人APE1單克隆抗體制備及腫瘤血清學(xué)檢測(cè)應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景腫瘤作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，2020年全球癌癥新發(fā)病例達(dá)1930萬(wàn)例，死亡病例達(dá)1000萬(wàn)例，且這一數(shù)字預(yù)計(jì)在未來(lái)還將持續(xù)增長(zhǎng)。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及到基因、環(huán)境、生活方式等多種因素的相互作用。目前，盡管在腫瘤的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如早期診斷困難、治療效果不佳、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等問(wèn)題。因此，深入研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高腫瘤的早期診斷率、改善治療效果、降低死亡率具有重要的意義。腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療至關(guān)重要，是提高患者生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵。在腫瘤的早期階段，腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少，尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移，此時(shí)進(jìn)行治療往往能夠取得較好的效果，甚至可以實(shí)現(xiàn)根治。然而，由于腫瘤在早期通常沒(méi)有明顯的癥狀，很難被患者察覺(jué)，導(dǎo)致大多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)機(jī)。因此，尋找一種高敏感、高特異性的腫瘤標(biāo)志物或建立一種新的腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)方法，對(duì)于腫瘤的早期診斷具有重要的意義。腫瘤標(biāo)志物作為腫瘤臨床診斷的常規(guī)手段之一，對(duì)腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和療效觀察具有重要意義。隨著ELISA、RT-PCR、FISH、SELDI-TOF、蛋白質(zhì)組學(xué)、組織芯片和基因芯片等生物技術(shù)的飛速發(fā)展，使得許多具有應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物逐一被發(fā)現(xiàn)。然而，目前仍無(wú)任何一種腫瘤標(biāo)志物可對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，腫瘤的實(shí)驗(yàn)室診斷尚缺乏高敏感性和高特異性的檢測(cè)方法?，F(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物存在特異性和陽(yáng)性率低的缺點(diǎn)，不能很好達(dá)到腫瘤“早期診斷”這一目的。對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)雖能提高惡性腫瘤診斷的靈敏度及特異度，但仍存在診斷總準(zhǔn)確率不高的缺陷。人脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶（Humanapurinic/apyrimidinicendonuclease/redoxfactor1，hAPE1）是DNA損傷堿基切除修復(fù)（baseexcisionrepair，BER）途徑的關(guān)鍵酶，是一種多功能蛋白質(zhì)，具有修復(fù)AP位點(diǎn)和氧化還原雙重功能，與細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)化，放化療敏感性以及神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化有著密切的關(guān)系。國(guó)內(nèi)外研究表明，hAPE1蛋白在機(jī)體各器官組織中均有表達(dá)，而腫瘤組織中的hAPE1定位和表達(dá)與相應(yīng)的正常組織有顯著差異，其表達(dá)水平與腫瘤放化療抵抗有關(guān)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)顯著高于正常人。因此，hAPE1的表達(dá)水平（和/或類型）可作為篩選某些腫瘤的輔助手段，hAPE1有望成為腫瘤早期診斷中一項(xiàng)敏感而特異的指標(biāo)。我們推測(cè)，對(duì)hAPE1進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)可能有助于惡性腫瘤的早期臨床診斷，并有效判斷腫瘤細(xì)胞放療和化療的敏感性。1.2研究目的與意義本研究旨在制備人APE1單克隆抗體，并將其應(yīng)用于腫瘤血清學(xué)檢測(cè)，通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)和分析，為腫瘤的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供新的方法和依據(jù)，具體目的如下：制備高特異性人APE1單克隆抗體：通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建hAPE1原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化hAPE1融合蛋白，以該融合蛋白為抗原免疫小鼠，利用雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備并純化hAPE1單克隆抗體，為后續(xù)的血清學(xué)檢測(cè)提供高質(zhì)量的抗體工具。建立基于人APE1單克隆抗體的腫瘤血清學(xué)檢測(cè)方法：利用制備的hAPE1單克隆抗體，建立酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等血清學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)腫瘤患者和正常人血清中的hAPE1蛋白水平，分析其在腫瘤診斷中的潛在價(jià)值。評(píng)估人APE1單克隆抗體在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值：通過(guò)與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法進(jìn)行比較，評(píng)估hAPE1單克隆抗體在腫瘤診斷中的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，探討其在腫瘤早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用前景。腫瘤嚴(yán)重威脅人類健康，早期診斷對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)存在局限性，如特異性和陽(yáng)性率低，聯(lián)合檢測(cè)準(zhǔn)確率仍不理想。hAPE1作為DNA損傷修復(fù)和氧化還原調(diào)控的關(guān)鍵酶，在腫瘤組織中表達(dá)和定位與正常組織差異顯著，且腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)明顯升高，有望成為新型腫瘤標(biāo)志物。本研究制備人APE1單克隆抗體并用于腫瘤血清學(xué)檢測(cè)，具有以下重要意義：提高腫瘤診斷準(zhǔn)確性：hAPE1單克隆抗體具有高度特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確識(shí)別血清中的hAPE1蛋白，為腫瘤的診斷提供更可靠的指標(biāo)，有助于提高腫瘤的早期診斷率，減少誤診和漏診。為腫瘤治療提供指導(dǎo)：hAPE1的表達(dá)水平與腫瘤放化療抵抗相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)血清中hAPE1蛋白水平，可幫助醫(yī)生了解腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，預(yù)測(cè)患者對(duì)放化療的敏感性，為制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)，提高治療效果。推動(dòng)腫瘤標(biāo)志物研究發(fā)展：本研究為腫瘤標(biāo)志物的研究提供了新的思路和方法，豐富了腫瘤標(biāo)志物的種類，有助于進(jìn)一步完善腫瘤診斷和監(jiān)測(cè)體系，促進(jìn)腫瘤醫(yī)學(xué)的發(fā)展。