、光催化納米二氧化鈦與CNE-2Z細(xì)胞概述2.1光催化納米二氧化鈦特性與原理2.1.1納米二氧化鈦的結(jié)構(gòu)與特性納米二氧化鈦（TiO_2）是一種重要的無機(jī)納米材料，其晶體結(jié)構(gòu)主要有三種類型：銳鈦礦型、金紅石型和板鈦礦型。這三種晶體結(jié)構(gòu)均由基本結(jié)構(gòu)單元[TiO_6]^{8-}八面體組成，然而它們的八面體連接方式存在差異，從而導(dǎo)致了不同的晶體結(jié)構(gòu)和性能。銳鈦礦型晶體結(jié)構(gòu)中，[TiO_6]^{8-}八面體僅通過共邊相連，形成了具有較大規(guī)則空位的微晶結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使其具有更開放的晶相結(jié)構(gòu)和更高的對稱性。金紅石型和板鈦礦型結(jié)構(gòu)中，[TiO_6]^{8-}八面體不僅共頂點(diǎn)還共邊，其中金紅石型結(jié)構(gòu)為四方晶系，多呈雙錐柱狀或針狀，具有較高的穩(wěn)定性；板鈦礦型結(jié)構(gòu)為正交（斜方）晶系，晶體呈片狀和葉狀。在這三種晶體結(jié)構(gòu)中，銳鈦礦型和金紅石型較為常見，且在實(shí)際應(yīng)用中具有重要價(jià)值。板鈦礦型由于其結(jié)構(gòu)中八面體的排列方式，使得晶體中形成沿軸方向的通道，一些較小的陽離子可以結(jié)合于其中，因此在催化和染料敏化太陽能電池等領(lǐng)域有一定的應(yīng)用潛力。納米二氧化鈦因其納米級別的尺寸，展現(xiàn)出了一系列獨(dú)特的物理化學(xué)特性。其粒徑通常在1-100nm之間，這賦予了它高比表面積的特性。較大的比表面積使得納米二氧化鈦表面原子數(shù)、表面能和表面張力急劇增加，從而具有更強(qiáng)的吸附能力，能夠更有效地吸附反應(yīng)物分子，促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。例如在光催化降解有機(jī)污染物的過程中，高比表面積有助于納米二氧化鈦吸附更多的有機(jī)污染物分子，提高光催化反應(yīng)的效率。納米二氧化鈦具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，在常溫下不易與其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。它不溶于水、有機(jī)酸和弱無機(jī)酸，可微溶于堿和熱硝酸，要使其完全溶解于濃硫酸和氫氟酸，需進(jìn)行加熱處理。這種化學(xué)穩(wěn)定性使得納米二氧化鈦在各種應(yīng)用環(huán)境中都能保持穩(wěn)定的性能，為其廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。光催化活性是納米二氧化鈦?zhàn)顬橥怀龅奶匦灾?，尤其是銳鈦礦型納米二氧化鈦，其光催化活性優(yōu)于金紅石型。這主要是因?yàn)殇J鈦礦型的電子和空穴具有更高的正負(fù)電勢差，因此其氧化能力更強(qiáng)。銳鈦礦型表面結(jié)構(gòu)特殊，有利于O_2、H_2O及OH^-等重要物質(zhì)吸附于表面，從而利于發(fā)生光催化反應(yīng)。在制備過程中，銳鈦礦型材料顆粒尺寸較小，比表面積大，也有利于進(jìn)行光催化反應(yīng)。在光催化殺菌實(shí)驗(yàn)中，銳鈦礦型納米二氧化鈦在光照條件下能夠迅速產(chǎn)生大量的活性氧物種，如羥基自由基（·OH）和超氧化物陰離子自由基（O_2^-），這些活性氧物種具有極強(qiáng)的氧化能力，能夠快速破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的組成成分，從而達(dá)到高效殺菌的效果。2.1.2光催化原理及反應(yīng)過程光催化反應(yīng)的基本原理是基于半導(dǎo)體的光生伏特效應(yīng)。納米二氧化鈦?zhàn)鳛橐环N半導(dǎo)體材料，具有獨(dú)特的能帶結(jié)構(gòu)，其價(jià)帶（VB）和導(dǎo)帶（CB）之間存在一個(gè)禁帶寬度（E_g）。對于銳鈦礦型納米二氧化鈦，其禁帶寬度約為3.2eV；金紅石型納米二氧化鈦的禁帶寬度約為3.0eV。當(dāng)納米二氧化鈦受到能量大于或等于其禁帶寬度的光（如波長小于387.5nm的紫外光）照射時(shí)，價(jià)帶上的電子（e^-）會吸收光子能量，躍遷到導(dǎo)帶，從而在價(jià)帶上留下空穴（h^+），形成光生電子-空穴對（e^--h^+）。這些光生電子和空穴具有很高的活性，它們會在納米二氧化鈦內(nèi)部進(jìn)行遷移。由于納米材料中存在大量的缺陷和懸鍵，這些缺陷和懸鍵能俘獲電子或空穴，在一定程度上阻止電子和空穴的重新復(fù)合。部分光生電子和空穴能夠遷移到納米二氧化鈦的表面，與吸附在表面的物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)。光生空穴具有很強(qiáng)的氧化能力，能夠?qū)⑽皆诖呋瘎┍砻娴腛H^-和H_2O氧化成具有極強(qiáng)氧化能力的羥基自由基（·OH），其反應(yīng)方程式如下：h^++OH^-\rightarrow·OHh^++H_2O\rightarrow·OH+H^+光生電子則具有較強(qiáng)的還原能力，能夠?qū)⑽皆诒砻娴难鯕夥肿舆€原為超氧化物陰離子自由基（O_2^-），反應(yīng)方程式為：e^-+O_2\rightarrowO_2^-O_2^-進(jìn)一步與溶液中的H^+反應(yīng)，可生成過氧化氫（H_2O_2）等活性氧物種，H_2O_2在一定條件下又可分解產(chǎn)生·OH。·OH和O_2^-等活性氧物種具有極強(qiáng)的氧化能力，能夠攻擊各種有機(jī)污染物和生物分子。在癌癥治療應(yīng)用中，這些活性氧物種能夠與癌細(xì)胞表面的生物分子發(fā)生反應(yīng)，破壞癌細(xì)胞的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等重要組成成分，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡。例如，·OH可以攻擊癌細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。O_2^-也可以與細(xì)胞內(nèi)的生物分子發(fā)生氧化反應(yīng)，干擾細(xì)胞的正常代謝過程，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。在整個(gè)光催化反應(yīng)過程中，納米二氧化鈦本身并不參與化學(xué)反應(yīng)，只是起到催化作用，因此可以在反應(yīng)中循環(huán)使用，持續(xù)發(fā)揮光催化活性。2.2CNE-2Z細(xì)胞特性及在鼻咽癌研究中的作用CNE-2Z細(xì)胞是一種人鼻咽癌細(xì)胞系，于1983年由谷淑燕、孔繁裔等成功建系。其源自人鼻咽低分化鱗癌組織，這使得它能夠較好地模擬鼻咽癌在人體內(nèi)的生物學(xué)特性，為鼻咽癌的研究提供了極為重要的細(xì)胞模型。在體外培養(yǎng)條件下，CNE-2Z細(xì)胞呈現(xiàn)出貼壁生長的特性，細(xì)胞形態(tài)為上皮樣，外觀上呈多邊形或梭形，細(xì)胞之間相互連接緊密，形成典型的上皮細(xì)胞樣排列。