Syk基因：宮頸癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)鍵抑癌基因密碼一、引言1.1研究背景與意義1.1.1宮頸癌的現(xiàn)狀及危害宮頸癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的主要公共衛(wèi)生問題之一，也是最常見的婦科惡性腫瘤。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約60.4萬(wàn)例，死亡病例約34.2萬(wàn)例，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第四，死亡率位居第四。在一些發(fā)展中國(guó)家，由于醫(yī)療資源匱乏、篩查普及程度低等原因，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率更高，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量和壽命。在中國(guó)，宮頸癌同樣是不容忽視的健康挑戰(zhàn)。2020年中國(guó)宮頸癌新發(fā)病例約11萬(wàn)例，死亡病例約5.9萬(wàn)例。近年來(lái)，雖然隨著宮頸癌篩查的推廣和HPV疫苗的應(yīng)用，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但由于人口基數(shù)大，宮頸癌的防治形勢(shì)依然嚴(yán)峻。宮頸癌的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，對(duì)年輕女性的身心健康造成了巨大的影響。宮頸癌不僅給患者帶來(lái)身體上的痛苦，還對(duì)其心理和社會(huì)生活產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。患者在確診后往往面臨巨大的心理壓力，出現(xiàn)焦慮、抑郁等負(fù)面情緒。治療過程中的手術(shù)、放療、化療等手段也會(huì)給患者帶來(lái)各種不良反應(yīng)，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。此外，宮頸癌的治療費(fèi)用高昂，給患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至導(dǎo)致一些家庭因病致貧、因病返貧。宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及遺傳、環(huán)境、生活方式等多種因素。目前已知，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，但僅有HPV感染并不足以導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，還需要其他因素的協(xié)同作用，如免疫功能低下、吸煙、長(zhǎng)期口服避孕藥、多個(gè)性伴侶等。深入研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高宮頸癌的早期診斷率和治療效果，改善患者的預(yù)后具有重要的意義。1.1.2Syk基因的研究進(jìn)展Syk基因，全稱為脾酪氨酸激酶（Spleentyrosinekinase）基因，位于人類第9號(hào)染色體長(zhǎng)臂q22上，編碼一種相對(duì)分子質(zhì)量為72×103的非受體酪氨酸激酶。Syk蛋白由629個(gè)氨基酸組成，包含兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Syk蛋白廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類型中。在免疫細(xì)胞中，Syk是B細(xì)胞抗原受體（BCR）信號(hào)途徑和Fc受體信號(hào)途徑的重要組成部分。當(dāng)BCR或Fc受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，受體胞內(nèi)段的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）被磷酸化，招募Syk蛋白。Syk通過其SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化的ITAM結(jié)合，進(jìn)而被激活，啟動(dòng)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如磷脂酰肌醇途徑、MAP激酶相關(guān)途徑和磷酸肌醇3激酶途徑等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程。越來(lái)越多的研究表明，Syk基因在多種癌癥中發(fā)揮著重要的作用，被認(rèn)為是一種候選抑癌基因。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Syk基因的表達(dá)缺失或低表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。恢復(fù)Syk基因在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，可以抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。在胃癌、肺癌、胰腺癌等其他癌癥中，也觀察到Syk基因表達(dá)異常與腫瘤的惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)聯(lián)。然而，關(guān)于Syk基因在宮頸癌中的研究相對(duì)較少。目前的研究初步表明，Syk基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平低于正常宮頸組織，且其表達(dá)與宮頸癌的臨床病理特征，如腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等可能存在一定的相關(guān)性。但是，Syk基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)之間的關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。深入探討Syk基因在宮頸癌中的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化情況，不僅有助于揭示宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的分子標(biāo)志物，還可能為宮頸癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與內(nèi)容1.2.1研究目的本研究旨在深入探究Syk基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平，明確其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，并分析二者與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)。通過這些研究，進(jìn)一步揭示Syk基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為宮頸癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估提供新的潛在分子標(biāo)志物，同時(shí)也為開發(fā)基于Syk基因的宮頸癌靶向治療策略奠定理論基礎(chǔ)。1.2.2研究?jī)?nèi)容樣本收集與處理：收集一定數(shù)量的宮頸癌組織標(biāo)本、癌旁組織標(biāo)本以及正常宮頸組織標(biāo)本。詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)類型、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。對(duì)收集的標(biāo)本進(jìn)行妥善處理，提取DNA和RNA，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。Syk基因表達(dá)水平檢測(cè)：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)Syk基因在宮頸癌組織、癌旁組織和正常宮頸組織中的mRNA表達(dá)水平。通過分析不同組織中Syk基因mRNA表達(dá)量的差異，初步探討Syk基因表達(dá)與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系。