Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有22.5萬卵巢癌新發(fā)病例，我國(guó)每年發(fā)病約3.5萬人，且其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。卵巢癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，70%的患者確診時(shí)已處于晚期。卵巢深藏于盆腔，體積小，病變?cè)缙谌狈Φ湫桶Y狀，多數(shù)患者因腹脹、腹痛等消化道癥狀就診時(shí)，病情已進(jìn)展至晚期。這導(dǎo)致卵巢癌早期診斷困難，延誤了最佳治療時(shí)機(jī)。手術(shù)和化療是卵巢癌的主要治療手段，但卵巢癌具有易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的特性。即便經(jīng)過規(guī)范的手術(shù)和化療，仍有70%的患者在2年內(nèi)復(fù)發(fā)，5年生存率僅為30%-40%。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是卵巢癌治療失敗的主要原因，也是導(dǎo)致患者死亡率高的關(guān)鍵因素?；熌退幍某霈F(xiàn)，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感，進(jìn)一步降低了治療效果。多西他賽是治療卵巢癌的常用新藥，與鉑類聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，臨床緩解率較高。然而，對(duì)于復(fù)發(fā)和多處轉(zhuǎn)移的患者，多西他賽也常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，限制了其臨床應(yīng)用。Survivin作為凋亡抑制蛋白（IAP）家族的重要成員，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Survivin能夠抑制caspase活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，得以持續(xù)增殖。已有大量研究證實(shí)，Survivin基因在多種腫瘤組織中高表達(dá)，包括卵巢癌。在卵巢癌中，Survivin的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及化療耐藥密切相關(guān)。抑制Survivin基因的表達(dá)，能夠打破腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，同時(shí)增加腫瘤組織對(duì)化療藥物的敏感性，為卵巢癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。基于此，本研究聚焦于Survivin反義核酸，旨在通過構(gòu)建Survivin反義核酸載體，將其導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞，阻斷Survivin基因的表達(dá)，深入探究其對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，以及對(duì)多西他賽化療敏感性的影響，并進(jìn)一步揭示其逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在機(jī)制。本研究成果有望為卵巢癌的治療提供新的策略和方法，改善患者的預(yù)后，提高生存率。1.2研究目的與意義本研究旨在通過構(gòu)建Survivin反義核酸載體，并將其導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞，明確Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，以及對(duì)多西他賽化療敏感性的影響，并深入探討其逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在機(jī)制。通過實(shí)驗(yàn)揭示Survivin反義核酸誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的策略和思路。具體而言，本研究的目的和意義體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：揭示Survivin反義核酸誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用：Survivin在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制其表達(dá)有望誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本研究通過構(gòu)建Survivin反義核酸載體，將其導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡的變化，明確Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。這有助于深入了解Survivin在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)。探討Survivin反義核酸對(duì)多西他賽化療敏感性的影響：多西他賽是治療卵巢癌的常用藥物，但耐藥現(xiàn)象限制了其臨床應(yīng)用。Survivin基因的高表達(dá)與化療耐藥密切相關(guān)，抑制Survivin基因的表達(dá)可能增加腫瘤組織對(duì)化療的敏感性。本研究通過檢測(cè)Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的化療敏感性變化，探討Survivin反義核酸對(duì)多西他賽化療敏感性的影響，為提高卵巢癌化療效果提供新的方法。闡明Survivin反義核酸逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在機(jī)制：耐藥是卵巢癌治療失敗的主要原因之一，深入研究耐藥機(jī)制對(duì)于克服耐藥具有重要意義。本研究通過檢測(cè)Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中多藥耐藥基因（MDR1）等相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，闡明Survivin反義核酸逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在機(jī)制，為卵巢癌的耐藥逆轉(zhuǎn)治療提供理論依據(jù)。為卵巢癌的治療提供新的策略和方法：本研究的成果有望為卵巢癌的治療提供新的策略和方法，如將Survivin反義核酸與多西他賽聯(lián)合應(yīng)用，提高化療效果，改善患者的預(yù)后。同時(shí)，本研究也為其他腫瘤的治療提供了借鑒和參考，推動(dòng)腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。二、卵巢癌與Survivin基因概述2.1卵巢癌的概述2.1.1卵巢癌的發(fā)病機(jī)制與現(xiàn)狀卵巢癌是發(fā)生在卵巢的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及遺傳、激素、生活習(xí)慣和環(huán)境等多種因素。遺傳因素在卵巢癌的發(fā)病中占據(jù)重要地位，約10%-15%的卵巢癌患者具有家族遺傳背景。BRCA1和BRCA2基因突變是最為常見的遺傳性因素，攜帶這些基因突變的女性，其一生中患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)可高達(dá)40%-60%。激素水平的失衡也與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。雌激素和孕激素長(zhǎng)期的刺激，可能促使卵巢表面上皮細(xì)胞不斷地?fù)p傷與修復(fù)，進(jìn)而增加了細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)期無排卵導(dǎo)致卵巢持續(xù)受到促性腺激素的刺激，也被認(rèn)為是卵巢癌的危險(xiǎn)因素之一。生活習(xí)慣和環(huán)境因素同樣不可忽視。不良的生活習(xí)慣，如長(zhǎng)期吸煙、過度飲酒，會(huì)削弱機(jī)體的免疫力，增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。肥胖也是卵巢癌的一個(gè)危險(xiǎn)因素，脂肪組織分泌的多種細(xì)胞因子和激素，可能干擾內(nèi)分泌平衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。暴露于某些有害物質(zhì)，如石棉、苯等化學(xué)物質(zhì)，以及電離輻射，也可能導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)生。卵巢癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重威脅女性生命健康的重大疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，卵巢癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第7位，死亡率則高居第5位。在我國(guó)，卵巢癌的發(fā)病率和死亡率也不容樂觀，每年新發(fā)病例約為5.5萬，死亡病例約為2.2萬。