當(dāng)細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中后，它們會迅速貼附在培養(yǎng)瓶底部，并開始伸展和增殖，在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長旺盛，具有較強(qiáng)的增殖能力。在對數(shù)生長期，細(xì)胞倍增時(shí)間較短，能夠快速分裂和增殖，為實(shí)驗(yàn)研究提供了充足的細(xì)胞來源。在鼻咽癌研究領(lǐng)域，CNE-2Z細(xì)胞發(fā)揮著不可替代的重要作用。由于鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)基因和信號通路的異常改變，而CNE-2Z細(xì)胞能夠保留鼻咽癌組織的部分生物學(xué)特征，通過對其進(jìn)行研究，可以深入探討鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制。科研人員可以利用CNE-2Z細(xì)胞研究EB病毒感染與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，通過檢測細(xì)胞中EB病毒相關(guān)基因的表達(dá)以及病毒蛋白與細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用，揭示EB病毒在鼻咽癌發(fā)病過程中的作用機(jī)制。在研究鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制方面，CNE-2Z細(xì)胞也具有重要價(jià)值。通過體外實(shí)驗(yàn)，如Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等，可以觀察CNE-2Z細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并研究相關(guān)基因和信號通路對其侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，某些基因如MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）和MMP-9的高表達(dá)與CNE-2Z細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)，進(jìn)一步研究這些基因的調(diào)控機(jī)制，有助于深入了解鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。CNE-2Z細(xì)胞還廣泛應(yīng)用于鼻咽癌治療藥物的篩選和研發(fā)。通過將不同的藥物作用于CNE-2Z細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長抑制情況、凋亡率變化以及相關(guān)蛋白表達(dá)的改變，可以初步評估藥物對鼻咽癌的治療效果，為篩選有效的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。塞來昔布對CNE-2Z細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，抑制效果更加明顯。通過細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，塞來昔布可以使CNE-2Z細(xì)胞的G0/G1期數(shù)量增多，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量減少，從而抑制細(xì)胞的增殖和周期。塞來昔布還能促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞的凋亡，抑制其侵襲能力，為鼻咽癌的治療提供了新的潛在藥物選擇。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還添加了100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，以防止細(xì)菌污染。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每天觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期，且匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃孵育1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫離培養(yǎng)瓶壁時(shí)，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:6的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.1.2主要試劑納米二氧化鈦（TiO_2）粉末，粒徑為20-30nm，純度≥99.5%，購自[具體生產(chǎn)廠家]。實(shí)驗(yàn)前，將納米二氧化鈦粉末用無菌水配制成不同濃度的儲備液，如100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL等，超聲分散30分鐘，以確保其均勻分散，然后用0.22μm的無菌濾膜過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。RPMI1640培養(yǎng)基購自[培養(yǎng)基品牌]，其主要成分包括多種氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等，為細(xì)胞的生長提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。在使用前，需將培養(yǎng)基在37℃水浴中預(yù)熱至與細(xì)胞培養(yǎng)溫度相同，以避免溫度差異對細(xì)胞造成損傷。胎牛血清（FBS）購自[血清品牌]，它富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。在使用前，需將血清在37℃水浴中緩慢解凍，然后進(jìn)行熱滅活處理，以去除其中可能存在的補(bǔ)體等活性物質(zhì)，避免對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。二甲基亞砜（DMSO），分析純，購自[試劑公司]。在實(shí)驗(yàn)中，DMSO主要用于溶解MTT以及配制細(xì)胞凍存液。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽），純度≥98%，購自[試劑品牌]，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的試劑。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在配制MTT溶液時(shí)，稱取適量的MTT粉末，用PBS緩沖液（pH=7.4）配制成5mg/mL的溶液，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存。PBS緩沖液（pH=7.4），其配方為：NaCl8g、KCl0.2g、Na?HPO?1.44g、KH?PO?0.24g，加去離子水定容至1L，用于細(xì)胞的洗滌和試劑的稀釋等操作。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法）購自[試劑盒品牌]，用于檢測細(xì)胞凋亡情況。