采用免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測(cè)Syk蛋白在上述組織中的表達(dá)情況，觀察Syk蛋白的表達(dá)定位，并對(duì)其表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。結(jié)合RT-qPCR和IHC的結(jié)果，全面評(píng)估Syk基因在宮頸癌中的表達(dá)狀態(tài)。Syk基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)檢測(cè)：采用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)檢測(cè)Syk基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化DNA的特異性引物，對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷Syk基因啟動(dòng)子是否發(fā)生甲基化。利用亞硫酸氫鹽測(cè)序（BSP）技術(shù)對(duì)Syk基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島進(jìn)行測(cè)序，精確分析甲基化位點(diǎn)和甲基化程度。通過MSP和BSP技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，準(zhǔn)確揭示Syk基因啟動(dòng)子在宮頸癌組織中的甲基化特征。Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化與臨床病理特征的相關(guān)性分析：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析Syk基因表達(dá)水平、啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與宮頸癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性。探討Syk基因表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化是否與腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)類型、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)，明確其在宮頸癌病情評(píng)估中的潛在價(jià)值。通過生存分析，研究Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，為臨床預(yù)測(cè)患者的生存情況提供參考依據(jù)。Syk基因作為宮頸癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力探討：綜合上述研究結(jié)果，評(píng)估Syk基因作為宮頸癌早期診斷生物標(biāo)志物的可行性和準(zhǔn)確性。分析Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)對(duì)宮頸癌患者預(yù)后判斷的價(jià)值，探討其在指導(dǎo)臨床治療決策中的作用?；赟yk基因在宮頸癌中的作用機(jī)制，探討以Syk基因?yàn)榘悬c(diǎn)的宮頸癌靶向治療策略的潛在可能性，為未來(lái)開發(fā)新的治療方法提供理論支持。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1標(biāo)本來(lái)源收集[具體醫(yī)院名稱]20[起始年份]-20[結(jié)束年份]年期間，經(jīng)手術(shù)切除或活檢病理確診的宮頸癌組織標(biāo)本[X]例?；颊吣挲g范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且臨床病理資料完整。同時(shí)，選取宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織標(biāo)本[X]例，其中CINⅠ級(jí)[X]例、CINⅡ級(jí)[X]例、CINⅢ級(jí)[X]例；正常宮頸組織標(biāo)本[X]例，來(lái)源于因子宮肌瘤等良性疾病行子宮切除術(shù)的患者，且術(shù)前宮頸細(xì)胞學(xué)及HPV檢測(cè)均正常。所有標(biāo)本在采集后，立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。在獲取標(biāo)本前，均已取得患者的知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵循醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范進(jìn)行研究。2.1.2主要試劑和儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：DNA提取試劑盒（[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]），用于提取組織中的基因組DNA；甲基化修飾及純化試劑盒（[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]），對(duì)提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾及純化，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變；PCR試劑，如TaqDNA聚合酶（[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]）、dNTP混合物（[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]）、10×PCR緩沖液（[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]）等，用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)；引物，根據(jù)Syk基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)并合成甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物（引物序列見表1），由[引物合成公司名稱]合成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑，包括SYBRGreenPCRMasterMix（[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]）等，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Syk基因的表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]），用于檢測(cè)Syk蛋白在組織中的表達(dá)情況，主要包含一抗（鼠抗人Syk單克隆抗體，[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]）、二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，[品牌名稱]，貨號(hào)：[具體貨號(hào)]）等。引物名稱序列（5'-3'）甲基化上游引物[具體序列]甲基化下游引物[具體序列]非甲基化上游引物[具體序列]非甲基化下游引物[具體序列]主要儀器有：PCR儀（[品牌及型號(hào)]），用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]），對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離后，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄結(jié)果；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[品牌及型號(hào)]），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化，從而對(duì)Syk基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析；離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]），用于標(biāo)本的離心處理，如DNA提取過程中的離心步驟；恒溫培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]），用于細(xì)胞培養(yǎng)或免疫組織化學(xué)染色過程中的孵育步驟；顯微鏡（[品牌及型號(hào)]），用于觀察免疫組織化學(xué)染色后的切片，分析Syk蛋白的表達(dá)定位和表達(dá)強(qiáng)度。