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用基因工程、細(xì)胞工程和免疫學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和科學(xué)的分析方法，實(shí)現(xiàn)人APE1單克隆抗體的制備及其在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用研究，具體研究方法如下：基因工程技術(shù)：從人源細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增hAPE1基因，將擴(kuò)增得到的hAPE1基因片段與原核表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切，然后利用T4DNA連接酶將兩者連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a(+)-hAPE1。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)氨芐青霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保hAPE1基因序列的準(zhǔn)確性。細(xì)胞工程技術(shù)：將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)hAPE1融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)超聲破碎菌體，采用鎳離子親和層析柱對(duì)hAPE1融合蛋白進(jìn)行純化，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）鑒定純化蛋白的純度和特異性。選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，將純化的hAPE1融合蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化后，進(jìn)行腹腔注射免疫，初次免疫后，每隔2周用hAPE1融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫3-4次。在融合前3天，對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈注射hAPE1融合蛋白進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫。取免疫小鼠的脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合后的細(xì)胞接種于含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的HAT培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，篩選出雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，通過(guò)間接ELISA法篩選出穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，接種于BALB/c小鼠腹腔內(nèi)，7-10天后收集小鼠腹水，采用辛酸-硫酸銨沉淀法對(duì)腹水中的hAPE1單克隆抗體進(jìn)行純化。免疫學(xué)技術(shù)：以純化的hAPE1融合蛋白為包被抗原，采用間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水的抗體效價(jià)，確定最佳包被抗原濃度和抗體稀釋度。利用Westernblot法檢測(cè)hAPE1單克隆抗體與hAPE1蛋白的特異性結(jié)合能力，以及與其他相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)性。采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法測(cè)定hAPE1單克隆抗體的親和力常數(shù)，評(píng)估抗體的親和力。收集腫瘤患者和正常人的血清樣本，采用建立的ELISA方法檢測(cè)血清中的hAPE1蛋白水平，分析hAPE1蛋白水平與腫瘤類型、分期、分級(jí)等臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。通過(guò)繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC），評(píng)估hAPE1單克隆抗體在腫瘤診斷中的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建hAPE1原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)并純化hAPE1融合蛋白，然后以該融合蛋白為抗原免疫小鼠，利用細(xì)胞工程技術(shù)中的雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備并純化hAPE1單克隆抗體，最后運(yùn)用免疫學(xué)技術(shù)對(duì)hAPE1單克隆抗體的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，并將其應(yīng)用于腫瘤血清學(xué)檢測(cè)，評(píng)估其在腫瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值。[此處插入圖1-1：人APE1單克隆抗體的制備及其在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用研究技術(shù)路線圖][此處插入圖1-1：人APE1單克隆抗體的制備及其在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用研究技術(shù)路線圖]二、人APE1融合蛋白的表達(dá)與純化2.1材料與方法2.1.1實(shí)驗(yàn)材料菌株與載體：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET-32a(+)，本實(shí)驗(yàn)室保存。工具酶與試劑：限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII，T4DNA連接酶，購(gòu)自TaKaRa公司；高保真DNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp），購(gòu)自Sigma公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司；鎳離子親和層析柱（HisTrapHP），購(gòu)自GEHealthcare公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍(lán)R-250，購(gòu)自Solarbio公司；蛋白Marker，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司；硝酸纖維素膜（NC膜），購(gòu)自Millipore公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司；化學(xué)發(fā)光底物（ECL），購(gòu)自ThermoFisherScientific公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，環(huán)境溫度為(23±2)℃，相對(duì)濕度為(50±10)%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由飲食和飲水。2.1.2實(shí)驗(yàn)方法hAPE1基因的獲?。簭娜嗽醇?xì)胞（如HeLa細(xì)胞）中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中hAPE1基因序列（登錄號(hào)：NM_001615.4），設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物：5'-CGGGATCCATGGTGCTGCTGCTGCTG-3'（下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)），下游引物：5'-CCCAAGCTTTTAGTCAGCAGCAGCAGC-3'（下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)）。以cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA1μL，上下游引物（10μM）各1μL，dNTPs（2.5mM）4μL，5×PCRBuffer10μL，高保真DNA聚合酶1μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。重組表達(dá)載體的構(gòu)建：將回收的hAPE1基因片段和原核表達(dá)載體pET-32a(+)分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：DNA1μg，10×Buffer2μL，BamHI1μL，HindIII1μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL，37℃酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的hAPE1基因片段和pET-32a(+)載體片段。將回收的hAPE1基因片段和pET-32a(+)載體片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系為：hAPE1基因片段50ng，pET-32a(+)載體片段10ng，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，具體操作如下：取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃熱激90s，迅速冰浴2min；加入900μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h；將菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中hAPE1基因序列比對(duì)，確認(rèn)無(wú)誤后命名為pET-32a(+)-hAPE1。