卵巢癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，約70%的患者確診時(shí)已處于晚期，這使得治療難度大幅增加，5年生存率僅為30%-40%。晚期卵巢癌患者往往伴有腫瘤的廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以徹底切除，且對(duì)化療藥物的耐藥性較高，導(dǎo)致治療效果不佳，預(yù)后較差。2.1.2卵巢癌的治療方法與挑戰(zhàn)目前，卵巢癌的治療主要以手術(shù)、化療和靶向治療為主，多種治療手段相互配合，旨在提高患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，這些治療方法在實(shí)際應(yīng)用中面臨著諸多挑戰(zhàn)。手術(shù)是卵巢癌治療的基石，對(duì)于早期卵巢癌患者，全面分期手術(shù)能夠切除腫瘤組織，明確病理分期，為后續(xù)治療提供重要依據(jù)。對(duì)于晚期卵巢癌患者，腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的目的是盡可能切除所有原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶，使殘留腫瘤病灶直徑小于1cm，以提高化療效果。然而，晚期卵巢癌患者常伴有廣泛的盆腹腔轉(zhuǎn)移，手術(shù)難度大，難以達(dá)到理想的減瘤效果。腫瘤侵犯重要臟器，如腸道、膀胱等，增加了手術(shù)的復(fù)雜性和風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致部分患者無法進(jìn)行徹底的手術(shù)切除?；熓锹殉舶┚C合治療的重要組成部分，常用的化療藥物包括順鉑、卡鉑、紫杉醇等，多采用以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案?；熕幬锟梢酝ㄟ^靜脈輸注或口服的方式給藥，有時(shí)也會(huì)直接注射到腹部進(jìn)行腹膜內(nèi)化療?；熢跉缒[瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，降低患者的生活質(zhì)量，影響化療的依從性?；熌退幨锹殉舶┲委熋媾R的另一個(gè)重大挑戰(zhàn)，約30%的患者在初次化療時(shí)就表現(xiàn)出耐藥性，即原發(fā)性耐藥；而在完成初始化療后，約70%的患者會(huì)在2-3年內(nèi)復(fù)發(fā)，并逐漸對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，即繼發(fā)性耐藥?；熌退幨沟媚[瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低，治療效果大打折扣，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。靶向治療是近年來卵巢癌治療領(lǐng)域的重要突破，PARP抑制劑是卵巢癌靶向治療的代表性藥物，主要用于卵巢癌患者完成手術(shù)和化療后的維持治療。PARP抑制劑通過抑制PARP酶的活性，阻斷腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。然而，并非所有卵巢癌患者都能從PARP抑制劑治療中獲益，部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，限制了其臨床應(yīng)用。靶向治療藥物的高昂費(fèi)用也給患者帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，影響了其可及性。綜上所述，卵巢癌的治療雖然取得了一定的進(jìn)展，但仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如手術(shù)難度大、化療耐藥、靶向治療耐藥和費(fèi)用高昂等。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，提高卵巢癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，成為當(dāng)前卵巢癌研究的重要方向。2.2Survivin基因的概述2.2.1Survivin基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Survivin基因是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中獨(dú)特且關(guān)鍵的成員，其結(jié)構(gòu)具有鮮明的特征。1997年，Altieri等學(xué)者利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1（EPR-1）cDNA篩選克隆出該基因。Survivin基因定位于人17號(hào)染色體頂端（17q25），靠近端粒區(qū)域，全長(zhǎng)14.7kb，包含3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子。由該基因編碼產(chǎn)生的Survivin蛋白，由142個(gè)氨基酸組成，分子量約為16.2kD，是IAP家族中最小的成員。Survivin蛋白最為顯著的結(jié)構(gòu)特征是含有一個(gè)桿狀病毒抑制凋亡蛋白重復(fù)序列（BaculovirusIAPRepeat，BIR）。BIR結(jié)構(gòu)域?qū)τ贗AP家族成員發(fā)揮抑制凋亡的功能起著不可或缺的作用，在Survivin中同樣如此，它是Survivin發(fā)揮抗凋亡活性的核心結(jié)構(gòu)。值得注意的是，Survivin的BIR結(jié)構(gòu)域中有3個(gè)氨基酸插入序列Cys2Pro2Thr，這一獨(dú)特的插入序列將BIR分子分為兩半，在抑制凋亡過程中扮演著極為重要的角色。與IAP家族其他成員不同，Survivin僅含有一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，且缺乏其他成員所特有的環(huán)指（Ringfinger）結(jié)構(gòu)。在Survivin蛋白的羧基末端，是由42個(gè)氨基酸組成的α-螺旋式交織螺旋結(jié)構(gòu)（coiled-coil）。這一α-螺旋結(jié)構(gòu)是Survivin在細(xì)胞周期中與紡錘體微管結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，對(duì)調(diào)節(jié)Survivin基因的定位分布起著關(guān)鍵作用。紡錘體微管在細(xì)胞有絲分裂過程中負(fù)責(zé)染色體的分離和細(xì)胞的分裂，Survivin通過與紡錘體微管結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)程，進(jìn)而維持細(xì)胞的正常增殖。若此處發(fā)生突變，Survivin將喪失與微管結(jié)合的能力，無法正常發(fā)揮抗凋亡的作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡通路的異常激活。此外，人Survivin基因啟動(dòng)子中不含TATA盒，但在基因讀碼框上游含有一段富GC區(qū)。TATA盒通常在基因轉(zhuǎn)錄起始過程中發(fā)揮重要作用，參與RNA聚合酶與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄起始。Survivin基因啟動(dòng)子缺乏TATA盒，卻擁有富GC區(qū)，這表明其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制與其他含有TATA盒的基因存在差異，可能通過獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控元件來啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，從而精細(xì)地調(diào)控Survivin基因在不同細(xì)胞狀態(tài)下的表達(dá)水平。2.2.2Survivin基因在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制Survivin基因在細(xì)胞凋亡過程中扮演著關(guān)鍵的抑制角色，其作用機(jī)制涉及多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理平衡、組織發(fā)育和免疫監(jiān)視等方面具有至關(guān)重要的意義。然而，腫瘤細(xì)胞常常通過異常激活Survivin基因，逃避細(xì)胞凋亡的調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)不受控制的增殖和存活。Survivin抑制細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制之一是對(duì)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的阻斷。caspase是一類半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵的執(zhí)行作用，猶如凋亡信號(hào)通路中的“劊子手”。