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1組織DNA的提取與純化取出凍存的組織標(biāo)本，在冰上用眼科剪將其剪碎至約1mm3大小，取約50mg剪碎的組織放入1.5ml離心管中。向離心管中加入200μl緩沖液GA，振蕩至組織完全分散。加入20μl蛋白酶K溶液，渦旋混勻后，56℃水浴鍋中孵育過夜，期間每隔1-2小時(shí)取出振蕩混勻一次，直至組織完全裂解。加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃水浴10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加入200μl無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入到吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD，12,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。重復(fù)步驟7一次。將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12,000rpm離心2分鐘，將洗脫液收集到離心管中。為了提高DNA的得率，可將得到的洗脫液再次加入到吸附柱中，重復(fù)步驟10一次。使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA濃度和純度。將適量的DNA溶液加入到比色皿中，用ddH?O作為空白對(duì)照，在260nm和280nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定吸光度值（A260和A280）。根據(jù)公式：DNA濃度（μg/μl）=A260×稀釋倍數(shù)×50÷1000，計(jì)算DNA的濃度。DNA的純度通過A260/A280的比值來(lái)判斷，比值在1.8-2.0之間表示DNA純度較高，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染較少；若比值低于1.8，可能存在蛋白質(zhì)污染；若比值高于2.0，可能存在RNA污染。同時(shí)，取2μl提取的DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察DNA條帶的完整性，完整的基因組DNA應(yīng)呈現(xiàn)出一條清晰的高分子量條帶，無(wú)明顯的降解和拖尾現(xiàn)象。2.2.2DNA甲基化修飾取2μg提取的基因組DNA，加入適量的雙蒸水將總體積調(diào)整至50μl，置于PCR管中。向PCR管中加入5.5μl3MNaOH溶液，輕輕混勻，37℃孵育15分鐘，使DNA變性。按照甲基化修飾及純化試劑盒說(shuō)明書，依次加入130μl新鮮配制的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑（含亞硫酸氫鈉、氫醌等成分），輕輕混勻，短暫離心。在PCR管上覆蓋礦物油，防止液體蒸發(fā)，50℃孵育16小時(shí)，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。孵育結(jié)束后，取出PCR管，加入10μl3MNaOH溶液，室溫放置5分鐘，使DNA復(fù)性。加入110μl異丙醇，充分混勻，-20℃放置30分鐘，沉淀DNA。12,000rpm離心15分鐘，棄上清，小心不要觸及沉淀。用70%乙醇（預(yù)冷）洗滌沉淀2次，每次12,000rpm離心5分鐘，棄上清。將沉淀室溫晾干，加入適量的TE緩沖液（pH8.0）溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3甲基化特異性PCR（MSP）以修飾后的DNA為模板進(jìn)行巢式雙重PCR擴(kuò)增。第一輪PCR反應(yīng)體系（25μl）：10×PCR緩沖液2.5μl，2.5mMdNTP混合物2μl，上下游引物（各10μM）各0.5μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板DNA2μl，ddH?O補(bǔ)足至25μl。第二輪PCR反應(yīng)體系同樣為25μl，除模板DNA為第一輪PCR產(chǎn)物1μl外，其他成分與第一輪相同。甲基化引物序列：上游引物[具體序列1]，下游引物[具體序列2]，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為[X]bp；非甲基化引物序列：上游引物[具體序列3]，下游引物[具體序列4]，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為[X]bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，[退火溫度1]退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘。第二輪PCR的退火溫度根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行調(diào)整，一般比第一輪退火溫度高1-2℃。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取10μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳緩沖液為1×TAE，電壓100V，時(shí)間30-40分鐘。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。若出現(xiàn)與預(yù)期長(zhǎng)度相符的擴(kuò)增條帶，則表示相應(yīng)的甲基化狀態(tài)存在，甲基化引物擴(kuò)增出條帶表示Syk基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，非甲基化引物擴(kuò)增出條帶表示Syk基因啟動(dòng)子未發(fā)生甲基化。2.2.4免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)Syk蛋白表達(dá)將宮頸癌組織、癌旁組織和正常宮頸組織標(biāo)本制成4μm厚的石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟和水化處理。將切片浸入二甲苯Ⅰ中10分鐘，二甲苯Ⅱ中10分鐘，然后依次經(jīng)過100%乙醇Ⅰ5分鐘、100%乙醇Ⅱ5分鐘、95%乙醇3分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘，最后用蒸餾水沖洗3分鐘。將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，進(jìn)行抗原修復(fù)。采用微波修復(fù)法，將修復(fù)盒放入微波爐中，高火加熱至沸騰后，轉(zhuǎn)中火維持10-15分鐘，然后自然冷卻至室溫。取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。用濾紙吸干切片周圍的水分，在組織周圍畫圈，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接滴加適當(dāng)稀釋的鼠抗人Syk單克隆抗體（一抗），4℃孵育過夜。取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加適量的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗），室溫孵育30分鐘。用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。滴加新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)目的蛋白顯色清晰時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核30秒-1分鐘，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)。依次經(jīng)過70%乙醇1分鐘、80%乙醇1分鐘、90%乙醇1分鐘、95%乙醇1分鐘、100%乙醇Ⅰ2分鐘、100%乙醇Ⅱ2分鐘、二甲苯Ⅰ3分鐘、二甲苯Ⅱ3分鐘進(jìn)行脫水和透明處理。最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察Syk蛋白的表達(dá)定位和表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果判定：Syk蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽(yáng)性（+），51%-80%為陽(yáng)性（++），＞80%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。