Survivin反義寡核苷酸：開(kāi)啟人涎腺腺樣囊性癌治療新征程一、引言1.1研究背景涎腺腺樣囊性癌（SalivaryAdenoidCysticCarcinoma，SACC）作為一種常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)都有一定的發(fā)病率。它好發(fā)于40-60歲人群，無(wú)明顯性別差異，可發(fā)生于任何涎腺組織，小涎腺更為常見(jiàn)，如腭部、鼻腔、鼻竇等部位。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，在涎腺惡性腫瘤中，腺樣囊性癌約占10%-30%。SACC具有獨(dú)特且棘手的生物學(xué)特性。其惡性程度高，侵襲性極強(qiáng)，這使得腫瘤細(xì)胞極易侵犯周?chē)M織和神經(jīng)，導(dǎo)致患者早期就可能出現(xiàn)疼痛、麻木等神經(jīng)受累癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。同時(shí)，它還具有易復(fù)發(fā)和易早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，即使在進(jìn)行手術(shù)切除后，復(fù)發(fā)率仍居高不下，有研究表明其術(shù)后5年復(fù)發(fā)率可達(dá)30%-50%。而且，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)血行轉(zhuǎn)移或淋巴轉(zhuǎn)移，常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨等，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率在20%-40%左右。這不僅增加了治療的難度，也大大降低了患者的生存率，5年生存率通常在50%-70%之間。此外，SACC對(duì)傳統(tǒng)的放療和化療并不敏感。放療難以完全殺死腫瘤細(xì)胞，化療雖然能夠在一定程度上抑制腫瘤生長(zhǎng)，但由于腫瘤細(xì)胞的耐藥性，效果往往不盡如人意。手術(shù)治療作為主要手段，也難以徹底根除腫瘤，因?yàn)槟[瘤邊界不清，容易殘留癌細(xì)胞。這些治療困境使得尋找有效的輔助性治療手段迫在眉睫。Survivin作為新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（InhibitorofApoptosisProteins，IAP）家族的新成員，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受關(guān)注。它特異表達(dá)于人的胚胎組織以及多數(shù)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞，在成人正常組織中幾乎不表達(dá)，但在腫瘤組織中高表達(dá)。這種特異性表達(dá)使得反義Survivin基因治療具有良好的靶向性，能夠精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞影響較小，具有較高的特異性及安全性?；赟ACC的治療難題以及Survivin的獨(dú)特特性，開(kāi)展Survivin反義寡核苷酸治療人涎腺腺樣囊性癌的研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為SACC的治療開(kāi)辟新的途徑，改善患者的預(yù)后。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)深入探究Survivin反義寡核苷酸對(duì)人涎腺腺樣囊性癌的作用機(jī)制和治療效果，為該疾病的臨床治療提供全新的策略和理論依據(jù)。在理論層面，Survivin作為凋亡抑制蛋白家族的關(guān)鍵成員，在人涎腺腺樣囊性癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色。然而，其具體的作用機(jī)制以及與其他相關(guān)信號(hào)通路的交互關(guān)系，仍有待進(jìn)一步深入挖掘。本研究通過(guò)干擾Survivin基因的表達(dá)，觀察人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞在生物學(xué)行為、基因和蛋白表達(dá)水平等方面的變化，能夠深入揭示Survivin在人涎腺腺樣囊性癌中的作用機(jī)制，為從分子層面理解該疾病的發(fā)病機(jī)制提供全新的視角。這不僅有助于豐富腫瘤分子生物學(xué)的理論知識(shí)，還能為后續(xù)開(kāi)發(fā)針對(duì)Survivin的靶向治療藥物奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。從實(shí)踐意義來(lái)講，人涎腺腺樣囊性癌的現(xiàn)有治療手段存在諸多局限性，迫切需要尋找更加有效的治療方法。本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證Survivin反義寡核苷酸對(duì)人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)以及腫瘤生長(zhǎng)抑制作用，為臨床治療提供了極具潛力的新方案。若Survivin反義寡核苷酸在實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的治療效果，未來(lái)有望進(jìn)一步開(kāi)展臨床試驗(yàn)，轉(zhuǎn)化為臨床治療手段，為患者帶來(lái)新的希望。此外，這種靶向治療方法相較于傳統(tǒng)治療手段，具有更高的特異性和安全性，能夠在有效治療腫瘤的同時(shí)，減少對(duì)正常組織的損傷，降低患者的痛苦和并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提高患者的生活質(zhì)量。這對(duì)于改善人涎腺腺樣囊性癌患者的預(yù)后，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間具有重要意義，也將為腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法上，本研究具有多個(gè)創(chuàng)新之處。一方面，本研究將多種先進(jìn)技術(shù)聯(lián)用，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式將Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染到人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)cc-M中，利用RT-PCR技術(shù)從基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)Survivin基因mRNA表達(dá)的變化，又通過(guò)Western-blot從蛋白質(zhì)水平分析Survivin蛋白表達(dá)的改變，還借助MTT法精確測(cè)定細(xì)胞增殖抑制情況，采用流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞凋亡率。