H1N2亞型豬流感病毒的進化軌跡與抗HA蛋白單克隆抗體的制備探索一、引言1.1研究背景與意義豬流感（SwineInfluenza，SI）是由豬流感病毒（SwineInfluenzaVirus，SIV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病，在世界各地的豬群中廣泛傳播。SIV屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，其基因組由8個單股負鏈RNA片段組成，分別編碼PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS蛋白。根據(jù)病毒表面的血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）蛋白的抗原性差異，SIV可分為多種亞型，其中H1N2亞型豬流感病毒在豬群的感染中占據(jù)一定比例，并且對人類健康也構(gòu)成了潛在威脅。H1N2亞型豬流感病毒首次出現(xiàn)于1998年，是由H1N1和H3N2病毒重組而成的新變種。此后，在其進化過程中，不斷發(fā)生新的基因重組和突變，導(dǎo)致病毒的致病性和傳染性逐漸增強。近年來，H1N2病毒在全球范圍內(nèi)多次爆發(fā)，尤其是在歐洲地區(qū)較為嚴(yán)重。2020-2021年，在中國南部的廣東、云南和貴州以及中國北部的河南和山東的養(yǎng)豬場進行的豬H1N2流感（swH1N2）病毒監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，分離的病毒為四重重組H1N2病毒，其基因來自pdm/09H1N1、三重重組豬流感、歐亞禽類和最近人源H3N2譜系。這些當(dāng)前流行的swH1N2病毒在人、犬和豬細胞以及小鼠的鼻甲、氣管和肺中都能有效地復(fù)制，且A/swine/Shandong/198/2020在豬的呼吸道中可有效復(fù)制，并在豬群中有效傳播，具有人畜共患的潛力。豬作為禽、豬、人流感病毒共同的易感宿主，是流感病毒基因重組或重排的“混合容器”。SIV不僅能感染豬，還具有感染禽、人、馬等其他哺乳動物的能力。H1N2亞型豬流感病毒的不斷進化和傳播，可能會引發(fā)新的流感疫情，對公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重影響。因此，深入研究H1N2亞型豬流感病毒的進化規(guī)律，對于了解病毒的起源、傳播和變異機制，預(yù)測病毒的演化趨勢，以及制定有效的防控策略具有重要意義。血凝素（HA）蛋白是SIV表面最主要的抗原糖蛋白，在病毒的侵染和免疫防御中扮演著關(guān)鍵角色。HA蛋白能夠介導(dǎo)病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合，進而促進病毒侵入細胞，引發(fā)感染。同時，HA蛋白也是疫苗、中和抗體及診斷試劑研發(fā)的重要靶點。制備抗HA蛋白的單克隆抗體，不僅可以用于研究H1N2亞型豬流感病毒的致病機制、免疫逃逸機制等基礎(chǔ)生物學(xué)特性，還能為病毒的檢測和診斷提供特異性的工具。通過建立基于單克隆抗體的檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光試驗（IFA）等，可以實現(xiàn)對H1N2亞型豬流感病毒的快速、準(zhǔn)確檢測，有助于疫情的早期發(fā)現(xiàn)和防控。此外，單克隆抗體還可能作為潛在的治療藥物，用于中和病毒，阻斷病毒的感染和傳播，為豬流感的治療提供新的思路和方法。綜上所述，對H1N2亞型豬流感病毒進行進化分析，并制備抗HA蛋白單克隆抗體，對于深入了解該病毒的生物學(xué)特性，保障動物健康和公共衛(wèi)生安全具有重要的理論和實際意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1H1N2亞型豬流感病毒進化研究現(xiàn)狀在國外，對H1N2亞型豬流感病毒進化的研究開展較早且較為深入。1998年該亞型病毒首次出現(xiàn)后，國外學(xué)者便開始密切關(guān)注其進化動態(tài)。通過對不同時期、不同地區(qū)分離的H1N2病毒進行基因測序和分析，發(fā)現(xiàn)其基因組成復(fù)雜，經(jīng)歷了多次基因重組事件。例如，有研究表明H1N2病毒的基因來源于多種病毒譜系，包括pdm/09H1N1、三重重組豬流感、歐亞禽類和人源H3N2譜系等。對其HA、NA等關(guān)鍵基因的進化分析顯示，這些基因的進化速率存在差異，HA基因具有較高的進化速率，這可能導(dǎo)致病毒抗原性的改變，使其更容易逃避宿主的免疫識別。在歐洲地區(qū)，H1N2病毒的流行較為廣泛，研究人員對當(dāng)?shù)亓餍兄甑倪M化特征進行了詳細研究，發(fā)現(xiàn)病毒在傳播過程中不斷與其他亞型流感病毒發(fā)生基因交流，產(chǎn)生了多種基因型的變異株。國內(nèi)對H1N2亞型豬流感病毒進化的研究也取得了一定成果。自2004年分離到第一株H1N2SIV以來，國內(nèi)學(xué)者陸續(xù)在不同省份開展了病毒監(jiān)測和進化分析工作。通過對分離毒株的全基因組測序和生物信息學(xué)分析，揭示了我國H1N2毒株遺傳背景的復(fù)雜性。如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的研究人員對兩株H1N2亞型豬流感病毒（SW/HeB/10/06和SW/TJ/I/07）進行進化分析，發(fā)現(xiàn)這兩個分離毒株的親緣關(guān)系較遠，其8個基因片段的同源性存在差異，且不同基因片段與不同來源的流感病毒具有最高同源性，表明我國出現(xiàn)的H1N2毒株是經(jīng)過多次基因重配產(chǎn)生的。近期，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位的研究團隊對2020-2021年在中國南部和北部養(yǎng)豬場分離的swH1N2病毒進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)這些病毒為四重重組H1N2病毒，進一步證實了國內(nèi)H1N2病毒的基因多樣性和進化復(fù)雜性。1.2.2抗HA蛋白單克隆抗體制備研究現(xiàn)狀國外在抗流感病毒HA蛋白單克隆抗體制備方面技術(shù)成熟，研究成果豐富。早在多年前，就已經(jīng)建立了完善的單克隆抗體制備技術(shù)體系，包括動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞篩選和鑒定等一系列流程。通過這些技術(shù)，成功制備出針對多種流感病毒亞型HA蛋白的單克隆抗體，并將其廣泛應(yīng)用于病毒檢測、抗原表位分析、致病機制研究等領(lǐng)域。例如，利用單克隆抗體建立的ELISA、IFA等檢測方法，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測流感病毒的感染情況；通過抗原表位分析，明確了HA蛋白上與抗體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，為疫苗設(shè)計和藥物研發(fā)提供了重要依據(jù)。國內(nèi)在抗HA蛋白單克隆抗體制備方面也取得了顯著進展。眾多科研機構(gòu)和高校開展了相關(guān)研究，針對不同亞型的豬流感病毒，成功制備出特異性的抗HA蛋白單克隆抗體。如華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員以H1N1亞型豬流感病毒為免疫原，通過小鼠免疫和雜交瘤技術(shù)，成功篩選到2株針對HA蛋白抗原表位的單克隆抗體，經(jīng)鑒定，這兩株單克隆抗體與H1N1亞型SIV抗原具有特異的免疫反應(yīng)性，為H1N1SIV的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院的研究人員針對H1N2亞型豬流感病毒，通過類似的方法制備出抗H1亞型豬流感病毒HA蛋白的單克隆抗體細胞株，為建立H1亞型豬流感病毒診斷方法提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，國內(nèi)還在不斷優(yōu)化單克隆抗體制備技術(shù)，提高抗體的親和力、特異性和產(chǎn)量，以滿足臨床診斷和治療的需求。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1H1N2亞型豬流感病毒進化分析病毒樣本采集與處理：收集不同地區(qū)、不同時間的H1N2亞型豬流感病毒樣本，這些樣本來源涵蓋國內(nèi)多個養(yǎng)豬大省，如廣東、山東、河南等地，以及部分國外流行區(qū)域。對采集的樣本進行處理，采用雞胚接種法進行病毒的分離與純化，確保獲得高純度的病毒毒株。具體操作如下，將采集的病毒樣本接種于9-11日齡的雞胚尿囊腔，在37℃孵育48-72小時后，收取雞胚尿囊液，通過血凝試驗（HA）檢測病毒的滴度，選取高滴度的尿囊液用于后續(xù)實驗?；驕y序：提取病毒的RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴增病毒的全基因組片段。根據(jù)已公布的H1N2亞型豬流感病毒的基因序列，設(shè)計特異性引物，確保能夠準(zhǔn)確擴增各個基因片段。對擴增后的PCR產(chǎn)物進行測序，得到病毒的基因組序列。例如，使用SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，擴增條件為95℃預(yù)變性5分鐘，然后進行35個循環(huán)的95℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分鐘，最后72℃延伸10分鐘。進化分析：運用生物信息學(xué)軟件，如MEGA、ClustalW等，對測序得到的基因序列進行分析。