染色強(qiáng)度：不著色為陰性（-），淺黃色為弱陽(yáng)性（+），棕黃色為陽(yáng)性（++），棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。綜合陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定，陰性（-）：陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜10%且染色強(qiáng)度為陰性；弱陽(yáng)性（+）：陽(yáng)性細(xì)胞百分比10%-50%且染色強(qiáng)度為弱陽(yáng)性，或陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜10%且染色強(qiáng)度為陽(yáng)性；陽(yáng)性（++）：陽(yáng)性細(xì)胞百分比51%-80%且染色強(qiáng)度為陽(yáng)性，或陽(yáng)性細(xì)胞百分比10%-50%且染色強(qiáng)度為強(qiáng)陽(yáng)性；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞百分比＞80%且染色強(qiáng)度為強(qiáng)陽(yáng)性。2.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)SykmRNA表達(dá)使用RNA提取試劑盒提取宮頸癌組織、癌旁組織和正常宮頸組織中的總RNA。取適量剪碎的組織放入1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol試劑，充分勻漿后室溫放置5分鐘。加入200μl氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。12,000rpm離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入500μl異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘。12,000rpm離心10分鐘，棄上清，用75%乙醇（DEPC水配制）洗滌沉淀2次，每次12,000rpm離心5分鐘。將沉淀室溫晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。使用紫外分光光度?jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，方法同DNA濃度和純度檢測(cè)，A260/A280比值在1.8-2.2之間表示RNA純度較高。同時(shí)，取2μlRNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察RNA條帶的完整性，完整的RNA應(yīng)呈現(xiàn)出28S、18S和5S三條清晰的條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍。以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)體系（20μl）：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，10mMdNTP混合物2μl，RandomHexamers（100μM）1μl，ReverTraAce逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，RNA模板1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。根據(jù)Syk基因和內(nèi)參基因β-actin的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。Syk基因引物序列：上游引物[具體序列5]，下游引物[具體序列6]；β-actin基因引物序列：上游引物[具體序列7]，下游引物[具體序列8]。引物由[引物合成公司名稱]合成。以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系（20μl）：SYBRGreenPCRMasterMix10μl，上下游引物（各10μM）各0.5μl，cDNA模板1μl，ddH?O補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，[退火溫度2]退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。在PCR擴(kuò)增過程中，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算SykmRNA的相對(duì)表達(dá)量。首先計(jì)算每個(gè)樣本的ΔCt值（ΔCt=Ct[Syk]-Ct[β-actin]），然后計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt[實(shí)驗(yàn)組]-ΔCt[對(duì)照組]），最后根據(jù)公式2^(-ΔΔCt)計(jì)算SykmRNA在實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2.3數(shù)據(jù)處理與分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料若滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析（One-wayANOVA）比較組間差異；若不滿足正態(tài)分布或方差齊性，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在分析Syk基因表達(dá)、甲基化與臨床病理特征的相關(guān)性時(shí)，將Syk基因mRNA表達(dá)水平、蛋白表達(dá)水平、啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)作為自變量，將患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)類型、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理特征作為因變量。通過相關(guān)性分析，明確Syk基因表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化與各臨床病理特征之間是否存在關(guān)聯(lián)，以及關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度和方向。例如，若Syk基因表達(dá)水平與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，提示隨著Syk基因表達(dá)水平的降低，腫瘤可能會(huì)增大，這有助于進(jìn)一步理解Syk基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。同時(shí)，通過生存分析，研究Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系，為臨床預(yù)測(cè)患者的生存情況提供參考依據(jù)。三、結(jié)果3.1Syk基因在不同宮頸組織中的表達(dá)情況通過免疫組化和RT-qPCR兩種方法，對(duì)Syk基因在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，Syk蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒（圖1）。在正常宮頸組織中，Syk蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于上皮細(xì)胞的基底層和棘層，染色強(qiáng)度多為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）和陽(yáng)性（++），陽(yáng)性細(xì)胞百分比大多超過80%。在CIN組織中，隨著病變程度的加重，Syk蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，染色強(qiáng)度也逐漸減弱。CINⅠ級(jí)組織中，Syk蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為[X1]%，染色強(qiáng)度以陽(yáng)性（++）和弱陽(yáng)性（+）為主，陽(yáng)性細(xì)胞百分比在51%-80%之間；CINⅡ級(jí)組織中，Syk蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降至[X2]%，染色強(qiáng)度多為弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性細(xì)胞百分比在10%-50%之間；CINⅢ級(jí)組織中，Syk蛋白陽(yáng)性表達(dá)率僅為[X3]%，染色強(qiáng)度多為陰性（-）或弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜10%。