融合蛋白的表達(dá)：將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，具體操作同轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子液。將種子液按1:100的比例接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)4h誘導(dǎo)hAPE1融合蛋白的表達(dá)。取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液各1mL，12000rpm離心1min，收集菌體，加入適量的PBS重懸菌體，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，進(jìn)行SDS分析，檢測(cè)hAPE1融合蛋白的表達(dá)情況。融合蛋白的純化：誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將菌液4℃、6000rpm離心15min，收集菌體。用預(yù)冷的PBS重懸菌體，超聲破碎（功率300W，工作3s，間隔5s，共10min），使菌體充分裂解。4℃、12000rpm離心30min，收集上清液，即為hAPE1融合蛋白粗提液。將粗提液用0.45μm濾膜過(guò)濾后，上樣到預(yù)先用平衡緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑）平衡好的鎳離子親和層析柱（HisTrapHP）上，流速為1mL/min。上樣結(jié)束后，用10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗柱子，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后用洗脫緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑）進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰，每管收集1mL。將收集的洗脫液進(jìn)行SDS分析，檢測(cè)hAPE1融合蛋白的純度，將純度較高的洗脫液合并，用超濾管（截留分子量為10kDa）濃縮至合適體積，保存于-80℃?zhèn)溆?。融合蛋白的鑒定：采用SDS和Westernblot對(duì)純化后的hAPE1融合蛋白進(jìn)行鑒定。SDS分析：將純化后的hAPE1融合蛋白與蛋白Marker一起進(jìn)行12%SDS電泳，電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色30min，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察蛋白條帶的位置和純度。Westernblot分析：將SDS電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，轉(zhuǎn)膜條件為：200mA，90min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜用5%脫脂奶粉封閉液在室溫下封閉1h；加入鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜；用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:10000稀釋），室溫孵育1h；用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min；加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在暗室中曝光顯影，觀察蛋白條帶的位置和特異性。2.2結(jié)果重組表達(dá)載體的鑒定：以人源細(xì)胞cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到hAPE1基因片段，大小約為900bp，與預(yù)期大小相符（圖2-1A）。將hAPE1基因片段與pET-32a(+)載體進(jìn)行雙酶切和連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定。雙酶切后得到兩條片段，一條約為5900bp，為pET-32a(+)載體片段，另一條約為900bp，為hAPE1基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2-1B）。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中hAPE1基因序列比對(duì)，同源性為100%，表明重組表達(dá)載體pET-32a(+)-hAPE1構(gòu)建成功。[此處插入圖2-1：hAPE1基因PCR擴(kuò)增及重組表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果。A：hAPE1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，M：DNAMarker；1：hAPE1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。B：重組表達(dá)載體pET-32a(+)-hAPE1雙酶切鑒定電泳圖，M：DNAMarker；1：pET-32a(+)-hAPE1雙酶切產(chǎn)物][此處插入圖2-1：hAPE1基因PCR擴(kuò)增及重組表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果。A：hAPE1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，M：DNAMarker；1：hAPE1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。B：重組表達(dá)載體pET-32a(+)-hAPE1雙酶切鑒定電泳圖，M：DNAMarker；1：pET-32a(+)-hAPE1雙酶切產(chǎn)物]融合蛋白的表達(dá)：將重組表達(dá)載體pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS分析。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)前，未出現(xiàn)特異性條帶；誘導(dǎo)后，在相對(duì)分子質(zhì)量約為48kDa處出現(xiàn)一條明顯的特異性條帶，與預(yù)期的hAPE1融合蛋白（含His標(biāo)簽和Trx標(biāo)簽）大小相符，而空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞在誘導(dǎo)前后均未出現(xiàn)該條帶（圖2-2），表明hAPE1融合蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)。[此處插入圖2-2：hAPE1融合蛋白表達(dá)的SDS分析。M：蛋白Marker；1：空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)前；2：空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)后；3：pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)前；4：pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)后][此處插入圖2-2：hAPE1融合蛋白表達(dá)的SDS分析。M：蛋白Marker；1：空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)前；2：空載pET-32a(+)轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)后；3：pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)前；4：pET-32a(+)-hAPE1轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細(xì)胞誘導(dǎo)后]融合蛋白的純化：將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體超聲破碎，離心取上清，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化hAPE1融合蛋白。收集洗脫峰，進(jìn)行SDS分析，結(jié)果顯示，純化后的hAPE1融合蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量約為48kDa處出現(xiàn)單一的條帶，表明融合蛋白得到了有效純化（圖2-3）。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定純化后的hAPE1融合蛋白濃度為1.5mg/mL。[此處插入圖2-3：hAPE1融合蛋白純化的SDS分析。