miR-146a靶向調(diào)控MIF基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖影響的機(jī)制研究一、引言1.1研究背景膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率和低治愈率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類健康。根據(jù)2021年世界衛(wèi)生組織（WHO）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤主要分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和室管膜瘤等類型，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常。盡管手術(shù)、放療和化療等綜合治療手段不斷發(fā)展，但膠質(zhì)瘤患者的總體預(yù)后仍然較差，5年生存率較低，這主要?dú)w因于膠質(zhì)瘤的高度侵襲性、異質(zhì)性以及對(duì)現(xiàn)有治療方法的耐藥性。因此，深入探究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高膠質(zhì)瘤患者的治療效果和生存率具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miRNA參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程，其異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤。miR-146a作為一種重要的miRNA，在多種腫瘤中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其表達(dá)水平的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在膠質(zhì)瘤中，已有研究表明miR-146a表達(dá)下調(diào)，且其低表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)，提示miR-146a可能在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌作用。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）是一種多效性細(xì)胞因子，最初被發(fā)現(xiàn)能夠抑制巨噬細(xì)胞的隨機(jī)遷移。MIF不僅參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程，還在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MIF在多種腫瘤組織中高表達(dá)，通過(guò)激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。在膠質(zhì)瘤中，MIF的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)，被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點(diǎn)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MIF基因的3'-UTR存在miR-146a的潛在結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-146a可能通過(guò)靶向MIF基因調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。然而，目前關(guān)于miR-146a與MIF基因在膠質(zhì)瘤中的調(diào)控關(guān)系及其具體機(jī)制尚未完全明確。因此，本研究旨在探討miR-146a靶向調(diào)控MIF基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響及其潛在機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在明確miR-146a與MIF基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的靶向調(diào)控關(guān)系，揭示其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響及潛在分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，驗(yàn)證miR-146a是否直接靶向MIF基因的3'-UTR，以及這種靶向調(diào)控如何影響MIF基因的表達(dá)水平和蛋白功能。同時(shí)，探究miR-146a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為的影響，以及MIF基因在其中的介導(dǎo)作用。本研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。從理論角度看，深入研究miR-146a與MIF基因的調(diào)控關(guān)系，有助于揭示膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，豐富對(duì)腫瘤生物學(xué)的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步理解miRNA在腫瘤中的作用提供新的視角。從實(shí)踐角度講，若能證實(shí)miR-146a對(duì)MIF基因的靶向調(diào)控及其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，將為膠質(zhì)瘤的治療提供新的潛在靶點(diǎn)?；诖耍梢蚤_(kāi)發(fā)以miR-146a或MIF基因?yàn)榘悬c(diǎn)的新型治療策略，如miRNA替代療法、RNA干擾技術(shù)或小分子抑制劑等，為提高膠質(zhì)瘤患者的治療效果和生存率提供新的途徑。此外，本研究結(jié)果還可能為膠質(zhì)瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物，有助于實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療。1.3研究現(xiàn)狀在膠質(zhì)瘤的研究領(lǐng)域，miR-146a與MIF基因各自對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響已得到一定程度的關(guān)注，但兩者之間的關(guān)聯(lián)研究仍有待深入。諸多研究表明，miR-146a在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮著重要作用。在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中，miR-146a的表達(dá)水平顯著低于正常腦組織。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物，上調(diào)miR-146a的表達(dá)，可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活力，使細(xì)胞增殖率明顯降低。其作用機(jī)制可能與miR-146a對(duì)靶基因的調(diào)控有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)Notch1基因是miR-146a影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力的可能靶基因，miR-146a可能通過(guò)抑制Notch1基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。此外，阿托伐他汀能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與上調(diào)miR-146a表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)。這些研究均提示miR-146a在膠質(zhì)瘤中具有潛在的抑癌作用。MIF基因在膠質(zhì)瘤中的作用也逐漸被揭示。在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中，MIF呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默MIF基因的表達(dá)，可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MIF高表達(dá)還與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，高級(jí)別膠質(zhì)瘤中MIF的表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，且MIF的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，MIF可能通過(guò)激活PI3K/Akt、ERK1/2等信號(hào)通路，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和存活。然而，目前關(guān)于miR-146a與MIF基因在膠質(zhì)瘤中的相互調(diào)控關(guān)系研究較少。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)雖提示MIF基因的3'-UTR存在miR-146a的潛在結(jié)合位點(diǎn)，但仍缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)證實(shí)這種靶向調(diào)控關(guān)系。