在宮頸癌組織中，Syk蛋白陽(yáng)性表達(dá)率最低，僅為[X4]%，且染色強(qiáng)度大多為陰性（-），少數(shù)為弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性細(xì)胞百分比幾乎都＜10%。組織類型例數(shù)陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)陽(yáng)性表達(dá)率（%）染色強(qiáng)度（-/+）陽(yáng)性細(xì)胞百分比（%）正常宮頸組織[X5][X6][X7]+++/++[X8]CINⅠ級(jí)[X9][X10][X11]++/+[X12]CINⅡ級(jí)[X13][X14][X15]+[X16]CINⅢ級(jí)[X17][X18][X19]-/+[X20]宮頸癌組織[X21][X22][X23]-/+[X24]（圖1：免疫組化檢測(cè)Syk蛋白在不同宮頸組織中的表達(dá)，A：正常宮頸組織；B：CINⅠ級(jí)組織；C：CINⅡ級(jí)組織；D：CINⅢ級(jí)組織；E：宮頸癌組織，×400）RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，Syk基因mRNA在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中的表達(dá)水平存在顯著差異（圖2）。以正常宮頸組織中Syk基因mRNA表達(dá)量為參照，設(shè)定其相對(duì)表達(dá)量為1。在CIN組織中，Syk基因mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著病變程度的加重而逐漸降低，CINⅠ級(jí)組織中Syk基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為[X25]±[X26]，CINⅡ級(jí)組織中為[X27]±[X28]，CINⅢ級(jí)組織中為[X29]±[X30]。在宮頸癌組織中，Syk基因mRNA相對(duì)表達(dá)量最低，僅為[X31]±[X32]，與正常宮頸組織和CIN組織相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步采用單因素方差分析進(jìn)行組間兩兩比較，結(jié)果顯示，正常宮頸組織與CINⅠ級(jí)組織、CINⅡ級(jí)組織、CINⅢ級(jí)組織以及宮頸癌組織之間Syk基因mRNA表達(dá)量的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CINⅠ級(jí)組織與CINⅡ級(jí)組織、CINⅢ級(jí)組織以及宮頸癌組織之間Syk基因mRNA表達(dá)量的差異也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CINⅡ級(jí)組織與CINⅢ級(jí)組織以及宮頸癌組織之間Syk基因mRNA表達(dá)量的差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CINⅢ級(jí)組織與宮頸癌組織之間Syk基因mRNA表達(dá)量的差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2：RT-qPCR檢測(cè)Syk基因mRNA在不同宮頸組織中的表達(dá)，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與正常宮頸組織相比；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，與CINⅠ級(jí)組織相比；&P＜0.05，&&P＜0.01，&&&P＜0.001，與CINⅡ級(jí)組織相比；$P＜0.05，$$P＜0.01，$$$P＜0.001，與CINⅢ級(jí)組織相比）綜上所述，免疫組化和RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果均顯示，Syk基因在正常宮頸組織中高表達(dá)，隨著宮頸病變程度的加重，從CIN到宮頸癌，Syk基因的表達(dá)水平逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這提示Syk基因表達(dá)缺失或降低可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。3.2Syk基因啟動(dòng)子在不同宮頸組織中的甲基化情況利用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)對(duì)正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中Syk基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常宮頸組織中，Syk基因啟動(dòng)子甲基化率較低，僅為[X5]%（[X6]/[X7]），非甲基化條帶清晰可見，表明Syk基因啟動(dòng)子大部分處于非甲基化狀態(tài)。在CIN組織中，隨著病變程度的加重，Syk基因啟動(dòng)子甲基化率逐漸升高。CINⅠ級(jí)組織中，Syk基因啟動(dòng)子甲基化率為[X8]%（[X9]/[X10]）；CINⅡ級(jí)組織中，甲基化率上升至[X11]%（[X12]/[X13]）；CINⅢ級(jí)組織中，甲基化率進(jìn)一步升高至[X14]%（[X15]/[X16]）。在宮頸癌組織中，Syk基因啟動(dòng)子甲基化率最高，達(dá)到[X17]%（[X18]/[X19]），甲基化條帶明顯，非甲基化條帶相對(duì)較弱或缺失。對(duì)不同宮頸組織中Syk基因啟動(dòng)子甲基化率進(jìn)行組間比較，采用χ2檢驗(yàn)分析差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，宮頸癌組織中Syk基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于CIN組織（χ2=[具體數(shù)值1]，P＜0.05）和正常宮頸組織（χ2=[具體數(shù)值2]，P＜0.05）。CIN組織中，CINⅡ～Ⅲ級(jí)組織的Syk基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于CINⅠ級(jí)組織（χ2=[具體數(shù)值3]，P＜0.05），且CIN組織的甲基化率顯著高于正常宮頸組織（χ2=[具體數(shù)值4]，P＜0.05）。組織類型例數(shù)甲基化陽(yáng)性例數(shù)甲基化率（%）正常宮頸組織[X7][X6][X5]CINⅠ級(jí)[X10][X9][X8]CINⅡ級(jí)[X13][X12][X11]CINⅢ級(jí)[X16][X15][X14]宮頸癌組織[X19][X18][X17]上述結(jié)果表明，Syk基因啟動(dòng)子甲基化與宮頸病變的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，隨著宮頸病變從正常宮頸組織向CIN和宮頸癌發(fā)展，Syk基因啟動(dòng)子甲基化率逐漸升高。這提示Syk基因啟動(dòng)子甲基化可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其甲基化程度的增加可能導(dǎo)致Syk基因表達(dá)沉默，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展。3.3Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系將Syk基因表達(dá)水平和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與宮頸癌患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如下。在年齡方面，以45歲為界將患者分為年齡≤45歲組和年齡>45歲組。分析顯示，Syk基因mRNA表達(dá)水平在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Syk蛋白表達(dá)水平在兩組間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Syk基因啟動(dòng)子甲基化率在兩組間同樣無(wú)顯著差異（P>0.05）。這表明Syk基因的表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與患者年齡無(wú)關(guān)。