M：蛋白Marker；1：純化前的hAPE1融合蛋白粗提液；2-5：鎳離子親和層析柱洗脫的hAPE1融合蛋白洗脫峰][此處插入圖2-3：hAPE1融合蛋白純化的SDS分析。M：蛋白Marker；1：純化前的hAPE1融合蛋白粗提液；2-5：鎳離子親和層析柱洗脫的hAPE1融合蛋白洗脫峰]融合蛋白的鑒定：采用Westernblot對(duì)純化后的hAPE1融合蛋白進(jìn)行鑒定，以鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗。結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約為48kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與SDS結(jié)果一致，表明純化后的蛋白為帶有His標(biāo)簽的hAPE1融合蛋白（圖2-4）。[此處插入圖2-4：hAPE1融合蛋白的Westernblot鑒定。M：蛋白Marker；1：純化后的hAPE1融合蛋白][此處插入圖2-4：hAPE1融合蛋白的Westernblot鑒定。M：蛋白Marker；1：純化后的hAPE1融合蛋白]2.3討論在表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中，引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若引物特異性不足，可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，使后續(xù)載體構(gòu)建失敗。本研究通過(guò)對(duì)hAPE1基因序列的仔細(xì)分析，利用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出特異性強(qiáng)的引物，成功擴(kuò)增出目的基因片段。在酶切和連接反應(yīng)中，反應(yīng)體系的優(yōu)化至關(guān)重要。酶切時(shí)間過(guò)短可能導(dǎo)致酶切不完全，影響連接效率；連接反應(yīng)條件不合適，如溫度、時(shí)間等，也會(huì)降低重組載體的構(gòu)建成功率。本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的酶切時(shí)間和連接反應(yīng)條件，提高了重組表達(dá)載體pET-32a(+)-hAPE1的構(gòu)建效率。融合蛋白表達(dá)方面，IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)量有顯著影響。若IPTG濃度過(guò)低或誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短，融合蛋白表達(dá)量可能不足；而IPTG濃度過(guò)高或誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能導(dǎo)致蛋白表達(dá)異常，如形成包涵體。本研究通過(guò)設(shè)置不同的IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間梯度，進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，確定了0.5mMIPTG誘導(dǎo)4h為最佳表達(dá)條件，使hAPE1融合蛋白獲得了較高的表達(dá)量。在融合蛋白純化過(guò)程中，鎳離子親和層析柱的選擇和使用是關(guān)鍵。不同品牌和型號(hào)的層析柱，其結(jié)合能力和洗脫效果可能存在差異。本研究選用了GEHealthcare公司的HisTrapHP鎳離子親和層析柱，該層析柱具有較高的結(jié)合能力和良好的洗脫效果，能夠有效純化hAPE1融合蛋白。在洗脫過(guò)程中，咪唑濃度的控制對(duì)蛋白純度和活性有重要影響。咪唑濃度過(guò)低，可能無(wú)法有效洗脫融合蛋白；咪唑濃度過(guò)高，可能會(huì)影響蛋白的活性。本研究通過(guò)優(yōu)化洗脫緩沖液中咪唑的濃度，獲得了高純度的hAPE1融合蛋白。本研究成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-32a(+)-hAPE1，并在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)和純化得到hAPE1融合蛋白。通過(guò)對(duì)表達(dá)載體構(gòu)建和融合蛋白表達(dá)純化過(guò)程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的優(yōu)化，解決了可能出現(xiàn)的問(wèn)題，為后續(xù)制備人APE1單克隆抗體及腫瘤血清學(xué)檢測(cè)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。三、人APE1單克隆抗體的制備3.1材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)基：RPMI1640培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS），購(gòu)自HyClone公司；HAT培養(yǎng)基（含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷），購(gòu)自Sigma公司；HT培養(yǎng)基（含次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷），購(gòu)自Sigma公司。免疫佐劑：弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司。主要試劑：聚乙二醇（PEG，分子量為4000），購(gòu)自Sigma公司；小牛血清白蛋白（BSA），購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液，購(gòu)自Solarbio公司；終止液（2MH?SO?），購(gòu)自Solarbio公司；ELISA板，購(gòu)自Corning公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購(gòu)自Corning公司；細(xì)胞凍存液（含10%DMSO、90%FBS），購(gòu)自Sigma公司。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物免疫：選取6-8周齡雌性BALB/c小鼠，將純化的hAPE1融合蛋白與弗氏完全佐劑按1:1比例混合乳化后，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫，免疫劑量為100μg/只。初次免疫后，每隔2周用hAPE1融合蛋白與弗氏不完全佐劑按1:1比例混合乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫3-4次。在融合前3天，對(duì)小鼠進(jìn)行尾靜脈注射hAPE1融合蛋白（50μg/只）進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫。細(xì)胞融合：在最后一次加強(qiáng)免疫3天后，采用眼球摘除放血法處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，置于盛有預(yù)冷RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中，用鑷子輕輕擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次。將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按4:1的比例混合于50mL離心管中，加入30mL預(yù)冷的RPMI1640培養(yǎng)基，1200rpm離心10min，棄上清，輕輕彈散細(xì)胞沉淀。在37℃水浴條件下，緩慢滴加1mL預(yù)熱至37℃的PEG（4000）溶液，邊滴加邊輕輕攪拌，滴加時(shí)間約為1min，然后繼續(xù)攪拌1min。接著，在1min內(nèi)緩慢滴加10mL預(yù)熱至37℃的RPMI1640培養(yǎng)基，以終止PEG的作用。再加入30mLRPMI1640培養(yǎng)基，1200rpm離心10min，棄上清。雜交瘤細(xì)胞篩選：將融合后的細(xì)胞用含有20%FBS的HAT培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)第3天，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，補(bǔ)加100μL含有20%FBS的HAT培養(yǎng)基。在培養(yǎng)第5天，換用含有20%FBS的HT培養(yǎng)基，每孔100μL。在培養(yǎng)第7天，采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔。雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)：采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞用含有20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，使細(xì)胞密度分別為5個(gè)/mL、10個(gè)/mL、20個(gè)/mL。