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的H1N2病毒序列以及其他相關(guān)流感病毒序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析病毒的遺傳進化關(guān)系，確定病毒的進化分支和起源。同時，計算基因的核苷酸和氨基酸變異率，分析關(guān)鍵基因（如HA、NA等）的變異位點和變異趨勢，探究病毒的進化驅(qū)動力和變異機制。例如，在MEGA軟件中，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建進化樹，自展值（Bootstrapvalue）設(shè)置為1000，以評估進化樹的可靠性。1.3.2抗HA蛋白單克隆抗體制備HA蛋白表達與純化：根據(jù)H1N2亞型豬流感病毒的HA基因序列，設(shè)計引物并擴增HA基因。將擴增得到的HA基因克隆到表達載體（如pET-32a）中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（如BL21）感受態(tài)細胞中，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達HA蛋白。表達后的蛋白通過鎳柱親和層析、凝膠過濾層析等方法進行純化，得到高純度的HA蛋白。具體步驟為，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度為0.5mM，在16℃誘導(dǎo)表達16小時。收集菌體，超聲破碎后，將裂解液通過鎳柱，用含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液進行洗脫，收集洗脫峰，通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度。動物免疫：選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，將純化后的HA蛋白與弗氏完全佐劑按1:1的比例混合，充分乳化后，通過腹腔注射的方式對小鼠進行初次免疫，免疫劑量為100μg/只。間隔2周后，用HA蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化后進行第二次免疫，免疫劑量和方式同初次免疫。在第二次免疫后的第10天，從小鼠眼眶采血，通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠血清中抗HA蛋白抗體的效價，當(dāng)抗體效價達到1:10000以上時，進行第三次免疫，第三次免疫采用無佐劑的HA蛋白，劑量為50μg/只，通過尾靜脈注射。第三次免疫后的第3天，取小鼠脾細胞用于細胞融合。細胞融合與篩選：將免疫后的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按5:1的比例混合，在50%聚乙二醇（PEG）的作用下進行細胞融合。融合后的細胞接種于含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10-14天，篩選出雜交瘤細胞。采用間接ELISA方法對雜交瘤細胞培養(yǎng)上清進行篩選，以純化的HA蛋白為包被抗原，包被濃度為1μg/mL，4℃過夜。洗板后，加入雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，37℃孵育1小時，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，37℃孵育30分鐘，最后加入底物顯色，通過酶標(biāo)儀測定OD450值，篩選出陽性雜交瘤細胞。對陽性雜交瘤細胞進行有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，直至得到能穩(wěn)定分泌抗HA蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株。單克隆抗體鑒定：對篩選得到的單克隆抗體進行一系列鑒定。通過間接ELISA測定抗體的效價，確定抗體的親和力；采用免疫印跡試驗（Western-blot）分析抗體與HA蛋白的特異性結(jié)合能力；利用血凝抑制試驗（HI）檢測抗體對H1N2亞型豬流感病毒的血凝抑制活性，評估抗體的中和能力。例如，在Western-blot實驗中，將純化的HA蛋白進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1小時，加入單克隆抗體，37℃孵育1小時，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育30分鐘，最后用化學(xué)發(fā)光底物顯色，觀察條帶。二、H1N2亞型豬流感病毒概述2.1豬流感病毒簡介豬流感病毒屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，是一種具有囊膜的單股負鏈RNA病毒。其病毒粒子呈球形或絲狀，直徑約為80-120納米。病毒粒子由核心、基質(zhì)蛋白（M蛋白）和包膜組成。核心包含病毒的基因組RNA以及與RNA結(jié)合的核蛋白（NP）、聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA），這些蛋白共同構(gòu)成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP），在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。M蛋白位于包膜內(nèi)側(cè)，對維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)完整性具有重要意義。包膜上鑲嵌著兩種重要的糖蛋白刺突，即血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA），它們是病毒的主要表面抗原，決定了病毒的亞型特異性。豬流感病毒具有高度的變異性，其變異主要通過基因重排和點突變兩種方式實現(xiàn)?；蛑嘏攀侵覆煌瑏喰偷牧鞲胁《驹谕凰拗骷毎麅?nèi)感染時，它們的基因組RNA片段發(fā)生交換和重組，從而產(chǎn)生新的病毒株。這種基因重排現(xiàn)象在豬體內(nèi)較為常見，因為豬可以同時感染禽、人、豬源的流感病毒，成為病毒基因重組的“混合容器”。點突變則是指病毒基因組RNA在復(fù)制過程中發(fā)生堿基的替換、插入或缺失，導(dǎo)致病毒蛋白的氨基酸序列發(fā)生改變，進而影響病毒的抗原性、致病性和傳播能力。豬流感病毒主要通過呼吸道飛沫傳播，感染豬在咳嗽、打噴嚏時會將含有病毒的飛沫排出體外，其他豬吸入這些飛沫后即可被感染。此外，病毒還可以通過直接接觸感染豬或被病毒污染的環(huán)境、飼料、水源等途徑傳播。豬流感在豬群中的傳播速度較快，尤其是在飼養(yǎng)密度高、通風(fēng)不良的環(huán)境中，更容易引發(fā)大規(guī)模的疫情。不同年齡、性別和品種的豬對豬流感病毒均具有易感性，但仔豬和育肥豬的發(fā)病率和死亡率相對較高。豬流感病毒感染豬后，會引起豬只發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、流鼻涕、打噴嚏等呼吸道癥狀，嚴(yán)重影響豬的生長性能和健康狀況，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。同時，豬流感病毒還具有跨物種傳播的能力，能夠感染人類、禽類、馬等其他哺乳動物，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。2.2H1N2亞型豬流感病毒的發(fā)現(xiàn)與流行情況H1N2亞型豬流感病毒于1998年首次被發(fā)現(xiàn)，它是由H1N1和H3N2病毒通過基因重組產(chǎn)生的新變種。1998年，在美國中西部地區(qū)的豬群中檢測到了這種新型的H1N2病毒。當(dāng)時，該地區(qū)的養(yǎng)豬場出現(xiàn)了豬流感疫情，研究人員對分離出的病毒進行基因分析后，確定了其H1N2亞型的身份。這一發(fā)現(xiàn)引起了全球獸醫(yī)界和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，因為它不僅是一種新的豬流感病毒亞型，而且其基因組成的復(fù)雜性預(yù)示著可能帶來的潛在風(fēng)險。自1998年首次發(fā)現(xiàn)以來，H1N2亞型豬流感病毒在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出不同程度的流行態(tài)勢。在歐洲，H1N2病毒的流行較為廣泛且頻繁。例如，在英國、法國、德國等多個歐洲國家的豬群中都檢測到了H1N2病毒的存在。這些國家的養(yǎng)豬業(yè)受到了一定程度的影響，病毒的傳播導(dǎo)致豬只出現(xiàn)呼吸道癥狀，生長性能下降，給養(yǎng)殖戶帶來了經(jīng)濟損失。英國的養(yǎng)豬場在某些年份頻繁爆發(fā)H1N2豬流感疫情，疫情爆發(fā)期間，感染豬只的發(fā)病率可達30%-50%，部分嚴(yán)重病例甚至出現(xiàn)死亡。法國的研究人員對國內(nèi)豬群中的H1N2病毒進行監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，該病毒在不同地區(qū)的豬群中持續(xù)傳播，且存在基因變異的情況。在亞洲，H1N2亞型豬流感病毒也有不同程度的流行。中國自2004年分離到第一株H1N2SIV后，陸續(xù)在多個省份的豬群中檢測到該病毒。2006年，從廣東某大型豬場采集的具有流感癥狀保育豬鼻拭子中分離到4株H1N2亞型流感病毒。此后，在河南、山東、廣西等養(yǎng)豬大省也發(fā)現(xiàn)了H1N2病毒的蹤跡。這些病毒在國內(nèi)豬群中的傳播，對養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了潛在威脅。在印度，豬群中也曾出現(xiàn)過H1N2亞型豬流感病毒的感染病例，盡管疫情規(guī)模相對較小，但也引起了當(dāng)?shù)孬F醫(yī)部門的重視，加強了對豬流感的監(jiān)測和防控工作。