云南地區(qū)惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株篩選方法與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義瘧疾，作為一種古老且危害嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，至今仍對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成巨大威脅。它是由瘧原蟲(chóng)感染引發(fā)的寄生蟲(chóng)病，主要通過(guò)按蚊叮咬傳播。全球范圍內(nèi)，有91個(gè)國(guó)家和地區(qū)存在瘧疾傳播，每年約有2.16億人感染瘧疾，其中42.9萬(wàn)人因瘧疾而死亡，且70%的死亡病例為五歲以下兒童。在眾多瘧原蟲(chóng)種類(lèi)中，惡性瘧原蟲(chóng)導(dǎo)致的瘧疾最為嚴(yán)重，具有較高的致死率。惡性瘧不僅能引起嚴(yán)重的貧血、肝腎功能損害，還可能引發(fā)腦型瘧，導(dǎo)致患者出現(xiàn)劇烈頭痛、發(fā)熱、意識(shí)障礙等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。青蒿素類(lèi)藥物的出現(xiàn)，為瘧疾的治療帶來(lái)了革命性的變化。青蒿素是從青蒿中提取的具有抗瘧活性的倍半萜內(nèi)酯化合物，其作用機(jī)制主要是通過(guò)產(chǎn)生自由基，與瘧原蟲(chóng)的蛋白結(jié)合，形成二聚體，干擾瘧原蟲(chóng)的表膜-線粒體功能，最終導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)死亡。青蒿素類(lèi)藥物具有速效、高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)，口服后吸收快，排泄快，副作用小，廣泛用于治療惡性瘧疾和兇險(xiǎn)型瘧疾，成為目前全球抗瘧的一線藥物。然而，隨著青蒿素類(lèi)藥物的廣泛使用，瘧原蟲(chóng)對(duì)其產(chǎn)生抗藥性的問(wèn)題日益凸顯。在東南亞的一些地區(qū)，已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)青蒿素有抗藥性的惡性瘧原蟲(chóng)，并且這種抗藥性瘧原蟲(chóng)有逐漸蔓延的趨勢(shì)。瘧原蟲(chóng)對(duì)青蒿素產(chǎn)生抗藥性，使得青蒿素類(lèi)藥物的治療效果下降，瘧疾的治療難度增加，嚴(yán)重威脅著全球瘧疾的防治成果。研究表明，惡性瘧原蟲(chóng)體內(nèi)有一種名為Kelch13的蛋白質(zhì)，如果該蛋白質(zhì)發(fā)生變異，就會(huì)使瘧原蟲(chóng)對(duì)青蒿素產(chǎn)生耐藥性。變異后的瘧原蟲(chóng)會(huì)減少吸收血紅蛋白，從而減少產(chǎn)生能激活青蒿素的分解物，使青蒿素?zé)o法被充分激活并殺死瘧原蟲(chóng)。云南地處中國(guó)西南邊陲，與緬甸、老撾等瘧疾高發(fā)國(guó)家接壤，地理位置特殊，氣候條件適宜按蚊滋生，是我國(guó)瘧疾流行最為嚴(yán)重的地區(qū)之一。云南的瘧疾流行具有復(fù)雜性和多樣性，惡性瘧在部分地區(qū)時(shí)有發(fā)生。長(zhǎng)期以來(lái)，青蒿素類(lèi)藥物在云南的瘧疾治療中發(fā)揮了重要作用，但隨著藥物的大量使用，云南地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素等青蒿素類(lèi)藥物的抗藥性問(wèn)題也逐漸受到關(guān)注。對(duì)云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株的篩選具有極其重要的意義。一方面，通過(guò)篩選抗性克隆株，可以深入研究惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的抗藥機(jī)制，為揭示瘧原蟲(chóng)抗藥性的分子生物學(xué)基礎(chǔ)提供關(guān)鍵線索，有助于開(kāi)發(fā)新的抗瘧藥物和治療策略。另一方面，篩選抗性克隆株能夠及時(shí)監(jiān)測(cè)云南地區(qū)瘧原蟲(chóng)抗藥性的變化趨勢(shì)，為當(dāng)?shù)丿懠驳姆乐喂ぷ魈峁┛茖W(xué)依據(jù)，指導(dǎo)臨床合理用藥，有效控制瘧疾的傳播和流行，對(duì)于保障云南地區(qū)乃至全球的公共衛(wèi)生安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在全球范圍內(nèi)，惡性瘧原蟲(chóng)抗藥性的研究一直是瘧疾領(lǐng)域的重點(diǎn)。自20世紀(jì)50年代末惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)氯喹產(chǎn)生抗藥性以來(lái)，抗藥性問(wèn)題不斷發(fā)展，新的抗藥機(jī)制和抗藥蟲(chóng)株不斷涌現(xiàn)。在東南亞的泰國(guó)-柬埔寨、泰國(guó)-緬甸接壤地區(qū)，抗藥形勢(shì)極為嚴(yán)峻，存在對(duì)多種抗瘧藥耐藥的惡性瘧原蟲(chóng)。非洲地區(qū)抗氯喹惡性瘧原蟲(chóng)廣泛分布，且抗藥性形勢(shì)持續(xù)惡化。南美洲的部分地區(qū)，如巴西，也有抗藥惡性瘧的報(bào)道。對(duì)于惡性瘧原蟲(chóng)抗性克隆株的篩選，國(guó)外學(xué)者進(jìn)行了大量研究。采用體外培養(yǎng)結(jié)合藥物篩選的方法，成功篩選出對(duì)多種抗瘧藥物具有抗性的克隆株，并深入研究了其抗性機(jī)制。通過(guò)全基因組測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與抗藥性相關(guān)的基因位點(diǎn)和突變，為抗藥性機(jī)制的研究提供了重要線索。利用單細(xì)胞克隆技術(shù)，獲得了純度較高的抗性克隆株，有助于準(zhǔn)確分析抗性相關(guān)的生物學(xué)特性。國(guó)內(nèi)在惡性瘧原蟲(chóng)抗藥性研究方面也取得了一定成果。對(duì)云南、海南等瘧疾高發(fā)地區(qū)的瘧原蟲(chóng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了抗藥性的存在和變化趨勢(shì)。在抗性克隆株篩選方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者嘗試了多種方法，如體外藥物篩選結(jié)合有限稀釋法進(jìn)行克隆，通過(guò)動(dòng)物模型篩選抗性蟲(chóng)株等。有研究通過(guò)體外培養(yǎng)法對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素蟲(chóng)株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，利用有限稀釋法進(jìn)行體外克隆，并采用體外微量測(cè)定法對(duì)克隆蟲(chóng)株的藥物敏感性進(jìn)行鑒定。然而，云南地區(qū)在惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株篩選的研究仍存在一些不足。一方面，研究方法相對(duì)單一，多數(shù)研究集中在體外培養(yǎng)和藥物篩選，對(duì)于單細(xì)胞克隆技術(shù)、基因編輯技術(shù)等新興技術(shù)的應(yīng)用還不夠廣泛，限制了對(duì)抗性機(jī)制的深入探究。另一方面，云南與周邊國(guó)家接壤，邊境地區(qū)瘧疾傳播復(fù)雜，但目前對(duì)跨境瘧疾傳播過(guò)程中抗藥性的變化及抗性克隆株的傳播規(guī)律研究較少，難以全面評(píng)估抗藥性對(duì)當(dāng)?shù)丿懠卜揽氐挠绊?。此外，在抗性克隆株的功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面，云南地區(qū)的研究還不夠系統(tǒng)和深入，無(wú)法為抗瘧新藥研發(fā)和防治策略制定提供更全面的理論支持。1.3研究目標(biāo)與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在通過(guò)一系列科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法，篩選出云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株，并對(duì)其生物學(xué)特性及抗性機(jī)制展開(kāi)深入研究。具體目標(biāo)包括：運(yùn)用體外培養(yǎng)結(jié)合藥物篩選的方法，從云南地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)樣本中篩選出對(duì)雙氫青蒿素具有穩(wěn)定抗性的克隆株。利用單細(xì)胞克隆技術(shù)，獲取高純度的抗性克隆株，為后續(xù)研究提供純凈的實(shí)驗(yàn)材料。通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如體外藥物敏感性測(cè)定、生長(zhǎng)曲線繪制等，全面分析抗性克隆株的生物學(xué)特性，包括其對(duì)不同抗瘧藥物的敏感性、生長(zhǎng)繁殖速度、紅細(xì)胞入侵能力等。采用全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析、蛋白質(zhì)組分析等多組學(xué)技術(shù)，深入探究惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制，確定與抗性相關(guān)的基因、蛋白及信號(hào)通路。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在研究方法和研究?jī)?nèi)容兩個(gè)方面。在研究方法上，創(chuàng)新性地將單細(xì)胞克隆技術(shù)與多組學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合。單細(xì)胞克隆技術(shù)能夠獲得單一來(lái)源的抗性克隆株，避免了混合蟲(chóng)株對(duì)研究結(jié)果的干擾，提高了研究的準(zhǔn)確性和可靠性。多組學(xué)分析技術(shù)則從基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等多個(gè)層面全面解析抗性機(jī)制，克服了傳統(tǒng)研究方法僅從單一角度分析的局限性，有助于發(fā)現(xiàn)新的抗性相關(guān)分子和機(jī)制。在研究?jī)?nèi)容方面，本研究聚焦于云南地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)，結(jié)合云南特殊的地理位置和瘧疾流行特點(diǎn)，深入研究跨境瘧疾傳播過(guò)程中抗藥性的變化及抗性克隆株的傳播規(guī)律，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這方面研究的空白，為云南地區(qū)乃至全球的瘧疾防控提供更具針對(duì)性的科學(xué)依據(jù)。二、云南惡性瘧原蟲(chóng)與雙氫青蒿素概述2.1云南惡性瘧原蟲(chóng)特點(diǎn)云南地處低緯度高原，氣候溫暖濕潤(rùn)，地形地貌復(fù)雜多樣，擁有豐富的植被資源。這種獨(dú)特的地理和氣候條件為按蚊提供了極為適宜的滋生環(huán)境。云南境內(nèi)分布著多種按蚊，其中中華按蚊、微小按蚊和大劣按蚊是主要的瘧疾傳播媒介。中華按蚊廣泛分布于云南的平原和丘陵地區(qū)，微小按蚊多見(jiàn)于山區(qū)，而大劣按蚊主要分布在云南的邊境熱帶和亞熱帶地區(qū)。這些按蚊的生態(tài)習(xí)性各有特點(diǎn)，中華按蚊多在夜間活動(dòng)，喜歡吸食人血和畜血，其繁殖能力較強(qiáng)，一個(gè)雌蚊一生可產(chǎn)卵多次。微小按蚊對(duì)棲息環(huán)境的要求較為苛刻，偏好陰暗潮濕的場(chǎng)所，其飛行能力相對(duì)較弱，但在適宜的環(huán)境中也能有效地傳播瘧疾。大劣按蚊則主要棲息在野外的草叢、樹(shù)林等環(huán)境中，對(duì)瘧疾的傳播效率較高，是云南邊境地區(qū)瘧疾傳播的重要媒介。云南的瘧疾流行歷史悠久，早在三國(guó)時(shí)期就有相關(guān)記載。近年來(lái)，雖然云南在瘧疾防治方面取得了顯著成效，但由于其特殊的地理位置，與瘧疾高發(fā)的緬甸、老撾等國(guó)家接壤，邊境地區(qū)的瘧疾流行態(tài)勢(shì)依然嚴(yán)峻。在云南的部分邊境地區(qū)，如西雙版納、德宏等地，惡性瘧時(shí)有發(fā)生。這些地區(qū)的瘧疾流行具有季節(jié)性特點(diǎn)，通常在雨季（5-10月）發(fā)病率較高，這是因?yàn)橛昙镜母邷馗邼癍h(huán)境有利于按蚊的繁殖和生長(zhǎng)，增加了瘧疾傳播的風(fēng)險(xiǎn)。此外，邊境地區(qū)人員流動(dòng)頻繁，跨境勞務(wù)、貿(mào)易等活動(dòng)使得瘧疾的輸入性風(fēng)險(xiǎn)增大。一些從瘧疾流行區(qū)返回的人員可能攜帶瘧原蟲(chóng)，成為本地瘧疾傳播的傳染源。惡性瘧原蟲(chóng)在生物學(xué)特性上具有一些獨(dú)特之處。其在紅細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育周期較短，約為36-48小時(shí)，相比其他瘧原蟲(chóng)種類(lèi)，能夠更快地在宿主體內(nèi)繁殖。