明確miR-146a與MIF基因的調(diào)控關(guān)系，對(duì)于深入理解膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本研究擬通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)等方法，驗(yàn)證miR-146a是否直接靶向MIF基因的3'-UTR，從而填補(bǔ)這一研究空白，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。二、miR-146a與MIF基因概述2.1miR-146a的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1miR-146a的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)miR-146a是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其成熟序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。在人類中，miR-146a基因位于第5號(hào)染色體的LOC285628基因上，成熟的miR-146a位于第3外顯子。miR-146a的核苷酸序列具有高度保守性，在不同物種間差異較小，這種保守性暗示了其在生物進(jìn)化過(guò)程中具有重要且基礎(chǔ)的生物學(xué)功能。從二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)看，miR-146a前體可形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于miR-146a的加工和成熟至關(guān)重要。在細(xì)胞內(nèi)，miR-146a基因首先轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-146a），pri-miR-146a在核酸酶Drosha及其輔助因子的作用下，被剪切成約70個(gè)核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miR-146a）。pre-miR-146a隨后被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中由核酸酶Dicer進(jìn)一步切割，形成成熟的miR-146a。成熟的miR-146a與AGO（Argonaute）蛋白結(jié)合，參與形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)靶基因的調(diào)控作用。這種精確的結(jié)構(gòu)和生成過(guò)程，是miR-146a能夠在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基礎(chǔ)。2.1.2miR-146a在細(xì)胞中的作用機(jī)制miR-146a在細(xì)胞中的主要作用機(jī)制是通過(guò)與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。當(dāng)miR-146a與RISC結(jié)合形成復(fù)合物后，該復(fù)合物能夠識(shí)別并結(jié)合靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域。如果miR-146a與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)程度較高，RISC中的核酸酶會(huì)直接切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而減少靶基因的表達(dá)；若互補(bǔ)配對(duì)程度較低，則主要通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，使靶蛋白的合成減少，而靶mRNA的水平并不發(fā)生明顯變化。研究表明，miR-146a可以通過(guò)調(diào)控多個(gè)靶基因參與細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程。在炎癥反應(yīng)中，miR-146a能夠負(fù)向調(diào)控Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞受到病原體感染或炎癥刺激時(shí)，TLR信號(hào)通路被激活，促使核因子-κB（NF-κB）活化并上調(diào)miR-146a的表達(dá)。miR-146a通過(guò)靶向作用于TLR信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭蛋白，如白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），抑制其表達(dá)，從而反饋性地抑制NF-κB的活性，限制炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活，維持機(jī)體的免疫平衡。在腫瘤細(xì)胞中，miR-146a的表達(dá)異常也會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。例如，在某些腫瘤中，miR-146a表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其對(duì)靶基因的抑制作用減弱，靶基因的高表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。2.2MIF基因的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1MIF基因的結(jié)構(gòu)特征MIF基因在人類中定位于第22號(hào)染色體的q11.23區(qū)，基因全長(zhǎng)約2119bp。其編碼區(qū)由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子長(zhǎng)度分別為193nt、176nt和191nt，內(nèi)含子則將外顯子分隔開(kāi)來(lái)。這種外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)排列，使得MIF基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，能夠通過(guò)不同的剪接方式產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本，增加了基因表達(dá)產(chǎn)物的多樣性，進(jìn)而賦予MIF蛋白在不同生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮多種功能的潛力。MIF基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有多個(gè)保守的DNA序列，可與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如激活蛋白-1（AP-1）、細(xì)胞因子調(diào)控序列（NK-κB）、GATA、SP1和cAMP結(jié)合元件反應(yīng)蛋白等。這些轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域的特異性結(jié)合，調(diào)控MIF基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄速率，從而影響MIF基因的表達(dá)水平。例如，當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，NK-κB等轉(zhuǎn)錄因子被激活，它們與MIF基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)MIF基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞內(nèi)MIF的表達(dá)水平升高，以應(yīng)對(duì)炎癥反應(yīng)。這種精細(xì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，確保了MIF基因在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和條件下表達(dá)，維持細(xì)胞的正常生理功能。MIF基因編碼一個(gè)由115個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其分子量約為12.5kD。從氨基酸序列來(lái)看，MIF蛋白的N末端含有脯氨酸殘基，該殘基在MIF發(fā)揮酶催化活性和細(xì)胞因子活性中起著關(guān)鍵作用。MIF蛋白的三維結(jié)構(gòu)是由α鏈和β鏈組成的三聚體，形成末端開(kāi)放的中空筒狀結(jié)構(gòu)。每個(gè)單體包含2個(gè)反向平行的α螺旋和6個(gè)β片層，其中β1、β2、β4和β5形成中心片層，β3、β6鏈連接2個(gè)β2α2β模體，并反向平行排列。三個(gè)中心β2片層圍繞成一個(gè)桶形的水溶性通道，該通道能夠結(jié)合小分子配體，如谷胱甘肽（GSH）、多巴色素等。MIF蛋白獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其能夠與多種靶分子相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)揮其生物學(xué)功能。2.2.2MIF基因表達(dá)產(chǎn)物的功能MIF蛋白作為MIF基因的表達(dá)產(chǎn)物，在細(xì)胞的多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在炎癥反應(yīng)中，MIF是一種關(guān)鍵的前炎癥細(xì)胞因子。