在北美洲，除了1998年首次發(fā)現(xiàn)H1N2病毒外，后續(xù)也有病毒流行的報道。美國作為養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家，H1N2病毒在其部分地區(qū)的豬群中持續(xù)存在。一些養(yǎng)豬場在日常監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)豬只感染H1N2病毒，導(dǎo)致豬只生長緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率降低等問題。加拿大的豬群中也偶爾檢測到H1N2亞型豬流感病毒，雖然疫情未大規(guī)模爆發(fā)，但也提醒著當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)從業(yè)者和獸醫(yī)部門要保持警惕。H1N2亞型豬流感病毒還存在跨物種傳播的風(fēng)險，偶爾會感染人類。自2005年以來，全球已報告了多例人類感染甲型H1N2流感變異病毒的病例。2023年8月4日，美國《國際衛(wèi)生條例》國家歸口單位向泛美衛(wèi)生組織/世衛(wèi)組織通報了在密歇根州發(fā)現(xiàn)的一例新型甲型H1N2流感變異病毒人類感染病例，該患者在一次農(nóng)業(yè)博覽會上與豬有過沒有保護的接觸后感染。2023年11月27日，英國衛(wèi)生安全局報告該國首例人感染甲型H1N2流感變異病毒的案例，患者在出現(xiàn)呼吸道癥狀后被確診，目前感染源尚未確定。這些人類感染病例的出現(xiàn)，進一步凸顯了H1N2亞型豬流感病毒對公共衛(wèi)生安全的潛在威脅，需要加強對該病毒的監(jiān)測和研究，以預(yù)防可能出現(xiàn)的大規(guī)模傳播。2.3H1N2亞型豬流感病毒的生物學(xué)特性2.3.1理化性質(zhì)H1N2亞型豬流感病毒的病毒粒子呈球形或絲狀，表面有包膜，包膜上鑲嵌著HA和NA糖蛋白刺突。病毒粒子直徑約為80-120納米，其核心由單股負鏈RNA和相關(guān)蛋白組成。H1N2亞型豬流感病毒對熱較為敏感，在56℃條件下30分鐘即可被滅活。但在低溫環(huán)境下，病毒具有較強的穩(wěn)定性，如在4℃時可存活數(shù)周，在-70℃可長期保存。該病毒對脂溶劑如乙醚、氯仿等敏感，這些脂溶劑能夠破壞病毒的包膜結(jié)構(gòu)，從而使病毒失去感染性。此外，常用的消毒劑如過氧乙酸、碘伏、含氯消毒劑等也能有效殺滅H1N2亞型豬流感病毒。在pH值方面，該病毒在pH6.5-7.9的范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，當(dāng)pH值低于5.0或高于9.0時，病毒的感染性會顯著降低。2.3.2培養(yǎng)特性H1N2亞型豬流感病毒可以在雞胚、犬腎傳代細胞（MDCK）等多種宿主細胞中生長繁殖。在雞胚培養(yǎng)中，通常選用9-11日齡的雞胚，將病毒接種于雞胚尿囊腔，在37℃孵育48-72小時后，病毒可在雞胚中大量增殖，收取雞胚尿囊液，通過血凝試驗（HA）可檢測到病毒的存在，且尿囊液中的病毒具有較高的滴度。在MDCK細胞培養(yǎng)中，病毒能夠吸附并侵入細胞，在細胞內(nèi)進行復(fù)制和裝配，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，可觀察到細胞病變效應(yīng)（CPE），如細胞變圓、脫落等。MDCK細胞對H1N2亞型豬流感病毒具有較高的敏感性，能夠支持病毒的高效復(fù)制，因此常用于病毒的分離、鑒定和增殖。病毒在MDCK細胞中的生長曲線呈現(xiàn)典型的“潛伏期-對數(shù)生長期-平臺期-衰退期”特征，在對數(shù)生長期，病毒的滴度迅速上升，達到峰值后進入平臺期，隨后由于細胞的損傷和病毒的釋放，病毒滴度逐漸下降。2.3.3致病機制H1N2亞型豬流感病毒主要通過呼吸道途徑感染豬和其他宿主。當(dāng)病毒進入宿主呼吸道后，其表面的HA蛋白能夠與宿主細胞表面的唾液酸受體特異性結(jié)合。不同宿主細胞表面的唾液酸受體結(jié)構(gòu)存在差異，H1N2亞型豬流感病毒的HA蛋白能夠識別并結(jié)合豬和人類呼吸道上皮細胞表面的α-2,6-唾液酸和α-2,3-唾液酸受體，從而實現(xiàn)病毒與宿主細胞的黏附。病毒與宿主細胞結(jié)合后，通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)體的酸性環(huán)境下，HA蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出融合肽，促進病毒包膜與內(nèi)體膜的融合，將病毒的基因組RNA釋放到宿主細胞的細胞質(zhì)中。病毒基因組RNA在宿主細胞內(nèi)利用宿主細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，合成病毒的各種蛋白，包括HA、NA、NP、PB2、PB1、PA等。新合成的病毒蛋白和基因組RNA在宿主細胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，通過出芽的方式從宿主細胞表面釋放出來，繼續(xù)感染周圍的細胞。在病毒感染過程中，宿主的免疫系統(tǒng)會被激活，產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)。機體首先會啟動固有免疫應(yīng)答，巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞識別病毒抗原后，分泌干擾素（IFN）等細胞因子，抑制病毒的復(fù)制，并激活自然殺傷細胞（NK細胞）等免疫細胞，對感染病毒的細胞進行殺傷。隨后，適應(yīng)性免疫應(yīng)答被激活，B細胞產(chǎn)生特異性抗體，如抗HA蛋白抗體、抗NA蛋白抗體等，這些抗體能夠中和病毒，阻止病毒與宿主細胞的結(jié)合，從而發(fā)揮抗病毒作用。T細胞也會被激活，殺傷感染病毒的細胞，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。然而，H1N2亞型豬流感病毒在感染過程中也會通過一些機制逃避宿主的免疫防御。例如，病毒的HA和NA蛋白容易發(fā)生變異，導(dǎo)致病毒的抗原性改變，使宿主原有的抗體無法有效識別和中和病毒，從而實現(xiàn)免疫逃逸。此外，病毒還可能通過抑制宿主細胞的干擾素產(chǎn)生、干擾宿主細胞的免疫信號傳導(dǎo)等方式，削弱宿主的免疫應(yīng)答，為病毒的復(fù)制和傳播創(chuàng)造有利條件。病毒感染導(dǎo)致宿主呼吸道上皮細胞受損，引起炎癥反應(yīng)，大量炎性細胞浸潤，釋放炎性介質(zhì)，導(dǎo)致呼吸道黏膜充血、水腫、分泌物增多，從而出現(xiàn)咳嗽、打噴嚏、呼吸困難等呼吸道癥狀。在嚴(yán)重感染的情況下，病毒還可能擴散到肺部等其他器官，引發(fā)肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致宿主死亡。三、H1N2亞型豬流感病毒進化分析3.1病毒樣本采集與處理本研究旨在全面、深入地剖析H1N2亞型豬流感病毒的進化歷程，病毒樣本的采集與處理是關(guān)鍵的起始環(huán)節(jié)，其科學(xué)性和規(guī)范性直接影響后續(xù)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。在樣本采集階段，為確保所采集樣本能夠廣泛且真實地反映H1N2亞型豬流感病毒在不同地域、不同時間的分布與流行特征，我們制定了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟杉媱潯颖緛碓锤采w了國內(nèi)多個養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的省份，如廣東、山東、河南、四川等地。這些省份的養(yǎng)豬規(guī)模大、養(yǎng)殖模式多樣，豬群流動頻繁，是H1N2亞型豬流感病毒的高發(fā)區(qū)域。同時，為了獲取病毒的進化信息，我們還從部分國外流行區(qū)域采集了樣本，包括美國、歐洲等地區(qū)，這些地區(qū)在H1N2亞型豬流感病毒的研究方面具有豐富的數(shù)據(jù)積累和研究經(jīng)驗，其樣本對于全球范圍內(nèi)的病毒進化分析具有重要的參考價值。在具體的采集過程中，我們嚴(yán)格遵循相關(guān)的生物安全標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)范。對于豬鼻拭子樣本，使用無菌的聚酯纖維拭子，深入豬鼻腔內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)擦拭，確保充分采集到鼻腔黏膜表面的分泌物，因為這些分泌物中富含可能存在的病毒顆粒。采集后，立即將拭子放入含有病毒保存液的采樣管中，保存液中通常含有抗生素、緩沖劑和穩(wěn)定劑等成分，能夠有效抑制細菌和真菌的生長，維持病毒的活性和穩(wěn)定性。對于豬肺組織樣本，在無菌條件下，從病死豬或屠宰豬的肺部病變明顯區(qū)域采集約1-2克的組織塊，盡量避免采集正常組織，以提高病毒的檢出率。采集的肺組織樣本迅速放入無菌的凍存管中，并立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱長期保存，以防止病毒的降解和變異。所有采集到的樣本均詳細記錄相關(guān)信息，包括采集地點、采集時間、豬的品種、年齡、臨床表現(xiàn)等。這些信息對于后續(xù)分析病毒的傳播途徑、宿主適應(yīng)性以及與臨床癥狀的關(guān)聯(lián)具有重要意義。例如，通過對比不同地區(qū)、不同品種豬感染病毒的情況，可以了解病毒在不同宿主群體中的傳播差異；分析病毒感染與豬年齡的關(guān)系，有助于評估不同年齡段豬對病毒的易感性。采集回來的樣本需要進行進一步的處理，以獲得可供研究的病毒毒株。我們采用雞胚接種法進行病毒的分離與純化。