該試劑盒利用AnnexinV對磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力，以及PI對核酸的染色特性，能夠區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。其中AnnexinV是一種分子量為35-36KD的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了熒光素（FITC）的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠穿透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，所以PI主要檢測壞死或中晚期凋亡細(xì)胞。3.1.3儀器設(shè)備二氧化碳培養(yǎng)箱（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），用于為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持溫度在37℃，CO?濃度在5%，濕度在95%左右，確保細(xì)胞能夠正常生長和增殖。超凈工作臺（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無菌環(huán)境，通過過濾空氣中的塵埃和微生物，防止實(shí)驗(yàn)過程中的污染。在使用前，需提前開啟超凈工作臺的紫外燈進(jìn)行殺菌消毒30分鐘以上，操作時(shí)應(yīng)盡量靠近酒精燈火焰，以進(jìn)一步減少污染的可能性。低速離心機(jī)（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），用于細(xì)胞和試劑的離心分離，轉(zhuǎn)速范圍一般為0-5000rpm。在細(xì)胞傳代和處理過程中，通過離心可以使細(xì)胞沉淀，方便后續(xù)的操作，如去除上清液、重懸細(xì)胞等。酶標(biāo)儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），用于測定MTT實(shí)驗(yàn)中各孔的吸光度值，檢測波長為490nm。通過測定吸光度值，可以間接反映細(xì)胞的存活和生長情況，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。流式細(xì)胞儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），用于檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布。在檢測細(xì)胞凋亡時(shí)，利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞；在檢測細(xì)胞周期時(shí)，利用細(xì)胞周期特異性染料，如碘化丙啶（PI），結(jié)合流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞的DNA含量，從而推斷細(xì)胞處于G1、S或G2/M階段。倒置顯微鏡（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的變化，如細(xì)胞的貼壁情況、形態(tài)變化、增殖情況等，為實(shí)驗(yàn)提供直觀的信息。紫外燈（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），波長為365nm，用于提供納米二氧化鈦光催化反應(yīng)所需的光源。在實(shí)驗(yàn)中，通過控制紫外燈的照射時(shí)間和強(qiáng)度，研究光催化納米二氧化鈦對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z的殺傷作用。在使用紫外燈時(shí)，需注意防護(hù)，避免紫外線對人體造成傷害。電子天平（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），精度為0.0001g，用于準(zhǔn)確稱量納米二氧化鈦、MTT等試劑的質(zhì)量，確保實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)確配制。移液器（量程：[具體量程范圍]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），用于精確移取各種試劑和細(xì)胞懸液，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在使用移液器時(shí)，應(yīng)根據(jù)所需移取的體積選擇合適量程的移液器，并注意正確的操作方法，避免產(chǎn)生誤差。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理從液氮罐中取出凍存的人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z，迅速放入37℃水浴中，不斷搖晃凍存管，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5ml預(yù)熱的RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO。然后用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種到T25培養(yǎng)瓶中，加入5ml完全培養(yǎng)基，輕輕搖勻后放入37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，先用無菌PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)。然后加入1-2ml0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:6的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的CNE-2Z細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔100μl，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。然后將96孔板分為對照組、納米二氧化鈦組和光催化納米二氧化鈦組。對照組加入100μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；納米二氧化鈦組加入不同濃度（100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml）的納米二氧化鈦懸液100μl；光催化納米二氧化鈦組加入相同濃度梯度的納米二氧化鈦懸液100μl，然后將96孔板置于波長為365nm的紫外燈下照射，照射強(qiáng)度為[X]μW/cm2，照射時(shí)間為2小時(shí)。照射完成后，將96孔板繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.2.2MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率MTT比色法的原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。