匯報人：文小庫2025-07-19真菌的檢驗技術(shù)CATALOGUE目錄01標(biāo)本采集與準(zhǔn)備02顯微鏡檢查技術(shù)03真菌培養(yǎng)方法04分子生物學(xué)檢測05免疫學(xué)檢驗方法06結(jié)果分析與報告01標(biāo)本采集與準(zhǔn)備標(biāo)本類型選擇臨床標(biāo)本包括皮膚刮屑、毛發(fā)、指甲、膿液、痰液、血液等，需根據(jù)感染部位和癥狀選擇合適標(biāo)本類型，確保病原體檢出率。食品與農(nóng)產(chǎn)品標(biāo)本針對霉菌污染檢測，需選取易霉變部位（如谷物胚芽、水果表皮）或加工環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵樣本。環(huán)境標(biāo)本如土壤、水體、空氣沉降物等，用于環(huán)境真菌污染監(jiān)測，需結(jié)合采樣目的選擇代表性樣本。采集方法與工具無菌操作技術(shù)使用滅菌棉簽、刮刀或活檢鉗采集臨床標(biāo)本，避免交叉污染，確保樣本原始性。01專用采樣設(shè)備空氣采樣器（如安德森撞擊器）用于氣載真菌孢子收集，土壤采樣器需保證深層樣本完整性。02標(biāo)準(zhǔn)化容器標(biāo)本需置于無菌密封容器或含轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基的試管中，防止干燥或微生物過度繁殖。03處理與保存規(guī)范添加抑制劑針對易腐標(biāo)本（如組織），可加入硫乙醇酸鈉等抑制劑以抑制細(xì)菌生長，突出真菌培養(yǎng)效果。03多數(shù)標(biāo)本需4℃短期保存，長期保存需-20℃或-80℃冷凍，避免反復(fù)凍融破壞菌體結(jié)構(gòu)。02低溫保存條件即時處理原則部分標(biāo)本（如痰液）需在采集后立即進(jìn)行消化或離心處理，以提高真菌檢出率。0102顯微鏡檢查技術(shù)直接鏡檢方法濕片法將臨床樣本（如痰液、皮屑）置于載玻片上，滴加生理鹽水或10%氫氧化鉀溶液溶解雜質(zhì)后直接觀察，適用于快速檢測真菌菌絲或孢子，尤其對皮膚癬菌和念珠菌的初步篩查效果顯著。壓片法對組織樣本進(jìn)行壓片處理后直接鏡檢，適用于深部真菌感染（如隱球菌）的快速診斷，需結(jié)合高倍鏡觀察特征性莢膜結(jié)構(gòu)。透明膠帶法利用透明膠帶黏取皮損表面樣本，粘貼于載玻片后鏡檢，可清晰展示真菌形態(tài)結(jié)構(gòu)，常用于淺表真菌感染的診斷，如花斑癬的鱗屑檢查。染色技術(shù)應(yīng)用革蘭染色可區(qū)分酵母菌（如白色念珠菌呈革蘭陽性）與細(xì)菌，但無法顯示真菌的特殊結(jié)構(gòu)，常用于初步鑒別混合感染中的真菌成分。乳酸酚棉藍(lán)染色使真菌細(xì)胞壁著色呈藍(lán)色，突出菌絲和孢子的形態(tài)，廣泛應(yīng)用于絲狀真菌（如曲霉、毛霉）的鑒定，尤其適用于培養(yǎng)物的鏡檢。六胺銀染色（GMS）通過黑色沉淀標(biāo)記真菌細(xì)胞壁多糖，靈敏度高，適用于組織病理學(xué)檢測肺孢子菌、組織胞漿菌等深部真菌，需配合高倍油鏡觀察。墨汁負(fù)染用于腦脊液中隱球菌的檢測，背景為黑色墨汁，莢膜呈透明暈輪，是診斷隱球菌性腦膜炎的金標(biāo)準(zhǔn)方法之一。特殊顯微鏡使用結(jié)合鈣熒光白、吖啶橙等熒光染料，可增強真菌結(jié)構(gòu)的對比度，顯著提高檢出率，尤其適用于低載量樣本（如肺泡灌洗液）的快速篩查。熒光顯微鏡相差顯微鏡共聚焦顯微鏡利用光相位差成像，無需染色即可觀察活體真菌的動態(tài)生長過程（如孢子萌發(fā)），常用于研究真菌的生物學(xué)特性及抗真菌藥物作用機制。通過三維成像技術(shù)解析真菌與宿主細(xì)胞的相互作用，適用于深部真菌感染（如侵襲性曲霉?。┑牟±頇C制研究，需配合特異性熒光標(biāo)記。03真菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)基選擇標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)需求匹配根據(jù)目標(biāo)真菌的生長特性選擇培養(yǎng)基，如沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）適用于多數(shù)腐生菌，而腦心浸液瓊脂（BHI）更適合營養(yǎng)要求苛刻的病原性真菌。