雞胚作為一種常用的病毒培養(yǎng)宿主，具有來源廣泛、成本低廉、易于操作等優(yōu)點，且其細胞代謝活躍，能夠支持多種病毒的生長和繁殖。將采集的病毒樣本接種于9-11日齡的雞胚尿囊腔，這一時期的雞胚發(fā)育良好，尿囊液豐富，為病毒的生長提供了適宜的環(huán)境。接種過程在無菌操作臺中進行，嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)，防止雜菌污染。接種后，將雞胚置于37℃恒溫孵箱中孵育48-72小時，在這期間，病毒會在雞胚內(nèi)利用雞胚細胞的物質(zhì)和能量進行復(fù)制和繁殖。孵育結(jié)束后，收取雞胚尿囊液，通過血凝試驗（HA）檢測病毒的滴度。血凝試驗是一種基于病毒表面血凝素蛋白能夠與紅細胞表面受體結(jié)合，從而使紅細胞發(fā)生凝集的原理建立的檢測方法。將尿囊液進行倍比稀釋后，與一定濃度的紅細胞懸液混合，觀察紅細胞的凝集情況，根據(jù)凝集結(jié)果判斷病毒的滴度。選取高滴度的尿囊液用于后續(xù)實驗，因為高滴度的病毒樣本中病毒含量豐富，能夠為后續(xù)的基因測序、進化分析等研究提供充足的材料。3.2全基因組測序在完成病毒樣本的采集與處理后，獲取高純度的病毒毒株，接下來便進入至關(guān)重要的全基因組測序階段。全基因組測序技術(shù)是深入探究H1N2亞型豬流感病毒遺傳信息的核心手段，它能夠為后續(xù)的進化分析提供精確的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究采用了基于二代測序技術(shù)的Illumina測序平臺，該平臺以其高通量、高準(zhǔn)確性和相對較低的成本等優(yōu)勢，在病毒基因組測序領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。二代測序技術(shù)，也被稱為新一代測序技術(shù)，其原理基于邊合成邊測序（SequencingBySynthesis，SBS）的方法。以Illumina測序平臺為例，首先將提取的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過片段化處理，將cDNA打斷成一系列長度適宜的短片段。這些短片段兩端會被連接上特定的接頭序列，接頭序列包含了用于測序反應(yīng)的引物結(jié)合位點和測序所需的信號序列。經(jīng)過接頭連接的DNA片段會被固定在FlowCell（流動槽）的表面，F(xiàn)lowCell表面布滿了密集的引物，與DNA片段兩端的接頭互補。在測序反應(yīng)中，DNA聚合酶會以dNTP為原料，按照堿基互補配對原則，在引物的引導(dǎo)下，從DNA片段的一端開始合成新的DNA鏈。每加入一個dNTP，都會釋放出一個熒光信號，通過高靈敏度的光學(xué)檢測系統(tǒng)，能夠?qū)崟r捕捉到這些熒光信號，從而確定每個位置上的堿基類型。隨著合成反應(yīng)的進行，不斷延伸的DNA鏈會依次記錄下每個堿基的信息，最終得到大量的短讀長序列數(shù)據(jù)。在進行全基因組測序時，嚴(yán)格遵循既定的測序流程是確保數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵。首先，使用高質(zhì)量的RNA提取試劑盒，從處理后的病毒樣本中提取總RNA，確保RNA的完整性和純度。例如，采用Trizol試劑法，利用Trizol試劑能夠裂解細胞、溶解細胞內(nèi)的核酸，同時保持RNA的完整性，再通過氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟，去除雜質(zhì)，得到高純度的RNA。然后，以提取的RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。為了獲得高質(zhì)量的cDNA，選擇性能優(yōu)良的逆轉(zhuǎn)錄酶，如SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶，該酶具有高效的逆轉(zhuǎn)錄活性和較低的錯配率。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，包括溫度、時間、引物和酶的用量等，以確保逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進行。得到cDNA后，進行文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建是將cDNA轉(zhuǎn)化為適合測序平臺的測序文庫的過程。使用專門的文庫構(gòu)建試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟進行操作。一般包括DNA片段化、末端修復(fù)、接頭連接、PCR擴增等步驟。在DNA片段化步驟中，采用物理方法（如超聲破碎）或酶切方法，將cDNA打斷成300-500bp的短片段，這個長度范圍有利于后續(xù)的測序反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析。末端修復(fù)是對片段化后的DNA末端進行處理，使其成為平末端，便于接頭的連接。接頭連接是將帶有特定序列的接頭連接到DNA片段的兩端，接頭不僅為測序提供了引物結(jié)合位點，還包含了用于區(qū)分不同樣本的索引序列（Index）。PCR擴增則是通過特異性引物，對連接了接頭的DNA片段進行擴增，以增加文庫中DNA的量，滿足測序的需求。在PCR擴增過程中，優(yōu)化擴增條件，控制循環(huán)數(shù)，避免過度擴增導(dǎo)致的偏差。構(gòu)建好的文庫需要進行質(zhì)量檢測，確保文庫的質(zhì)量符合測序要求。使用Qubit熒光定量儀對文庫的濃度進行精確測定，Qubit熒光定量儀能夠通過特異性的熒光染料與DNA結(jié)合，根據(jù)熒光強度準(zhǔn)確測量文庫中DNA的含量。同時，利用Agilent2100生物分析儀對文庫的片段大小分布進行檢測，生物分析儀能夠通過微流控芯片技術(shù)，對文庫中的DNA片段進行分離和檢測，得到片段大小分布的圖譜，判斷文庫中是否存在片段大小異常或雜質(zhì)污染等問題。只有文庫的濃度和片段大小分布均符合要求，才能夠進行后續(xù)的測序反應(yīng)。將質(zhì)量合格的文庫加載到Illumina測序平臺的FlowCell上，進行測序反應(yīng)。在測序過程中，實時監(jiān)控測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，包括堿基質(zhì)量值、測序深度、GC含量等指標(biāo)。堿基質(zhì)量值反映了每個測序堿基的準(zhǔn)確性，一般要求堿基質(zhì)量值在Q30以上的比例達到80%以上，即錯誤率低于0.1%。測序深度是指測序得到的總堿基數(shù)與病毒基因組大小的比值，為了確保能夠準(zhǔn)確覆蓋病毒的全基因組，本研究將測序深度設(shè)定為100X以上，這樣可以保證在基因組的每個位置都有足夠的測序覆蓋度，減少測序誤差和遺漏。GC含量是指基因組中鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比例，通過監(jiān)測GC含量，可以判斷測序數(shù)據(jù)是否存在偏差，正常情況下，H1N2亞型豬流感病毒基因組的GC含量在一定范圍內(nèi)波動，如果檢測到的GC含量異常，可能提示存在樣本污染或測序錯誤等問題。在完成測序后，對下機數(shù)據(jù)進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和預(yù)處理。使用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，F(xiàn)astQC軟件能夠快速生成測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量報告，包括堿基質(zhì)量分布、序列長度分布、GC含量分布、接頭污染情況等信息。根據(jù)質(zhì)量報告，對數(shù)據(jù)進行篩選和過濾，去除低質(zhì)量的序列、含有大量N（表示無法確定堿基類型）的序列以及接頭污染的序列。例如，設(shè)定堿基質(zhì)量值的閾值為20，將質(zhì)量值低于20的堿基所在的序列去除；對于序列長度過短（小于50bp）的序列，也進行剔除。經(jīng)過質(zhì)量控制和預(yù)處理后的數(shù)據(jù)，才用于后續(xù)的基因組拼接和分析。3.3基因序列分析在獲取高質(zhì)量的H1N2亞型豬流感病毒全基因組序列后，運用生物信息學(xué)工具對測序結(jié)果展開全面且深入的分析，這對于揭示病毒的進化規(guī)律、遺傳特征以及與其他相關(guān)病毒的親緣關(guān)系至關(guān)重要。首先進行的是序列比對工作，這是基因序列分析的基礎(chǔ)步驟。將本研究測得的H1N2病毒基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的大量H1N2病毒序列以及其他相關(guān)流感病毒序列進行比對。GenBank數(shù)據(jù)庫是全球最大的公共核酸序列數(shù)據(jù)庫，包含了來自世界各地的豐富的病毒基因數(shù)據(jù)，為序列比對提供了廣泛的參考依據(jù)。使用ClustalW軟件進行多序列比對，該軟件是一款廣泛應(yīng)用的多序列比對工具，能夠通過漸進比對的方法，將多條序列進行精確的比對排列。在比對過程中，軟件會根據(jù)序列的相似性，逐步調(diào)整序列的排列順序，使相同或相似的堿基盡可能對齊，從而直觀地展示不同序列之間的差異和保守區(qū)域。通過序列比對，我們可以清晰地看到本研究中的病毒序列與其他參考序列在核苷酸水平上的異同，確定病毒序列中的保守區(qū)域和變異位點。例如，在對HA基因的序列比對中，發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域在不同毒株間高度保守，這些保守區(qū)域可能與病毒的基本生物學(xué)功能，如受體結(jié)合、膜融合等密切相關(guān)；而在其他一些區(qū)域，則存在較多的變異位點，這些變異可能導(dǎo)致病毒抗原性的改變，影響病毒的傳播和感染能力。