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡刺激信號(hào)時(shí)，一系列caspase酶被激活，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Survivin能夠直接與caspase-3和caspase-7結(jié)合，這兩種caspase酶處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是直接執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶。Survivin與它們結(jié)合后，能夠抑制其活性，就像給“劊子手”戴上了枷鎖，使其無法發(fā)揮切割底物、引發(fā)細(xì)胞凋亡的功能，從而有效地阻止細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段，使細(xì)胞得以逃避凋亡，繼續(xù)存活和增殖。除了直接抑制caspase活性外，Survivin還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來影響細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要，任何異常都可能導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)的改變，包括凋亡的發(fā)生。Survivin在細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，它主要在細(xì)胞周期的G2/M期表達(dá)上調(diào)。在這一時(shí)期，細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制和染色體分離，為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備。Survivin通過與紡錘體微管結(jié)合，穩(wěn)定紡錘體結(jié)構(gòu)，確保染色體的正確分離和細(xì)胞分裂的順利進(jìn)行。若Survivin表達(dá)缺失或功能異常，紡錘體結(jié)構(gòu)將變得不穩(wěn)定，染色體分離過程出現(xiàn)錯(cuò)誤，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，Survivin通過維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，間接抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，為腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖提供了保障。Survivin還參與DNA損傷修復(fù)機(jī)制，這也是其抑制細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。細(xì)胞在受到各種內(nèi)外因素的刺激時(shí)，DNA容易發(fā)生損傷，如紫外線照射、化學(xué)物質(zhì)損傷等。DNA損傷若不能及時(shí)修復(fù)，將導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞功能異常，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)細(xì)胞凋亡。Survivin能夠與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白相互作用，促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)過程。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，Survivin被招募到損傷位點(diǎn)，協(xié)助修復(fù)蛋白識(shí)別和修復(fù)受損的DNA片段，維持基因組的穩(wěn)定性。通過高效修復(fù)DNA損傷，Survivin減少了因DNA損傷積累而引發(fā)的細(xì)胞凋亡，使得腫瘤細(xì)胞能夠在惡劣的環(huán)境中生存和增殖。2.2.3Survivin基因與卵巢癌的相關(guān)性Survivin基因與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，在卵巢癌的病程中扮演著極為關(guān)鍵的角色。大量研究表明，Survivin基因在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這種高表達(dá)與卵巢癌的多種惡性生物學(xué)行為緊密相連。在卵巢癌組織中，Survivin基因的高表達(dá)水平顯著高于正常卵巢組織。通過免疫組化、實(shí)時(shí)定量PCR等檢測(cè)技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者腫瘤組織中的SurvivinmRNA和蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)。這種高表達(dá)賦予卵巢癌細(xì)胞強(qiáng)大的抗凋亡能力，使得癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)，持續(xù)存活和增殖。Survivin通過抑制caspase-3和caspase-7等凋亡執(zhí)行酶的活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，使卵巢癌細(xì)胞在面臨各種不利因素時(shí)仍能頑強(qiáng)存活，不斷分裂，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。Survivin基因的高表達(dá)與卵巢癌的化療耐藥密切相關(guān)，是導(dǎo)致化療失敗的重要原因之一。化療是卵巢癌綜合治療的重要手段，但化療耐藥的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了治療效果，降低了患者的生存率。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性顯著降低。當(dāng)卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)Survivin時(shí)，它能夠通過多種機(jī)制降低化療藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用。Survivin可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，增加藥物外排，減少細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度；還可以通過抑制細(xì)胞凋亡，使癌細(xì)胞在化療藥物的作用下仍能存活，繼續(xù)增殖。這使得化療難以徹底清除癌細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。Survivin基因的表達(dá)水平還與卵巢癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。臨床研究表明，Survivin高表達(dá)的卵巢癌患者，其無進(jìn)展生存期和總生存期明顯縮短，復(fù)發(fā)率顯著增加。高表達(dá)的Survivin不僅促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和化療耐藥，還與卵巢癌的轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。Survivin通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)和細(xì)胞間的黏附分子，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使癌細(xì)胞更容易突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，Survivin基因可作為評(píng)估卵巢癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，為臨床醫(yī)生制定治療方案和判斷患者預(yù)后提供重要參考。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究選用人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。該細(xì)胞株具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，常用于卵巢癌相關(guān)的基礎(chǔ)研究。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）環(huán)境中，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%，給予無菌飼料和飲用水自由攝取。在實(shí)驗(yàn)前，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定，滿足實(shí)驗(yàn)要求。3.1.2主要試劑與儀器Survivin反義核酸由上海生工生物工程股份有限公司合成，其序列經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計(jì)，能夠特異性地與SurvivinmRNA互補(bǔ)結(jié)合，阻斷其翻譯過程，從而抑制Survivin蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine3000（Invitrogen公司），該試劑具有高效、低毒的特點(diǎn)，能夠?qū)urvivin反義核酸高效地導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞中。