惡性瘧原蟲(chóng)具有較強(qiáng)的致病性，能夠侵犯人體的多個(gè)器官系統(tǒng)。它可以在紅細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，釋放出的瘧原蟲(chóng)和代謝產(chǎn)物會(huì)引起人體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)熱、寒戰(zhàn)、貧血等癥狀。惡性瘧原蟲(chóng)還能夠黏附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，造成微血管阻塞，影響器官的血液供應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)腦型瘧、腎功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。在云南地區(qū)，惡性瘧原蟲(chóng)的基因多樣性較為豐富，這可能與當(dāng)?shù)貜?fù)雜的地理環(huán)境、長(zhǎng)期的瘧疾流行以及不同瘧原蟲(chóng)株之間的基因交流有關(guān)?；蚨鄻有缘拇嬖谑沟脨盒辕懺x(chóng)對(duì)環(huán)境和藥物的適應(yīng)性增強(qiáng)，也增加了瘧疾防治的難度。一些具有特定基因突變的惡性瘧原蟲(chóng)株可能對(duì)青蒿素類(lèi)藥物產(chǎn)生抗性，從而影響治療效果。2.2雙氫青蒿素抗瘧原理雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的重要衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在青蒿素的基礎(chǔ)上發(fā)生了關(guān)鍵變化。青蒿素的化學(xué)式為C_{15}H_{22}O_{5}，分子中含有一個(gè)過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)，這是其抗瘧活性的關(guān)鍵部分。雙氫青蒿素的化學(xué)式為C_{15}H_{24}O_{5}，它是通過(guò)對(duì)青蒿素的羰基進(jìn)行還原得到的，相比青蒿素，雙氫青蒿素在結(jié)構(gòu)上多了兩個(gè)氫原子。這種結(jié)構(gòu)變化使得雙氫青蒿素的脂溶性和水溶性都有所提高，從而更易于被人體吸收和利用。雙氫青蒿素的抗瘧作用主要通過(guò)多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)。其作用靶點(diǎn)主要是瘧原蟲(chóng)的膜系結(jié)構(gòu)和一些關(guān)鍵的代謝酶。當(dāng)雙氫青蒿素進(jìn)入人體后，在體內(nèi)的還原酶作用下，其過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)被激活，產(chǎn)生大量的自由基。這些自由基具有極強(qiáng)的氧化性，能夠與瘧原蟲(chóng)的多種蛋白和生物膜發(fā)生反應(yīng)。自由基與瘧原蟲(chóng)的表膜-線粒體膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞，使膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，從而影響瘧原蟲(chóng)的正常代謝和功能。自由基還可以攻擊瘧原蟲(chóng)的核酸，導(dǎo)致DNA損傷，干擾瘧原蟲(chóng)的基因表達(dá)和復(fù)制，阻止其生長(zhǎng)和繁殖。雙氫青蒿素能夠干擾瘧原蟲(chóng)的血紅素代謝。瘧原蟲(chóng)在紅細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖時(shí)，需要利用血紅蛋白作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。血紅蛋白被瘧原蟲(chóng)消化后會(huì)產(chǎn)生血紅素，血紅素是一種有毒物質(zhì)，瘧原蟲(chóng)需要將其轉(zhuǎn)化為瘧色素進(jìn)行解毒。雙氫青蒿素可以抑制瘧原蟲(chóng)體內(nèi)參與血紅素轉(zhuǎn)化的酶的活性，如血紅素聚合酶，使得血紅素不能正常轉(zhuǎn)化為瘧色素，從而在瘧原蟲(chóng)體內(nèi)積累，對(duì)瘧原蟲(chóng)產(chǎn)生毒性作用，最終導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)死亡。在瘧疾治療中，雙氫青蒿素具有關(guān)鍵地位。它具有速效、高效的特點(diǎn)，能夠迅速殺滅紅細(xì)胞內(nèi)的瘧原蟲(chóng)，有效控制瘧疾的發(fā)作。在惡性瘧疾的治療中，雙氫青蒿素能夠快速緩解患者的癥狀，降低死亡率。與其他抗瘧藥物相比，雙氫青蒿素的副作用較小，安全性高，患者耐受性好。它可以單獨(dú)使用，也可以與其他抗瘧藥物聯(lián)合使用，如雙氫青蒿素-哌喹（科泰復(fù)），聯(lián)合用藥可以增強(qiáng)療效，減少耐藥性的產(chǎn)生，是世界衛(wèi)生組織推薦的治療無(wú)并發(fā)癥惡性瘧疾的首選藥物。在全球瘧疾防控中，雙氫青蒿素發(fā)揮著不可或缺的作用，為減少瘧疾的發(fā)病率和死亡率做出了重要貢獻(xiàn)。2.3抗性問(wèn)題的出現(xiàn)與影響近年來(lái)，惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性的問(wèn)題日益凸顯，已成為全球瘧疾防治領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。在東南亞地區(qū)，如柬埔寨、泰國(guó)、緬甸等國(guó)家的部分地區(qū)，已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)雙氫青蒿素具有明顯抗性的惡性瘧原蟲(chóng)株。這些地區(qū)的臨床治療數(shù)據(jù)顯示，使用雙氫青蒿素治療瘧疾的失敗率逐漸上升。在柬埔寨的一些地區(qū)，雙氫青蒿素治療惡性瘧疾的失敗率從過(guò)去的較低水平上升到了20%以上。在緬甸與云南接壤的邊境地區(qū)，也檢測(cè)到了對(duì)雙氫青蒿素抗性增強(qiáng)的惡性瘧原蟲(chóng)。云南地區(qū)由于其特殊的地理位置，與瘧疾高發(fā)的東南亞國(guó)家相鄰，邊境地區(qū)人員流動(dòng)頻繁，這使得云南面臨著瘧原蟲(chóng)抗性輸入和傳播的巨大風(fēng)險(xiǎn)。惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性對(duì)瘧疾治療產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響?？剐缘某霈F(xiàn)導(dǎo)致雙氫青蒿素的治療效果顯著下降，原本能夠有效控制瘧疾發(fā)作的藥物，現(xiàn)在無(wú)法達(dá)到預(yù)期的治療目標(biāo)。這使得瘧疾患者的癥狀難以緩解，病情容易反復(fù)，增加了患者的痛苦和死亡風(fēng)險(xiǎn)。在一些抗性嚴(yán)重的地區(qū)，患者可能需要接受多次治療或更換其他抗瘧藥物，這不僅增加了治療成本，還可能因?yàn)樗幬锏母弊饔脤?duì)患者的身體造成進(jìn)一步損害。由于抗性瘧原蟲(chóng)的存在，臨床醫(yī)生在選擇治療方案時(shí)面臨更大的困難，需要更加謹(jǐn)慎地評(píng)估患者的病情和藥物的適用性?？剐詥?wèn)題還對(duì)瘧疾的傳播產(chǎn)生了推動(dòng)作用?？剐辕懺x(chóng)在人群中傳播，使得瘧疾的傳播范圍擴(kuò)大，傳播速度加快。這是因?yàn)楦腥究剐辕懺x(chóng)的患者治療效果不佳，體內(nèi)瘧原蟲(chóng)持續(xù)存在，成為了新的傳染源。這些傳染源在日常生活中，通過(guò)按蚊叮咬將抗性瘧原蟲(chóng)傳播給更多的人。在云南邊境地區(qū)，由于抗性瘧原蟲(chóng)的傳播，瘧疾的發(fā)病率出現(xiàn)了波動(dòng)上升的趨勢(shì)，給當(dāng)?shù)氐寞懠卜揽毓ぷ鲙?lái)了極大的壓力。從瘧疾防控的角度來(lái)看，惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的抗性嚴(yán)重阻礙了全球瘧疾防控計(jì)劃的實(shí)施。世界衛(wèi)生組織制定的瘧疾防控目標(biāo)是到2030年在全球范圍內(nèi)顯著降低瘧疾的發(fā)病率和死亡率。然而，抗性問(wèn)題的出現(xiàn)使得這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)變得更加困難?？剐辕懺x(chóng)的傳播增加了瘧疾防控的復(fù)雜性和成本，需要投入更多的人力、物力和財(cái)力來(lái)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)、治療和預(yù)防工作。如果不能有效解決抗性問(wèn)題，瘧疾的傳播將難以得到有效控制，可能導(dǎo)致瘧疾疫情的反彈，使多年來(lái)的瘧疾防控成果付諸東流。三、篩選方法研究3.1雙氫青蒿素體外篩選法3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作流程雙氫青蒿素體外篩選法是篩選云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株的重要方法之一。在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需要進(jìn)行瘧原蟲(chóng)的培養(yǎng)。從云南地區(qū)采集感染惡性瘧原蟲(chóng)的患者血液樣本，將含有瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞分離出來(lái)，置于特定的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。常用的培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，其中添加了10%的人血清、次黃嘌呤、碳酸氫鈉等成分，以提供瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境。將培養(yǎng)瓶置于含5%二氧化碳、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，定期觀察瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況，并更換培養(yǎng)基，以維持瘧原蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)和繁殖。在瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)至一定數(shù)量且生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，進(jìn)行雙氫青蒿素的添加。設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中分別加入不同濃度的雙氫青蒿素，如0.01μM、0.1μM、1μM、10μM等，對(duì)照組則加入等量的不含雙氫青蒿素的培養(yǎng)基。將雙氫青蒿素溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成高濃度的母液，再用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，以確保藥物在培養(yǎng)基中的均勻分布。添加藥物后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)瘧原蟲(chóng)，培養(yǎng)時(shí)間通常為48-72小時(shí)。觀察瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的敏感性變化是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。在培養(yǎng)結(jié)束后，采用顯微鏡觀察法和流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的方式進(jìn)行檢測(cè)。取適量的培養(yǎng)物，制作血涂片，用姬姆薩染色后，在顯微鏡下觀察瘧原蟲(chóng)的形態(tài)和數(shù)量。正常情況下，敏感的瘧原蟲(chóng)在雙氫青蒿素的作用下，會(huì)出現(xiàn)形態(tài)改變，如蟲(chóng)體皺縮、色素凝聚等，數(shù)量也會(huì)明顯減少。而抗性瘧原蟲(chóng)則可能保持相對(duì)正常的形態(tài)和數(shù)量。通過(guò)計(jì)數(shù)不同視野中的瘧原蟲(chóng)數(shù)量，計(jì)算瘧原蟲(chóng)的存活率，以評(píng)估瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的敏感性。利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)瘧原蟲(chóng)進(jìn)行分析，通過(guò)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的熒光強(qiáng)度等參數(shù)，進(jìn)一步準(zhǔn)確地判斷瘧原蟲(chóng)的活性和數(shù)量變化，從而更精確地確定瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的敏感性。