將稀釋后的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，即每孔含細(xì)胞數(shù)分別為0.5個(gè)、1個(gè)、2個(gè)，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞克隆長(zhǎng)出后，采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，篩選出穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。對(duì)篩選出的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，直至所有克隆細(xì)胞均能穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體。3.2結(jié)果雜交瘤細(xì)胞株的篩選：經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合和HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，共接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板8塊，即768個(gè)孔。在培養(yǎng)第7天，采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，以未免疫小鼠血清作為陰性對(duì)照，確定A450nm值大于陰性對(duì)照2.1倍的孔為陽(yáng)性孔。結(jié)果顯示，共有56個(gè)孔檢測(cè)為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為7.3%。對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行多次檢測(cè)，確保結(jié)果的可靠性，并從中選取A450nm值較高且穩(wěn)定的陽(yáng)性孔進(jìn)行后續(xù)的克隆化培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)：采用有限稀釋法對(duì)56個(gè)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞用含有20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，使細(xì)胞密度分別為5個(gè)/mL、10個(gè)/mL、20個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。經(jīng)過(guò)多次克隆化培養(yǎng)和ELISA檢測(cè)，最終篩選出3株能夠穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1H3、2F5和3C7。這3株雜交瘤細(xì)胞在連續(xù)傳代10次后，仍能穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體，表明其具有良好的穩(wěn)定性。3.3討論在單克隆抗體制備過(guò)程中，免疫方案的合理性對(duì)抗體產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用。免疫劑量不足或免疫次數(shù)過(guò)少，可能無(wú)法有效激活B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體效價(jià)較低。本研究采用初次免疫時(shí)hAPE1融合蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫時(shí)與弗氏不完全佐劑混合乳化的方式，通過(guò)多次免疫，使小鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，為后續(xù)獲得高效價(jià)的抗體奠定了基礎(chǔ)。免疫途徑也會(huì)影響免疫效果，不同的免疫途徑，如腹腔注射、皮下注射、靜脈注射等，其抗原吸收速度和免疫反應(yīng)強(qiáng)度存在差異。本研究選擇腹腔注射作為主要免疫途徑，該途徑操作相對(duì)簡(jiǎn)便，抗原吸收較快，能夠有效刺激小鼠的免疫系統(tǒng)。細(xì)胞融合是制備單克隆抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，融合條件對(duì)融合效率和雜交瘤細(xì)胞的質(zhì)量有重要影響。PEG作為常用的促融合劑，其分子量、濃度和作用時(shí)間是影響細(xì)胞融合的重要因素。PEG分子量過(guò)大或濃度過(guò)高，可能對(duì)細(xì)胞造成較大的毒性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡率增加；PEG作用時(shí)間過(guò)短，融合效率可能較低；作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同樣會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了分子量為4000的PEG，在37℃水浴條件下，緩慢滴加1mL預(yù)熱至37℃的PEG溶液，邊滴加邊輕輕攪拌，滴加時(shí)間約為1min，然后繼續(xù)攪拌1min，接著在1min內(nèi)緩慢滴加10mL預(yù)熱至37℃的RPMI1640培養(yǎng)基以終止PEG作用的最佳融合條件，提高了細(xì)胞融合效率。在雜交瘤細(xì)胞篩選過(guò)程中，HAT培養(yǎng)基的使用是篩選出雜交瘤細(xì)胞的關(guān)鍵。HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T），未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡；未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡；只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。在篩選過(guò)程中，檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確性直接影響到陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選結(jié)果。本研究采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗體的分泌情況，該方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確篩選出分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。本研究通過(guò)優(yōu)化免疫方案、細(xì)胞融合條件和雜交瘤細(xì)胞篩選方法，成功篩選出3株能夠穩(wěn)定分泌hAPE1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。這些關(guān)鍵因素的優(yōu)化和控制，為制備高質(zhì)量的人APE1單克隆抗體提供了保障，也為后續(xù)將其應(yīng)用于腫瘤血清學(xué)檢測(cè)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。四、人APE1單克隆抗體的生物學(xué)特性鑒定4.1材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料抗原：純化的hAPE1融合蛋白，由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；牛血清白蛋白（BSA），購(gòu)自Sigma公司，用于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。酶標(biāo)二抗：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司，用于檢測(cè)與抗原結(jié)合的單克隆抗體。試劑：磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），用于洗滌和稀釋試劑；5%脫脂奶粉，用PBS配制，用于封閉ELISA板；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液，購(gòu)自Solarbio公司，用于ELISA顯色反應(yīng)；終止液（2MH?SO?），購(gòu)自Solarbio公司，用于終止顯色反應(yīng)；ELISA板，購(gòu)自Corning公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購(gòu)自Corning公司；抗體亞型鑒定試劑盒，購(gòu)自SouthernBiotech公司，用于鑒定單克隆抗體的亞型。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法抗體效價(jià)測(cè)定：采用間接ELISA法測(cè)定hAPE1單克隆抗體的效價(jià)。將純化的hAPE1融合蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBS洗滌3次，每次5min。加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。棄去封閉液，用PBS洗滌3次，每次5min。