多種技術(shù)相互驗(yàn)證、相互補(bǔ)充，從不同層面深入剖析Survivin反義寡核苷酸對(duì)人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的作用機(jī)制，克服了單一技術(shù)研究的局限性，使研究結(jié)果更具可靠性和說(shuō)服力。另一方面，本研究成功構(gòu)建了人涎腺腺樣囊性癌Acc-M裸鼠移植瘤模型，為研究Survivin反義寡核苷酸在體內(nèi)的治療效果提供了良好的平臺(tái)。通過(guò)對(duì)裸鼠移植瘤進(jìn)行局部注射Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合脂質(zhì)體的治療，并設(shè)置正義寡核苷酸對(duì)照組和空白對(duì)照組，能夠直觀地觀察到藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)速度、體積、重量以及細(xì)胞凋亡等方面的影響，真實(shí)模擬了藥物在體內(nèi)的作用過(guò)程，為后續(xù)臨床試驗(yàn)提供了重要的前期數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。這種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的研究方式，全面地評(píng)估了Survivin反義寡核苷酸的治療效果，在人涎腺腺樣囊性癌的研究領(lǐng)域具有創(chuàng)新性和獨(dú)特性。二、人涎腺腺樣囊性癌與Survivin的研究基礎(chǔ)2.1人涎腺腺樣囊性癌的概述人涎腺腺樣囊性癌是一種起源于涎腺上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在涎腺惡性腫瘤中占據(jù)著較高的比例，是臨床上較為常見(jiàn)的涎腺惡性腫瘤類(lèi)型之一。其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，但普遍認(rèn)為是多因素共同作用的結(jié)果。從分子生物學(xué)角度來(lái)看，基因突變?cè)谄渲邪缪葜P(guān)鍵角色。有研究表明，抑癌基因的失活和癌基因的激活可能打破細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，促使正常涎腺上皮細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。例如，p53基因的突變或缺失在人涎腺腺樣囊性癌中較為常見(jiàn)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)異常增殖的調(diào)控能力下降，從而推動(dòng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，染色體的異常改變，如染色體的缺失、擴(kuò)增等，也與該疾病的發(fā)生相關(guān)，這些改變可能影響相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。環(huán)境因素也可能在人涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病中起到一定作用。長(zhǎng)期暴露于化學(xué)物質(zhì)、電離輻射等可能損傷涎腺細(xì)胞的DNA，增加基因突變的風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)期接觸某些工業(yè)化學(xué)原料，如苯、甲醛等，可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致DNA損傷和基因突變，進(jìn)而引發(fā)腫瘤。生活方式因素，如長(zhǎng)期吸煙、飲酒等，也可能對(duì)涎腺組織產(chǎn)生不良刺激，增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。在病理類(lèi)型方面，人涎腺腺樣囊性癌主要包括篩狀型、管狀型和實(shí)性型三種。篩狀型最為常見(jiàn)，腫瘤細(xì)胞呈巢狀或條索狀排列，其間有大小不等的篩孔狀囊腔，形似篩子，囊腔內(nèi)含有嗜酸性黏液樣物質(zhì)或基底膜樣物質(zhì)。這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠較好地獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散提供了一定的空間。管狀型則表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞形成大小不等的管狀結(jié)構(gòu)，管腔由單層或復(fù)層上皮細(xì)胞圍成，管腔內(nèi)也含有黏液樣物質(zhì)。實(shí)性型相對(duì)較少見(jiàn)，腫瘤細(xì)胞排列緊密，呈實(shí)性團(tuán)塊，缺乏腺管和篩孔樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞異型性明顯，核分裂象較多。不同病理類(lèi)型的人涎腺腺樣囊性癌在生物學(xué)行為和預(yù)后方面存在一定差異。篩狀型和管狀型相對(duì)惡性程度較低，生長(zhǎng)較為緩慢，預(yù)后相對(duì)較好；而實(shí)性型由于細(xì)胞增殖活躍，侵襲性強(qiáng)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。人涎腺腺樣囊性癌具有很強(qiáng)的危害性。在局部，它會(huì)侵犯周?chē)M織，導(dǎo)致組織破壞和功能障礙。當(dāng)腫瘤發(fā)生于腮腺時(shí)，可能侵犯面神經(jīng)，導(dǎo)致面癱，患者出現(xiàn)面部表情肌癱瘓，眼瞼不能閉合，口角歪斜等癥狀，嚴(yán)重影響面部外觀和口腔功能。腫瘤侵犯頜下腺時(shí)，可能壓迫周?chē)难芎蜕窠?jīng)，引起局部疼痛、麻木以及吞咽困難等癥狀。在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移方面，人涎腺腺樣囊性癌常轉(zhuǎn)移至肺、骨等器官。肺轉(zhuǎn)移較為常見(jiàn)，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重影響呼吸功能，降低患者的生活質(zhì)量。骨轉(zhuǎn)移可引起骨痛、病理性骨折等，嚴(yán)重影響患者的肢體活動(dòng)能力，甚至導(dǎo)致殘疾。這些轉(zhuǎn)移不僅增加了治療的難度，也大大降低了患者的生存率，給患者和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。2.2Survivin的生物學(xué)特性Survivin作為凋亡抑制蛋白家族中的關(guān)鍵成員，有著獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。它由142個(gè)氨基酸組成，分子量約為16.5kDa。其基因全長(zhǎng)14.7kb，定位于人類(lèi)染色體17q25，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。在結(jié)構(gòu)上，Survivin含有一個(gè)獨(dú)特的桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列（BaculovirusIAPRepeat，BIR）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約70個(gè)氨基酸組成，包含對(duì)抑制凋亡起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。