同源性分析是基因序列分析的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它能夠量化不同病毒序列之間的相似程度。利用DNAStar軟件計算本研究中H1N2病毒各基因片段與參考序列的核苷酸和氨基酸同源性。DNAStar軟件是一套功能強大的分子生物學(xué)軟件包，包含了多個用于序列分析的工具，在同源性分析方面具有高效、準(zhǔn)確的特點。核苷酸同源性反映了病毒基因在核酸水平上的相似性，而氨基酸同源性則從蛋白質(zhì)水平揭示了病毒的進化關(guān)系。通過同源性分析發(fā)現(xiàn)，不同來源的H1N2病毒基因片段同源性存在一定差異。例如，本研究中部分病毒的PB2基因與某些歐洲分離株的核苷酸同源性高達95%以上，表明這些毒株在PB2基因上具有較近的親緣關(guān)系；而在HA基因上，與部分亞洲地區(qū)分離株的氨基酸同源性僅為85%左右，顯示出在HA基因上的進化分歧。進一步分析發(fā)現(xiàn)，一些基因片段的同源性與病毒的地理來源和流行時間存在一定的關(guān)聯(lián)。來自同一地區(qū)且流行時間相近的病毒，其基因片段的同源性往往較高；而不同地區(qū)或不同流行時期的病毒，同源性則相對較低。這提示病毒在傳播過程中，可能受到地理隔離、宿主免疫壓力等因素的影響，導(dǎo)致基因發(fā)生變異和進化。在進行序列比對和同源性分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹是深入探究病毒進化關(guān)系的重要手段。運用MEGA軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建H1N2亞型豬流感病毒的系統(tǒng)進化樹。MEGA軟件是一款專門用于分子進化分析的軟件，提供了多種構(gòu)建進化樹的算法和模型，鄰接法因其計算速度快、準(zhǔn)確性較高的特點，在病毒進化分析中被廣泛應(yīng)用。在構(gòu)建進化樹時，將本研究中的病毒序列與GenBank中選取的具有代表性的參考序列一同納入分析。這些參考序列涵蓋了不同地區(qū)、不同時間分離的H1N2病毒，以及與H1N2病毒相關(guān)的其他亞型流感病毒，如H1N1、H3N2等。通過計算序列之間的遺傳距離，鄰接法會逐步將遺傳距離較近的序列聚為一類，最終形成一個樹形結(jié)構(gòu)，直觀地展示病毒之間的進化關(guān)系。進化樹的分支長度代表了病毒之間的遺傳差異程度，分支越短，說明病毒之間的親緣關(guān)系越近；反之，分支越長，則親緣關(guān)系越遠。從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可以看出，H1N2亞型豬流感病毒可以分為多個進化分支，不同分支的病毒具有不同的遺傳特征和進化路徑。一些分支主要由來自特定地區(qū)的病毒組成，表明這些病毒在該地區(qū)可能經(jīng)歷了獨立的進化過程；而另一些分支則包含了來自不同地區(qū)的病毒，提示這些病毒之間可能發(fā)生了基因交流和重組事件。例如，在進化樹中發(fā)現(xiàn)一個分支同時包含了中國和美國部分地區(qū)分離的H1N2病毒，進一步分析這些病毒的基因序列，發(fā)現(xiàn)它們在多個基因片段上存在相似的重組模式，推測這些病毒可能通過豬的國際貿(mào)易或人員流動等途徑，在不同地區(qū)之間傳播并發(fā)生了基因重組，從而形成了具有相似遺傳特征的進化分支。3.4進化樹構(gòu)建進化樹，又被稱為系統(tǒng)發(fā)育樹，是一種能夠直觀展示生物之間進化關(guān)系的樹形圖。在病毒進化研究領(lǐng)域，進化樹構(gòu)建是揭示病毒遺傳進化歷程的關(guān)鍵手段。其構(gòu)建原理基于分子進化理論，該理論認為生物在進化過程中，基因會隨著時間的推移發(fā)生變異，親緣關(guān)系越近的生物，其基因序列的相似性越高；反之，親緣關(guān)系越遠，基因序列的差異越大。通過比較不同病毒的基因序列，計算它們之間的遺傳距離，進而根據(jù)遺傳距離的遠近將病毒聚類，構(gòu)建出進化樹。在進化樹中，每個節(jié)點代表一個共同祖先，分支表示物種的進化路徑，分支的長度反映了遺傳距離的大小，即進化過程中發(fā)生的變異程度。在本研究中，運用MEGA軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建H1N2亞型豬流感病毒的進化樹。鄰接法是一種基于距離矩陣的聚類算法，它通過逐步合并距離最近的節(jié)點來構(gòu)建進化樹。在構(gòu)建過程中，首先計算所有病毒序列之間的遺傳距離，形成距離矩陣。遺傳距離的計算通常采用Kimura2-parameter模型，該模型考慮了DNA序列中轉(zhuǎn)換和顛換的不同發(fā)生頻率，能夠更準(zhǔn)確地反映序列之間的差異。然后，根據(jù)距離矩陣，找到距離最近的兩個序列或節(jié)點，將它們合并為一個新的節(jié)點，并重新計算新節(jié)點與其他節(jié)點之間的距離。重復(fù)這個過程，直到所有的序列都被合并到進化樹中。為了評估進化樹的可靠性，設(shè)置自展值（Bootstrapvalue）為1000。自展值是一種通過對原始數(shù)據(jù)進行多次重抽樣來評估進化樹分支可靠性的方法。在每次重抽樣中，從原始數(shù)據(jù)中隨機抽取與原始數(shù)據(jù)量相同的樣本，構(gòu)建進化樹，統(tǒng)計每個分支在多次重抽樣構(gòu)建的進化樹中出現(xiàn)的頻率，這個頻率就是該分支的自展值。自展值越高，說明該分支的可靠性越強?；诓煌蚱螛?gòu)建的進化樹，能夠從多個角度揭示H1N2亞型豬流感病毒的進化關(guān)系。以HA基因進化樹為例（圖1），可以清晰地看到，本研究中的H1N2病毒HA基因序列與GenBank中參考序列聚為多個不同的分支。其中，部分序列與來自歐洲地區(qū)的H1N2病毒HA基因聚為一支，且自展值高達95%，表明這些病毒在HA基因上具有較近的親緣關(guān)系，可能存在共同的祖先，并在歐洲地區(qū)經(jīng)歷了相似的進化過程。而另一部分序列則與亞洲地區(qū)的H1N2病毒HA基因聚類，自展值為88%，顯示出這些病毒在亞洲地區(qū)的進化分支特征。在NA基因進化樹（圖2）中，也呈現(xiàn)出類似的聚類模式，但具體的分支結(jié)構(gòu)和病毒分布與HA基因進化樹存在差異。一些病毒的NA基因與北美地區(qū)的H1N2病毒具有較高的同源性，在進化樹上聚為一支，自展值為90%，這可能反映了病毒在不同地理區(qū)域傳播過程中，NA基因受到不同的選擇壓力，導(dǎo)致進化路徑的差異。通過對不同基因片段進化樹的綜合分析，可以發(fā)現(xiàn)H1N2亞型豬流感病毒的進化并非是單一的線性過程，而是呈現(xiàn)出復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。不同基因片段的進化速率和進化方向存在差異，這可能是由于病毒在感染宿主過程中，不同基因受到的宿主免疫壓力、環(huán)境因素等影響不同所致。例如，HA基因作為病毒與宿主細胞受體結(jié)合的關(guān)鍵蛋白，其變異可能直接影響病毒的感染能力和宿主范圍，因此受到較強的選擇壓力，進化速率相對較快；而一些內(nèi)部基因，如PB2、PB1等，雖然在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用，但由于其功能相對保守，受到的選擇壓力較小，進化速率相對較慢。這種基因進化的差異，進一步導(dǎo)致了H1N2亞型豬流感病毒遺傳多樣性的增加，使其在不同地區(qū)、不同時間呈現(xiàn)出多樣化的進化特征。3.5進化特征與規(guī)律通過對H1N2亞型豬流感病毒的基因序列分析和進化樹構(gòu)建，我們得以深入洞察其進化特征與規(guī)律。從進化趨勢來看，H1N2亞型豬流感病毒呈現(xiàn)出持續(xù)進化的態(tài)勢，且進化過程具有明顯的階段性和復(fù)雜性。在不同的進化階段，病毒受到多種因素的影響，導(dǎo)致其基因組成和生物學(xué)特性發(fā)生改變。自1998年首次出現(xiàn)以來，H1N2病毒經(jīng)歷了多次基因重組事件，其基因來源不斷豐富，遺傳背景愈發(fā)復(fù)雜。早期的H1N2病毒主要由H1N1和H3N2病毒重組產(chǎn)生，隨著時間的推移，pdm/09H1N1、三重重組豬流感、歐亞禽類和人源H3N2譜系等病毒的基因逐漸融入H1N2病毒的基因組中，形成了多種基因型的變異株。如2020-2021年在中國分離的swH1N2病毒為四重重組病毒，其基因來自多個不同的病毒譜系?；蜃儺愂荋1N2亞型豬流感病毒進化的重要驅(qū)動力之一。病毒在復(fù)制過程中，由于RNA聚合酶缺乏校正功能，容易發(fā)生堿基的錯配和突變，導(dǎo)致基因序列的改變。尤其是HA、NA等表面抗原基因，它們直接暴露在病毒表面，與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，受到的選擇壓力較大，因此進化速率相對較快。以HA基因為例，其氨基酸序列的變異可能導(dǎo)致病毒抗原性的改變，使宿主原有的抗體無法有效識別和中和病毒，從而實現(xiàn)免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，一些H1N2病毒的HA基因在關(guān)鍵位點發(fā)生了氨基酸替換，這些替換影響了HA蛋白與宿主細胞表面受體的結(jié)合能力，進而改變了病毒的感染特性和宿主范圍。基因重組也是H1N2亞型豬流感病毒進化的關(guān)鍵因素。豬作為多種流感病毒的共同易感宿主，為病毒基因重組提供了有利條件。不同亞型的流感病毒在豬體內(nèi)同時感染時，它們的基因組RNA片段可能發(fā)生交換和重組，產(chǎn)生具有新基因組合的病毒株。這種基因重組不僅增加了病毒的遺傳多樣性，還可能導(dǎo)致病毒的生物學(xué)特性發(fā)生顯著變化，如致病性、傳播能力等。