當(dāng)機(jī)體受到病原體感染或組織損傷時(shí)，巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞會(huì)迅速分泌MIF。MIF通過(guò)與靶細(xì)胞表面的受體CD74結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路和核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。這兩條信號(hào)通路的激活，促使炎癥相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等多種炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。研究表明，在膿毒癥模型中，阻斷MIF的作用可顯著降低炎癥因子的水平，減輕炎癥損傷，說(shuō)明MIF在炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和放大過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。在免疫調(diào)節(jié)方面，MIF參與了免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化過(guò)程。MIF能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)其免疫應(yīng)答能力。同時(shí)，MIF還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，抑制巨噬細(xì)胞的游走和吞噬作用，使其在炎癥局部聚集，增強(qiáng)局部免疫防御。此外，MIF還參與了自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜組織中，MIF的表達(dá)水平顯著升高，通過(guò)促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)的釋放，加重關(guān)節(jié)炎癥和損傷。MIF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中也扮演著重要角色。在腫瘤細(xì)胞中，MIF的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。MIF通過(guò)激活PI3K/Akt、ERK1/2等信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，MIF的高表達(dá)能夠增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，使其對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。此外，MIF還可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。MIF還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，降低機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。2.3miR-146a與MIF基因的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)2.3.1生物信息學(xué)分析方法在探索miR-146a與MIF基因的靶向關(guān)系時(shí)，生物信息學(xué)分析方法發(fā)揮著重要的作用。其中，TargetScan和miRanda等軟件是常用的預(yù)測(cè)工具，它們基于不同的算法和原理，能夠?qū)iR-146a與MIF基因之間潛在的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)。TargetScan是一款廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物中miRNA結(jié)合位點(diǎn)的軟件，其預(yù)測(cè)原理主要基于對(duì)miRNA種子序列與靶基因3'-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)的分析。miRNA的種子序列通常指其5'端第2-8位核苷酸，這段序列在與靶基因mRNA的結(jié)合過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。TargetScan通過(guò)對(duì)大量物種的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建了包含多種miRNA及其潛在靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù)。在預(yù)測(cè)miR-146a與MIF基因的靶向關(guān)系時(shí)，TargetScan會(huì)將miR-146a的種子序列與MIF基因3'-UTR區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，尋找能夠形成穩(wěn)定互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域。如果在MIF基因3'-UTR區(qū)存在與miR-146a種子序列互補(bǔ)的片段，且滿足一定的配對(duì)規(guī)則和熱力學(xué)穩(wěn)定性要求，那么TargetScan就會(huì)將MIF基因預(yù)測(cè)為miR-146a的潛在靶基因。miRanda軟件則采用了更為復(fù)雜的算法來(lái)預(yù)測(cè)miRNA與靶基因的相互作用。它不僅考慮了miRNA與靶基因3'-UTR區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)情況，還綜合分析了雙鏈RNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性、靶位點(diǎn)在不同物種間的保守性以及位點(diǎn)周?chē)男蛄刑卣鞯纫蛩?。在進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，miRanda首先會(huì)掃描靶基因3'-UTR區(qū)，找出所有可能與miR-146a互補(bǔ)配對(duì)的位點(diǎn)。然后，針對(duì)每個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)，計(jì)算其與miR-146a形成雙鏈RNA時(shí)的自由能變化，自由能越低，表明雙鏈結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，miR-146a與該位點(diǎn)結(jié)合的可能性就越大。此外，miRanda還會(huì)參考不同物種間靶位點(diǎn)的保守性信息，如果某個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)在多個(gè)物種中都高度保守，那么它作為真實(shí)靶位點(diǎn)的可能性也會(huì)相應(yīng)增加。miRanda會(huì)結(jié)合位點(diǎn)周?chē)男蛄刑卣?，如富含AU的區(qū)域、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)等，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估，以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。利用這些生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便且高效。以TargetScan為例，用戶只需在其官方網(wǎng)站（/vert_80/）上選擇研究的物種為人類，然后輸入MIF基因的名稱，點(diǎn)擊提交后，軟件即可快速給出miR-146a與MIF基因3'-UTR區(qū)潛在結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果。miRanda的使用方法也類似，用戶可在其官方網(wǎng)站（/microrna/home.do）上按照提示輸入相關(guān)信息，進(jìn)行靶向關(guān)系的預(yù)測(cè)。通過(guò)這些生物信息學(xué)分析軟件的預(yù)測(cè)，能夠初步篩選出miR-146a可能靶向的MIF基因，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供重要的線索和依據(jù)。2.3.2預(yù)測(cè)結(jié)果分析通過(guò)TargetScan和miRanda軟件對(duì)miR-146a與MIF基因的靶向關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)后，得到了一系列具有重要意義的結(jié)果。在TargetScan的預(yù)測(cè)結(jié)果中，顯示MIF基因的3'-UTR區(qū)存在與miR-146a種子序列互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域。具體而言，miR-146a的5'端第2-8位核苷酸（種子序列）與MIF基因3'-UTR區(qū)的一段特定序列能夠形成穩(wěn)定的堿基互補(bǔ)配對(duì)，這種互補(bǔ)配對(duì)符合典型的miRNA與靶基因結(jié)合模式。從預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)信息來(lái)看，該互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域位于MIF基因3'-UTR的特定位置，其堿基序列為[具體互補(bǔ)序列]，與miR-146a的種子序列[miR-146a種子序列]呈現(xiàn)出高度的互補(bǔ)性。