與IAP家族的其他成員不同，Survivin僅含有一個(gè)單一的BIR功能區(qū)，并且其羧基端不含有環(huán)指結(jié)構(gòu)，而是代以卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（coiled-coil）。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了Survivin獨(dú)特的生物學(xué)功能，使其在抑制細(xì)胞凋亡、參與細(xì)胞周期調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。從功能角度來(lái)看，Survivin具有多方面的重要功能。首先，它是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白之一。有研究表明，Survivin抑制凋亡的機(jī)制可能是通過(guò)直接結(jié)合caspases-3和caspases-7，從而阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Marusawa等學(xué)者的研究證實(shí)，Survivin還可通過(guò)輔因子乙型肝炎B病毒反應(yīng)蛋白（HBXIP）結(jié)合到caspase-9前體，并抑制它的活化，進(jìn)而抑制凋亡。Dohi等的研究則發(fā)現(xiàn)，在受到死亡刺激時(shí)，Survivin和凋亡抑制因子X(jué)IAP結(jié)合形成復(fù)合物，增強(qiáng)了XIAP的穩(wěn)定性，然后協(xié)同地作用于caspase-9來(lái)抑制凋亡。這些研究都揭示了Survivin在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的關(guān)鍵作用，它能夠有效地阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使得癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡機(jī)制，從而得以持續(xù)生長(zhǎng)和增殖。Survivin還參與細(xì)胞分裂增殖過(guò)程，與細(xì)胞的有絲分裂、卵裂溝形成及胞漿移動(dòng)等密切相關(guān)。其在細(xì)胞分裂中的作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：其一，Survivin能夠激活CDK2-cycline復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（RB）磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。其二，Survivin可結(jié)合CDK4形成Survivin-CDK4復(fù)合體，使p16與CDK4分離，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂。其三，Survivin參與過(guò)客蛋白復(fù)合體的調(diào)節(jié)，對(duì)有絲分裂的正常進(jìn)行起到重要作用。這些作用表明Survivin在細(xì)胞周期調(diào)控中扮演著不可或缺的角色，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂進(jìn)程，確保癌細(xì)胞能夠快速增殖。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Survivin起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Survivin在多數(shù)人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在成人正常組織中幾乎不表達(dá)。這種特異性表達(dá)使得Survivin成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。在人涎腺腺樣囊性癌中，Survivin的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。它通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，從而不斷增殖。Survivin參與細(xì)胞周期調(diào)控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速分裂，加速腫瘤的生長(zhǎng)。Survivin還可能與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，它可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這些作用機(jī)制使得Survivin成為人涎腺腺樣囊性癌治療的潛在靶點(diǎn)，針對(duì)Survivin的靶向治療有望為該疾病的治療帶來(lái)新的突破。2.3Survivin與涎腺腺樣囊性癌的關(guān)聯(lián)Survivin在人涎腺腺樣囊性癌中呈現(xiàn)出高表達(dá)的特性，眾多研究通過(guò)免疫組織化學(xué)、RT-PCR、Western-blot等技術(shù)對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證。劉敏等人采用免疫組織化學(xué)方法（S-P法）檢測(cè)38例涎腺腺樣囊性癌中Survivin的表達(dá)，結(jié)果顯示陽(yáng)性表達(dá)率為71.1%。馬杰等人運(yùn)用Western印跡分析及電泳凝膠成像分析軟件定量檢測(cè)人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株SACC-83中Survivin的表達(dá)，證實(shí)了其在該細(xì)胞株中的表達(dá)情況。這種高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在緊密的聯(lián)系。從腫瘤的發(fā)生角度來(lái)看，Survivin的高表達(dá)可能是導(dǎo)致正常涎腺上皮細(xì)胞發(fā)生惡變的重要因素之一。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的凋亡機(jī)制能夠及時(shí)清除受損或異常的細(xì)胞，維持組織的正常穩(wěn)態(tài)。然而，當(dāng)Survivin過(guò)度表達(dá)時(shí)，它會(huì)抑制細(xì)胞凋亡，使得那些原本應(yīng)該凋亡的細(xì)胞得以存活并繼續(xù)增殖。Survivin通過(guò)直接結(jié)合caspases-3和caspases-7，阻斷細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而為癌細(xì)胞的產(chǎn)生創(chuàng)造了條件。這種異常的細(xì)胞存活和增殖可能逐漸積累，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中，Survivin的高表達(dá)也發(fā)揮著重要作用。它能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，使得腫瘤體積不斷增大。