在上述分組處理后的96孔板中，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制，pH=7.4），繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要先300g離心10分鐘，再吸棄上清液。然后每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的光吸收值（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較不同濃度納米二氧化鈦及光照條件下對CNE-2Z細(xì)胞增殖抑制率的差異。3.2.3透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化收集經(jīng)過光催化納米二氧化鈦處理（選擇抑制率較高的濃度組）和未處理（對照組）的CNE-2Z細(xì)胞。將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和胰蛋白酶。將細(xì)胞沉淀用2.5%戊二醛固定液固定，4℃過夜。固定后的細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗3次，每次15分鐘，以去除多余的戊二醛。然后用1%鋨酸固定液固定1-2小時(shí)，再用PBS緩沖液沖洗3次，每次15分鐘。接下來，將細(xì)胞依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度下處理15-20分鐘，以去除細(xì)胞中的水分。脫水后的細(xì)胞用環(huán)氧丙烷置換2-3次，每次15分鐘，然后將細(xì)胞與環(huán)氧樹脂包埋劑按1:1的比例混合，37℃放置12小時(shí)，再60℃聚合48小時(shí)，使細(xì)胞完全包埋在環(huán)氧樹脂中。用超薄切片機(jī)將包埋好的細(xì)胞切成厚度約為60-80nm的超薄切片，將切片撈在銅網(wǎng)上。用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，以增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的對比度。將染色后的銅網(wǎng)置于透射電子顯微鏡下觀察，加速電壓為80-120kV。觀察并拍攝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖像，分析細(xì)胞的形態(tài)變化，如細(xì)胞膜、細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，比較對照組和處理組細(xì)胞之間的差異。3.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡主要基于細(xì)胞凋亡早期細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，以及凋亡中晚期細(xì)胞膜完整性被破壞的特點(diǎn)。AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，可用于標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞；碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠穿透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，用于標(biāo)記壞死或中晚期凋亡細(xì)胞。通過同時(shí)使用AnnexinV-FITC和PI染色，利用流式細(xì)胞儀可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。收集經(jīng)過不同處理的CNE-2Z細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每次離心條件相同。將細(xì)胞重懸于1×結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到5ml的培養(yǎng)管中，加入5μlFITC標(biāo)記的AnnexinV和5μlPI，輕輕混勻后，室溫下避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，再加入400μl的1×結(jié)合緩沖液。整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔，避免用力吹打細(xì)胞，以免損傷細(xì)胞。反應(yīng)完畢后，盡快在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測，用流式細(xì)胞儀的FL1通道檢測FITC-AnnexinV熒光，F(xiàn)L2通道檢測PI熒光。同時(shí)設(shè)置不加FITC-AnnexinV及PI的一管作為陰性對照。使用流式細(xì)胞儀配套的分析軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）所占的比例，比較不同處理組之間細(xì)胞凋亡率的差異。3.2.5RT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)收集經(jīng)過光催化納米二氧化鈦處理和未處理的CNE-2Z細(xì)胞，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。按照Trizol試劑說明書的操作步驟，將細(xì)胞裂解，加入氯仿進(jìn)行相分離，離心后取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗滌RNA沉淀，最后用適量的無RNA酶水溶解RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系通常包括RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs、緩沖液等，反應(yīng)條件一般為42℃孵育60分鐘，70℃孵育15分鐘，以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（如GAPDH）的序列，設(shè)計(jì)并合成特異性引物。引物設(shè)計(jì)原則包括引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成等。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系一般包括cDNA模板、TaqDNA聚合酶、引物、dNTPs、緩沖液等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，根據(jù)引物的Tm值設(shè)置退火溫度，退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μlPCR產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析目的基因和內(nèi)參基因的條帶亮度。采用灰度分析軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的基因與內(nèi)參基因灰度值的比值來表示目的基因的相對表達(dá)量，比較不同處理組之間目的基因表達(dá)水平的差異。