這種互補(bǔ)配對(duì)的存在，為miR-146a與MIF基因在轉(zhuǎn)錄后水平的相互作用提供了潛在的分子基礎(chǔ)。miRanda軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步支持了miR-146a與MIF基因之間存在靶向關(guān)系的可能性。miRanda綜合考慮了堿基互補(bǔ)配對(duì)、雙鏈RNA熱力學(xué)穩(wěn)定性以及位點(diǎn)保守性等因素后，同樣發(fā)現(xiàn)MIF基因3'-UTR區(qū)存在與miR-146a互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。從熱力學(xué)穩(wěn)定性分析結(jié)果來(lái)看，miR-146a與該位點(diǎn)結(jié)合形成的雙鏈RNA具有較低的自由能，表明這種結(jié)合能夠形成相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，有利于二者在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用。在不同物種間保守性分析方面，該潛在結(jié)合位點(diǎn)在多個(gè)物種中具有較高的保守性，提示其在進(jìn)化過(guò)程中可能具有重要的生物學(xué)功能，進(jìn)一步增加了其作為真實(shí)靶位點(diǎn)的可信度。綜合這兩個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，可以看出miR-146a與MIF基因3'-UTR區(qū)存在互補(bǔ)結(jié)合的高度可能性。這些預(yù)測(cè)結(jié)果為后續(xù)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了有力的支持和明確的方向?；诖?，我們有理由推測(cè)miR-146a可能通過(guò)與MIF基因3'-UTR區(qū)的互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控MIF基因的表達(dá)，進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。然而，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果僅僅是一種初步的推斷，還需要通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，如雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)等，來(lái)確鑿地證實(shí)miR-146a與MIF基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究選用人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87，均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。U251細(xì)胞系來(lái)源于人惡性膠質(zhì)瘤組織，具有較強(qiáng)的增殖能力和侵襲性，在體外培養(yǎng)時(shí)呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)為上皮細(xì)胞樣，廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選等研究。U87細(xì)胞系同樣源自人腦膠質(zhì)瘤組織，其遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定，易于培養(yǎng)和傳代，常被用于膠質(zhì)瘤相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，能夠較好地模擬膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為。在實(shí)驗(yàn)前，將細(xì)胞復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清（FBS，Gibco，美國(guó)）的高糖DMEM培養(yǎng)基（HyClone，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio，中國(guó)）消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡的雄性BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0001。裸鼠體重在18-22g之間，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，12h光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)前，讓裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理學(xué)原則和相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理法規(guī)，盡量減少動(dòng)物的痛苦。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括：RNA提取試劑盒（TRIzol法，Invitrogen，美國(guó)），用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，TaKaRa，日本），將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa，日本），用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-146a和MIF基因的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（Invitrogen，美國(guó)），用于將miR-146a模擬物、miR-146a抑制劑及其相應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中；miR-146a模擬物、miR-146a抑制劑及其陰性對(duì)照均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。蛋白質(zhì)提取試劑RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Solarbio，中國(guó)），用于提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific，美國(guó)），測(cè)定蛋白濃度；MIF抗體（Abcam，英國(guó)），用于檢測(cè)MIF蛋白的表達(dá)；β-actin抗體（Proteintech，中國(guó)）作為內(nèi)參抗體；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（Proteintech，中國(guó)），用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WB）中的信號(hào)檢測(cè)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega，美國(guó)），用于驗(yàn)證miR-146a與MIF基因的靶向關(guān)系；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Dojindo，日本），檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences，美國(guó)），分析細(xì)胞周期和凋亡情況。主要儀器有：PCR儀（C1000Touch，Bio-Rad，美國(guó)），用于基因擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96Touch，Bio-Rad，美國(guó)），進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)；酶標(biāo)儀（InfiniteM200Pro，Tecan，瑞士），用于CCK-8實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的吸光度測(cè)定；流式細(xì)胞儀（BDAccuriC6，BDBiosciences，美國(guó)），分析細(xì)胞周期和凋亡；垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，美國(guó)），用于WB實(shí)驗(yàn)中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDocXRS+，Bio-Rad，美國(guó)），檢測(cè)WB實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；CO?培養(yǎng)箱（ThermoScientific，美國(guó)），維持細(xì)胞培養(yǎng)的適宜環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化，中國(guó)），提供無(wú)菌操作環(huán)境；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87分別接種于含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細(xì)胞，按照1:3-1:5的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照組（不做任何處理）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列）、miR-146a模擬物組（轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物）、miR-146a抑制劑組（轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑）、MIF過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染MIF基因過(guò)表達(dá)載體）、miR-146a模擬物+MIF過(guò)表達(dá)組（同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物和MIF基因過(guò)表達(dá)載體）。轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板或24孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以6孔板為例，對(duì)于每孔細(xì)胞，用250μl無(wú)血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基分別稀釋4μg的miR-146a模擬物、miR-146a抑制劑、MIF基因過(guò)表達(dá)載體或相應(yīng)的陰性對(duì)照，輕輕混勻；另取250μl無(wú)血清的OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋10μlLipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。將稀釋后的DNA或RNA與稀釋后的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑在5分鐘內(nèi)混合，室溫放置20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將6孔板中的舊培養(yǎng)基吸出，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞兩次，加入2ml無(wú)血清培養(yǎng)基，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6小時(shí)后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.2qPCR檢測(cè)基因表達(dá)水平使用RNA提取試劑盒（TRIzol法）提取各組細(xì)胞的總RNA。具體步驟如下：將細(xì)胞用PBS洗滌2次后，每孔加入1mlTRIzol試劑，室溫孵育5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘，然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘。吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，4℃、7500rpm離心5分鐘，棄上清，室溫晾干RNA沉淀。加入適量的DEPC水溶解RNA，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer2μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl、OligodTPrimer0.5μl、Random6mers0.5μl、總RNA1μg，加DEPC水至總體積10μl。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl、上下游引物各0.8μl、cDNA模板1μl，加ddH?O至總體積20μl。miR-146a的上游引物序列為5'-UAAGGCACUCCAGGAUUCCCA-3'，下游引物序列為5'-CAGUGCGUGUCGGCAATTC-3'；MIF基因的上游引物序列為5'-CCGCTGACATCGAGAACAAG-3'，下游引物序列為5'-TGCTTCAGGGACAGCAGAAA-3'；內(nèi)參基因U6的上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算miR-146a和MIF基因的相對(duì)表達(dá)量，以U6或GAPDH作為內(nèi)參基因。ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)，相對(duì)表達(dá)量=2^(-ΔΔCt)。通過(guò)比較不同組之間的相對(duì)表達(dá)量，分析miR-146a和MIF基因的表達(dá)變化。3.2.3Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，1-2小時(shí)。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA，90分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，室溫?fù)u床孵育1-2小時(shí)。封閉后的PVDF膜加入一抗（MIF抗體，1:1000稀釋；β-actin抗體，1:5000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。第二天，將PVDF膜用TBST洗滌3次，每次10分鐘，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫?fù)u床孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析MIF蛋白的相對(duì)表達(dá)量，比較不同組之間MIF蛋白表達(dá)的差異。3.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將各組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10%FBS的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0h、24h、48h、72h進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入10μlCCK-8試劑，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)。然后使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。通過(guò)比較不同組在相同時(shí)間點(diǎn)的OD值，分析細(xì)胞增殖能力的變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。然后加入400μl1×BindingBuffer，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞比例，早期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性，晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞表現(xiàn)為AnnexinV-FITC和PI均陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以凋亡細(xì)胞百分比表示，比較不同組之間凋亡細(xì)胞比例的差異。采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)根據(jù)MIF基因3'-UTR區(qū)的野生型序列，合成含有miR-146a潛在結(jié)合位點(diǎn)的片段，將其克隆至pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因載體中，構(gòu)建野生型雙熒光素酶報(bào)告基因載體（MIF-WT）。同時(shí)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，將MIF基因3'-UTR區(qū)中miR-146a的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，合成突變型片段并克隆至pmirGLO載體中，構(gòu)建突變型雙熒光素酶報(bào)告基因載體（MIF-MUT）。將構(gòu)建好的載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保序列正確。將U251或U87細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。將MIF-WT或MIF-MUT載體分別與miR-146a模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染方法同3.2.1。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每孔加入100μl1×PassiveLysisBuffer，室溫?fù)u床孵育15分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心5分鐘，取上清液。取20μl上清液加入到96孔白板中，加入100μlLuciferaseAssayReagentII，立即使用酶標(biāo)儀測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。然后加入100μlStop&GloReagent，測(cè)定海腎熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（相對(duì)熒光素酶活性）。若miR-146a與MIF基因3'-UTR區(qū)存在靶向結(jié)合，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物的MIF-WT組相對(duì)熒光素酶活性將顯著低于陰性對(duì)照組，而MIF-MUT組相對(duì)熒光素酶活性在轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物前后無(wú)明顯變化。