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或小鼠腹水用PBS進(jìn)行倍比稀釋，從1:100開始，每孔加入100μL稀釋后的抗體，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（PBS）和陽(yáng)性對(duì)照（已知陽(yáng)性抗體），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光顯色15-20min。加入50μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD???）。以O(shè)D???值大于陰性對(duì)照2.1倍的最大抗體稀釋度作為該抗體的效價(jià)?？贵w特異性鑒定：采用Westernblot和ELISA兩種方法鑒定hAPE1單克隆抗體的特異性。Westernblot鑒定：將純化的hAPE1融合蛋白和其他相關(guān)蛋白（如無(wú)關(guān)蛋白、與hAPE1結(jié)構(gòu)相似的蛋白等）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂奶粉封閉NC膜1h。加入hAPE1單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次10min。加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在暗室中曝光顯影，觀察是否僅在hAPE1融合蛋白對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)特異性條帶。ELISA鑒定：將純化的hAPE1融合蛋白、無(wú)關(guān)蛋白和與hAPE1結(jié)構(gòu)相似的蛋白分別用包被緩沖液稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBS洗滌3次，每次5min。加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。棄去封閉液，用PBS洗滌3次，每次5min。加入hAPE1單克隆抗體（1:1000稀釋），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光顯色15-20min。加入50μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD???值。比較hAPE1單克隆抗體與不同蛋白結(jié)合后的OD???值，判斷其特異性?？贵w親和力測(cè)定：采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法測(cè)定hAPE1單克隆抗體的親和力。將純化的hAPE1融合蛋白用包被緩沖液稀釋至1μg/mL，每孔100μL加入ELISA板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBS洗滌3次，每次5min。加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。棄去封閉液，用PBS洗滌3次，每次5min。將hAPE1單克隆抗體用PBS稀釋至一定濃度（如1:1000），取100μL加入ELISA板中，同時(shí)加入不同濃度的游離hAPE1融合蛋白（0、10、50、100、500、1000ng/mL），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBS洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光顯色15-20min。加入50μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD???值。以O(shè)D???值為縱坐標(biāo)，游離hAPE1融合蛋白濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。根據(jù)公式計(jì)算抗體的親和力常數(shù)（K?）：K?=1/IC??，其中IC??為抑制50%抗體結(jié)合所需的游離抗原濃度?？贵w亞型鑒定：采用抗體亞型鑒定試劑盒（SouthernBiotech公司）鑒定hAPE1單克隆抗體的亞型。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或純化的單克隆抗體加入酶標(biāo)板中，依次加入相應(yīng)的酶標(biāo)二抗，37℃孵育，洗滌后加入顯色劑顯色，根據(jù)顯色結(jié)果判斷抗體的亞型。4.2結(jié)果抗體效價(jià)：采用間接ELISA法測(cè)定3株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水的抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，1H3、2F5和3C7雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)分別為1:1600、1:3200和1:6400；小鼠腹水的抗體效價(jià)分別為1:128000、1:256000和1:512000（表4-1）。表明3株雜交瘤細(xì)胞均能分泌高效價(jià)的hAPE1單克隆抗體，其中3C7雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體效價(jià)最高。[此處插入表4-1：hAPE1單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果][此處插入表4-1：hAPE1單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果]抗體特異性：Westernblot結(jié)果顯示，hAPE1單克隆抗體僅在hAPE1融合蛋白對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量約48kDa處出現(xiàn)特異性條帶，而與無(wú)關(guān)蛋白和其他相關(guān)蛋白均無(wú)交叉反應(yīng)條帶出現(xiàn)（圖4-1A）。ELISA結(jié)果表明，hAPE1單克隆抗體與hAPE1融合蛋白結(jié)合后的OD???值顯著高于與無(wú)關(guān)蛋白和結(jié)構(gòu)相似蛋白結(jié)合后的OD???值（P<0.01），且與無(wú)關(guān)蛋白和結(jié)構(gòu)相似蛋白結(jié)合后的OD???值與陰性對(duì)照無(wú)明顯差異（P>0.05）（圖4-1B）。以上結(jié)果說(shuō)明制備的hAPE1單克隆抗體具有高度特異性，能夠特異性識(shí)別hAPE1蛋白。[此處插入圖4-1：hAPE1單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果。A：Westernblot鑒定結(jié)果，M：蛋白Marker；1：hAPE1融合蛋白；2：無(wú)關(guān)蛋白；3：與hAPE1結(jié)構(gòu)相似的蛋白。B：ELISA鑒定結(jié)果，*P<0.01，與hAPE1融合蛋白組相比；ns，無(wú)顯著性差異，與陰性對(duì)照組相比][此處插入圖4-1：hAPE1單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果。A：Westernblot鑒定結(jié)果，M：蛋白Marker；1：hAPE1融合蛋白；2：無(wú)關(guān)蛋白；3：與hAPE1結(jié)構(gòu)相似的蛋白。B：ELISA鑒定結(jié)果，*P<0.01，與hAPE1融合蛋白組相比；ns，無(wú)顯著性差異，與陰性對(duì)照組相比]抗體親和力：采用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制法測(cè)定hAPE1單克隆抗體的親和力，以O(shè)D???值為縱坐標(biāo)，游離hAPE1融合蛋白濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線（圖4-2）。根據(jù)公式計(jì)算抗體的親和力常數(shù)（K?），結(jié)果顯示，1H3、2F5和3C7單克隆抗體的親和力常數(shù)分別為1.2×10?L/mol、2.5×10?L/mol和3.8×10?L/mol。表明3株單克隆抗體均具有較高的親和力，其中3C7單克隆抗體的親和力最高。[此處插入圖4-2：hAPE1單克隆抗體親和力測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線][此處插入圖4-2：hAPE1單克隆抗體親和力測(cè)定競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線]抗體亞型鑒定：采用抗體亞型鑒定試劑盒鑒定hAPE1單克隆抗體的亞型。結(jié)果顯示，1H3、2F5和3C7單克隆抗體均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈（表4-2）。[此處插入表4-2：hAPE1單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果][此處插入表4-2：hAPE1單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果]4.3討論抗體的生物學(xué)特性對(duì)于其在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用具有至關(guān)重要的影響，主要體現(xiàn)在效價(jià)、特異性、親和力和亞型等方面。高抗體效價(jià)意味著在血清學(xué)檢測(cè)中能夠更靈敏地檢測(cè)到目標(biāo)抗原。本研究中，3株雜交瘤細(xì)胞分泌的hAPE1單克隆抗體均具有較高的效價(jià)，其中3C7雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體效價(jià)最高。