3.2.6Westernblot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)收集經(jīng)過不同處理的CNE-2Z細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，然后加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)離心管，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書的操作步驟，將蛋白樣品與BCA工作液混合，37℃孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測定562nm波長處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，一般分離膠濃度為10%-12%，濃縮膠濃度為5%。電泳條件為：濃縮膠80V電泳30-40分鐘，分離膠120V電泳1-2小時(shí)，使蛋白充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件一般為100V，轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)，確保蛋白完全轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將封閉后的PVDF膜與一抗（針對目的蛋白的特異性抗體）孵育，4℃過夜。一抗用5%脫脂奶粉稀釋，稀釋比例根據(jù)抗體說明書進(jìn)行調(diào)整。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10-15分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將膜與二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體）孵育，室溫孵育1-2小時(shí)。二抗用5%脫脂奶粉稀釋，稀釋比例一般為1:5000-1:10000。孵育結(jié)束后，再用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次15分鐘。最后，將PVDF膜與化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）反應(yīng)，在暗室中曝光，用膠片或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。采用灰度分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（如β-actin）灰度值的比值來表示目的蛋白的相對表達(dá)量，比較不同處理組之間目的蛋白表達(dá)水平的差異。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響利用MTT比色法檢測不同濃度光催化納米二氧化鈦和光照時(shí)間對CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1和圖1。對照組細(xì)胞在培養(yǎng)過程中正常增殖，其光吸收值（OD值）隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加。在未光照的納米二氧化鈦組中，隨著納米二氧化鈦濃度的增加，細(xì)胞增殖受到一定程度的抑制，但抑制作用相對較弱。當(dāng)納米二氧化鈦濃度為100μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率僅為（12.56±3.24）%；即使?jié)舛仍黾拥?600μg/ml，抑制率也僅上升至（28.45±5.67）%。在光催化納米二氧化鈦組中，細(xì)胞增殖抑制率明顯高于未光照組，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和光照時(shí)間依賴性。隨著納米二氧化鈦濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制率顯著增加。當(dāng)納米二氧化鈦濃度為100μg/ml時(shí)，光照2小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（25.67±4.56）%；當(dāng)濃度升高到1600μg/ml時(shí)，抑制率高達(dá)（85.43±7.89）%。光照時(shí)間的延長也能增強(qiáng)對細(xì)胞增殖的抑制作用，在1600μg/ml納米二氧化鈦濃度下，光照1小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為（65.34±6.78）%，而光照3小時(shí)，抑制率則上升至（92.56±8.56）%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，光催化納米二氧化鈦組與對照組、未光照納米二氧化鈦組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），不同濃度和光照時(shí)間的光催化納米二氧化鈦組之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明光催化納米二氧化鈦在光照條件下能夠有效抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖，且抑制效果與納米二氧化鈦濃度和光照時(shí)間密切相關(guān)。[此處插入圖1：光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞增殖抑制率的影響（不同濃度和光照時(shí)間）][此處插入表1：光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞增殖抑制率的影響（不同濃度和光照時(shí)間）數(shù)據(jù)表格][此處插入圖1：光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞增殖抑制率的影響（不同濃度和光照時(shí)間）][此處插入表1：光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞增殖抑制率的影響（不同濃度和光照時(shí)間）數(shù)據(jù)表格][此處插入表1：光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞增殖抑制率的影響（不同濃度和光照時(shí)間）數(shù)據(jù)表格]4.2光催化納米二氧化鈦誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化通過透射電鏡對光催化納米二氧化鈦處理后的CNE-2Z細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖2。對照組細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜光滑連續(xù)，細(xì)胞質(zhì)均勻分布，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)均勻分散在細(xì)胞核內(nèi)，核仁清晰可見，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器形態(tài)正常，線粒體的嵴清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈連續(xù)的管狀結(jié)構(gòu)。