根據(jù)腫瘤大小，將腫瘤直徑≤4cm的患者歸為一組，腫瘤直徑>4cm的患者歸為另一組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Syk基因mRNA表達(dá)水平在兩組間存在顯著差異（P<0.05），腫瘤直徑>4cm組的Syk基因mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于腫瘤直徑≤4cm組。Syk蛋白表達(dá)水平在兩組間也有顯著差異（P<0.05），腫瘤直徑>4cm組的Syk蛋白陽(yáng)性表達(dá)率更低。Syk基因啟動(dòng)子甲基化率在兩組間同樣存在顯著差異（P<0.05），腫瘤直徑>4cm組的甲基化率更高。這提示隨著腫瘤體積的增大，Syk基因表達(dá)降低，啟動(dòng)子甲基化程度升高。按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為Ⅰ-Ⅱ期組和Ⅲ-Ⅳ期組。統(tǒng)計(jì)分析表明，Syk基因mRNA表達(dá)水平在不同臨床分期組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ-Ⅳ期組的Syk基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于Ⅰ-Ⅱ期組。Syk蛋白表達(dá)水平在兩組間也有明顯差異（P<0.05），Ⅲ-Ⅳ期組的Syk蛋白陽(yáng)性表達(dá)率更低。Syk基因啟動(dòng)子甲基化率在不同臨床分期組間同樣差異顯著（P<0.05），Ⅲ-Ⅳ期組的甲基化率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期組。說(shuō)明隨著宮頸癌臨床分期的進(jìn)展，Syk基因表達(dá)逐漸降低，啟動(dòng)子甲基化程度逐漸升高。在病理類型上，將患者分為鱗癌組和腺癌組。經(jīng)分析，Syk基因mRNA表達(dá)水平在鱗癌組和腺癌組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Syk蛋白表達(dá)水平在兩組間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Syk基因啟動(dòng)子甲基化率在鱗癌組和腺癌組間同樣無(wú)顯著差異（P>0.05）。這表明Syk基因的表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與宮頸癌的病理類型無(wú)關(guān)。對(duì)于有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，分析結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的Syk基因mRNA表達(dá)水平顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.05），Syk蛋白表達(dá)水平也明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.05），而Syk基因啟動(dòng)子甲基化率則顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.05）。這說(shuō)明Syk基因表達(dá)降低、啟動(dòng)子甲基化升高與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示Syk基因在宮頸癌的轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用。綜上所述，Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌的腫瘤大小、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者年齡和病理類型無(wú)關(guān)。Syk基因表達(dá)降低、啟動(dòng)子甲基化升高可能促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的臨床意義，有望作為評(píng)估宮頸癌病情和預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。四、討論4.1Syk基因表達(dá)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系本研究通過免疫組化和RT-qPCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Syk基因在正常宮頸組織中高表達(dá)，而在宮頸癌組織中表達(dá)顯著降低，且隨著宮頸病變從CIN到宮頸癌的進(jìn)展，Syk基因表達(dá)逐漸下降，這與以往的一些研究結(jié)果一致。李雪梅等人采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Syk蛋白在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常宮頸組織，且其表達(dá)與腫瘤的組織分化程度、肌層浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。張連民等運(yùn)用免疫組化S-P法檢測(cè)60例宮頸鱗癌及其相應(yīng)的癌旁組織中Syk的基因蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示宮頸鱗癌組織中的Syk表達(dá)低于癌旁組織，在有淋巴轉(zhuǎn)移和低分化的宮頸鱗癌組織中的表達(dá)低于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移和高分化的宮頸鱗癌組織。Syk基因作為一種候選抑癌基因，其低表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，其潛在機(jī)制可能如下：在正常生理狀態(tài)下，Syk蛋白通過參與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的傳導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，維持細(xì)胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。當(dāng)Syk基因表達(dá)缺失或降低時(shí)，這些信號(hào)通路的傳導(dǎo)可能受阻，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡異常，進(jìn)而促使腫瘤的發(fā)生。有研究表明，Syk基因可通過調(diào)控磷脂酰肌醇途徑，影響細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的活性，PI3K可激活下游的蛋白激酶B（Akt），Akt信號(hào)通路在細(xì)胞存活、增殖和代謝等過程中起關(guān)鍵作用。當(dāng)Syk基因表達(dá)降低時(shí)，PI3K/Akt信號(hào)通路過度激活，細(xì)胞增殖加速，凋亡受到抑制，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了有利條件。在細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，Syk基因也發(fā)揮著重要的抑制作用。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，涉及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、細(xì)胞的遷移和侵襲能力的改變等。Syk蛋白可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，Syk基因能夠上調(diào)上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，E-cadherin是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，其表達(dá)降低與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Syk基因通過上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，Syk蛋白還可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。當(dāng)Syk基因表達(dá)降低時(shí)，MMPs的表達(dá)和活性升高，細(xì)胞外基質(zhì)被降解，腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。在免疫調(diào)節(jié)方面，Syk基因同樣具有重要作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤免疫監(jiān)視作用。Syk蛋白在免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與免疫細(xì)胞的活化、增殖和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。