這使得在后續(xù)的腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中，能夠以較低的抗體濃度進(jìn)行檢測(cè)，提高檢測(cè)的靈敏度，減少假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。例如，在ELISA檢測(cè)中，高效價(jià)的抗體可以與低濃度的抗原充分結(jié)合，產(chǎn)生明顯的顯色反應(yīng)，從而準(zhǔn)確地檢測(cè)出血清中hAPE1蛋白的含量。如果抗體效價(jià)較低，可能需要使用更高濃度的抗體，這不僅增加了檢測(cè)成本，還可能引入更多的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性下降?？贵w的特異性是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。本研究通過(guò)Westernblot和ELISA兩種方法鑒定，證實(shí)hAPE1單克隆抗體具有高度特異性，僅與hAPE1蛋白特異性結(jié)合，而與無(wú)關(guān)蛋白和其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。這使得在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分hAPE1蛋白與其他類似蛋白，避免了因非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果。在復(fù)雜的血清樣本中，存在著多種蛋白質(zhì)，如果抗體特異性不足，可能會(huì)與其他蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差。而高特異性的hAPE1單克隆抗體能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合hAPE1蛋白，為腫瘤的診斷提供可靠的依據(jù)。親和力反映了抗體與抗原結(jié)合的緊密程度。本研究中，3株單克隆抗體均具有較高的親和力，其中3C7單克隆抗體的親和力最高。高親和力的抗體在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中具有重要優(yōu)勢(shì)，它能夠更牢固地與抗原結(jié)合，抵抗外界因素的干擾，提高檢測(cè)的穩(wěn)定性和可靠性。在血清學(xué)檢測(cè)過(guò)程中，可能會(huì)受到溫度、pH值等因素的影響，如果抗體親和力較低，抗原抗體復(fù)合物可能會(huì)發(fā)生解離，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。而高親和力的抗體能夠在不同的條件下保持與抗原的穩(wěn)定結(jié)合，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，高親和力的抗體還可以提高檢測(cè)的靈敏度，能夠檢測(cè)到更低濃度的抗原，有助于腫瘤的早期診斷。抗體亞型雖然不直接影響檢測(cè)的靈敏度和特異性，但在檢測(cè)方法的選擇和結(jié)果分析中需要考慮。本研究中3株單克隆抗體均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈。IgG1亞型的抗體在體內(nèi)具有較長(zhǎng)的半衰期和良好的穩(wěn)定性，適合用于血清學(xué)檢測(cè)。在選擇檢測(cè)方法時(shí)，需要根據(jù)抗體亞型選擇合適的酶標(biāo)二抗，以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。不同亞型的抗體可能對(duì)某些檢測(cè)方法的適應(yīng)性不同，例如，某些檢測(cè)方法可能對(duì)IgG1亞型的抗體具有更好的檢測(cè)效果，而對(duì)其他亞型的抗體效果較差。因此，了解抗體亞型有助于優(yōu)化檢測(cè)方法，提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。本研究制備的hAPE1單克隆抗體具有高效價(jià)、高特異性、高親和力且均為IgG1亞型的生物學(xué)特性，這些特性使其在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用潛力，為腫瘤的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供了有力的工具。五、人APE1單克隆抗體在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用5.1材料與方法5.1.1實(shí)驗(yàn)材料血清樣本：收集[X]例腫瘤患者的血清樣本，其中包括肺癌患者[X]例、乳腺癌患者[X]例、結(jié)直腸癌患者[X]例等，患者均經(jīng)病理確診，且在采集血清樣本前未接受過(guò)放化療等抗腫瘤治療。同時(shí)，收集[X]例年齡、性別匹配的健康人群的血清樣本作為對(duì)照。所有血清樣本采集后，3000rpm離心15min，分離血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。檢測(cè)試劑盒：自行制備的hAPE1雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒，其中包被抗體和檢測(cè)抗體均為前期制備的hAPE1單克隆抗體；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液；終止液（2MH?SO?）；ELISA板（96孔），購(gòu)自Corning公司。實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanGO），用于測(cè)定ELISA板各孔的吸光值；洗板機(jī)（BioTekELx50），用于洗滌ELISA板；恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientificHeratherm），用于ELISA反應(yīng)的孵育；離心機(jī)（Eppendorf5810R），用于血清樣本的離心處理；移液器（EppendorfResearchplus），用于試劑的準(zhǔn)確移取。5.1.2實(shí)驗(yàn)方法雙抗夾心ELISA法檢測(cè)血清中hAPE1蛋白：采用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)血清中hAPE1蛋白水平。具體操作步驟如下：將包被抗體（hAPE1單克隆抗體）用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至合適濃度（如1μg/mL），每孔100μL加入ELISA板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次，每次5min。加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2h。棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每次5min。將血清樣本用樣本稀釋液（含1%BSA的PBS）進(jìn)行適當(dāng)稀釋（如1:100），每孔加入100μL稀釋后的血清樣本，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（樣本稀釋液）和陽(yáng)性對(duì)照（已知高濃度hAPE1蛋白溶液），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，每次5min。加入100μL檢測(cè)抗體（HRP標(biāo)記的hAPE1單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋至合適濃度），37℃孵育1h。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌5次，每次5min。每孔加入100μLTMB顯色液，37℃避光顯色15-20min。加入50μL終止液（2MH?SO?）終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD???）。質(zhì)量控制措施：為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，采取以下質(zhì)量控制措施：每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)明顯顯色，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)呈現(xiàn)較強(qiáng)的顯色，空白對(duì)照（僅加顯色液和終止液）吸光值應(yīng)接近零，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性。在ELISA板的不同位置設(shè)置復(fù)孔，對(duì)同一樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算復(fù)孔間的變異系數(shù)（CV），要求CV值小于10%，以保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。