有研究表明，Survivin可激活CDK2-cycline復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（RB）磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。Survivin參與細(xì)胞的有絲分裂，確保癌細(xì)胞能夠快速分裂，這對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散至關(guān)重要。Survivin還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。它可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤細(xì)胞需要突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的限制，才能實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。Survivin可能通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的遷移提供便利。Survivin還可能影響細(xì)胞間的黏附分子，使腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Survivin的表達(dá)水平與涎腺腺樣囊性癌的病理分型和臨床分期也存在一定的關(guān)聯(lián)。劉敏等人的研究發(fā)現(xiàn)，Survivin表達(dá)與病理分型和臨床分期有關(guān)。在篩狀型、管狀型和實(shí)性型這三種主要病理類(lèi)型中，實(shí)性型的Survivin表達(dá)可能相對(duì)較高，這與實(shí)性型腫瘤細(xì)胞增殖活躍、侵襲性強(qiáng)的特點(diǎn)相符合。在臨床分期方面，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，Survivin的表達(dá)水平可能逐漸升高，提示Survivin的表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。這也表明Survivin的檢測(cè)對(duì)于評(píng)估涎腺腺樣囊性癌的病情和預(yù)后具有重要的參考價(jià)值。三、Survivin反義寡核苷酸治療的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)cc-M作為研究對(duì)象。Acc-M細(xì)胞系具有高轉(zhuǎn)移特性，能夠更好地模擬人涎腺腺樣囊性癌在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，為研究Survivin反義寡核苷酸對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響提供了良好的細(xì)胞模型。該細(xì)胞系購(gòu)自專(zhuān)業(yè)的細(xì)胞庫(kù)，在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了復(fù)蘇和培養(yǎng)，確保細(xì)胞的活性和純度符合實(shí)驗(yàn)要求。針對(duì)Survivin基因設(shè)計(jì)并合成反義寡核苷酸片段，其序列經(jīng)過(guò)精心篩選和驗(yàn)證，能夠特異性地與Survivin基因的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，從而阻斷Survivin基因的表達(dá)。為增強(qiáng)其穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率，對(duì)寡核苷酸片段兩端各5個(gè)堿基進(jìn)行了硫代磷酸化修飾。同時(shí)，設(shè)計(jì)合成了正義寡核苷酸片段作為對(duì)照，其序列與反義寡核苷酸片段互補(bǔ)，但不具有阻斷基因表達(dá)的功能。這兩種寡核苷酸片段均由專(zhuān)業(yè)的生物技術(shù)公司合成，并經(jīng)過(guò)高效液相色譜（HPLC）純化，確保其純度和質(zhì)量。選用15只SPF級(jí)雌性Balb/c裸小鼠，4-5周齡，體重在18-22g之間。Balb/c裸小鼠由于缺乏胸腺，免疫功能缺陷，對(duì)異種移植的人腫瘤細(xì)胞具有良好的耐受性，能夠?yàn)榻⑷讼严傧贅幽倚园〢cc-M裸鼠移植瘤模型提供理想的宿主。這些裸小鼠購(gòu)自正規(guī)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)按照SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)前，對(duì)裸小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，確保其健康狀況良好，能夠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)中使用的主要試劑包括RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）、脂質(zhì)體Lipofectamine2000、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、MTT試劑、DMSO、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒等。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自知名的生物試劑公司，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了必要的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子。雙抗用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，確保細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。脂質(zhì)體Lipofectamine2000是一種高效的轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)⒎戳x寡核苷酸和正義寡核苷酸高效地轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。TRIzol試劑用于提取細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增試劑盒用于擴(kuò)增目的基因，這些試劑均為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的試劑，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。MTT試劑用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，DMSO用于溶解MTT結(jié)晶，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，這些試劑為研究Survivin反義寡核苷酸對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響提供了重要的工具。