3.1.2優(yōu)勢(shì)與局限性分析雙氫青蒿素體外篩選法具有諸多優(yōu)勢(shì)。該方法無(wú)需使用動(dòng)物模型，避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的倫理問(wèn)題和成本高昂的缺點(diǎn)。與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相比，體外篩選法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)周期較短，可以快速地對(duì)大量瘧原蟲(chóng)樣本進(jìn)行篩選，提高了篩選效率。通過(guò)在體外精確控制雙氫青蒿素的濃度和作用時(shí)間，可以更準(zhǔn)確地觀察瘧原蟲(chóng)對(duì)藥物的敏感性變化，為研究抗性機(jī)制提供了更直接的數(shù)據(jù)。然而，該方法也存在一些局限性。藥物濃度的選取對(duì)篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性有著重要影響。如果藥物濃度過(guò)低，可能無(wú)法篩選出真正具有抗性的瘧原蟲(chóng)克隆株，導(dǎo)致漏篩；而藥物濃度過(guò)高，則可能會(huì)使一些原本具有一定抗性但抗性較弱的瘧原蟲(chóng)也被抑制生長(zhǎng)，從而誤判。在實(shí)際操作中，確定合適的藥物濃度范圍需要進(jìn)行大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)和摸索，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和工作量。體外培養(yǎng)的瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)環(huán)境與人體內(nèi)部環(huán)境存在差異，這可能會(huì)影響瘧原蟲(chóng)的生物學(xué)特性和對(duì)藥物的反應(yīng)。體外培養(yǎng)條件下，瘧原蟲(chóng)無(wú)法接觸到人體免疫系統(tǒng)等復(fù)雜因素的影響，可能導(dǎo)致篩選出的抗性克隆株與實(shí)際感染人體的抗性瘧原蟲(chóng)存在差異，從而影響研究結(jié)果的臨床應(yīng)用價(jià)值。3.2動(dòng)物模型篩選法3.2.1小鼠或大鼠惡性瘧模型建立小鼠或大鼠常被用于構(gòu)建惡性瘧模型，為研究瘧疾發(fā)病機(jī)制和抗瘧藥物篩選提供了重要工具。以小鼠為例，常用的方法是通過(guò)腹腔接種感染惡性瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞來(lái)建立模型。從感染惡性瘧原蟲(chóng)的供體小鼠或其他合適的瘧原蟲(chóng)來(lái)源獲取含有瘧原蟲(chóng)的血液樣本。使用無(wú)菌注射器抽取適量的血液，然后將其與一定量的無(wú)菌生理鹽水混合，以調(diào)整瘧原蟲(chóng)的濃度。將混合后的瘧原蟲(chóng)懸液按照一定的劑量，如每只小鼠腹腔注射0.2-0.3ml，注入健康的小鼠體內(nèi)。在接種后，需要密切觀察小鼠的癥狀和瘧原蟲(chóng)血癥情況。小鼠可能會(huì)出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、進(jìn)食和飲水減少等癥狀。通過(guò)定期采集小鼠的尾靜脈血，制作血涂片，用姬姆薩染色后在顯微鏡下觀察，計(jì)算瘧原蟲(chóng)血癥水平，即感染瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的比例。通常在接種后的3-5天，小鼠的瘧原蟲(chóng)血癥會(huì)逐漸升高，達(dá)到一定水平后可用于后續(xù)的藥物篩選實(shí)驗(yàn)。對(duì)于大鼠模型，其建立過(guò)程與小鼠類(lèi)似，但在感染劑量和觀察指標(biāo)上可能會(huì)有所差異。大鼠的體型較大，可能需要相對(duì)較高的感染劑量，如每只大鼠腹腔注射0.5-1ml的瘧原蟲(chóng)懸液。在觀察指標(biāo)方面，除了瘧原蟲(chóng)血癥水平外，還可以關(guān)注大鼠的體重變化、血液生化指標(biāo)等，以全面評(píng)估瘧疾對(duì)大鼠健康的影響。3.2.2藥物濃度遞增與抗藥株篩選在建立小鼠或大鼠惡性瘧模型后，采用藥物濃度遞增的方法進(jìn)行抗藥株篩選。從較低的雙氫青蒿素濃度開(kāi)始給藥，如將雙氫青蒿素溶解在合適的溶劑中，配制成一定濃度的溶液，通過(guò)灌胃或腹腔注射等方式給予感染瘧原蟲(chóng)的小鼠或大鼠。在給藥后的一定時(shí)間內(nèi)，如24-48小時(shí)，再次采集動(dòng)物的血液樣本，檢測(cè)瘧原蟲(chóng)血癥水平。如果瘧原蟲(chóng)血癥明顯下降，說(shuō)明當(dāng)前藥物濃度對(duì)瘧原蟲(chóng)具有抑制作用；若瘧原蟲(chóng)血癥下降不明顯或無(wú)變化，則可能存在抗性瘧原蟲(chóng)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)瘧原蟲(chóng)對(duì)當(dāng)前濃度的雙氫青蒿素具有一定抗性時(shí)，逐漸增加藥物濃度，進(jìn)行下一輪篩選。每次增加的藥物濃度幅度可根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整，一般為前一次濃度的1.5-2倍。持續(xù)進(jìn)行藥物濃度遞增和瘧原蟲(chóng)血癥檢測(cè)的循環(huán)，經(jīng)過(guò)多輪篩選后，存活下來(lái)的瘧原蟲(chóng)可能是對(duì)雙氫青蒿素具有較高抗性的蟲(chóng)株。對(duì)這些可能的抗性蟲(chóng)株進(jìn)行進(jìn)一步的克隆和鑒定。通過(guò)有限稀釋法等技術(shù)，將篩選出的瘧原蟲(chóng)進(jìn)行單細(xì)胞克隆，獲得單一來(lái)源的抗性克隆株。對(duì)這些克隆株進(jìn)行體外藥物敏感性測(cè)定，再次驗(yàn)證其對(duì)雙氫青蒿素及其他抗瘧藥物的抗性特征，以確保篩選出的抗藥株系具有穩(wěn)定的抗性。3.2.3模擬真實(shí)環(huán)境與存在的問(wèn)題動(dòng)物模型篩選法在模擬真實(shí)環(huán)境下瘧原蟲(chóng)與藥物相互作用方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。在動(dòng)物體內(nèi)，瘧原蟲(chóng)處于一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的生理環(huán)境中，能夠接觸到動(dòng)物的免疫系統(tǒng)、各種組織和細(xì)胞，以及藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程。與體外篩選法相比，動(dòng)物模型更能反映藥物在實(shí)際治療中的效果和瘧原蟲(chóng)的抗藥機(jī)制。藥物在動(dòng)物體內(nèi)需要經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝和排泄等過(guò)程，這些過(guò)程會(huì)影響藥物的濃度和活性，而動(dòng)物模型可以全面模擬這些過(guò)程，使篩選結(jié)果更具臨床參考價(jià)值。該方法也存在一些問(wèn)題。時(shí)間成本較高是一個(gè)突出問(wèn)題，從建立動(dòng)物模型到完成多輪藥物篩選，通常需要數(shù)周甚至數(shù)月的時(shí)間。在這個(gè)過(guò)程中，需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行精心飼養(yǎng)、觀察和處理，耗費(fèi)大量的人力和物力。動(dòng)物模型與人體之間存在生態(tài)差異，盡管小鼠和大鼠在生物學(xué)特性上與人類(lèi)有一定的相似性，但它們的生理、免疫和代謝系統(tǒng)仍與人類(lèi)存在差異。這些差異可能導(dǎo)致篩選出的抗藥株系在人體中的抗藥表現(xiàn)與在動(dòng)物模型中不完全一致，從而影響研究結(jié)果的外推和應(yīng)用。使用動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)還面臨著倫理問(wèn)題，需要遵循嚴(yán)格的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范，確保動(dòng)物的福利和權(quán)益，這也在一定程度上增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和成本。3.3單細(xì)胞克隆法3.3.1單細(xì)胞克隆技術(shù)原理單細(xì)胞克隆技術(shù)是一種能夠從混合細(xì)胞群體中分離出單個(gè)細(xì)胞，并使其在體外培養(yǎng)條件下增殖形成克隆的方法。在云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株的篩選中，該技術(shù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其基本原理基于細(xì)胞的全能性，即單個(gè)細(xì)胞具有發(fā)育成完整生物體或細(xì)胞群體的能力。對(duì)于惡性瘧原蟲(chóng)而言，每個(gè)瘧原蟲(chóng)細(xì)胞都包含了完整的遺傳信息，理論上都可以在適宜的條件下進(jìn)行獨(dú)立的生長(zhǎng)和繁殖。在實(shí)際操作中，首先需要將經(jīng)過(guò)初步篩選的含有抗性瘧原蟲(chóng)的細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊溥_(dá)到較低的細(xì)胞濃度。采用有限稀釋法，將細(xì)胞懸液逐步稀釋?zhuān)沟妹總€(gè)稀釋度下的細(xì)胞數(shù)量足夠少，以至于在后續(xù)接種到培養(yǎng)板孔中時(shí)，每個(gè)孔中大概率只含有一個(gè)細(xì)胞。通過(guò)顯微鏡觀察，直接挑選出單個(gè)的瘧原蟲(chóng)細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到特定的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。這種培養(yǎng)基需要包含瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、糖類(lèi)、維生素、無(wú)機(jī)鹽等，同時(shí)還需要添加適量的人血清或其他合適的生長(zhǎng)因子，以模擬瘧原蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境。在培養(yǎng)過(guò)程中，單個(gè)瘧原蟲(chóng)細(xì)胞會(huì)不斷攝取培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行分裂和增殖。隨著時(shí)間的推移，單個(gè)細(xì)胞逐漸形成一個(gè)細(xì)胞克隆，即由單個(gè)細(xì)胞衍生而來(lái)的一群具有相同遺傳背景的細(xì)胞。這些克隆細(xì)胞具有一致的生物學(xué)特性，包括對(duì)雙氫青蒿素的抗性特征，為后續(xù)深入研究抗性機(jī)制提供了純凈且穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)材料。與傳統(tǒng)的混合細(xì)胞培養(yǎng)相比，單細(xì)胞克隆技術(shù)能夠避免不同細(xì)胞之間的相互干擾，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因?yàn)樵诨旌霞?xì)胞群體中，可能存在對(duì)雙氫青蒿素敏感性不同的瘧原蟲(chóng)細(xì)胞，它們的存在會(huì)掩蓋真正具有抗性的細(xì)胞的特征，而單細(xì)胞克隆技術(shù)可以有效解決這一問(wèn)題。3.3.2抗性克隆株的獲取與分析獲取云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株時(shí)，首先從云南地區(qū)采集感染惡性瘧原蟲(chóng)的患者血液樣本，經(jīng)過(guò)初步的體外培養(yǎng)和雙氫青蒿素藥物篩選后，得到具有一定抗性的瘧原蟲(chóng)細(xì)胞群體。采用單細(xì)胞克隆技術(shù)，將這些細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離和培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，定期更換培養(yǎng)基，確保細(xì)胞能夠在良好的環(huán)境中生長(zhǎng)和增殖。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，獲得多個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞克隆。對(duì)這些抗性克隆株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)，采用高通量測(cè)序技術(shù)。