例如，某些基因重組后的H1N2病毒可能獲得了更強的跨物種傳播能力，從而對人類健康構(gòu)成更大的威脅。除了基因變異和重組，病毒的進化還受到宿主免疫壓力、環(huán)境因素、病毒傳播途徑等多種因素的影響。宿主的免疫系統(tǒng)在識別和清除病毒的過程中，會對病毒產(chǎn)生選擇壓力，促使病毒發(fā)生變異以逃避宿主的免疫攻擊。環(huán)境因素，如溫度、濕度、養(yǎng)殖密度等，也可能影響病毒的存活、傳播和進化。在養(yǎng)殖密度高、通風(fēng)不良的環(huán)境中，病毒更容易在豬群中傳播，增加了病毒基因重組和變異的機會。此外，病毒的傳播途徑，如豬與豬之間的直接接觸、空氣傳播、通過污染物傳播等，也會影響病毒的進化方向。不同的傳播途徑可能導(dǎo)致病毒在不同的宿主群體中傳播，從而受到不同的選擇壓力，進而影響病毒的進化。四、抗HA蛋白單克隆抗體制備的理論基礎(chǔ)4.1HA蛋白在豬流感病毒中的作用HA蛋白作為豬流感病毒表面最主要的抗原糖蛋白，在病毒的生命周期中扮演著舉足輕重的角色，對病毒的感染過程和免疫應(yīng)答機制有著深遠影響。從結(jié)構(gòu)層面來看，HA蛋白是一種三聚體跨膜糖蛋白，由兩條不同的多肽鏈HA1和HA2通過二硫鍵連接而成。HA1亞基位于三聚體的頭部，富含多種抗原決定簇，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且多變，能夠與宿主細胞表面的唾液酸受體特異性結(jié)合，從而決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。HA2亞基則構(gòu)成了三聚體的莖部，包含一個高度保守的融合肽區(qū)域。在病毒感染宿主細胞的過程中，當(dāng)病毒粒子與宿主細胞表面受體結(jié)合后，通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)體，內(nèi)體的酸性環(huán)境會引發(fā)HA蛋白的構(gòu)象變化。此時，HA2亞基的融合肽暴露并插入宿主細胞膜，促使病毒包膜與宿主細胞膜發(fā)生融合，進而將病毒的基因組RNA釋放到宿主細胞的細胞質(zhì)中，啟動病毒的復(fù)制周期。例如，當(dāng)H1N2亞型豬流感病毒感染豬呼吸道上皮細胞時，HA1亞基首先識別并結(jié)合上皮細胞表面的α-2,6-唾液酸和α-2,3-唾液酸受體，使病毒吸附在細胞表面，隨后在細胞內(nèi)體酸性環(huán)境的作用下，HA2亞基的融合肽發(fā)揮作用，實現(xiàn)病毒與細胞的膜融合，完成病毒基因組的入侵。在免疫應(yīng)答方面，HA蛋白具有極強的免疫原性，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的關(guān)鍵抗原。當(dāng)機體感染H1N2亞型豬流感病毒后，免疫系統(tǒng)會迅速識別HA蛋白上的抗原表位，激活B淋巴細胞，使其分化為漿細胞，產(chǎn)生特異性的抗HA蛋白抗體。這些中和抗體能夠與HA蛋白結(jié)合，阻斷病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合，或者抑制HA蛋白的構(gòu)象變化，從而阻止病毒的感染和傳播。例如，在豬感染H1N2病毒后，體內(nèi)產(chǎn)生的抗HA蛋白抗體可以與病毒表面的HA蛋白結(jié)合，使病毒無法吸附到呼吸道上皮細胞表面，從而保護豬免受病毒的進一步感染。此外，HA蛋白的抗原性具有高度的變異性，其氨基酸序列的微小改變就可能導(dǎo)致抗原表位的變化，使病毒能夠逃避宿主原有的免疫防御，這也是豬流感病毒難以徹底防控的重要原因之一。研究表明，HA蛋白上某些關(guān)鍵位點的氨基酸替換，如H3N2亞型流感病毒HA蛋白上的第156位和第189位氨基酸的變異，會顯著影響病毒與抗體的結(jié)合能力，導(dǎo)致原有的中和抗體失效。4.2單克隆抗體技術(shù)原理單克隆抗體是由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。其概念的提出和技術(shù)的發(fā)展，是免疫學(xué)領(lǐng)域的重大突破，為生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了強有力的工具。與傳統(tǒng)的多克隆抗體相比，單克隆抗體具有高度特異性、均一性和可重復(fù)性等顯著優(yōu)勢。多克隆抗體是由多種B細胞克隆產(chǎn)生的，針對多個抗原表位，其成分復(fù)雜，不同批次之間存在差異，而單克隆抗體則克服了這些問題，能夠提供更加精準(zhǔn)和穩(wěn)定的免疫檢測和治療效果。單克隆抗體的制備主要依賴于雜交瘤技術(shù)，該技術(shù)由G.K?hler和C.Milstein于1975年創(chuàng)立，他們也因此獲得了1984年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。雜交瘤技術(shù)的基本原理是將能夠產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞進行融合，形成雜交瘤細胞。B淋巴細胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力，但B細胞的這種能力和量是有限的，且不能在體外長期存活。而骨髓瘤細胞則可以在體外無限生長繁殖。通過細胞融合技術(shù)，將二者融合形成的雜交瘤細胞，既繼承了B淋巴細胞分泌特異性抗體的能力，又具備了骨髓瘤細胞無限增殖的特性。在實際制備過程中，首先用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞。一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。然后，采用二氧化碳氣體處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇（PEG）。在PEG作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。融合后的細胞需要進行選擇性培養(yǎng)，以篩選出融合的雜交瘤細胞。一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基，其含有次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細胞雖具有HGPRT，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了HGPRT，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，如間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光試驗（IFA）等，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。4.3抗HA蛋白單克隆抗體的應(yīng)用前景抗HA蛋白單克隆抗體在病毒檢測領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，能夠為H1N2亞型豬流感病毒的快速、準(zhǔn)確檢測提供有力支持?；趩慰寺】贵w的檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光試驗（IFA）、膠體金免疫層析技術(shù)等，具有高度的特異性和敏感性。在ELISA檢測中，將抗HA蛋白單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上，當(dāng)樣本中存在H1N2亞型豬流感病毒時，病毒表面的HA蛋白會與包被的單克隆抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的二抗和底物，通過檢測底物顯色的深淺來判斷樣本中病毒的含量。這種方法操作簡便、成本較低，能夠?qū)崿F(xiàn)對大量樣本的快速篩查，適用于養(yǎng)殖場、屠宰場等場所的疫情監(jiān)測。例如，在養(yǎng)豬場的日常疫病監(jiān)測中，定期采集豬的鼻拭子、血清等樣本，利用ELISA方法進行檢測，能夠及時發(fā)現(xiàn)豬群中是否存在H1N2病毒感染，為疫情防控爭取寶貴時間。免疫熒光試驗（IFA）則是利用熒光素標(biāo)記的抗HA蛋白單克隆抗體，與感染病毒的細胞或組織切片中的HA蛋白結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察，若樣本中存在病毒，則會出現(xiàn)特異性的熒光信號。IFA具有直觀、快速的特點，能夠在細胞水平上檢測病毒的感染情況，對于研究病毒的感染機制、病毒在組織中的分布等具有重要意義。膠體金免疫層析技術(shù)以膠體金作為標(biāo)記物，將抗HA蛋白單克隆抗體固定在硝酸纖維素膜上，當(dāng)樣本滴加到試紙條上時，若樣本中含有病毒HA蛋白，會與膠體金標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合，形成復(fù)合物，在檢測線上出現(xiàn)紅色條帶，實現(xiàn)對病毒的快速定性檢測。該技術(shù)操作簡單，無需特殊儀器設(shè)備，可用于現(xiàn)場檢測，如在基層獸醫(yī)站、動物疫病防控一線，工作人員可以使用膠體金免疫層析試紙條對疑似感染豬流感的豬只進行快速檢測，及時做出診斷。在診斷試劑開發(fā)方面，抗HA蛋白單克隆抗體是制備高特異性、高靈敏度診斷試劑的關(guān)鍵原料。以單克隆抗體為基礎(chǔ)開發(fā)的診斷試劑盒，能夠準(zhǔn)確區(qū)分H1N2亞型豬流感病毒與其他亞型的流感病毒，以及與其他呼吸道病原體。這對于豬流感的早期診斷、疫情的準(zhǔn)確判斷和防控措施的有效制定至關(guān)重要。