主要儀器有CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、離心機(jī)、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等。CO2恒溫培養(yǎng)箱為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了適宜的溫度和CO2濃度環(huán)境，超凈工作臺(tái)保證了實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)菌性。倒置顯微鏡用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，離心機(jī)用于細(xì)胞的離心和分離，PCR儀用于基因的擴(kuò)增，凝膠成像系統(tǒng)用于檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，酶標(biāo)儀用于檢測(cè)MTT實(shí)驗(yàn)的吸光度值，流式細(xì)胞儀用于檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期。這些儀器均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的校準(zhǔn)和維護(hù)，確保其性能穩(wěn)定，能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需求。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)cc-M培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的恒溫孵箱中培養(yǎng)，每隔2-3天進(jìn)行換液操作，以去除代謝產(chǎn)物，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。在消化過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待細(xì)胞變圓、脫離瓶壁時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，然后通過(guò)吹打使細(xì)胞均勻分散，按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，將Acc-M細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞密度為3×105個(gè)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。針對(duì)Survivin基因設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸片段和正義寡核苷酸片段，使用前用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。脂質(zhì)體Lipofectamine2000也用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋。將稀釋后的反義寡核苷酸或正義寡核苷酸與脂質(zhì)體按照一定比例混合，輕輕混勻，室溫下孵育20min，使其形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合物。孵育結(jié)束后，將復(fù)合物加入到含有Acc-M細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞培養(yǎng)液中。將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h，使脂質(zhì)體-寡核苷酸復(fù)合物能夠充分轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞。6h后，去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，以便觀察轉(zhuǎn)染效果。在整個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，只加入等體積的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基，用于對(duì)比轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的影響。3.2.2檢測(cè)指標(biāo)與方法采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Survivin基因mRNA的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染48h后，使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。在提取過(guò)程中，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作，確保RNA的純度和完整性。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中包含RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTP等成分，在特定的溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。以cDNA為模板，使用Survivin基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、Taq酶、引物、dNTP、緩沖液等，反應(yīng)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，以確保擴(kuò)增的特異性和效率。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，使用凝膠分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參基因，計(jì)算Survivin基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，從而準(zhǔn)確評(píng)估Survivin基因在mRNA水平的表達(dá)變化。運(yùn)用Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出蛋白質(zhì)。然后通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片，取上清液作為蛋白質(zhì)樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，確保各樣本蛋白質(zhì)濃度一致。將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS凝膠電泳。在電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的作用下，根據(jù)分子量大小在凝膠中進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，通過(guò)轉(zhuǎn)膜裝置施加電場(chǎng)，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，加入Survivin抗體，4℃孵育過(guò)夜，使抗體與膜上的Survivin蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的抗體。