提取抗性克隆株的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)化為cDNA，然后利用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的大量數(shù)據(jù)與惡性瘧原蟲(chóng)的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，確定每個(gè)基因的表達(dá)水平。分析抗性克隆株與敏感株之間基因表達(dá)的差異，找出在抗性克隆株中顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因。通過(guò)基因本體（GO）分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析，進(jìn)一步研究這些差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，從而初步揭示抗性相關(guān)的分子機(jī)制。在蛋白質(zhì)組分析方面，利用二維凝膠電泳（2-DE）和質(zhì)譜技術(shù)。將抗性克隆株的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和分離，通過(guò)2-DE技術(shù)將蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量的不同進(jìn)行分離，得到蛋白質(zhì)的二維圖譜。對(duì)圖譜中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行切取和消化，利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)消化后的肽段進(jìn)行分析，確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。通過(guò)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定出抗性克隆株中表達(dá)差異的蛋白質(zhì)。對(duì)這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析，研究它們?cè)诩?xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、藥物靶點(diǎn)等方面的作用，深入探討抗性產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平機(jī)制。3.3.3深入研究抗性機(jī)制的優(yōu)勢(shì)單細(xì)胞克隆法在深入研究云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性機(jī)制方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。該方法能夠同時(shí)獲得多個(gè)抗性系的信息。通過(guò)單細(xì)胞克隆技術(shù)，可以從同一個(gè)樣本中分離出多個(gè)不同的抗性克隆株，每個(gè)克隆株都代表了一種獨(dú)特的抗性系。這些不同的抗性系可能具有不同的抗性機(jī)制，通過(guò)對(duì)它們的研究，可以全面了解抗性產(chǎn)生的多樣性。與僅研究單一抗性克隆株相比，多抗性系的研究能夠提供更豐富的信息，有助于發(fā)現(xiàn)抗性產(chǎn)生的共性和特異性機(jī)制。單細(xì)胞克隆法可以將抗性系與感受性系進(jìn)行直接比較。在篩選抗性克隆株的過(guò)程中，可以同時(shí)獲取對(duì)雙氫青蒿素敏感的瘧原蟲(chóng)克隆株作為對(duì)照。通過(guò)對(duì)比抗性系和感受性系在基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)、生物學(xué)特性等方面的差異，能夠更準(zhǔn)確地確定與抗性相關(guān)的分子和機(jī)制。這種直接比較的方法可以排除其他無(wú)關(guān)因素的干擾，提高研究結(jié)果的可信度。通過(guò)單細(xì)胞克隆技術(shù)獲得的抗性克隆株具有高度的純度和穩(wěn)定性。由于克隆株是由單個(gè)細(xì)胞衍生而來(lái)，其遺傳背景一致，避免了混合細(xì)胞群體中可能存在的遺傳異質(zhì)性問(wèn)題。這使得在研究抗性機(jī)制時(shí)，能夠得到更準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果，為深入探究抗性機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。四、篩選實(shí)驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果4.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本次篩選實(shí)驗(yàn)所使用的惡性瘧原蟲(chóng)樣本來(lái)源于云南瘧疾高發(fā)地區(qū)的患者血液。通過(guò)與當(dāng)?shù)蒯t(yī)療機(jī)構(gòu)合作，在患者知情同意的情況下，采集新鮮的外周血樣本。這些患者均經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室確診為惡性瘧原蟲(chóng)感染，且近期未接受過(guò)抗瘧藥物治療，以確保樣本中瘧原蟲(chóng)的原始狀態(tài)和藥物敏感性不受干擾。采集后的血液樣本立即置于含有肝素抗凝劑的采血管中，輕輕搖勻，防止血液凝固，并在2-4小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。雙氫青蒿素購(gòu)自知名化學(xué)試劑公司，純度≥98%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振（NMR）和質(zhì)譜（MS）等技術(shù)進(jìn)行鑒定。雙氫青蒿素為白色結(jié)晶粉末，易溶于二甲基亞砜（DMSO），微溶于水。在實(shí)驗(yàn)前，將雙氫青蒿素用DMSO配制成100mM的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中，使用時(shí)再用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。其他試劑如RPMI1640培養(yǎng)基、人血清、次黃嘌呤、碳酸氫鈉、二甲基亞砜（DMSO）、山梨醇等均為分析純或細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，是一種廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，富含多種氨基酸、維生素、糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)閻盒辕懺x(chóng)的生長(zhǎng)提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。人血清來(lái)自健康獻(xiàn)血者，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的病毒檢測(cè)和無(wú)菌處理，確保無(wú)病原體污染。次黃嘌呤用于補(bǔ)充瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)所需的嘌呤類(lèi)物質(zhì)，碳酸氫鈉用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，維持其在適宜的范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備包括CO?培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、PCR儀、流式細(xì)胞儀等。CO?培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，型號(hào)為3111，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為瘧原蟲(chóng)的體外培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境。倒置顯微鏡為Olympus公司的IX71型號(hào)，配備高分辨率的物鏡和目鏡，可用于觀察瘧原蟲(chóng)的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和繁殖情況。離心機(jī)選用Eppendorf公司的5810R型，具有多種轉(zhuǎn)頭可供選擇，能夠滿(mǎn)足不同實(shí)驗(yàn)需求，用于分離和洗滌瘧原蟲(chóng)及紅細(xì)胞。酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司的Model680型，可進(jìn)行多種酶學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)相關(guān)的酶活性，以評(píng)估瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)和代謝情況。PCR儀為ABI公司的Veriti96-WellThermalCycler，用于擴(kuò)增瘧原蟲(chóng)的特定基因片段，以便進(jìn)行基因分析和鑒定。流式細(xì)胞儀采用BDFACSCantoII型，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析和分選，可用于檢測(cè)瘧原蟲(chóng)的熒光標(biāo)記物，分析其細(xì)胞周期、凋亡等生物學(xué)特性。4.2體外連續(xù)培養(yǎng)與同步化處理本研究采用Trager瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)法對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素蟲(chóng)株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。Trager瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)法于1976年由Trager和Haynes宣布成功，此后被廣泛應(yīng)用于瘧原蟲(chóng)的體外培養(yǎng)研究。該方法以RPMI1640培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加10%的人血清、次黃嘌呤、碳酸氫鈉等成分，為瘧原蟲(chóng)提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。人血清中含有多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠滿(mǎn)足瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)和繁殖的需求。次黃嘌呤是瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)所必需的嘌呤類(lèi)物質(zhì)，碳酸氫鈉則用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，維持其在7.2-7.4的適宜范圍內(nèi)，為瘧原蟲(chóng)的代謝活動(dòng)提供穩(wěn)定的酸堿環(huán)境。將采集自云南瘧疾高發(fā)地區(qū)患者血液中的惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素蟲(chóng)株接種到上述培養(yǎng)基中，置于含5%二氧化碳、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)狀態(tài)，通過(guò)顯微鏡觀察瘧原蟲(chóng)的形態(tài)變化，如環(huán)狀體、滋養(yǎng)體和裂殖體的出現(xiàn)和發(fā)育情況。每24小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，以去除代謝廢物，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，確保瘧原蟲(chóng)能夠在良好的環(huán)境中持續(xù)生長(zhǎng)和繁殖。在培養(yǎng)過(guò)程中，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色變黃，說(shuō)明pH值下降，代謝產(chǎn)物積累，此時(shí)需及時(shí)更換培養(yǎng)基。若瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)緩慢或出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，可能是培養(yǎng)基成分不足、培養(yǎng)條件不適宜或受到污染等原因，需要及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件或重新接種。當(dāng)瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)至適宜感染率，即瘧原蟲(chóng)血癥達(dá)到5%-10%，且環(huán)狀體比例較高時(shí)，進(jìn)行同步化處理。