例如，開發(fā)的基于單克隆抗體的熒光定量PCR診斷試劑盒，將抗HA蛋白單克隆抗體與熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，不僅能夠快速檢測病毒的核酸，還能通過單克隆抗體的特異性識別，提高檢測的準(zhǔn)確性，減少假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。這種診斷試劑盒可以廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)實驗室、動物疫病防控機構(gòu)等，為豬流感的診斷提供可靠的技術(shù)手段。在治療藥物研究領(lǐng)域，抗HA蛋白單克隆抗體作為一種潛在的治療藥物，具有獨特的優(yōu)勢。單克隆抗體能夠特異性地結(jié)合病毒表面的HA蛋白，阻斷病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合，從而抑制病毒的感染和傳播。與傳統(tǒng)的抗病毒藥物相比，單克隆抗體具有更高的特異性，能夠減少對宿主正常細胞的損傷，降低藥物的副作用。目前，已經(jīng)有一些針對流感病毒的單克隆抗體藥物進入臨床試驗階段，并取得了一定的成果。對于H1N2亞型豬流感病毒，研發(fā)抗HA蛋白單克隆抗體治療藥物，有望為豬流感的治療提供新的有效手段。在豬感染H1N2病毒的早期，通過注射抗HA蛋白單克隆抗體，能夠中和病毒，減輕病毒對豬體的侵害，促進豬只的康復(fù)。此外，抗HA蛋白單克隆抗體還可以與其他抗病毒藥物聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。五、抗HA蛋白單克隆抗體的制備過程5.1實驗材料準(zhǔn)備實驗動物選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購自[具體實驗動物供應(yīng)商名稱]。該品系小鼠具有免疫反應(yīng)靈敏、繁殖能力強、遺傳背景清晰等優(yōu)點，在單克隆抗體制備實驗中被廣泛應(yīng)用。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，給予充足的飼料和飲水，自由采食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔衛(wèi)生，定期更換墊料，每周更換2-3次，以減少微生物污染，為小鼠提供良好的生長和免疫環(huán)境。細胞株方面，采用小鼠骨髓瘤細胞SP2/0，該細胞株由本實驗室保存。SP2/0細胞具有在體外無限增殖的特性，且不分泌免疫球蛋白，是細胞融合制備雜交瘤細胞的常用細胞株。在細胞培養(yǎng)過程中，將SP2/0細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，促進細胞的增殖和存活。RPMI-1640培養(yǎng)基購自[培養(yǎng)基供應(yīng)商名稱]，其含有細胞生長所需的氨基酸、維生素、無機鹽等成分，能夠滿足SP2/0細胞的生長需求。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，CO?能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為細胞生長提供適宜的環(huán)境。定期觀察細胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)，以保持細胞的活性和生長能力。試劑準(zhǔn)備包括多種關(guān)鍵試劑。用于細胞融合的聚乙二醇（PEG，分子量為4000）購自[PEG供應(yīng)商名稱]。PEG是一種常用的細胞融合劑，能夠促進細胞之間的膜融合，提高細胞融合效率。在使用前，將PEG溶解于無菌的RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成50%（w/v）的PEG溶液，過濾除菌后備用。次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于配制HAT選擇性培養(yǎng)基。HAT培養(yǎng)基是篩選雜交瘤細胞的關(guān)鍵試劑，其中氨基蝶呤能夠阻斷骨髓瘤細胞DNA合成的主要途徑，而次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷則為具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）的雜交瘤細胞提供合成DNA的原料，從而使雜交瘤細胞能夠在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖，而未融合的骨髓瘤細胞和脾細胞則無法存活。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自[佐劑供應(yīng)商名稱]，用于動物免疫時與抗原混合乳化，增強抗原的免疫原性。弗氏完全佐劑中含有卡介苗等成分，能夠刺激機體產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)，常用于初次免疫；弗氏不完全佐劑則不含卡介苗，免疫刺激作用相對較弱，常用于加強免疫。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自[抗體供應(yīng)商名稱]，用于間接ELISA檢測中，與雜交瘤細胞分泌的抗體結(jié)合，通過酶催化底物顯色來檢測抗體的存在和效價。此外，還準(zhǔn)備了其他常用試劑，如胰蛋白酶、EDTA、PBS緩沖液等，用于細胞的消化、洗滌和稀釋等操作。胰蛋白酶能夠消化細胞之間的連接蛋白，使細胞分散，便于傳代培養(yǎng)和細胞融合操作；EDTA能夠螯合細胞外的鈣離子和鎂離子，增強胰蛋白酶的消化作用；PBS緩沖液用于清洗細胞和稀釋試劑，維持溶液的pH值和滲透壓穩(wěn)定。儀器設(shè)備方面，主要有CO?培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、離心機、酶標(biāo)儀等。CO?培養(yǎng)箱購自[品牌名稱]，型號為[具體型號]，能夠精確控制溫度和CO?濃度，為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的環(huán)境。超凈工作臺用于無菌操作，防止微生物污染，購自[品牌名稱]，其通過過濾空氣，提供一個潔凈的工作空間，確保實驗操作的無菌性。倒置顯微鏡用于觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，購自[品牌名稱]，能夠清晰地觀察到細胞的形態(tài)、大小、透明度等特征，幫助實驗人員判斷細胞的健康狀況和生長情況。離心機用于細胞和試劑的離心分離，購自[品牌名稱]，型號為[具體型號]，能夠根據(jù)實驗需求調(diào)整離心速度和時間，實現(xiàn)細胞的沉淀和上清液的分離。酶標(biāo)儀用于檢測ELISA實驗中的吸光度值，購自[品牌名稱]，能夠快速、準(zhǔn)確地測定酶標(biāo)板中各孔的吸光度，從而判斷抗體的效價和抗原-抗體反應(yīng)的強度。5.2免疫動物免疫原的制備是免疫動物的關(guān)鍵前提，其質(zhì)量直接影響免疫效果。本研究以H1N2亞型豬流感病毒的HA蛋白作為免疫原。首先，根據(jù)H1N2亞型豬流感病毒的HA基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計遵循引物長度適宜（一般為18-25bp）、GC含量在40%-60%之間、避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成等原則。上游引物為5’-[具體堿基序列]-3’，下游引物為5’-[具體堿基序列]-3’。以提取的病毒RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴增HA基因。RT-PCR反應(yīng)體系為25μL，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5μL，dNTP混合物（10mMeach）1μL，隨機引物（50μM）1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）1μL，RNA模板1μg，用RNase-free水補足至25μL。反應(yīng)條件為：42℃逆轉(zhuǎn)錄60分鐘，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5分鐘。隨后進行PCR擴增，反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL，dNTP混合物（10mMeach）0.5μL，上下游引物（10μMeach）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板1μL，用ddH?O補足至25μL。擴增條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；72℃延伸10分鐘。擴增后的HA基因通過凝膠電泳進行檢測，切下目的條帶，利用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化。將回收的HA基因與表達載體pET-32a（+）進行雙酶切，酶切體系為20μL，包括10×Buffer2μL，HA基因或載體DNA10μL，限制性內(nèi)切酶（10U/μL）各1μL，用ddH?O補足至20μL。37℃酶切3小時后，通過凝膠電泳回收酶切后的片段。使用T4DNA連接酶將酶切后的HA基因與pET-32a（+）載體連接，連接體系為10μL，包括10×T4DNA連接酶緩沖液1μL，HA基因片段3μL，pET-32a（+）載體片段1μL，T4DNA連接酶（350U/μL）1μL，用ddH?O補足至10μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化后的細胞涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證，確保HA基因正確插入載體中。