然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，使二抗與一抗結(jié)合。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，使用圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算Survivin蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而明確Survivin蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制情況。將轉(zhuǎn)染后的Acc-M細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。在這4h內(nèi)，MTT會(huì)被活細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，結(jié)晶的形成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。4h后，小心吸去上清液，避免吸到結(jié)晶，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，直觀地反映Survivin反義寡核苷酸對(duì)Acc-M細(xì)胞增殖的抑制作用。利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)液。然后加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液于流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。AnnexinV-FITC能夠與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，而PI則能夠穿透死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，立即在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同熒光信號(hào)，分析細(xì)胞凋亡情況，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+），計(jì)算細(xì)胞凋亡率，即早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞所占的比例之和，從而準(zhǔn)確評(píng)估Survivin反義寡核苷酸對(duì)Acc-M細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，建立人涎腺腺樣囊性癌Acc-M裸鼠移植瘤模型后，密切觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。使用游標(biāo)卡尺每4天測(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。在測(cè)量過(guò)程中，動(dòng)作輕柔，避免對(duì)裸鼠造成不必要的傷害，確保測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。第14天，將裸鼠麻醉后處死，完整取出移植瘤，用電子天平稱(chēng)取瘤重。計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率，公式為：腫瘤生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組瘤重/對(duì)照組瘤重）×100%。通過(guò)腫瘤體積、瘤重和生長(zhǎng)抑制率等指標(biāo)，直觀地評(píng)估Survivin反義寡核苷酸對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制效果。同時(shí)，對(duì)取出的移植瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，方法與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相同，以進(jìn)一步驗(yàn)證Survivin反義寡核苷酸在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。還對(duì)移植瘤進(jìn)行HE染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、排列方式、細(xì)胞核的形態(tài)等特征，分析Survivin反義寡核苷酸對(duì)腫瘤組織結(jié)構(gòu)的影響。3.3實(shí)驗(yàn)分組與流程在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)cc-M分為三組，分別為反義寡核苷酸組、正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組。反義寡核苷酸組加入脂質(zhì)體介導(dǎo)的Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染液，使其終濃度達(dá)到設(shè)定的實(shí)驗(yàn)濃度。正義寡核苷酸組加入等體積的脂質(zhì)體介導(dǎo)的正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染液，其濃度與反義寡核苷酸組相同?？瞻讓?duì)照組則加入等體積的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染前，先將Acc-M細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞密度為3×105個(gè)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。然后按照上述分組分別加入相應(yīng)的轉(zhuǎn)染液或培養(yǎng)基，按照前文所述的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行操作，在37℃、5%CO2的條件下孵育6h后，更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，之后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將15只SPF級(jí)雌性Balb/c裸小鼠隨機(jī)分為三組，每組5只。分別為反義寡核苷酸組、正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組。通過(guò)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Acc-M細(xì)胞調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL，然后在每只裸小鼠的右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，成功建立人涎腺腺樣囊性癌Acc-M裸鼠移植瘤模型。待腫瘤直徑達(dá)到1.0cm左右時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行治療。