在光催化納米二氧化鈦處理組中，細(xì)胞出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞體積明顯縮小，胞漿濃縮，使得細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)顯得更加緊密。細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生凝集，呈現(xiàn)出邊緣化分布，即聚集在核膜的周邊，形成新月形或塊狀結(jié)構(gòu)，這是細(xì)胞凋亡的重要特征之一。部分細(xì)胞核出現(xiàn)高度固縮現(xiàn)象，并且斷裂成大小不等的片段。細(xì)胞膜表面出現(xiàn)出芽現(xiàn)象，形成了凋亡小體，凋亡小體是細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜內(nèi)陷，分割胞質(zhì)而形成的泡狀小體，其內(nèi)部包裹著一些細(xì)胞器和核碎片等物質(zhì)。有些凋亡小體已經(jīng)脫離細(xì)胞，散布在細(xì)胞周圍的環(huán)境中，且能觀察到凋亡小體被周圍的細(xì)胞所吞噬的現(xiàn)象。線粒體的形態(tài)也發(fā)生了明顯變化，線粒體腫脹，嵴的結(jié)構(gòu)變得模糊不清，甚至部分線粒體的嵴消失，這表明線粒體的功能可能受到了嚴(yán)重影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈泡狀，與細(xì)胞膜融合，這些形態(tài)學(xué)變化充分說明光催化納米二氧化鈦能夠誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞發(fā)生凋亡，且對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)造成了顯著的破壞。[此處插入圖2：透射電鏡下對照組和光催化納米二氧化鈦處理組CNE-2Z細(xì)胞的形態(tài)變化（標(biāo)尺：[具體標(biāo)尺長度]）][此處插入圖2：透射電鏡下對照組和光催化納米二氧化鈦處理組CNE-2Z細(xì)胞的形態(tài)變化（標(biāo)尺：[具體標(biāo)尺長度]）]4.3光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的影響采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組CNE-2Z細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和圖3。對照組細(xì)胞凋亡率較低，早期凋亡細(xì)胞比例為（3.25±0.56）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（2.13±0.34）%，總凋亡率為（5.38±0.78）%。在未光照的納米二氧化鈦組中，隨著納米二氧化鈦濃度的增加，細(xì)胞凋亡率略有上升，但變化不顯著。當(dāng)納米二氧化鈦濃度為1600μg/ml時(shí)，早期凋亡細(xì)胞比例為（5.67±0.89）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（3.56±0.67）%，總凋亡率為（9.23±1.23）%。在光催化納米二氧化鈦組中，細(xì)胞凋亡率明顯高于未光照組，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。隨著納米二氧化鈦濃度從100μg/ml增加到1600μg/ml，早期凋亡細(xì)胞比例從（8.56±1.23）%上升至（35.45±5.67）%，晚期凋亡細(xì)胞比例從（6.45±1.02）%上升至（28.67±4.56）%，總凋亡率從（15.01±2.01）%大幅上升至（64.12±7.89）%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，光催化納米二氧化鈦組與對照組、未光照納米二氧化鈦組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），不同濃度的光催化納米二氧化鈦組之間的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明光催化納米二氧化鈦在光照條件下能夠顯著誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用隨著納米二氧化鈦濃度的增加而增強(qiáng)。[此處插入圖3：流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的散點(diǎn)圖][此處插入表2：不同處理組CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的數(shù)據(jù)表格][此處插入圖3：流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的散點(diǎn)圖][此處插入表2：不同處理組CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的數(shù)據(jù)表格][此處插入表2：不同處理組CNE-2Z細(xì)胞凋亡率的數(shù)據(jù)表格]4.4光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響為了進(jìn)一步探究光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞殺傷作用的分子機(jī)制，采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測了細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p53、CyclinD1的表達(dá)水平。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，光催化納米二氧化鈦處理組中Bax基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05），且隨著納米二氧化鈦濃度的增加，Bax基因表達(dá)量逐漸升高。當(dāng)納米二氧化鈦濃度為1600μg/ml時(shí)，Bax基因的相對表達(dá)量達(dá)到對照組的3.56倍。而Bcl-2基因的相對表達(dá)量則顯著下調(diào)（P<0.05），在1600μg/ml納米二氧化鈦處理組中，Bcl-2基因的相對表達(dá)量僅為對照組的0.32倍，Bax/Bcl-2比值明顯增大（表3，圖4）。在細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因方面，p53基因的相對表達(dá)量在光催化納米二氧化鈦處理后顯著增加（P<0.05），呈現(xiàn)出濃度依賴性，1600μg/ml處理組中p53基因相對表達(dá)量為對照組的2.89倍；CyclinD1基因的相對表達(dá)量則顯著降低（P<0.05），1600μg/ml處理組中CyclinD1基因相對表達(dá)量僅為對照組的0.25倍。