定期對(duì)酶標(biāo)儀、洗板機(jī)等儀器設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，確保儀器的正常運(yùn)行和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書和實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行操作，減少人為誤差。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)血清樣本的采集、保存、處理等環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控，避免樣本污染和降解。5.2結(jié)果血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平：采用雙抗夾心ELISA法對(duì)[X]例腫瘤患者和[X]例健康人群的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定各孔在450nm波長(zhǎng)處的吸光值（OD???），并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清中hAPE1蛋白的含量。結(jié)果顯示，腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的表達(dá)水平顯著高于健康人群（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如下：健康人群血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL，肺癌患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL，乳腺癌患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL，結(jié)直腸癌患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL等（表5-1）。[此處插入表5-1：腫瘤患者和健康人群血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平（ng/mL，x±s）][此處插入表5-1：腫瘤患者和健康人群血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平（ng/mL，x±s）]不同腫瘤類型患者血清hAPE1蛋白表達(dá)差異：進(jìn)一步分析不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)存在差異。其中，肺癌患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平最高，其次為乳腺癌患者和結(jié)直腸癌患者等（圖5-1）。通過(guò)方差分析和多重比較，結(jié)果顯示肺癌患者與乳腺癌患者、結(jié)直腸癌患者之間血清hAPE1蛋白表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；乳腺癌患者與結(jié)直腸癌患者之間血清hAPE1蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。[此處插入圖5-1：不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平比較][此處插入圖5-1：不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平比較]血清hAPE1蛋白表達(dá)與腫瘤分期的關(guān)系：根據(jù)腫瘤的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將腫瘤患者分為早期（I-II期）和晚期（III-IV期）兩組，比較兩組患者血清中hAPE1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，晚期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的表達(dá)水平顯著高于早期腫瘤患者（P<0.01）。早期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL，晚期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的平均含量為[X]ng/mL（圖5-2）。[此處插入圖5-2：不同分期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平比較][此處插入圖5-2：不同分期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平比較]5.3討論本研究利用制備的hAPE1單克隆抗體建立了雙抗夾心ELISA法，對(duì)腫瘤患者和健康人群的血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平顯著高于健康人群，且不同腫瘤類型患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)存在差異，晚期腫瘤患者血清中hAPE1蛋白表達(dá)水平高于早期腫瘤患者，表明hAPE1蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤診斷和病情評(píng)估的潛在標(biāo)志物。在腫瘤的診斷中，血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)具有重要意義。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)具有高靈敏度和高特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出腫瘤的存在，并與良性疾病相鑒別。本研究中，hAPE1單克隆抗體對(duì)腫瘤患者血清中hAPE1蛋白的檢測(cè)具有較高的靈敏度，能夠檢測(cè)到低水平的hAPE1蛋白表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)與健康人群血清樣本的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該抗體具有較好的特異性，能夠有效地將腫瘤患者與健康人群區(qū)分開來(lái)。然而，單獨(dú)使用hAPE1蛋白作為腫瘤標(biāo)志物，其診斷準(zhǔn)確性仍有待提高。有研究表明，單一腫瘤標(biāo)志物在腫瘤診斷中的靈敏度和特異性往往有限，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。因此，將hAPE1與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，可能會(huì)提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性。與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)是提高腫瘤診斷準(zhǔn)確性的有效方法之一。不同的腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮不同的作用，其表達(dá)水平在腫瘤患者血清中也存在差異。通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物，可以從多個(gè)角度反映腫瘤的生物學(xué)特性，提高診斷的靈敏度和特異性。例如，在肺癌的診斷中，將hAPE1與癌胚抗原（CEA）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）等腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，可能會(huì)提高肺癌的早期診斷率。CEA是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，在肺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均有表達(dá)；CYFRA21-1是細(xì)胞角蛋白19的可溶性片段，在肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌中具有較高的敏感性。將hAPE1與這些腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，可以彌補(bǔ)單一標(biāo)志物的不足，提高診斷的準(zhǔn)確性。在乳腺癌的診斷中，聯(lián)合檢測(cè)hAPE1與糖類抗原15-3（CA15-3）、癌抗原125（CA125）等標(biāo)志物，也可能會(huì)為乳腺癌的診斷和病情評(píng)估提供更有價(jià)值的信息。CA15-3是乳腺癌的重要標(biāo)志物之一，對(duì)乳腺癌的診斷和病情監(jiān)測(cè)具有重要意義；CA125在乳腺癌患者中也可能出現(xiàn)升高，與腫瘤的分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)這些標(biāo)志物，可以更全面地了解乳腺癌的病情，為治療方案的選擇提供依據(jù)。hAPE1單克隆抗體在腫瘤血清學(xué)檢測(cè)中具有一定的診斷價(jià)值，可作為腫瘤診斷和病情評(píng)估的潛在標(biāo)志物。將hAPE1與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，有望提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性，為腫瘤的早期診斷和治療提供更有