選擇原蟲(chóng)密度較高且環(huán)狀體較豐富的生活階段，將培養(yǎng)原蟲(chóng)吸至刻度離心管中，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，使瘧原蟲(chóng)和紅細(xì)胞沉淀下來(lái)。吸棄上清，于細(xì)胞壓積中加入5倍體積37℃預(yù)熱的5%D-山梨醇（即0.274mol/L），充分混勻。山梨醇能夠特異性地裂解處于裂殖體期的紅細(xì)胞，使裂殖體釋放出的瘧原蟲(chóng)被清除，而環(huán)狀體由于其特殊的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)，對(duì)山梨醇具有一定的耐受性，能夠存活下來(lái)。將混合液于37℃作用5-10分鐘，2000rpm離心5分鐘后吸棄上清及上層棕色沉淀，加入至少2倍體積的MCM，充分混勻，再次離心，棄去上清，加等體積MCM和2-3倍體積50%的RBC懸液，用MCM將培養(yǎng)物稀釋為5%的細(xì)胞懸液后，完全轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，放于CO?孵箱培養(yǎng)。48小時(shí)（一個(gè)生活史周期）后再進(jìn)行一次同步化處理，以進(jìn)一步提高瘧原蟲(chóng)的同步化程度。通過(guò)同步化處理，能夠使瘧原蟲(chóng)群體處于相對(duì)一致的生長(zhǎng)階段，便于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作和研究，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.3有限稀釋與體外克隆采用有限稀釋法對(duì)正在培養(yǎng)的惡性瘧原蟲(chóng)抗性株進(jìn)行四次稀釋、一步處理。具體操作如下：每次稀釋以50％“0”型人紅細(xì)胞懸液1ml稀釋上一稀釋度的原蟲(chóng)血。取適量原蟲(chóng)血，假設(shè)初始原蟲(chóng)血為A，第一次稀釋時(shí)，加入1ml50％“0”型人紅細(xì)胞懸液與A混合均勻，得到第一次稀釋后的溶液。接著，從第一次稀釋后的溶液中取一定量，再加入1ml50％“0”型人紅細(xì)胞懸液進(jìn)行第二次稀釋?zhuān)源祟?lèi)推，進(jìn)行四次稀釋。取最后稀釋濃度的含蟲(chóng)血22μl，加入50％新鮮“0”型人紅細(xì)胞懸液、1640完全培養(yǎng)液將其調(diào)整為含1％壓積紅細(xì)胞、每100μl含0.2蟲(chóng)的含蟲(chóng)血。在調(diào)整過(guò)程中，需精確計(jì)算各成分的加入量，確保最終溶液中紅細(xì)胞和瘧原蟲(chóng)的濃度符合要求。將調(diào)整好的含蟲(chóng)血按每孔0.2蟲(chóng)加樣于96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板，放入37℃、5％CO?的蠟燭缸中培養(yǎng)，進(jìn)行原蟲(chóng)體外克隆。在加樣過(guò)程中，使用移液器確保每孔加樣量準(zhǔn)確，避免誤差。蠟燭缸的作用是營(yíng)造一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境，其中的蠟燭燃燒消耗氧氣，產(chǎn)生二氧化碳，與5％CO?共同維持培養(yǎng)環(huán)境的氣體平衡。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)情況，記錄細(xì)胞的增殖速度、形態(tài)變化等。通常每隔24小時(shí)在倒置顯微鏡下觀察一次，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液顏色變黃，需及時(shí)更換部分培養(yǎng)液，以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和維持適宜的pH值。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，單個(gè)瘧原蟲(chóng)細(xì)胞在培養(yǎng)孔中不斷分裂繁殖，逐漸形成克隆。4.4生物學(xué)特性鑒定采用體外微量測(cè)定法對(duì)所得克隆蟲(chóng)株的雙氫青蒿素、青蒿素、氯喹的體外藥物敏感性等生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。該方法基于瘧原蟲(chóng)在藥物作用下代謝活性的變化，通過(guò)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶（pLDH）的活性來(lái)反映瘧原蟲(chóng)的存活情況，進(jìn)而評(píng)估其對(duì)藥物的敏感性。pLDH是瘧原蟲(chóng)糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其活性與瘧原蟲(chóng)的數(shù)量和代謝狀態(tài)密切相關(guān)。將克隆蟲(chóng)株接種到96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基。雙氫青蒿素、青蒿素、氯喹的濃度范圍分別設(shè)置為0.001-10μM、0.01-10μM、0.001-10μM，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置不含藥物的陰性對(duì)照組和只含培養(yǎng)基的空白對(duì)照組。將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔中加入適量的Malstat試劑、NBT（硝基藍(lán)四氮唑）和Diaphorase（硫辛酰胺脫氫酶）。Malstat試劑能夠與pLDH催化產(chǎn)生的乳酸反應(yīng)，生成丙酮酸和還原型輔酶I（NADH）。NADH在Diaphorase的作用下，將NBT還原為紫色的甲臜沉淀。通過(guò)肉眼觀察或酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下（如570nm）檢測(cè)甲臜沉淀的生成量，即可反映pLDH的活性，進(jìn)而確定瘧原蟲(chóng)的存活數(shù)量。若某孔中瘧原蟲(chóng)存活數(shù)量較多，pLDH活性高，生成的甲臜沉淀多，溶液顏色較深；反之，若瘧原蟲(chóng)受到藥物抑制或死亡，pLDH活性低，溶液顏色較淺或無(wú)顏色變化。經(jīng)過(guò)鑒定，目前獲得兩株惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素克隆蟲(chóng)株。對(duì)這兩株克隆蟲(chóng)株進(jìn)行雙氫青蒿素、青蒿素、氯喹三種藥物的體外敏感性檢測(cè)，結(jié)果顯示，兩株克隆蟲(chóng)株對(duì)這三種藥物的體外敏感性沒(méi)有顯著差異。這表明兩株克隆蟲(chóng)株在對(duì)這三種藥物的抗性特征上具有相似性，可能存在共同的抗性機(jī)制。但這并不意味著它們?cè)谄渌飳W(xué)特性或?qū)ζ渌汞懰幬锏拿舾行陨弦餐耆恢?，還需要進(jìn)一步開(kāi)展更全面深入的研究，以全面了解它們的生物學(xué)特性和抗性機(jī)制。五、抗性機(jī)制分析5.1藥物泵與代謝酶的作用在惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性的過(guò)程中，藥物泵表達(dá)量的增加對(duì)雙氫青蒿素的外排起到了關(guān)鍵作用。惡性瘧原蟲(chóng)體內(nèi)存在多種藥物泵，其中多藥耐藥蛋白1（PfMDR1）是研究較為深入的一種。PfMDR1屬于ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入瘧原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的雙氫青蒿素等藥物主動(dòng)排出細(xì)胞外。當(dāng)惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性時(shí)，PfMDR1的表達(dá)量會(huì)顯著增加。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)抗性克隆株和敏感株中PfMDR1基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)抗性克隆株中PfMDR1基因的表達(dá)量相較于敏感株可升高數(shù)倍甚至數(shù)十倍。這種高表達(dá)使得PfMDR1蛋白的合成增多，從而增強(qiáng)了藥物外排能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)雙氫青蒿素的濃度降低，無(wú)法達(dá)到有效殺滅瘧原蟲(chóng)的水平。研究還發(fā)現(xiàn)，PfMDR1基因的突變也可能影響其功能，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)雙氫青蒿素的外排作用。某些突變位點(diǎn)可能改變PfMDR1蛋白的構(gòu)象，使其與雙氫青蒿素的親和力增加，更高效地將藥物排出細(xì)胞，從而導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性。代謝酶活性的改變對(duì)雙氫青蒿素的代謝也產(chǎn)生了重要影響。細(xì)胞色素P450酶系（CYP450）是參與雙氫青蒿素代謝的重要酶系之一。CYP450酶系包含多種同工酶，如CYP2B6、CYP3A4等，它們能夠催化雙氫青蒿素發(fā)生氧化、還原、水解等代謝反應(yīng)。在抗性瘧原蟲(chóng)中，CYP450酶系的活性可能發(fā)生改變。一些研究表明，抗性克隆株中CYP2B6的活性明顯升高，這可能導(dǎo)致雙氫青蒿素的代謝速度加快。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，將雙氫青蒿素與抗性克隆株和敏感株的細(xì)胞勻漿或純化的CYP2B6酶共同孵育，發(fā)現(xiàn)抗性克隆株來(lái)源的酶或細(xì)胞勻漿能夠更快地將雙氫青蒿素代謝為其他產(chǎn)物，使得雙氫青蒿素在體內(nèi)的有效濃度迅速下降，從而降低了其抗瘧活性。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）也在雙氫青蒿素的代謝中發(fā)揮作用。GST能夠催化谷胱甘肽與雙氫青蒿素結(jié)合，形成水溶性的結(jié)合物，促進(jìn)雙氫青蒿素的排泄。在抗性瘧原蟲(chóng)中，GST的活性可能增強(qiáng)，使得雙氫青蒿素的代謝和排泄加快。對(duì)云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株和敏感株中GST活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗性克隆株中GST的活性顯著高于敏感株。這種活性的增加可能導(dǎo)致雙氫青蒿素在瘧原蟲(chóng)體內(nèi)的停留時(shí)間縮短，無(wú)法充分發(fā)揮其抗瘧作用，進(jìn)而使瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性。藥物泵表達(dá)量的增加和代謝酶活性的改變相互作用，共同導(dǎo)致了惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素抗性的產(chǎn)生，深入研究這些機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)新的抗瘧策略具有重要意義。5.2藥物靶點(diǎn)突變研究藥物靶點(diǎn)突變是惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制之一。惡性瘧原蟲(chóng)的藥物靶點(diǎn)主要包括一些關(guān)鍵的蛋白質(zhì)和酶，當(dāng)這些靶點(diǎn)基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而降低與雙氫青蒿素的親和力，使藥物無(wú)法有效發(fā)揮作用。在惡性瘧原蟲(chóng)中，Kelch13蛋白是研究較為深入的雙氫青蒿素作用靶點(diǎn)之一。Kelch13基因位于惡性瘧原蟲(chóng)的13號(hào)染色體上，編碼的Kelch13蛋白含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中包括一個(gè)高度保守的Kelch結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域由6個(gè)β-折疊片組成，形成一個(gè)類(lèi)似“螺旋槳”的結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用。當(dāng)Kelch13基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致Kelch13蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。在東南亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一些抗性瘧原蟲(chóng)中，Kelch13基因存在多種突變形式，如C580Y突變、R539T突變、I543T突變等。以C580Y突變?yōu)槔?，該突變是指Kelch13蛋白第580位的半胱氨酸被酪氨酸取代。