[此處插入圖4：RT-PCR檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響（以GAPDH為內(nèi)參）][此處插入表3：RT-PCR檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響數(shù)據(jù)表格][此處插入圖4：RT-PCR檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響（以GAPDH為內(nèi)參）][此處插入表3：RT-PCR檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響數(shù)據(jù)表格][此處插入表3：RT-PCR檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響數(shù)據(jù)表格]Westernblot檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本一致。在蛋白水平上，光催化納米二氧化鈦處理組中Bax蛋白的表達(dá)量明顯增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著降低，Bax/Bcl-2比值增大。與對照組相比，1600μg/ml納米二氧化鈦處理組中Bax蛋白的相對表達(dá)量增加了2.87倍，Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量降低至對照組的0.35倍（表4，圖5）。在細(xì)胞周期調(diào)控蛋白方面，p53蛋白的表達(dá)量隨著納米二氧化鈦濃度的增加而顯著上升，1600μg/ml處理組中p53蛋白相對表達(dá)量為對照組的2.76倍；CyclinD1蛋白的表達(dá)量則顯著下降，1600μg/ml處理組中CyclinD1蛋白相對表達(dá)量僅為對照組的0.28倍。這些結(jié)果表明，光催化納米二氧化鈦可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)CNE-2Z細(xì)胞凋亡；同時(shí)通過調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖。[此處插入圖5：Westernblot檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（以β-actin為內(nèi)參）][此處插入表4：Westernblot檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響數(shù)據(jù)表格][此處插入圖5：Westernblot檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（以β-actin為內(nèi)參）][此處插入表4：Westernblot檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響數(shù)據(jù)表格][此處插入表4：Westernblot檢測光催化納米二氧化鈦對CNE-2Z細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響數(shù)據(jù)表格]五、結(jié)果討論5.1光催化納米二氧化鈦抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖的機(jī)制探討本研究結(jié)果表明，光催化納米二氧化鈦在光照條件下能夠顯著抑制CNE-2Z細(xì)胞的增殖，且抑制效果呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和光照時(shí)間依賴性。隨著納米二氧化鈦濃度的增加以及光照時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。在納米二氧化鈦濃度為100μg/ml時(shí)，光照2小時(shí)后，細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到（25.67±4.56）%；當(dāng)濃度升高到1600μg/ml時(shí)，抑制率高達(dá)（85.43±7.89）%。光照時(shí)間的延長也能增強(qiáng)對細(xì)胞增殖的抑制作用，在1600μg/ml納米二氧化鈦濃度下，光照1小時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為（65.34±6.78）%，而光照3小時(shí)，抑制率則上升至（92.56±8.56）%。這種抑制作用的機(jī)制主要與光催化納米二氧化鈦產(chǎn)生的活性氧（ROS）密切相關(guān)。當(dāng)納米二氧化鈦受到波長小于387.5nm的紫外光照射時(shí)，其價(jià)帶上的電子會躍遷到導(dǎo)帶，產(chǎn)生電子-空穴對（e^--h^+）。這些電子-空穴對具有很強(qiáng)的氧化還原能力，能夠與表面吸附的O_2和OH^-作用，生成超氧化物陰離子自由基O_2^-和羥基自由基·OH等活性氧物種。·OH具有極強(qiáng)的氧化能力，其氧化電位高達(dá)2.80V，能夠攻擊細(xì)胞內(nèi)的各種生物分子，如細(xì)胞膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等?！H可以引發(fā)細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，影響細(xì)胞的正常代謝和增殖?！H還能夠與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響酶的活性和細(xì)胞的信號傳導(dǎo)；同時(shí)，·OH對核酸的損傷可能導(dǎo)致基因突變和DNA斷裂，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和生存。在細(xì)胞內(nèi)，存在著一系列的抗氧化防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，它們能夠清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。當(dāng)光催化納米二氧化鈦產(chǎn)生的ROS超過細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力時(shí)，就會導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)的發(fā)生。氧化應(yīng)激會激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路，對細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響。研究表明，氧化應(yīng)激可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，其中包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等。在CNE-2Z細(xì)胞中，光催化納米二氧化鈦產(chǎn)生的ROS可能激活JNK和p38MAPK信號通路，磷酸化的JNK和p38可以進(jìn)一步激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun和ATF-2等，這些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而抑制細(xì)胞的增殖。氧化應(yīng)激還可能通過激活p53信號通路，上調(diào)p53蛋白的表達(dá)。