多西他賽購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，是一種臨床常用的化療藥物，通過抑制微管解聚，干擾細(xì)胞有絲分裂，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。在實(shí)驗(yàn)中，多西他賽用無水乙醇溶解后，再用生理鹽水稀釋至所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。胎牛血清（FBS，Gibco公司）富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司）用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，確保細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。MTT試劑（Sigma公司）即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的試劑?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）用于溶解甲瓚，以便在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定吸光度值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司）用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。磷脂酰絲氨酸（PS）在細(xì)胞凋亡早期會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，與碘化丙啶（PI）匹配使用，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、中晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。兔抗人Survivin多克隆抗體（Abcam公司）用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)，能夠特異性識(shí)別Survivin蛋白，通過與二抗結(jié)合，利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)Survivin蛋白的表達(dá)水平。羊抗兔IgG-HRP二抗（Proteintech公司）是與一抗結(jié)合的二抗，其攜帶的辣根過氧化物酶（HRP）能夠催化底物發(fā)光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）用于檢測(cè)基因表達(dá)水平，包括反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、引物等試劑，能夠?qū)NA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過程，從而精確測(cè)定基因的表達(dá)量。主要儀器包括流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（ThermoScientificMultiskanFC，ThermoFisherScientific公司），用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems7500，ThermoFisherScientific公司），用于實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)基因表達(dá)水平；蛋白電泳儀（Bio-RadMini-PROTEANTetraSystem，Bio-Rad公司）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-RadTrans-BlotSDSemi-DryTransferCell，Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeracellVIOS160i，ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細(xì)胞操作，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無菌狀態(tài)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1Survivin反義核酸載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染根據(jù)GenBank中Survivin基因的序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為：上游引物5'-CCGCTCGAGATGGTGCTGCTCCTGCTG-3'，下游引物5'-CCCAAGCTTTTACAGTGGCCGCCGCTG-3'，其中下劃線部分分別為XhoI和HindIII酶切位點(diǎn)。以人卵巢癌細(xì)胞SK-OV-3的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括10×PCRbuffer2.5μl，dNTPs（2.5mMeach）2μl，上下游引物（10μMeach）各1μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，cDNA模板1μl，ddH?O17μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的Survivin基因片段和真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）分別用XhoI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切體系為20μl，包括10×Buffer2μl，Survivin基因片段或pcDNA3.1（+）載體5μl，XhoI和HindIII各1μl，ddH?O11μl，37℃水浴酶切3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用膠回收試劑盒回收酶切后的Survivin基因片段和pcDNA3.1（+）載體。將回收的酶切后的Survivin基因片段和pcDNA3.1（+）載體按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為10μl，包括10×T4DNALigaseBuffer1μl，Survivin基因片段3μl，pcDNA3.1（+）載體1μl，T4DNALigase1μl，ddH?O4μl，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素（100μg/ml）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，用XhoI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-OV-3細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h，更換為無血清無雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基。按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行操作，將Survivin反義核酸載體（實(shí)驗(yàn)組）或空載體（對(duì)照組）與Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5min后，將兩者混合，室溫孵育20min，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。將復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6h后，更換為含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。3.2.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1000r/min離心5min，棄上清。加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管中。加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，用FL1通道檢測(cè)AnnexinV-FITC的熒光強(qiáng)度，用FL2通道檢測(cè)PI的熒光強(qiáng)度。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h。取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次，每次5min。按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入TdT酶和FITC-dUTP混合液，37℃避光孵育60min。PBS洗滌3次，每次5min。加入DAPI染液，室溫避光孵育10min，染細(xì)胞核。PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，藍(lán)色熒光為DAPI染色的細(xì)胞核，綠色熒光為TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。