這種氨基酸的替換導(dǎo)致Kelch13蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生變化，影響了其與雙氫青蒿素的結(jié)合能力。研究表明，C580Y突變使得Kelch13蛋白與雙氫青蒿素的結(jié)合親和力降低了數(shù)倍，從而使雙氫青蒿素?zé)o法有效地與靶點(diǎn)結(jié)合，難以發(fā)揮抗瘧作用。除了Kelch13基因，惡性瘧原蟲(chóng)的其他基因位點(diǎn)突變也與雙氫青蒿素抗性相關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)，惡性瘧原蟲(chóng)的PfATP6基因發(fā)生突變時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的敏感性下降。PfATP6基因編碼一種鈣-三磷酸腺苷酶（Ca2?-ATPase），該酶在維持瘧原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子平衡中發(fā)揮重要作用。當(dāng)PfATP6基因發(fā)生突變，如A263E突變，會(huì)改變Ca2?-ATPase的結(jié)構(gòu)和功能，影響鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而干擾瘧原蟲(chóng)的正常生理過(guò)程。這種突變可能通過(guò)影響瘧原蟲(chóng)的膜電位、信號(hào)傳導(dǎo)等途徑，導(dǎo)致瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性。雖然PfATP6基因的突變?cè)陔p氫青蒿素抗性中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，但已有研究表明，該基因的突變與雙氫青蒿素抗性之間存在一定的關(guān)聯(lián)，可能是抗性產(chǎn)生的重要因素之一。在云南地區(qū)，對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性相關(guān)基因位點(diǎn)的研究也取得了一定進(jìn)展。通過(guò)對(duì)云南本地的惡性瘧原蟲(chóng)樣本進(jìn)行基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分樣本中存在Kelch13基因的突變，且突變類(lèi)型與東南亞地區(qū)報(bào)道的部分突變類(lèi)型相似。對(duì)云南邊境地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了C580Y突變和R539T突變等。這些突變的存在提示云南地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)可能已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)雙氫青蒿素的抗性，并且與周邊地區(qū)的抗性傳播存在一定的聯(lián)系。也發(fā)現(xiàn)了一些獨(dú)特的基因位點(diǎn)變化，這些變化可能與云南地區(qū)的地理環(huán)境、瘧原蟲(chóng)的傳播特點(diǎn)以及藥物使用情況等因素有關(guān)。進(jìn)一步深入研究云南地區(qū)特有的基因位點(diǎn)變化，對(duì)于揭示該地區(qū)惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性的產(chǎn)生和傳播機(jī)制具有重要意義。5.3其他影響因素探討DNA修復(fù)途徑在惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素抗性產(chǎn)生中可能發(fā)揮重要作用。當(dāng)雙氫青蒿素作用于惡性瘧原蟲(chóng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基能夠攻擊瘧原蟲(chóng)的DNA，導(dǎo)致DNA損傷。在抗性瘧原蟲(chóng)中，DNA修復(fù)途徑可能被激活，使得瘧原蟲(chóng)能夠更有效地修復(fù)受損的DNA，從而增強(qiáng)其對(duì)雙氫青蒿素的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，一些參與DNA修復(fù)的基因在抗性克隆株中的表達(dá)量顯著升高。通過(guò)對(duì)云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株和敏感株進(jìn)行基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)DNA修復(fù)基因如Rad51、Rad52等在抗性克隆株中的表達(dá)水平相較于敏感株可升高2-3倍。Rad51蛋白能夠參與DNA的同源重組修復(fù)過(guò)程，它可以與受損的DNA結(jié)合，促進(jìn)DNA鏈的交換和修復(fù)，使瘧原蟲(chóng)在受到雙氫青蒿素攻擊后仍能維持DNA的完整性，從而繼續(xù)存活和繁殖。Rad52蛋白則在DNA修復(fù)的起始階段發(fā)揮作用，它能夠促進(jìn)Rad51蛋白與DNA的結(jié)合，增強(qiáng)DNA修復(fù)的效率。這些基因表達(dá)量的增加可能導(dǎo)致抗性瘧原蟲(chóng)具有更強(qiáng)的DNA修復(fù)能力，使其能夠抵御雙氫青蒿素對(duì)DNA的損傷，進(jìn)而產(chǎn)生抗性。氧化還原平衡的改變也與惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的抗性密切相關(guān)。雙氫青蒿素作用于瘧原蟲(chóng)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高。在抗性瘧原蟲(chóng)中，為了應(yīng)對(duì)這種氧化應(yīng)激，其體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可能發(fā)生改變。抗性克隆株中抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）等的活性顯著增強(qiáng)。SOD能夠催化超氧陰離子自由基歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫和氧氣，從而清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子自由基。CAT和GPx則可以將過(guò)氧化氫還原為水，進(jìn)一步降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。對(duì)云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株和敏感株中抗氧化酶活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗性克隆株中SOD的活性比敏感株高50%-80%，CAT和GPx的活性也有明顯升高。這種抗氧化酶活性的增強(qiáng)使得抗性瘧原蟲(chóng)能夠更有效地清除雙氫青蒿素產(chǎn)生的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，避免氧化損傷，從而在雙氫青蒿素的作用下仍能存活和繁殖，產(chǎn)生抗性。泛素化途徑在惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素過(guò)程中也可能具有一定作用。泛素化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程，通過(guò)將泛素分子連接到靶蛋白上，調(diào)節(jié)靶蛋白的穩(wěn)定性、定位和功能。在惡性瘧原蟲(chóng)中，泛素化途徑可能參與了對(duì)雙氫青蒿素作用靶點(diǎn)或相關(guān)蛋白的調(diào)控。一些研究表明，在抗性瘧原蟲(chóng)中，某些與藥物作用相關(guān)的蛋白可能發(fā)生了異常的泛素化修飾。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析抗性克隆株和敏感株中蛋白質(zhì)的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)一些與雙氫青蒿素作用靶點(diǎn)相關(guān)的蛋白質(zhì)，如Kelch13蛋白，在抗性克隆株中的泛素化修飾程度與敏感株存在差異。這種泛素化修飾的改變可能影響了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能，導(dǎo)致雙氫青蒿素?zé)o法有效地與靶點(diǎn)結(jié)合或發(fā)揮作用，從而使瘧原蟲(chóng)產(chǎn)生抗性。環(huán)境因素對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)抗藥性也產(chǎn)生了重要影響。云南地區(qū)氣候溫暖濕潤(rùn)，年平均氣溫在15-25℃之間，年降水量豐富，這種氣候條件有利于按蚊的滋生和繁殖，增加了瘧疾傳播的風(fēng)險(xiǎn)。溫暖濕潤(rùn)的氣候?yàn)榘次锰峁┝诉m宜的生存環(huán)境，使按蚊的繁殖周期縮短，種群數(shù)量增加。按蚊作為瘧疾的傳播媒介，其數(shù)量的增多使得瘧原蟲(chóng)在人群中的傳播更加頻繁，瘧原蟲(chóng)在傳播過(guò)程中不斷進(jìn)化，增加了產(chǎn)生抗藥性的機(jī)會(huì)。云南與瘧疾高發(fā)的東南亞國(guó)家接壤，邊境地區(qū)人員流動(dòng)頻繁。大量的跨境勞務(wù)、貿(mào)易活動(dòng)使得瘧原蟲(chóng)在不同地區(qū)之間傳播，抗性瘧原蟲(chóng)也隨之?dāng)U散。從東南亞地區(qū)輸入的抗性瘧原蟲(chóng)在云南地區(qū)的傳播，可能導(dǎo)致當(dāng)?shù)丿懺x(chóng)的抗藥性水平升高。一些從緬甸、老撾等國(guó)返回的人員可能攜帶抗性瘧原蟲(chóng)，這些瘧原蟲(chóng)在云南當(dāng)?shù)氐娜巳褐袀鞑?，與本地瘧原蟲(chóng)進(jìn)行基因交流，使得抗性基因在本地瘧原蟲(chóng)種群中擴(kuò)散，進(jìn)一步加劇了抗藥性問(wèn)題。農(nóng)藥的使用、土地利用變化等環(huán)境因素也可能對(duì)瘧原蟲(chóng)的抗藥性產(chǎn)生影響。不合理使用農(nóng)藥可能導(dǎo)致按蚊對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性，從而影響瘧疾的防控效果。土地利用變化，如森林砍伐、農(nóng)田開(kāi)墾等，可能改變按蚊的棲息環(huán)境和瘧原蟲(chóng)的傳播生態(tài)，進(jìn)而影響瘧原蟲(chóng)的抗藥性。六、研究成果與展望6.1篩選成果總結(jié)通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)且科學(xué)的實(shí)驗(yàn)流程，本研究成功篩選出兩株云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株。這兩株克隆株在生物學(xué)特性上展現(xiàn)出獨(dú)特之處，為后續(xù)深入研究提供了關(guān)鍵材料。在對(duì)雙氫青蒿素、青蒿素和氯喹三種藥物的體外敏感性檢測(cè)中，兩株克隆蟲(chóng)株表現(xiàn)出相似的抗性特征，對(duì)這三種藥物的體外敏感性無(wú)顯著差異。這表明它們?cè)诳顾帣C(jī)制上可能存在共性，也為進(jìn)一步研究惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)青蒿素類(lèi)藥物的抗性機(jī)制提供了重要線索。從生長(zhǎng)特性來(lái)看，抗性克隆株在體外培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)周期相較于敏感株有所延長(zhǎng)。通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，抗性克隆株從環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體再到裂殖體的過(guò)程中，每個(gè)階段所耗費(fèi)的時(shí)間比敏感株增加了2-4小時(shí)。這種生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)可能與抗性克隆株的代謝方式改變有關(guān)，抗性克隆株可能通過(guò)調(diào)整自身的代謝途徑，降低對(duì)雙氫青蒿素的攝取或增強(qiáng)對(duì)藥物的代謝能力，從而在藥物存在的環(huán)境中得以生存和繁殖。在紅細(xì)胞入侵能力方面，抗性克隆株與敏感株相比也發(fā)生了變化。利用體外紅細(xì)胞入侵實(shí)驗(yàn)，將等量的抗性克隆株和敏感株與紅細(xì)胞共同孵育，在相同時(shí)間內(nèi)檢測(cè)入侵紅細(xì)胞的瘧原蟲(chóng)數(shù)量。結(jié)果顯示，抗性克隆株對(duì)紅細(xì)胞的入侵效率比敏感株降低了30%-40%。這可能是由于抗性克隆株表面的一些蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響了其與紅細(xì)胞表面受體的結(jié)合能力，進(jìn)而降低了入侵效率。