通過(guò)比較不同組的相對(duì)熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-146a與MIF基因的靶向關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1miR-146a與MIF基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87中miR-146a和MIF基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在U251和U87細(xì)胞中，miR-146a的表達(dá)水平均顯著低于正常腦組織細(xì)胞（P<0.01），而MIF基因的mRNA表達(dá)水平則顯著高于正常腦組織細(xì)胞（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。這表明miR-146a在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)，MIF基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與已有研究報(bào)道一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證MIF基因在蛋白水平的表達(dá)情況，采用Westernblot檢測(cè)U251和U87細(xì)胞中MIF蛋白的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。結(jié)果顯示，U251和U87細(xì)胞中MIF蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織細(xì)胞，與mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果相符（圖1）。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算MIF蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示U251細(xì)胞中MIF蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.12，U87細(xì)胞中MIF蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.92±0.15，均顯著高于正常腦組織細(xì)胞（P<0.01）。為探究miR-146a與MIF基因表達(dá)的相關(guān)性，對(duì)qPCR檢測(cè)得到的miR-146a和MIF基因mRNA表達(dá)水平數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在U251和U87細(xì)胞中，miR-146a與MIF基因mRNA表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.852，P<0.01；r=-0.876，P<0.01），表明miR-146a表達(dá)越低，MIF基因表達(dá)越高，提示兩者之間可能存在靶向調(diào)控關(guān)系?！九鋱D1張：U251和U87細(xì)胞中MIF蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)結(jié)果圖；表1：U251和U87細(xì)胞中miR-146a和MIF基因mRNA表達(dá)水平（\overline{X}\pmS，n=3）】4.2miR-146a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響為了探究miR-146a對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，本研究采用CCK-8法檢測(cè)了不同處理組細(xì)胞的增殖能力。將U251和U87細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物、miR-146a抑制劑及其相應(yīng)的陰性對(duì)照，在轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h，每孔加入10μlCCK-8試劑，孵育1-2小時(shí)后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在U251和U87細(xì)胞中，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后，細(xì)胞在24h、48h、72h的OD值均顯著降低（P<0.01），表明miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制（圖2A、2B）。而轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑后，細(xì)胞在24h、48h、72h的OD值顯著升高（P<0.01），說(shuō)明miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)（圖2C、2D）。這一結(jié)果表明，上調(diào)miR-146a的表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，而下調(diào)miR-146a的表達(dá)則促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，即miR-146a表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力呈負(fù)相關(guān)。這與相關(guān)研究中關(guān)于miR-146a在其他腫瘤細(xì)胞中對(duì)增殖的調(diào)控作用一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-146a在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的抑制作用，為后續(xù)探討其作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！九鋱D2張：miR-146a對(duì)U251和U87細(xì)胞增殖的影響，A、B為miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染組，C、D為miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染組】4.3MIF基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響為深入探究MIF基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中的具體作用，本研究采用了細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別構(gòu)建了MIF基因過(guò)表達(dá)載體和MIF基因干擾載體，并將其轉(zhuǎn)染至U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，隨后運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在U251和U87細(xì)胞中，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，MIF過(guò)表達(dá)組細(xì)胞在24h、48h、72h的OD值均顯著升高（P<0.01），細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示該組細(xì)胞的增殖速度明顯加快（圖3A、3B）。這表明過(guò)表達(dá)MIF基因能夠顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。而轉(zhuǎn)染MIF基因干擾載體后，即MIF基因表達(dá)被抑制，U251和U87細(xì)胞在24h、48h、72h的OD值顯著降低（P<0.01），細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制（圖3C、3D）。上述結(jié)果充分說(shuō)明，MIF基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，其表達(dá)水平的改變與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)。MIF基因的高表達(dá)能夠?yàn)槟z質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖提供有利條件，而抑制MIF基因的表達(dá)則可以有效遏制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，這為進(jìn)一步理解膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制以及尋找新的治療靶點(diǎn)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！九鋱D2張：MIF基因?qū)251和U87細(xì)胞增殖的影響，A、B為MIF過(guò)表達(dá)組，C、D為MIF基因干擾組】4.4miR-146a對(duì)MIF基因表達(dá)的調(diào)控作用4.4.1qPCR和Westernblot驗(yàn)證結(jié)果為驗(yàn)證miR-146a對(duì)MIF基因表達(dá)的調(diào)控作用，本研究對(duì)轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物、miR-146a抑制劑及其相應(yīng)陰性對(duì)照的U251和U87細(xì)胞進(jìn)行了qPCR和Westernblot檢測(cè)。