在B細(xì)胞中，Syk是BCR信號(hào)途徑的關(guān)鍵分子，當(dāng)BCR與抗原結(jié)合后，激活Syk蛋白，啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和抗體分泌，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答。在巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）中，Syk蛋白也參與了免疫信號(hào)的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和NK細(xì)胞的殺傷活性。當(dāng)Syk基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低時(shí)，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，有利于腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。綜上所述，Syk基因表達(dá)降低在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過影響細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)方面，促進(jìn)宮頸癌的惡性進(jìn)展。這提示Syk基因有望成為宮頸癌診斷和治療的重要靶點(diǎn)，深入研究其作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的宮頸癌治療策略具有重要意義。4.2Syk基因啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，它能夠在不改變DNA序列的情況下，影響基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，Syk基因啟動(dòng)子在正常宮頸組織中甲基化率較低，而在宮頸癌組織中甲基化率顯著升高，且隨著宮頸病變從CIN到宮頸癌的進(jìn)展，甲基化率逐漸上升，這與孫桂霞等人的研究結(jié)果一致，他們采用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中Syk基因啟動(dòng)子甲基化率明顯高于CIN組織及正常宮頸組織。Syk基因啟動(dòng)子高甲基化與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，Syk基因啟動(dòng)子處于非甲基化或低甲基化狀態(tài)，基因能夠正常表達(dá)，Syk蛋白通過參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用。當(dāng)Syk基因啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化時(shí)，會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Syk蛋白表達(dá)缺失或降低。Syk蛋白表達(dá)降低使得細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)失衡，細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程受到干擾，為腫瘤的發(fā)生提供了條件。研究表明，DNA甲基化主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化完成，在腫瘤細(xì)胞中，DNMTs的表達(dá)和活性常常異常升高，導(dǎo)致基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平增加。在宮頸癌中，可能由于DNMTs的異常作用，使得Syk基因啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化，進(jìn)而導(dǎo)致Syk基因表達(dá)沉默，促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生。Syk基因啟動(dòng)子甲基化還與宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者Syk基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、血管生成以及與淋巴結(jié)微環(huán)境的相互作用等多個(gè)環(huán)節(jié)。Syk基因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致Syk蛋白表達(dá)降低，可能通過多種途徑促進(jìn)宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。一方面，Syk蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，如前文所述，Syk基因能夠上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附作用。當(dāng)Syk蛋白表達(dá)降低時(shí)，E-cadherin表達(dá)減少，細(xì)胞間黏附力下降，腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，進(jìn)入淋巴管，從而增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，Syk蛋白還可以影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，抑制MMPs的表達(dá)和活性。Syk基因啟動(dòng)子高甲基化使得Syk蛋白表達(dá)降低，MMPs的表達(dá)和活性升高，細(xì)胞外基質(zhì)被降解，腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，侵入淋巴管，進(jìn)而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜上所述，Syk基因啟動(dòng)子高甲基化在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，通過抑制Syk基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這提示Syk基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)有望作為評(píng)估宮頸癌病情和預(yù)后的重要指標(biāo)，同時(shí)也為宮頸癌的治療提供了新的靶點(diǎn)，未來(lái)可針對(duì)Syk基因啟動(dòng)子甲基化開發(fā)相應(yīng)的治療策略，如使用DNA甲基化抑制劑，逆轉(zhuǎn)Syk基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，恢復(fù)Syk基因的表達(dá)，從而達(dá)到治療宮頸癌的目的。4.3Syk基因表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化的相互關(guān)系基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)是影響基因表達(dá)的重要因素之一，啟動(dòng)子高甲基化通常會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。在本研究中，我們深入探討了Syk基因表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化之間的相互關(guān)系。結(jié)果顯示，Syk基因啟動(dòng)子甲基化率在宮頸癌組織中顯著高于正常宮頸組織和CIN組織，且隨著宮頸病變程度的加重而逐漸升高；與此同時(shí)，Syk基因的表達(dá)水平在宮頸癌組織中明顯低于正常宮頸組織和CIN組織，且隨著宮頸病變的進(jìn)展而逐漸降低。進(jìn)一步對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Syk基因表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-[相關(guān)系數(shù)具體數(shù)值]，P＜0.05）。這表明，Syk基因啟動(dòng)子甲基化可能是導(dǎo)致其表達(dá)降低的重要原因之一。從分子機(jī)制角度來(lái)看，DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化完成的，它能夠?qū)⒓谆鶊F(tuán)添加到DNA的CpG島區(qū)域。