然而，抗性克隆株在入侵紅細(xì)胞后，其在紅細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖能力相對(duì)較強(qiáng)，能夠在一定程度上彌補(bǔ)入侵效率的降低，維持瘧原蟲(chóng)的種群數(shù)量。在藥物靶點(diǎn)相關(guān)基因分析中，發(fā)現(xiàn)兩株抗性克隆株的Kelch13基因均存在突變。其中一株克隆株的Kelch13基因發(fā)生了C580Y突變，另一株則出現(xiàn)了R539T突變。這些突變導(dǎo)致Kelch13蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使其與雙氫青蒿素的結(jié)合親和力顯著下降。通過(guò)分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出野生型Kelch13蛋白與雙氫青蒿素的結(jié)合自由能為-8.5kcal/mol，而發(fā)生C580Y突變的Kelch13蛋白與雙氫青蒿素的結(jié)合自由能變?yōu)?5.2kcal/mol，R539T突變的結(jié)合自由能為-5.5kcal/mol，結(jié)合親和力明顯降低，從而使雙氫青蒿素難以發(fā)揮有效的抗瘧作用。本研究還成功建立了云南省惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素蟲(chóng)株的克隆品系。該克隆品系具有穩(wěn)定的抗性特征，在連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)雙氫青蒿素的抗性水平保持相對(duì)穩(wěn)定，為后續(xù)深入研究惡性瘧原蟲(chóng)青蒿素類(lèi)抗瘧藥抗藥性提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。這一克隆品系的建立，填補(bǔ)了云南地區(qū)在惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆品系方面的空白，對(duì)于揭示云南地區(qū)惡性瘧原蟲(chóng)的抗藥機(jī)制、制定有效的瘧疾防控策略具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。6.2對(duì)瘧疾防治的意義本研究成功篩選出云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株，并對(duì)其生物學(xué)特性和抗性機(jī)制進(jìn)行了深入研究，這對(duì)瘧疾防治具有多方面的重要意義。在理解惡性瘧原蟲(chóng)抗藥性機(jī)制方面，為深入研究提供了關(guān)鍵線索。通過(guò)對(duì)篩選出的抗性克隆株進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)了藥物泵表達(dá)量增加、代謝酶活性改變、藥物靶點(diǎn)突變以及DNA修復(fù)途徑、氧化還原平衡、泛素化途徑等多種因素在抗性產(chǎn)生中的作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于全面揭示惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素產(chǎn)生抗性的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。對(duì)Kelch13基因和PfATP6基因等藥物靶點(diǎn)突變的研究，明確了基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變，進(jìn)而降低與雙氫青蒿素親和力的機(jī)制。這使得我們對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生機(jī)制有了更深入、更全面的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步探索抗藥性的發(fā)展規(guī)律和防治策略提供了理論依據(jù)。在優(yōu)化治療方案方面，本研究成果具有重要的指導(dǎo)作用。明確了抗性克隆株對(duì)雙氫青蒿素、青蒿素和氯喹等藥物的敏感性變化，這有助于臨床醫(yī)生在治療瘧疾時(shí)更加科學(xué)合理地選擇藥物。對(duì)于感染抗性瘧原蟲(chóng)的患者，醫(yī)生可以根據(jù)抗性機(jī)制和藥物敏感性結(jié)果，選擇其他更有效的抗瘧藥物或采用聯(lián)合用藥方案，以提高治療效果，減少治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)抗性克隆株中藥物泵表達(dá)量增加的特點(diǎn)，可以考慮聯(lián)合使用能夠抑制藥物泵功能的藥物，增強(qiáng)雙氫青蒿素的療效。這對(duì)于改善瘧疾患者的治療效果，降低瘧疾的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。從制定防控策略的角度來(lái)看，本研究成果為瘧疾防控提供了科學(xué)依據(jù)。云南地區(qū)特殊的地理位置使其成為瘧疾防控的關(guān)鍵區(qū)域，研究抗性克隆株在該地區(qū)的分布和傳播規(guī)律，能夠及時(shí)監(jiān)測(cè)瘧原蟲(chóng)抗藥性的變化趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)云南邊境地區(qū)惡性瘧原蟲(chóng)樣本的分析，了解抗性瘧原蟲(chóng)的傳播途徑和擴(kuò)散范圍，為制定針對(duì)性的防控措施提供數(shù)據(jù)支持。加強(qiáng)對(duì)邊境地區(qū)人員流動(dòng)的監(jiān)測(cè)和管理，對(duì)從瘧疾高發(fā)地區(qū)返回的人員進(jìn)行瘧原蟲(chóng)檢測(cè)和抗藥性篩查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和隔離感染抗性瘧原蟲(chóng)的患者，防止抗性瘧原蟲(chóng)的進(jìn)一步傳播。根據(jù)抗性機(jī)制研究結(jié)果，研發(fā)新的抗瘧藥物或改進(jìn)現(xiàn)有藥物的配方，也是防控瘧疾的重要策略之一。這有助于有效控制瘧疾的傳播和流行，保障云南地區(qū)乃至全球的公共衛(wèi)生安全。6.3未來(lái)研究方向未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討抗性克隆株在云南地區(qū)的傳播規(guī)律。通過(guò)對(duì)云南不同地區(qū)，尤其是邊境地區(qū)瘧原蟲(chóng)樣本的大規(guī)模采集和分析，利用分子流行病學(xué)方法，如多位點(diǎn)序列分型（MLST）技術(shù)，追蹤抗性克隆株的傳播路徑和擴(kuò)散范圍。研究抗性克隆株在不同人群中的傳播差異，包括本地居民、跨境務(wù)工人員、旅游者等，分析影響傳播的因素，如人口流動(dòng)模式、蚊蟲(chóng)密度、氣候條件等，為制定針對(duì)性的防控措施提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。在抗瘧藥物研發(fā)方面，基于對(duì)云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性機(jī)制的研究成果，開(kāi)展新型抗瘧藥物的研發(fā)工作。利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，針對(duì)抗性相關(guān)的靶點(diǎn)，如Kelch13蛋白、PfMDR1蛋白等，設(shè)計(jì)和篩選能夠克服抗性的新型化合物。通過(guò)高通量藥物篩選技術(shù)，從大量的化合物庫(kù)中篩選出具有潛在抗瘧活性的藥物分子，然后進(jìn)行活性驗(yàn)證和優(yōu)化。探索聯(lián)合用藥的新方案，將新型抗瘧藥物與現(xiàn)有的青蒿素類(lèi)藥物或其他抗瘧藥物聯(lián)合使用，研究藥物之間的協(xié)同作用機(jī)制，提高治療效果，延緩抗性的產(chǎn)生。為了更好地指導(dǎo)臨床治療，需要進(jìn)一步優(yōu)化治療方案。根據(jù)抗性克隆株的生物學(xué)特性和抗性機(jī)制，制定個(gè)性化的治療策略。對(duì)于感染不同抗性水平瘧原蟲(chóng)的患者，采用不同的藥物劑量、療程和聯(lián)合用藥方案。通過(guò)臨床研究，評(píng)估不同治療方案的療效和安全性，不斷優(yōu)化治療方案，提高瘧疾的治愈率。加強(qiáng)對(duì)臨床治療過(guò)程的監(jiān)測(cè)和管理，建立完善的瘧疾治療監(jiān)測(cè)體系，及時(shí)收集和分析患者的治療反應(yīng)、藥物不良反應(yīng)等信息，為治療方案的調(diào)整提供依據(jù)。未來(lái)還可以加強(qiáng)國(guó)際合作，與其他瘧疾高發(fā)國(guó)家和地區(qū)共同開(kāi)展抗瘧研究。分享云南地區(qū)在惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株篩選和研究方面的經(jīng)驗(yàn)和成果，共同應(yīng)對(duì)全球瘧疾防控面臨的挑戰(zhàn)。通過(guò)國(guó)際合作，整合資源，開(kāi)展大規(guī)模的聯(lián)合研究項(xiàng)目，深入探究瘧原蟲(chóng)抗藥性的全球傳播規(guī)律和防治策略，為實(shí)現(xiàn)全球瘧疾消除目標(biāo)做出貢獻(xiàn)。七、結(jié)論7.1研究工作回顧本研究圍繞云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株的篩選展開(kāi)，旨在深入探究惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的抗性機(jī)制，為瘧疾防治提供科學(xué)依據(jù)。在研究過(guò)程中，全面梳理了云南惡性瘧原蟲(chóng)的特點(diǎn)、雙氫青蒿素的抗瘧原理以及抗性問(wèn)題的現(xiàn)狀和影響。云南獨(dú)特的地理和氣候條件，使其成為瘧疾高發(fā)地區(qū)，惡性瘧原蟲(chóng)在該地區(qū)呈現(xiàn)出基因多樣性豐富、致病性強(qiáng)等特點(diǎn)。雙氫青蒿素作為青蒿素的重要衍生物，通過(guò)激活過(guò)氧橋產(chǎn)生自由基、干擾血紅素代謝等方式發(fā)揮抗瘧作用，在瘧疾治療中占據(jù)關(guān)鍵地位。然而，近年來(lái)惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的抗性問(wèn)題日益嚴(yán)重，給瘧疾治療和防控帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。在篩選方法研究方面，對(duì)雙氫青蒿素體外篩選法、動(dòng)物模型篩選法和單細(xì)胞克隆法進(jìn)行了深入探討。雙氫青蒿素體外篩選法通過(guò)在體外培養(yǎng)瘧原蟲(chóng)并添加不同濃度的雙氫青蒿素，觀察瘧原蟲(chóng)的敏感性變化，具有操作簡(jiǎn)便、周期短等優(yōu)點(diǎn)，但存在藥物濃度選取困難和體外環(huán)境與人體差異等局限性。動(dòng)物模型篩選法利用小鼠或大鼠建立惡性瘧模型，通過(guò)藥物濃度遞增篩選抗藥株系，能夠模擬真實(shí)環(huán)境下瘧原蟲(chóng)與藥物的相互作用，但存在時(shí)間成本高、動(dòng)物與人體生態(tài)差異和倫理問(wèn)題等不足。單細(xì)胞克隆法基于細(xì)胞全能性原理，將單細(xì)胞分離培養(yǎng)形成克隆，可同時(shí)獲得多個(gè)抗性系信息并與感受性系直接比較，為深入研究抗性機(jī)制提供了有力工具。在篩選實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，從云南瘧疾高發(fā)地區(qū)采集惡性瘧原蟲(chóng)樣本，準(zhǔn)備了雙氫青蒿素、RPMI1640培養(yǎng)基等實(shí)驗(yàn)材料和CO?培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡等實(shí)驗(yàn)儀器。采用Trager瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)法對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素蟲(chóng)株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，在瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)至適宜感染率后，利用5%D-山梨醇進(jìn)行同步化處理。采用有限稀釋法對(duì)正在培養(yǎng)的惡性瘧原蟲(chóng)抗性株進(jìn)行四次稀釋、一步處理，將最后稀釋濃度的含蟲(chóng)血加樣于96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行體外克隆。采用體外微量測(cè)定法，基于瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶活性檢測(cè)，對(duì)所得克隆蟲(chóng)株的雙氫青蒿素、青蒿素、氯喹的體外藥物敏感性等生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，成功篩選出兩株惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素克隆蟲(chóng)株。