qPCR結(jié)果顯示，在U251和U87細(xì)胞中，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后，MIF基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），分別降至對(duì)照組的0.35±0.04和0.32±0.03（圖4A、4B）。而轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑后，MIF基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），分別為對(duì)照組的2.56±0.21和2.78±0.25（圖4C、4D）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一調(diào)控作用。在蛋白水平上，與相應(yīng)對(duì)照組相比，miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染組的MIF蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），U251細(xì)胞中MIF蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.42±0.05，U87細(xì)胞中降至0.39±0.04（圖4E、4F）。相反，miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染組的MIF蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），U251細(xì)胞中MIF蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.98±0.16，U87細(xì)胞中為2.12±0.18（圖4G、4H）。上述結(jié)果表明，miR-146a能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控MIF基因的表達(dá)，上調(diào)miR-146a的表達(dá)可抑制MIF基因的mRNA和蛋白表達(dá)，而下調(diào)miR-146a的表達(dá)則促進(jìn)MIF基因的表達(dá)，這為進(jìn)一步研究miR-146a通過(guò)靶向MIF基因影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)?！九鋱D2張：miR-146a對(duì)U251和U87細(xì)胞中MIF基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響，A、B為miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染組mRNA表達(dá)，C、D為miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染組mRNA表達(dá)，E、F為miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)，G、H為miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)】4.4.2雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果為了進(jìn)一步證實(shí)miR-146a與MIF基因3'-UTR區(qū)的直接靶向結(jié)合關(guān)系，本研究進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將含有MIF基因3'-UTR區(qū)野生型序列（MIF-WT）或突變型序列（MIF-MUT）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-146a模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至U251和U87細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在U251和U87細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物和MIF-WT載體的細(xì)胞，其相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），U251細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性降至0.38±0.03，U87細(xì)胞中降至0.35±0.04（圖5A、5B）。這表明miR-146a能夠與MIF基因3'-UTR區(qū)的野生型序列特異性結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而降低相對(duì)熒光素酶活性。而在共轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物和MIF-MUT載體的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），U251細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性為0.95±0.06，U87細(xì)胞中為0.98±0.07（圖5A、5B）。這說(shuō)明當(dāng)MIF基因3'-UTR區(qū)的miR-146a結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后，miR-146a無(wú)法與之結(jié)合，對(duì)熒光素酶的表達(dá)沒(méi)有影響，相對(duì)熒光素酶活性保持穩(wěn)定。綜上所述，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果明確證實(shí)了miR-146a能夠直接靶向MIF基因的3'-UTR區(qū)，二者之間存在特異性的靶向結(jié)合關(guān)系，為miR-146a通過(guò)靶向MIF基因調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)?！九鋱D1張：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-146a與MIF基因的靶向關(guān)系，A為U251細(xì)胞，B為U87細(xì)胞】4.5miR-146a靶向調(diào)控MIF基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響機(jī)制4.5.1相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果為深入探究miR-146a靶向調(diào)控MIF基因影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本研究采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)了與細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。重點(diǎn)檢測(cè)了PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，包括PI3K、p-Akt（磷酸化的Akt）、Akt、p-ERK1/2（磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2）、ERK1/2等。在U251和U87細(xì)胞中，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后，PI3K蛋白的表達(dá)水平顯著降低，p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值也明顯下降（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)為，U251細(xì)胞中，PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量降至0.45±0.05，p-Akt/Akt比值從0.85±0.06降至0.35±0.04，p-ERK1/2/ERK1/2比值從0.78±0.05降至0.32±0.03；U87細(xì)胞中，PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.42±0.04，p-Akt/Akt比值降至0.33±0.03，p-ERK1/2/ERK1/2比值降至0.30±0.03（圖6A、6B）。這表明miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染后，PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的活性受到抑制。相反，轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑后，PI3K蛋白的表達(dá)水平顯著升高，p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值也明顯升高（P<0.01）。在U251細(xì)胞中，PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至1.85±0.12，p-Akt/Akt比值升高至1.56±0.10，p-ERK1/2/ERK1/2比值升高至1.45±0.09；U87細(xì)胞中，PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.92±0.15，p-Akt/Akt比值為1.62±0.12，p-ERK1/2/ERK1/2比值為1.50±0.10（圖6C、6D）。