01選擇性抑制劑添加針對混合樣本中細(xì)菌或雜菌的干擾，需添加氯霉素、放線菌酮等抑制劑，確保真菌純培養(yǎng)。例如，沙氏培養(yǎng)基常含氯霉素以抑制細(xì)菌生長。pH與滲透壓調(diào)節(jié)多數(shù)真菌偏好弱酸性環(huán)境（pH5.6-6.0），而雙相真菌需調(diào)整培養(yǎng)基滲透壓以模擬宿主內(nèi)環(huán)境，如添加10%羊血或20%蔗糖。特殊成分需求部分真菌需特定誘導(dǎo)物（如橄欖油促進(jìn)馬拉色菌生長）或維生素（如硫胺素）以激活孢子萌發(fā)或菌絲擴展。020304接種技術(shù)規(guī)范溫度梯度控制采用三區(qū)劃線法或點接種法分離單菌落，避免交叉污染；對于組織樣本，需研磨后均勻涂布以釋放菌體。常規(guī)培養(yǎng)溫度設(shè)定為25-28℃，但深部病原真菌（如組織胞漿菌）需37℃雙溫培養(yǎng)以模擬體內(nèi)環(huán)境。接種與培養(yǎng)條件氣體環(huán)境調(diào)控需氧真菌需暴露于空氣，而厭氧性真菌（如毛霉目）需微需氧條件（5%CO?），必要時使用氣密培養(yǎng)罐調(diào)節(jié)氧分壓。培養(yǎng)周期管理快速生長型真菌（如曲霉）需3-5天觀察，而慢速型（如莢膜組織胞漿菌）需孵育4-6周，定期檢查避免遺漏。菌落觀察要點Step1Step3Step4Step2觀察生長速率差異及隨培養(yǎng)時間產(chǎn)生的形態(tài)變化，如白色念珠菌從酵母相到菌絲相的轉(zhuǎn)換。動態(tài)變化監(jiān)測包括菌落直徑、隆起度（扁平/凸起）、邊緣（規(guī)則/羽毛狀）、表面（粉末狀/絨毛狀）及色素分泌（背面/正面顯色）。形態(tài)學(xué)特征記錄特殊結(jié)構(gòu)識別注意氣生菌絲（如曲霉的分生孢子頭）、色素擴散（如紅色毛癬菌的紅色擴散）及培養(yǎng)基變色（如新型隱球菌產(chǎn)棕色素）。污染與變異鑒別排除細(xì)菌污染（菌落邊緣渾濁）或真菌變異（如菌落局部退化），必要時通過鏡檢或傳代培養(yǎng)驗證。04分子生物學(xué)檢測PCR技術(shù)原理模板DNA變性引物退火DNA鏈延伸循環(huán)放大效應(yīng)通過高溫（94-98℃）使雙鏈DNA解鏈為單鏈，為后續(xù)引物結(jié)合和DNA合成提供模板。溫度降至50-65℃時，特異性引物與單鏈DNA模板的互補序列結(jié)合，形成引物-模板復(fù)合物。在72℃下，TaqDNA聚合酶以dNTPs為原料，沿模板從5'→3'方向合成新的DNA鏈，完成目標(biāo)片段擴增。上述步驟重復(fù)25-40個循環(huán)，可使目標(biāo)DNA片段呈指數(shù)級增長（理論擴增倍數(shù)為2^n）。DNA測序流程4數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與分析3邊合成邊測序（SBS）2簇生成與橋式PCR1樣本制備與文庫構(gòu)建使用Phred質(zhì)量值評估測序準(zhǔn)確性，通過比對參考基因組、變異檢測等生物信息學(xué)分析獲得最終序列信息。在流動槽中將DNA片段固定并擴增成簇，每個簇包含數(shù)千份相同DNA分子的拷貝，為并行測序奠定基礎(chǔ)。加入熒光標(biāo)記的可逆終止子dNTPs，通過掃描熒光信號確定堿基序列，循環(huán)進(jìn)行數(shù)百輪以獲得長讀段。提取高質(zhì)量基因組DNA后，通過片段化、末端修復(fù)、加接頭等步驟構(gòu)建測序文庫，確保DNA片段適合測序平臺要求。分子探針應(yīng)用將標(biāo)記熒光素的核酸探針與樣本DNA/RNA雜交，通過熒光顯微鏡直接觀察病原體在組織中的定位分布。熒光原位雜交（FISH）設(shè)計TaqMan探針或分子信標(biāo)，在PCR擴增過程中實時釋放熒光信號，實現(xiàn)病原體載量的精確定量。針對抗真菌藥物靶點（如ERG11、CYP51）設(shè)計探針，快速檢測臨床分離株的耐藥相關(guān)突變，指導(dǎo)精準(zhǔn)用藥。實時PCR定量檢測將數(shù)百種探針固定于芯片表面，通過雜交信號同時檢測多種真菌的特異性基因標(biāo)記，適用于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查?