將鑒定正確的重組菌株接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達到0.6-0.8時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5mM，16℃誘導(dǎo)表達16小時。誘導(dǎo)表達結(jié)束后，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌兩次，然后重懸于含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中，冰浴超聲破碎菌體。超聲條件為：功率300W，超聲3秒，間隔5秒，共超聲30分鐘。破碎后的菌體裂解液于12000r/min離心30分鐘，收集上清液。將上清液通過鎳柱親和層析進行純化，鎳柱預(yù)先用平衡緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH7.4）平衡。將上清液緩慢上樣到鎳柱上，然后用含有不同濃度咪唑（20mM、50mM、100mM、250mM、500mM）的洗脫緩沖液（20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH7.4）進行洗脫。收集洗脫峰，通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度，將純度達到90%以上的HA蛋白收集備用。免疫動物選擇6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，該品系小鼠免疫應(yīng)答能力強，對多種抗原能夠產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，在單克隆抗體制備實驗中廣泛應(yīng)用。在免疫前，對小鼠進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，觀察小鼠的健康狀況，確保小鼠無疾病感染。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40%-60%，給予充足的飼料和飲水，自由采食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境保持清潔衛(wèi)生，定期更換墊料，每周更換2-3次，以減少微生物污染，為小鼠提供良好的生長和免疫環(huán)境。本研究采用的免疫方案為：將純化后的HA蛋白與弗氏完全佐劑按1:1的比例混合，在無菌條件下，使用注射器反復(fù)抽打，充分乳化，形成均勻的乳劑。通過腹腔注射的方式對小鼠進行初次免疫，免疫劑量為100μg/只。初次免疫后，小鼠的免疫系統(tǒng)被激活，B淋巴細胞開始識別HA蛋白抗原，并啟動免疫應(yīng)答過程。間隔2周后，進行第二次免疫。第二次免疫采用HA蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化后進行，免疫劑量和方式同初次免疫。弗氏不完全佐劑能夠進一步增強抗原的免疫原性，刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強的免疫反應(yīng)。在第二次免疫后的第10天，從小鼠眼眶采血，通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測小鼠血清中抗HA蛋白抗體的效價。ELISA檢測步驟如下：將純化的HA蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，包被于96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液（PBS+0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3分鐘。然后用5%脫脂奶粉封閉，每孔200μL，37℃孵育1小時。棄去封閉液，洗滌3次后，加入稀釋后的小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育1小時。再次洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，每孔100μL，37℃孵育30分鐘。最后洗滌3次，加入底物TMB顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15分鐘。加入2MH?SO?終止液，每孔50μL，在酶標(biāo)儀上測定OD450值。當(dāng)抗體效價達到1:10000以上時，表明小鼠免疫系統(tǒng)對HA蛋白產(chǎn)生了較強的免疫應(yīng)答，此時進行第三次免疫。第三次免疫采用無佐劑的HA蛋白，劑量為50μg/只，通過尾靜脈注射。尾靜脈注射能夠使抗原迅速進入小鼠血液循環(huán)系統(tǒng)，直接刺激脾臟等免疫器官中的B淋巴細胞，增強免疫效果。第三次免疫后的第3天，取小鼠脾細胞用于細胞融合，此時小鼠脾臟中的B淋巴細胞處于高度活化狀態(tài)，能夠提高細胞融合的成功率。5.3細胞融合在單克隆抗體制備過程中，細胞融合是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，它決定了能否成功獲得兼具抗體分泌能力和無限增殖特性的雜交瘤細胞。本研究選用小鼠骨髓瘤細胞SP2/0作為融合對象，該細胞株具有在體外無限增殖的特性，且不分泌免疫球蛋白，是細胞融合制備雜交瘤細胞的理想選擇。在進行細胞融合前，需對SP2/0細胞進行充分的準(zhǔn)備工作。將處于對數(shù)生長期的SP2/0細胞從培養(yǎng)瓶中用胰蛋白酶-EDTA消化液消化下來，制成單細胞懸液。胰蛋白酶能夠消化細胞之間的連接蛋白，使細胞分散，EDTA則能螯合細胞外的鈣離子和鎂離子，增強胰蛋白酶的消化作用。通過細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×10?個/mL，確保細胞狀態(tài)良好，活力在95%以上，為后續(xù)的細胞融合提供高質(zhì)量的細胞材料。從經(jīng)過三次免疫后的BALB/c小鼠中獲取脾細胞。采用頸椎脫臼法處死小鼠，將小鼠置于超凈工作臺中，用75%酒精浸泡消毒5分鐘，以殺滅小鼠體表的微生物，防止污染實驗材料。無菌打開小鼠腹腔，取出脾臟，將脾臟置于盛有預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基的平皿中。用鑷子和剪刀將脾臟剪碎成1mm3左右的小塊，然后用注射器的活塞輕輕研磨脾臟組織，使脾細胞充分釋放到培養(yǎng)基中。將研磨后的細胞懸液通過200目細胞篩網(wǎng)過濾，去除未研磨碎的組織塊，得到單細胞懸液。通過細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整脾細胞濃度至5×10?個/mL。將制備好的脾細胞懸液和骨髓瘤細胞SP2/0懸液按照5:1的比例混合于50mL離心管中。此比例是經(jīng)過多次預(yù)實驗優(yōu)化確定的，在該比例下，細胞融合效率較高，能夠獲得較多的雜交瘤細胞。加入預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基至40mL，輕輕吹打混勻，1000r/min離心10分鐘，使細胞沉淀。離心后，棄去上清液，用手指輕輕彈擊離心管底部，使細胞沉淀松散。在37℃水浴條件下，緩慢滴加50%（w/v）的PEG溶液1mL，邊滴加邊輕輕攪拌，滴加時間控制在1分鐘左右。PEG是一種常用的細胞融合劑，能夠促進細胞之間的膜融合，提高細胞融合效率。滴加完畢后，繼續(xù)在37℃水浴中靜置1分鐘，然后緩慢加入預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，第1分鐘內(nèi)加入1mL，第2分鐘內(nèi)加入2mL，第3分鐘內(nèi)加入3mL，第4分鐘內(nèi)加入4mL，第5分鐘內(nèi)加入5mL，隨后補加無血清RPMI-1640培養(yǎng)基至40mL，以稀釋PEG，減輕其對細胞的毒性。1000r/min離心10分鐘，棄去上清液。將離心后的細胞沉淀用含有20%胎牛血清（FBS）、1%HAT（次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分散。將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，共接種10塊96孔板。將接種好的培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用補救途徑合成DNA而死亡。未融合的淋巴細胞雖具有HGPRT，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了HGPRT，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。在培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，記錄細胞的形態(tài)、密度和有無污染等情況。培養(yǎng)3-5天后，可見雜交瘤細胞開始增殖，逐漸形成克隆。在培養(yǎng)10-14天內(nèi)，根據(jù)細胞的生長情況，及時補充含有1%HAT的培養(yǎng)基，確保細胞有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長和增殖。5.4陽性克隆篩選與鑒定在完成細胞融合并于HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，雜交瘤細胞開始增殖，此時需要從眾多的雜交瘤細胞中篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗HA蛋白單克隆抗體的陽性克隆。本研究采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對雜交瘤細胞培養(yǎng)上清進行初次篩選。將純化的HA蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入96孔酶標(biāo)板中，4℃過夜，使HA蛋白