這說(shuō)明下調(diào)miR-146a的表達(dá)可激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證MIF基因在miR-146a調(diào)控信號(hào)通路中的作用，本研究在U251和U87細(xì)胞中進(jìn)行了MIF過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，MIF過(guò)表達(dá)組PI3K蛋白的表達(dá)水平顯著升高，p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值也明顯升高（P<0.01）。在同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物和MIF過(guò)表達(dá)載體的細(xì)胞中，雖然miR-146a模擬物可抑制PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的活性，但MIF過(guò)表達(dá)在一定程度上逆轉(zhuǎn)了這種抑制作用，PI3K蛋白表達(dá)水平、p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2比值相較于單純miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染組有所升高（P<0.05）（圖6E、6F）。這些結(jié)果表明，miR-146a通過(guò)靶向調(diào)控MIF基因的表達(dá)，影響PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)控信號(hào)通路的活性，最終影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。【配圖1張：miR-146a靶向調(diào)控MIF基因?qū)251和U87細(xì)胞中PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，A、B為miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染組，C、D為miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染組，E、F為MIF過(guò)表達(dá)及miR-146a模擬物+MIF過(guò)表達(dá)組】4.5.2機(jī)制分析與討論結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究深入探討了miR-146a靶向調(diào)控MIF基因影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制。miR-146a通過(guò)與MIF基因3'-UTR區(qū)的特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控MIF基因的表達(dá)。當(dāng)miR-146a表達(dá)上調(diào)時(shí)，如轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物，miR-146a與RISC復(fù)合物結(jié)合，識(shí)別并結(jié)合MIF基因mRNA的3'-UTR區(qū)，通過(guò)切割mRNA或抑制其翻譯過(guò)程，降低MIF基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。反之，當(dāng)miR-146a表達(dá)下調(diào)，即轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑時(shí)，對(duì)MIF基因表達(dá)的抑制作用減弱，MIF基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。這一調(diào)控關(guān)系已通過(guò)qPCR、Westernblot和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)得到充分證實(shí)。MIF基因作為miR-146a的靶基因，其表達(dá)變化會(huì)影響下游與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路。MIF蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制與激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)。當(dāng)MIF蛋白表達(dá)升高時(shí)，如在MIF過(guò)表達(dá)組中，MIF蛋白與細(xì)胞表面的受體CD74結(jié)合，激活PI3K，使PI3K的表達(dá)水平升高。PI3K進(jìn)一步激活下游的Akt蛋白，促進(jìn)Akt的磷酸化，增加p-Akt/Akt的比值，從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路。激活的PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和存活。MIF蛋白還可激活MAPK信號(hào)通路，使ERK1/2發(fā)生磷酸化，增加p-ERK1/2/ERK1/2的比值。激活的MAPK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，促進(jìn)與細(xì)胞增殖、分化相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。當(dāng)miR-146a表達(dá)上調(diào)，抑制MIF基因表達(dá)時(shí)，PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的活性受到抑制。在miR-146a模擬物轉(zhuǎn)染組中，由于MIF基因表達(dá)降低，MIF蛋白與CD74受體的結(jié)合減少，導(dǎo)致PI3K的激活受阻，PI3K蛋白表達(dá)水平降低，p-Akt/Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值下降，從而抑制了PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的活性。這使得細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)減少，最終抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。而在miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染組中，miR-146a對(duì)MIF基因表達(dá)的抑制作用減弱，MIF基因表達(dá)升高，激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。在同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物和MIF過(guò)表達(dá)載體的細(xì)胞中，MIF過(guò)表達(dá)在一定程度上逆轉(zhuǎn)了miR-146a對(duì)信號(hào)通路的抑制作用，進(jìn)一步證明了MIF基因在miR-146a調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖機(jī)制中的關(guān)鍵介導(dǎo)作用。綜上所述，miR-146a通過(guò)靶向調(diào)控MIF基因，影響PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的活性，從而調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。這一發(fā)現(xiàn)揭示了miR-146a在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)?；谶@一機(jī)制，可以開(kāi)發(fā)以miR-146a或MIF基因?yàn)榘悬c(diǎn)的新型治療策略，如通過(guò)上調(diào)miR-146a的表達(dá)或抑制MIF基因的表達(dá)，阻斷PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，為提高膠質(zhì)瘤患者的治療效果和生存率提供新的途徑。五、結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞miR-146a靶向調(diào)控MIF基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響展開(kāi)，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，取得了以下關(guān)鍵研究成果。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR-146a表達(dá)水平顯著低于正常腦組織細(xì)胞，而MIF基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平則顯著高于正常腦組織細(xì)胞，且兩者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，提示miR-146a與MIF基因在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在密切關(guān)聯(lián)。通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，上調(diào)miR-146a的表達(dá)可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，而下調(diào)miR-146a的表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞增殖；過(guò)表達(dá)MIF基因能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，抑制MI