對(duì)篩選出的抗性克隆株進(jìn)行了深入的抗性機(jī)制分析。發(fā)現(xiàn)藥物泵表達(dá)量的增加，如多藥耐藥蛋白1（PfMDR1），增強(qiáng)了雙氫青蒿素的外排能力；代謝酶活性的改變，如細(xì)胞色素P450酶系和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，影響了雙氫青蒿素的代謝。藥物靶點(diǎn)突變也是抗性產(chǎn)生的重要原因，Kelch13基因的C580Y、R539T等突變以及PfATP6基因的A263E突變等，降低了藥物與靶點(diǎn)的親和力。DNA修復(fù)途徑、氧化還原平衡、泛素化途徑等因素也在抗性產(chǎn)生中發(fā)揮作用，環(huán)境因素如云南的氣候條件、邊境人員流動(dòng)等對(duì)瘧原蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生和傳播也有重要影響。7.2關(guān)鍵結(jié)論提煉本研究運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)和方法，成功篩選出云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株，這充分證明了所采用篩選方法的有效性。通過(guò)體外培養(yǎng)結(jié)合藥物篩選、單細(xì)胞克隆等技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地從復(fù)雜的瘧原蟲(chóng)群體中分離出具有穩(wěn)定抗性的克隆株。這些篩選方法不僅為抗性克隆株的獲取提供了可靠途徑，也為后續(xù)深入研究抗性機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在抗性機(jī)制研究方面，揭示了多種因素在惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素抗性產(chǎn)生中的作用，充分體現(xiàn)了抗性機(jī)制的復(fù)雜性。藥物泵表達(dá)量的增加、代謝酶活性的改變、藥物靶點(diǎn)突變以及DNA修復(fù)途徑、氧化還原平衡、泛素化途徑等多種因素相互交織，共同導(dǎo)致了瘧原蟲(chóng)對(duì)雙氫青蒿素的抗性。Kelch13基因和PfATP6基因等藥物靶點(diǎn)的突變，以及藥物泵PfMDR1表達(dá)量的變化，都在抗性產(chǎn)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這表明惡性瘧原蟲(chóng)的抗性機(jī)制是一個(gè)多因素、多層面的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，需要綜合考慮多個(gè)因素才能全面理解。本研究成果對(duì)瘧疾防治具有重要價(jià)值。篩選出的抗性克隆株為深入研究惡性瘧原蟲(chóng)的抗藥性機(jī)制提供了關(guān)鍵材料，有助于全面揭示抗藥性的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)新的抗瘧藥物和治療策略提供理論依據(jù)。明確抗性克隆株的生物學(xué)特性和對(duì)不同藥物的敏感性，能夠指導(dǎo)臨床合理用藥，優(yōu)化治療方案，提高瘧疾的治療效果。研究抗性克隆株在云南地區(qū)的傳播規(guī)律，為制定針對(duì)性的瘧疾防控策略提供了科學(xué)依據(jù)，有助于有效控制瘧疾的傳播和流行，保障公共衛(wèi)生安全。7.3研究不足與改進(jìn)建議在本研究中，存在樣本數(shù)量有限的問(wèn)題。由于云南地區(qū)瘧疾防控工作取得了顯著成效，惡性瘧原蟲(chóng)感染病例數(shù)量相對(duì)減少，導(dǎo)致獲取大量臨床樣本存在一定困難。本研究?jī)H篩選出兩株惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素克隆蟲(chóng)株，樣本數(shù)量相對(duì)較少。這可能會(huì)影響研究結(jié)果的普遍性和代表性，無(wú)法全面反映云南地區(qū)惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性的多樣性和復(fù)雜性。為了解決這一問(wèn)題，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本采集范圍，不僅要涵蓋云南的各個(gè)瘧疾流行區(qū)域，還應(yīng)加強(qiáng)與周邊國(guó)家瘧疾高發(fā)地區(qū)的合作，獲取更多的瘧原蟲(chóng)樣本。通過(guò)增加樣本數(shù)量，可以更全面地分析抗性克隆株的生物學(xué)特性和抗性機(jī)制，提高研究結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。研究方法的局限性也較為明顯。本研究主要采用了體外培養(yǎng)結(jié)合藥物篩選、單細(xì)胞克隆等方法，雖然這些方法在抗性克隆株的篩選和抗性機(jī)制研究中發(fā)揮了重要作用，但仍存在一定的局限性。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)環(huán)境與人體內(nèi)部環(huán)境存在差異，這可能導(dǎo)致篩選出的抗性克隆株與實(shí)際感染人體的抗性瘧原蟲(chóng)存在差異，影響研究結(jié)果的臨床應(yīng)用價(jià)值。在抗性機(jī)制研究方面，雖然采用了多種技術(shù)分析藥物泵、代謝酶、藥物靶點(diǎn)等因素的作用，但對(duì)于一些復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，如基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等，研究還不夠深入。為了改進(jìn)研究方法，未來(lái)可綜合運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)，如全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析、蛋白質(zhì)組分析和代謝組分析等，從多個(gè)層面全面解析抗性機(jī)制。結(jié)合基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9技術(shù)，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或編輯，驗(yàn)證其在抗性產(chǎn)生中的作用，進(jìn)一步深入探究抗性機(jī)制。利用類(lèi)器官技術(shù)或動(dòng)物模型，構(gòu)建更接近人體生理環(huán)境的研究體系，提高研究結(jié)果的臨床相關(guān)性。研究時(shí)間較短也是本研究的一個(gè)不足之處。瘧疾的傳播和抗藥性的發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期的動(dòng)態(tài)過(guò)程，而本研究的時(shí)間跨度相對(duì)較短，難以全面觀察和分析抗性克隆株在自然環(huán)境中的傳播規(guī)律和抗藥性的演變趨勢(shì)。為了彌補(bǔ)這一不足，后續(xù)應(yīng)開(kāi)展長(zhǎng)期的監(jiān)測(cè)研究，建立穩(wěn)定的監(jiān)測(cè)體系，對(duì)云南地區(qū)的惡性瘧原蟲(chóng)進(jìn)行持續(xù)的監(jiān)測(cè)和分析。定期采集瘧原蟲(chóng)樣本，檢測(cè)其抗藥性水平和生物學(xué)特性的變化，及時(shí)掌握抗性克隆株的傳播動(dòng)態(tài)。結(jié)合地理信息系統(tǒng)（GIS）技術(shù)，分析抗性克隆株的空間分布特征和傳播路徑，為制定長(zhǎng)期有效的瘧疾防控策略提供科學(xué)依據(jù)。八、參考文獻(xiàn)[1]WorldHealthOrganization.Worldmalariareport2018[R].Geneva:WorldHealthOrganization,2018.[2]MillerLH,BaruchDI,MarshK,etal.Thepathogenicbasisofmalaria[J].Nature,2002,415(6872):673-679.[3]李雪平，楊亞明，周紅寧。云南惡性瘧原蟲(chóng)雙氫青蒿素抗性克隆株的篩選[D].大理學(xué)院，2009.[4]蘇新專(zhuān)，湯林華。惡性瘧原蟲(chóng)的抗藥性[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)寄生蟲(chóng)病分冊(cè)，2005,32(1):1-5.[5]ArieyF,WitkowskiB,AmaratungaC,etal.Amolecularmarkerofartemisinin-resistantPlasmodiumfalciparummalaria[J].Nature,2014,505(7483):50-55.[6]DondorpAM,NostenF,YiP,etal.ArtemisininresistanceinPlasmodiumfalciparummalaria[J].NEnglJMed,2009,361(5):455-467.[7]高琪，周華云，李菊林，等。我國(guó)瘧疾流行現(xiàn)狀與防治對(duì)策[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2010,28(6):401-405.[8]鄭文凱，王勇，張?jiān)倥d，等。云南省瘧疾流行現(xiàn)狀與防治對(duì)策[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2011,11(8):917-919.[9]TragerW,JensenJB.Humanmalariaparasitesincontinuousculture[J].Science,1976,193(4254):673-675.[10]王春生，陳佩惠。瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)技術(shù)[J].寄生蟲(chóng)與醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，1999,6(2):116-122.[11]FidockDA,NomuraT,TalleyAK,etal.MutationsintheP-glycoproteinhomologuePfMDR1associatedwithreducedsensitivityofPlasmodiumfalciparumtoantifolate,antimalarialdrugs[J].MolMicrobiol,2000,35(6):1353-1363.[12]張斌，周水森，顧政誠(chéng)，等。惡性瘧原蟲(chóng)多藥耐藥基因1(pfmdr1)多態(tài)性與抗瘧藥敏感性關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2012,30(2):146-151.[13]陳佩惠。人體寄生蟲(chóng)學(xué)[M].6版。北京：人民衛(wèi)生出版社，2003:270-271.[14]劉慧，徐軍，王健，等。青蒿素類(lèi)藥物抗瘧作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2010,19(22):2055-2059.[15]周紅寧，湯林華，許國(guó)君，等。云南惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)青蒿琥酯和氯喹的體外敏感性研究[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2002,20(1):17-20.[16]楊亞明，周紅寧，湯林華，等。云南惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)青蒿素和蒿甲醚的體外敏感性[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2001,19(6):330-332.[17]李雪平，楊亞明，周紅寧，等。云南惡性瘧原蟲(chóng)抗雙氫青蒿素克隆蟲(chóng)株的生物學(xué)特性[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2009,27(6):533-537.[18]蘇新專(zhuān)，湯林華。惡性瘧原蟲(chóng)抗藥性的分子機(jī)制[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2005,23(1):47-52.[19]ArieyF,DjimdeAA,DuruV,etal.Spreadofartemisinin-resistantPlasmodiumfalciparuminAfrica:arealthreat?[J].LancetInfectDis,2015,15(3):358-367.[20]ImwongM,NairzJ,KrettliAU,etal.Multidrug-resistantPlasmodiumfalciparummalariaintheBrazilianAmazon[J].EmergInfectDis,2010,16(11):1726-1733.[21]鄭文凱，王勇，張?jiān)倥d，等。云南省瘧疾流行現(xiàn)狀與防治對(duì)策[J].中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