3.2.3細(xì)胞增殖與活力檢測(cè)采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，將各組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入100μl含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），37℃孵育4h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，將各組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入100μl含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10μlCCK-8溶液，37℃孵育1-4h。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。3.2.4相關(guān)基因與蛋白表達(dá)檢測(cè)采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)Survivin、MDR1等相關(guān)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，用TRIzol試劑提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Survivin基因引物序列為：上游引物5'-ATGGTGCTGCTCCTGCTG-3'，下游引物5'-TTACAGTGGCCGCCGCTG-3'；MDR1基因引物序列為：上游引物5'-CCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括10×PCRbuffer2.5μl，dNTPs（2.5mMeach）2μl，上下游引物（10μMeach）各1μl，TaqDNA聚合酶0.5μl，cDNA模板1μl，ddH?O17μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析目的基因與內(nèi)參基因條帶的灰度值，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)Survivin、MDR1等相關(guān)蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，TBST洗滌3次，每次10min。加入兔抗人Survivin多克隆抗體（1:1000稀釋）、兔抗人MDR1多克隆抗體（1:1000稀釋）或鼠抗人β-actin單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10min。加入羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋）或羊抗鼠IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗滌3次，每次10min。用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，曝光，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞的凋亡率為（5.26±1.03）%，而Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率顯著升高至（28.54±3.56）%，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），具體數(shù)據(jù)詳見表1和圖1。組別凋亡率（%）對(duì)照組5.26±1.03Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組28.54±3.56表1：兩組卵巢癌細(xì)胞凋亡率比較（x±s，n=3）圖1：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞凋亡（A：對(duì)照組；B：Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組）從圖1中可以直觀地看出，對(duì)照組中處于凋亡早期（AnnexinV?/PI?）和凋亡晚期（AnnexinV?/PI?）的細(xì)胞數(shù)量較少，而Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組中，這兩個(gè)象限內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，表明細(xì)胞凋亡率顯著增加。進(jìn)一步通過TUNEL法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果同樣證實(shí)了Survivin反義核酸能夠有效誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。在熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）較少，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色（DAPI染色）；而Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組中，TUNEL陽性細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光（FITC標(biāo)記），凋亡細(xì)胞形態(tài)特征明顯，如細(xì)胞核固縮、碎裂等。隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（6.12±1.25）%，Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率高達(dá)（30.21±4.02）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Survivin反義核酸能夠成功導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞，并顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為后續(xù)研究其對(duì)卵巢癌細(xì)胞化療敏感性及逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。4.2Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測(cè)Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)各組細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果清晰地顯示，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的增殖趨勢(shì)，其吸光度值（OD值）不斷上升。在24h時(shí)，對(duì)照組的OD值為0.356±0.021；48h時(shí)，OD值增長(zhǎng)至0.568±0.032；72h時(shí)，OD值進(jìn)一步上升到0.854±0.045。與之形成鮮明對(duì)比的是，Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖受到了顯著抑制。在24h時(shí)，轉(zhuǎn)染組的OD值為0.289±0.018，與對(duì)照組相比，差異雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但抑制效果相對(duì)不明顯。然而，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)。48h時(shí)，轉(zhuǎn)染組OD值僅為0.376±0.025，與對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。到72h時(shí)，轉(zhuǎn)染組OD值增長(zhǎng)更為緩慢，僅達(dá)到0.458±0.030，與對(duì)照組相比，差異極為顯著（P<0.01）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖2），直觀地展示了兩組細(xì)胞的增殖差異。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈快速上升趨勢(shì)，而Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線則較為平緩，表明其增殖速度明顯減緩。采用CCK-8法對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果與MTT法高度一致。在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的活力均顯著低于對(duì)照組。在24h時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力為（80.56±4.23）%，顯著低于對(duì)照組的（100.00±5.00）%（P<0.05）。48h時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力降至（65.32±3.15）%，與對(duì)照組的（100.00±5.00）%相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。