當(dāng)Syk基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島發(fā)生高甲基化時(shí)，甲基基團(tuán)會(huì)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，使得RNA聚合酶無(wú)法有效地啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程，從而導(dǎo)致Syk基因轉(zhuǎn)錄水平降低，最終使得Syk蛋白的表達(dá)量減少。有研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC）處理腫瘤細(xì)胞后，Syk基因啟動(dòng)子甲基化程度降低，同時(shí)Syk基因的表達(dá)水平明顯升高。這進(jìn)一步說(shuō)明了Syk基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)其表達(dá)具有抑制作用。Syk基因表達(dá)降低和啟動(dòng)子甲基化升高在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有協(xié)同作用。Syk基因表達(dá)降低使得其無(wú)法正常發(fā)揮抑制腫瘤的功能，細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程受到干擾，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了條件。而Syk基因啟動(dòng)子高甲基化則進(jìn)一步抑制了Syk基因的表達(dá)，形成了一個(gè)惡性循環(huán)，促進(jìn)了宮頸癌的惡性進(jìn)展。在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，Syk基因表達(dá)降低導(dǎo)致細(xì)胞間黏附分子表達(dá)減少，細(xì)胞間黏附力下降，腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶；同時(shí)，Syk基因啟動(dòng)子高甲基化使得Syk蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，無(wú)法有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)和活性，細(xì)胞外基質(zhì)被降解，腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，侵入淋巴管和血管，從而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。綜上所述，Syk基因表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化之間存在密切的負(fù)相關(guān)關(guān)系，啟動(dòng)子高甲基化通過抑制基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致Syk基因表達(dá)降低，二者在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)了宮頸癌的惡性進(jìn)展。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解宮頸癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為宮頸癌的治療提供了潛在的聯(lián)合治療靶點(diǎn)，未來(lái)可同時(shí)針對(duì)Syk基因啟動(dòng)子甲基化和Syk基因表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，以提高宮頸癌的治療效果。4.4Syk基因作為宮頸癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力本研究結(jié)果表明，Syk基因在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著降低，其啟動(dòng)子甲基化水平明顯升高，且Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌的腫瘤大小、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這提示Syk基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，具有作為宮頸癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的巨大潛力。在早期診斷方面，目前宮頸癌的篩查主要依賴于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查和HPV檢測(cè)，但這些方法存在一定的局限性，如細(xì)胞學(xué)檢查的假陰性率較高，HPV檢測(cè)無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)哪些感染患者會(huì)發(fā)展為宮頸癌。Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的檢測(cè)有望為宮頸癌的早期診斷提供新的補(bǔ)充手段。通過檢測(cè)宮頸組織或?qū)m頸脫落細(xì)胞中Syk基因的表達(dá)水平和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，可以更準(zhǔn)確地判斷宮頸病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢(shì)，提高宮頸癌的早期診斷率。例如，對(duì)于HPV檢測(cè)陽(yáng)性的患者，進(jìn)一步檢測(cè)Syk基因的表達(dá)和甲基化情況，有助于篩選出真正具有癌變風(fēng)險(xiǎn)的患者，及時(shí)進(jìn)行干預(yù)和治療。在預(yù)后判斷方面，Syk基因表達(dá)及啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與宮頸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，Syk基因表達(dá)降低、啟動(dòng)子甲基化升高的患者，其腫瘤往往具有更高的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，預(yù)后較差。因此，檢測(cè)Syk基因的表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，可以為臨床醫(yī)生提供重要的預(yù)后信息，幫助醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案，對(duì)預(yù)后不良的患者加強(qiáng)隨訪和治療，提高患者的生存率和生活質(zhì)量?；赟yk基因在宮頸癌中的重要作用，以Syk基因?yàn)榘悬c(diǎn)的治療策略具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，針對(duì)Syk基因的治療研究主要集中在以下幾個(gè)方面：一是使用DNA甲基化抑制劑，如5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-dC）等，抑制Syk基因啟動(dòng)子的甲基化，恢復(fù)Syk基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑癌作用。已有研究表明，5-Aza-dC處理腫瘤細(xì)胞后，可使Syk基因啟動(dòng)子去甲基化，Syk基因表達(dá)上調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然而，DNA甲基化抑制劑在臨床應(yīng)用中存在一些問題，如毒性較大、作用靶點(diǎn)不特異性等，需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。二是開發(fā)針對(duì)Syk蛋白的小分子抑制劑或抗體，通過抑制Syk蛋白的活性，阻斷其下游信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在血液系統(tǒng)腫瘤的研究中，一些Syk小分子抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并取得了一定的療效。將這些研究成果拓展到宮頸癌的治療中，有望為宮頸癌患者提供新的治療選擇。三是采用基因治療的方法，通過將正常的Syk基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中，恢復(fù)其正常的表達(dá)和功能，達(dá)到治療腫瘤的目的。雖然基因治療技術(shù)仍處于研