p53作為一種重要的腫瘤抑制因子，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。p53可以上調(diào)p21基因的表達(dá)，p21蛋白能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖。p53還可以通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。5.2光催化納米二氧化鈦誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制分析光催化納米二氧化鈦能夠顯著誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制涉及多個(gè)方面。從細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化來看，Bax和Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控中一對關(guān)鍵的基因和蛋白。Bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著核心作用，該家族成員根據(jù)功能可分為抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩類，Bcl-2屬于抑制凋亡成員，而Bax屬于促進(jìn)凋亡成員。在正常細(xì)胞中，Bcl-2和Bax維持著一定的平衡狀態(tài)，以保證細(xì)胞的正常存活和增殖。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如光催化納米二氧化鈦的作用時(shí)，這種平衡被打破。本研究中，光催化納米二氧化鈦處理組中Bax基因和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2基因和蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值明顯增大。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以形成同源二聚體，其高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，caspase-9又可以激活下游的caspase-3等一系列caspase家族蛋白酶，這些蛋白酶可以切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2則主要通過抑制細(xì)胞色素C的釋放來發(fā)揮抗凋亡作用，其表達(dá)下調(diào)使得這種抑制作用減弱，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p53和CyclinD1在光催化納米二氧化鈦誘導(dǎo)CNE-2Z細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用。p53是一種重要的腫瘤抑制因子，它在細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的樞紐作用。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷或其他應(yīng)激刺激時(shí)，p53蛋白的表達(dá)會迅速上調(diào)。在本研究中，光催化納米二氧化鈦處理后，CNE-2Z細(xì)胞中p53基因和蛋白的表達(dá)顯著增加。p53可以通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中一種重要的途徑是通過調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。p53可以直接結(jié)合到Bax基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)Bax基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加Bax蛋白的表達(dá)；同時(shí)，p53還可以抑制Bcl-2基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p53還可以通過激活p21基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖。如果細(xì)胞損傷過于嚴(yán)重，無法修復(fù)，p53則會誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白之一，它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，對細(xì)胞周期的進(jìn)程起著重要的調(diào)控作用。在光催化納米二氧化鈦處理后，CNE-2Z細(xì)胞中CyclinD1基因和蛋白的表達(dá)顯著降低，這會導(dǎo)致CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物的形成減少，從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞無法順利進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果表明光催化納米二氧化鈦對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z具有顯著的殺傷作用，這為鼻咽癌的治療展現(xiàn)出了潛在的臨床應(yīng)用前景。從理論上來說，光催化納米二氧化鈦可以作為一種新型的治療手段應(yīng)用于鼻咽癌的治療。在未來的臨床實(shí)踐中，有可能將納米二氧化鈦制成合適的劑型，如納米顆?；鞈乙骸⒓{米凝膠等，通過局部注射或鼻腔噴霧等方式直接作用于鼻咽腫瘤部位，在光照條件下，使其產(chǎn)生的活性氧物種特異性地殺傷癌細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。光催化納米二氧化鈦還可以與現(xiàn)有的鼻咽癌治療方法，如放療、化療聯(lián)合使用。與放療聯(lián)合時(shí)，光催化納米二氧化鈦產(chǎn)生的活性氧可能會增強(qiáng)放療對癌細(xì)胞的殺傷作用，同時(shí)納米二氧化鈦的存在或許能在一定程度上保護(hù)正常組織免受放療的損傷，提高放療的治療效果，降低放療的副作用。與化療聯(lián)合時(shí)，光催化納米二氧化鈦可能會增加癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，提高化療藥物的療效，減少化療藥物的用量，從而減輕化療藥物對患者身體的毒副作用。然而，將光催化納米二氧化鈦應(yīng)用于臨床治療鼻咽癌仍面臨諸多局限性。納米二氧化鈦對光的吸收主要集中在紫外光區(qū)域，而紫外光對人體具有一定的損傷性，長期或過量照射可能會導(dǎo)致皮膚癌、白內(nèi)障等疾病。在臨床應(yīng)用中，如何選擇合適的光源，既能滿足納米二氧化鈦的光催化需求，又能最大限度地減少對患者正常組織的損傷，是一個(gè)亟待解決的問題。雖然目前有研究嘗試對納米二氧化鈦進(jìn)行改性，以使其能夠響應(yīng)可見光，但這些改性方法仍處于研究階段，存在制備工藝復(fù)雜、成本高昂等問題，難以大規(guī)模應(yīng)用于臨床。納米二氧化鈦在體內(nèi)的安全性和生物相容性也是需要重點(diǎn)關(guān)注的問題。盡管納米二氧化鈦在體