72h時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力進(jìn)一步降低至（48.21±2.89）%，與對(duì)照組相比，差異極為顯著（P<0.01）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明，Survivin反義核酸能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)。這一結(jié)果與細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果相互印證，進(jìn)一步說明了Survivin反義核酸通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，為卵巢癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。4.3Survivin反義核酸對(duì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)，對(duì)Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞中Survivin、caspase-3、MDR1等相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。RT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞中Survivin基因的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.05，而Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Survivin基因的相對(duì)表達(dá)量顯著降低至0.25±0.03，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明Survivin反義核酸能夠有效抑制Survivin基因的轉(zhuǎn)錄，減少其mRNA的表達(dá)水平。同時(shí)，caspase-3基因的表達(dá)在Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組中顯著上調(diào)，其相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.05升高至2.35±0.12，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，其基因表達(dá)的上調(diào)進(jìn)一步證實(shí)了Survivin反義核酸通過激活caspase-3信號(hào)通路，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。MDR1基因的表達(dá)在Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組中也出現(xiàn)了明顯的下降，其相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.05降低至0.45±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MDR1基因編碼的P-糖蛋白是一種重要的多藥耐藥蛋白，其表達(dá)的降低可能與Survivin反義核酸逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞多西他賽耐藥的作用相關(guān)。Westernblot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了Survivin反義核酸對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞中Survivin蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.08，Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Survivin蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著下降至0.30±0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。caspase-3蛋白的表達(dá)在Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組中明顯增加，其相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.08升高至2.50±0.15，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MDR1蛋白的表達(dá)在Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組中同樣顯著降低，其相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.08降低至0.50±0.06，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。圖3：RT-PCR和Westernblot檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)（A：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；B：Westernblot檢測(cè)結(jié)果；1：對(duì)照組；2：Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組）上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Survivin反義核酸能夠通過抑制Survivin基因和蛋白的表達(dá)，上調(diào)caspase-3基因和蛋白的表達(dá)，同時(shí)降低MDR1基因和蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，并可能逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐藥性。這些結(jié)果為深入理解Survivin反義核酸的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、討論5.1Survivin反義核酸誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討本研究結(jié)果顯示，Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率顯著升高，同時(shí)Survivin基因和蛋白的表達(dá)明顯降低，而caspase-3基因和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，這表明Survivin反義核酸誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制與抑制Survivin表達(dá)、激活caspase-3信號(hào)通路密切相關(guān)。Survivin作為凋亡抑制蛋白家族的重要成員，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它強(qiáng)大的抗凋亡功能，而在卵巢癌細(xì)胞中，Survivin的高表達(dá)是導(dǎo)致癌細(xì)胞逃避凋亡、持續(xù)增殖的重要原因之一。本研究通過構(gòu)建Survivin反義核酸載體，并將其成功導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞，利用反義核酸與SurvivinmRNA互補(bǔ)結(jié)合的特性，特異性地阻斷了Survivin基因的表達(dá)。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組中Survivin基因和蛋白的表達(dá)量相較于對(duì)照組大幅降低，這直接削弱了Survivin對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，為細(xì)胞凋亡的發(fā)生創(chuàng)造了條件。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行酶，處于凋亡信號(hào)通路的下游，是細(xì)胞凋亡的直接執(zhí)行者。在正常生理狀態(tài)下，caspase-3以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡刺激信號(hào)時(shí)，一系列上游信號(hào)分子被激活，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活caspase-3，使其從酶原形式轉(zhuǎn)化為具有活性的裂解形式。活化的caspase-3能夠切割多種細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵底物，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶等，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和功能的改變，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在本研究中，Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染后，卵巢癌細(xì)胞中caspase-3基因和蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，表明Survivin反義核酸通過抑制Survivin的表達(dá)，解除了對(duì)caspase-3的抑制作用，從而激活了caspase-3信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。