；蛐酒咄亢Y查01020403耐藥基因快速鑒定05免疫學(xué)檢驗方法血清學(xué)檢測技術(shù)凝集試驗通過真菌抗原與患者血清中特異性抗體結(jié)合形成可見凝集顆粒，適用于隱球菌、組織胞漿菌等感染的篩查，操作簡便但靈敏度受抗原純度影響。補體結(jié)合試驗（CFT）檢測血清中抗體與真菌抗原結(jié)合后激活補體的能力，常用于深部真菌病診斷，但需嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化以避免假陽性。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）利用酶標(biāo)記抗體定量檢測血清中真菌特異性IgG/IgM，適用于曲霉病、念珠菌病的早期診斷，靈敏度高且可自動化。免疫熒光法（IFA）通過熒光標(biāo)記抗體直接觀察血清中抗體與真菌抗原的結(jié)合，用于肺孢子菌等快速檢測，需專業(yè)設(shè)備且結(jié)果判讀依賴經(jīng)驗。抗原檢測策略半乳甘露聚糖（GM）試驗通過ELISA檢測血清或肺泡灌洗液中的曲霉細(xì)胞壁成分GM抗原，對侵襲性曲霉病診斷特異性達(dá)80%以上，需注意假陽性（如抗生素使用）。β-1,3-葡聚糖（G試驗）定量檢測真菌細(xì)胞壁共有成分，適用于念珠菌、曲霉等廣譜篩查，但無法區(qū)分具體菌種且易受透析患者樣本干擾。隱球菌莢膜多糖抗原檢測采用乳膠凝集或側(cè)流免疫層析法快速檢測腦脊液或血清中的抗原，對隱球菌腦膜炎診斷靈敏度超95%，需排除類風(fēng)濕因子干擾。念珠菌甘露聚糖抗原檢測聯(lián)合檢測甘露聚糖和抗甘露聚糖抗體可提高侵襲性念珠菌病的早期診斷率，但需動態(tài)監(jiān)測以排除定植干擾?？贵w檢測流程樣本前處理抗體滴度測定交叉反應(yīng)評估結(jié)果解釋與報告采集患者血清后需離心分離，避免溶血或脂血影響檢測結(jié)果，部分方法需56℃滅活補體30分鐘以降低非特異性反應(yīng)。通過系列稀釋血清確定終點滴度，如IFA或免疫擴散試驗，滴度≥1:16提示活動性感染，需結(jié)合臨床動態(tài)觀察。針對組織胞漿菌、球孢子菌等地域性真菌病，需使用特異性吸收抗原排除與其他真菌抗體的交叉反應(yīng)。結(jié)合患者免疫狀態(tài)（如HIV感染者抗體可能缺失）及治療史（如抗真菌藥影響抗原水平），綜合判斷陽性結(jié)果的臨床意義。06結(jié)果分析與報告鑒定標(biāo)準(zhǔn)指南通過顯微鏡觀察真菌的菌絲、孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。需注意環(huán)境因素對形態(tài)的影響，如培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件。形態(tài)學(xué)特征分析利用PCR擴增真菌的特定基因序列（如ITS、18SrRNA），通過測序與數(shù)據(jù)庫比對，實現(xiàn)高精度物種鑒定。該方法適用于形態(tài)特征不典型或難以培養(yǎng)的真菌。分子生物學(xué)鑒定通過檢測真菌的代謝產(chǎn)物（如酶活性、碳源利用譜）輔助鑒定，尤其適用于酵母樣真菌的區(qū)分，需結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒和操作流程。生化特性檢測綜合形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和生化數(shù)據(jù)，采用多相分類原則提高鑒定可靠性，避免單一方法的局限性。多相分類法整合結(jié)果解讀原則根據(jù)藥敏試驗結(jié)果（如MIC值）解讀真菌對抗真菌藥物的敏感性，需參考國際標(biāo)準(zhǔn)（如CLSI、EUCAST）的折點，指導(dǎo)臨床用藥選擇。耐藥性分析

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識別檢測方法中可能存在的交叉反應(yīng)（如其他微生物或藥物干擾），在報告中注明潛在影響因素。交叉反應(yīng)與干擾因素結(jié)合患者癥狀、標(biāo)本來源（如呼吸道、血液）判斷真菌的致病性，區(qū)分定植與感染，避免過度解讀非致病性真菌的陽性結(jié)果。臨床相關(guān)性評估對定量檢測（如GM試驗、β-葡聚糖檢測）設(shè)定臨界值，排除假陽性干擾，動態(tài)監(jiān)測數(shù)值變化以評估治療效果。定量結(jié)果閾值報告撰寫規(guī)范報告需包含患者信息、標(biāo)本類型、檢測方法、結(jié)