具體來說，Survivin的表達(dá)被抑制后，無法再有效地與caspase-3結(jié)合并抑制其活性，使得caspase-3能夠正常激活，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。除了上述直接作用機(jī)制外，Survivin反義核酸可能還通過其他間接途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期的正常調(diào)控是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要保障，而Survivin在細(xì)胞周期的調(diào)控中扮演著重要角色。在細(xì)胞周期的G2/M期，Survivin表達(dá)上調(diào)，它與紡錘體微管結(jié)合，參與調(diào)控染色體的分離和細(xì)胞分裂過程。當(dāng)Survivin表達(dá)被Survivin反義核酸抑制后，紡錘體微管的穩(wěn)定性受到影響，染色體分離異常，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)被激活，細(xì)胞無法順利完成有絲分裂，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。Survivin反義核酸還可能通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)基因和信號(hào)通路，如Bcl-2家族基因、MAPK信號(hào)通路等，協(xié)同誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族基因包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它們之間的平衡決定了細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。Survivin反義核酸可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因的表達(dá)，打破這種平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述，Survivin反義核酸誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的、多途徑的過程，主要通過抑制Survivin表達(dá)，解除對(duì)caspase-3的抑制作用，激活caspase-3信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。還可能通過影響細(xì)胞周期調(diào)控以及調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)基因和信號(hào)通路，協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的理論依據(jù)，也為Survivin反義核酸在卵巢癌治療中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。5.2Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖抑制的原因分析本研究結(jié)果表明，Survivin反義核酸能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，這一作用可能是通過多種機(jī)制共同實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞周期調(diào)控異常在腫瘤細(xì)胞的無限增殖中起著關(guān)鍵作用，而Survivin在細(xì)胞周期的調(diào)控中扮演著重要角色。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期受到嚴(yán)格的調(diào)控，包括G1期、S期、G2期和M期，各期之間存在著關(guān)鍵的檢查點(diǎn)，以確保細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞接收到增殖信號(hào)時(shí)，會(huì)依次通過各個(gè)時(shí)期，完成DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。然而，在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制常常出現(xiàn)異常，導(dǎo)致細(xì)胞能夠繞過檢查點(diǎn)，持續(xù)進(jìn)行增殖。Survivin在細(xì)胞周期的G2/M期高表達(dá)，這一時(shí)期是細(xì)胞分裂的關(guān)鍵時(shí)期，涉及到染色體的分離和細(xì)胞的分裂。Survivin通過與紡錘體微管結(jié)合，維持紡錘體的穩(wěn)定性，確保染色體能夠正確地分離到兩個(gè)子細(xì)胞中。紡錘體微管是由微管蛋白組成的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞分裂過程中起著至關(guān)重要的作用。Survivin與紡錘體微管的結(jié)合，能夠增強(qiáng)微管的穩(wěn)定性，防止微管的解聚，從而保證染色體的正常分離。當(dāng)Survivin表達(dá)被Survivin反義核酸抑制后，紡錘體微管的穩(wěn)定性受到影響，染色體分離異常，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻。具體來說，Survivin表達(dá)缺失可能導(dǎo)致紡錘體微管的組裝和功能異常，使得染色體無法準(zhǔn)確地排列在赤道板上，或者在分離過程中出現(xiàn)錯(cuò)誤，導(dǎo)致子細(xì)胞中染色體數(shù)目異常。這些異常會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的檢查點(diǎn)機(jī)制，如紡錘體組裝檢查點(diǎn)，使細(xì)胞周期停滯在G2/M期，無法繼續(xù)進(jìn)行分裂。細(xì)胞周期的停滯使得細(xì)胞無法進(jìn)行正常的增殖，從而抑制了卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Survivin反義核酸還可能通過調(diào)節(jié)增殖相關(guān)信號(hào)通路來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的增殖和存活信號(hào)通路之一，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3K能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)kt蛋白。激活的Akt通過磷酸化下游的多種底物，如mTOR、GSK-3β等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和代謝。在卵巢癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常處于異常激活狀態(tài)，導(dǎo)致癌細(xì)胞的無限增殖。Survivin反義核酸可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。研究表明，Survivin能夠與PI3K相互作用，促進(jìn)PI3K的激活，進(jìn)而激活A(yù)kt蛋白。當(dāng)Survivin表達(dá)被抑制后，PI3K的激活受到影響，Akt蛋白的磷酸化水平降低，下游的增殖相關(guān)信號(hào)通路被阻斷。這使得細(xì)胞無法接收到足夠的增殖信號(hào)，從而抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖。Wnt/β-catenin信號(hào)通路也與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。在正常情況下，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，位于細(xì)胞膜上，參與細(xì)胞間的黏附。當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)分子，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累。積累的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。在卵巢癌細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活可導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖。Survivin反義核酸可能通過影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，Survivin能夠調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，如β-catenin和TCF/LEF的表達(dá)和活性。當(dāng)Survivin表達(dá)被抑制后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性受到抑制，β-catenin的核轉(zhuǎn)位減少，相關(guān)增殖基因的表達(dá)下調(diào)，從而抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖。綜上所述，Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能通過影響細(xì)胞周期調(diào)控，使細(xì)胞周期停滯在G2/M期，以及調(diào)節(jié)增殖相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性，來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。這些機(jī)制的深入研究，為進(jìn)一步理解卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新的理論依據(jù)，也為Survivin反義核酸在卵巢癌治療中的應(yīng)用提供了更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究結(jié)果顯示，Survivin反義核酸能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，并可能逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐藥性，這為卵巢癌的治療提供了新的策略和方法，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。在卵巢癌的治療中，Survivin反義核酸可作為一種潛在的靶向治療藥物。目前，卵巢癌的治療主要依賴手術(shù)和化療，但化療耐藥問題嚴(yán)重影響了治療效果。Survivin反義核酸通過抑制Survivin基因的表達(dá)，能夠增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療效果。將Survivin反義核酸與多西他賽等化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可能成為一種有效的卵巢癌治療方案，有助于提高患者的生存率和生活質(zhì)量。Survivin反義核酸還可用于卵巢癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。由于Survivin在卵巢癌組織中高表達(dá)，檢測(cè)Survivin的表達(dá)水平可以作為卵巢癌早期診斷的指標(biāo)之一。Survivin的表達(dá)水平與卵巢癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，通過檢測(cè)Survivin反義核酸治療前后Survivin的表達(dá)變化，可評(píng)估治療效果和預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。盡管Survivin反義核酸在卵巢癌治療中展現(xiàn)出了巨大的潛力，但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些局限性。Survivin反義核酸的載體遞送問題是一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。目前，常用的載體如脂質(zhì)體、病毒載體等，在將反義核酸導(dǎo)入細(xì)胞的過程中，存在轉(zhuǎn)染效率低、靶向性差、生物安全性等問題。脂質(zhì)體載體雖然具有一定的生物相容性，但在體內(nèi)容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，導(dǎo)致其在腫瘤組織中的分布和攝取不足；病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但存在免疫原性、潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)等問題，限制了其臨床應(yīng)用。脫靶效應(yīng)也是Survivin反義核酸應(yīng)用中需要關(guān)注的問題。反義核酸可能會(huì)與非靶基因的mRNA發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致非預(yù)期的基因表達(dá)改變，從而引發(fā)一系列不良反應(yīng)。由于細(xì)胞內(nèi)存在復(fù)雜的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，反義核酸在抑制靶基因表達(dá)的同時(shí)，可能會(huì)對(duì)其他相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生間接影響，進(jìn)一步增加了脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。Survivin反義核酸的穩(wěn)定性和半衰期也是影響其臨床應(yīng)用的重要因素。在體內(nèi)，反義核酸容易被核酸酶降解，導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差，半衰期較短，難以維持有效的治療濃度。這就需要開發(fā)新型的化學(xué)修飾方法，提高反義核酸的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期，以確保其在體內(nèi)能夠發(fā)揮持續(xù)的治療作用。綜上所述，Survivin反義核酸在卵巢癌治療中具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，但仍面臨著載體遞送、脫靶效應(yīng)、穩(wěn)定性等諸多挑戰(zhàn)。未來的研究需要進(jìn)一步優(yōu)化反義核酸的設(shè)計(jì)和載體系統(tǒng)，提高其靶向性和穩(wěn)定性，降低脫靶效應(yīng)，以推動(dòng)Survivin反義核酸從實(shí)驗(yàn)室研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，為卵巢癌患者帶來新的希望。5.4與其他相關(guān)研究結(jié)果的比較與分析本研究結(jié)果與其他相關(guān)研究在Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用方面既有相似之處，也存在一定差異。在誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡方面，馬榮等人的研究構(gòu)建了Survivin反義真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系Skov3，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為19%，本研究中Survivin反義核酸轉(zhuǎn)染組卵巢癌細(xì)胞凋亡率高達(dá)（28.54±3.56）%。兩項(xiàng)研究都證實(shí)了Survivin反義核酸能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，這一結(jié)果具有一致性，進(jìn)一步驗(yàn)證了抑制Survivin表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。不同之處在于凋亡率存在差異，可能是由于實(shí)驗(yàn)中所采用的細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染方法、反義核酸序列及作用時(shí)間等因素不同導(dǎo)致的。本研究選用的SK-OV-3細(xì)胞株與馬榮研究中的Skov3細(xì)胞株雖然都為卵巢癌細(xì)胞株，但在細(xì)胞特性上可能存在細(xì)微差異。轉(zhuǎn)染方法上，本研究采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，而馬榮研究采用電轉(zhuǎn)染法，不同的轉(zhuǎn)染方法對(duì)反義核酸進(jìn)入細(xì)胞的效率及在細(xì)胞內(nèi)的分布可能產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其誘導(dǎo)凋亡的效果。反義核酸序列的差異也可能導(dǎo)致對(duì)Survivin基因的抑制效果不同，從而影響細(xì)胞凋亡率。在對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用方面，本研究通過MTT法和CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Survivin反義核酸能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)。這與霍曉溪等人關(guān)于WT1反義核酸對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖影響的研究結(jié)果類似。霍曉溪等人的研究表明，WT1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖，抑制率為49.48%。雖然本研究未直接計(jì)算抑制率，但從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果可以看出，Survivin反義核酸對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用顯著。兩者的相似之處在于都證明了反義核酸技術(shù)能夠抑制