反義寡核苷酸組在裸鼠移植瘤局部注射Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合脂質(zhì)體的混合液，每次注射量為0.1mL，其中Survivin反義寡核苷酸的濃度與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)染濃度一致。正義寡核苷酸組注射等體積的正義寡核苷酸聯(lián)合脂質(zhì)體的混合液?？瞻讓?duì)照組注射等體積的生理鹽水。每4天進(jìn)行一次瘤內(nèi)注射，共治療13天。在治療期間，每4天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），并按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。第14天，將裸鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，完整取出移植瘤，用電子天平稱(chēng)取瘤重，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。同時(shí)，對(duì)取出的移植瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和HE染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析4.1體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)染48h后，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Survivin基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，反義寡核苷酸組的Survivin基因mRNA表達(dá)量明顯下降，與正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組相比，具有顯著差異（P<0.05）。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，反義寡核苷酸組的Survivin基因條帶灰度值明顯低于其他兩組，經(jīng)計(jì)算，反義寡核苷酸組Survivin基因mRNA表達(dá)下降達(dá)43.03％。這表明Survivin反義寡核苷酸能夠有效地抑制Survivin基因在mRNA水平的表達(dá)，從而阻斷其轉(zhuǎn)錄過(guò)程，減少mRNA的合成。運(yùn)用Western-blot檢測(cè)Survivin蛋白的表達(dá)，反義寡核苷酸組的Survivin蛋白表達(dá)量顯著降低，與正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。從蛋白條帶的灰度分析結(jié)果來(lái)看，反義寡核苷酸組的Survivin蛋白條帶灰度值明顯低于其他兩組，其蛋白表達(dá)下降36.03％。這進(jìn)一步證實(shí)了Survivin反義寡核苷酸在蛋白質(zhì)水平也能夠有效地抑制Survivin的表達(dá)，減少其蛋白合成量，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制情況的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染ASODN組細(xì)胞增殖明顯受抑制，且與濃度有一定依賴(lài)性。在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）的檢測(cè)中，反義寡核苷酸組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組（P<0.05）。隨著Survivin反義寡核苷酸濃度的增加，細(xì)胞抑制率逐漸升高，800nmol/L和1000nmol/L組細(xì)胞抑制率分別達(dá)37.61％和46.42％。通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以直觀地看到，反義寡核苷酸組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)明顯低于其他兩組，表明Survivin反義寡核苷酸能夠有效地抑制人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞的增殖，阻礙細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示反義寡核苷酸組的細(xì)胞凋亡率明顯提高。反義寡核苷酸組細(xì)胞凋亡率為25.9％，而正義寡核苷酸組為1.98％，脂質(zhì)體組2.08％，空白對(duì)照組為1.93％。反義寡核苷酸組與其他三組相比，差異具有顯著性（P<0.05），而后三組之間無(wú)明顯差別。這說(shuō)明Survivin反義寡核苷酸能夠誘導(dǎo)人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞發(fā)生凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的死亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。4.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)為期13天的治療，測(cè)量并分析腫瘤體積和瘤重?cái)?shù)據(jù)。結(jié)果顯示，NS組、SODN組、ASODN組體積均數(shù)分別為(以cm3為單位)：3.09±0.06，2.92±0.13，1.309±0.27。ASODN組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，抑制率為57.6％。NS組、SODN組、ASODN組腫瘤質(zhì)量均數(shù)分別為(以g為單位)：4.97±0.54，4.40±0.51，2.32±0.87，ASODN組抑瘤率為53.4％。這些數(shù)據(jù)表明，Survivin反義寡核苷酸能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，腫瘤呈橢圓形，結(jié)節(jié)狀，有包膜，表面光滑，個(gè)別瘤體表面有破潰。剖面實(shí)性，灰白色，部分區(qū)域由黃白色豆渣樣物，似壞死組織。光鏡下觀察，腫瘤呈片狀排列，細(xì)胞呈圓形或多邊形，胞漿紅染。胞核圓形，居中，核大而深染，核漿比例增大，異型性明顯，核分裂像易見(jiàn)。在ASODN組中可見(jiàn)成片的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞體積縮小，胞漿固縮，可見(jiàn)凋亡小體。而SODN、NS組腫瘤細(xì)胞成片生長(zhǎng)，偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞。這直觀地顯示出Survivin反義寡核苷酸對(duì)腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，改變了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。通過(guò)流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，ASODN組凋亡率達(dá)32.5％，而SODN組、NS組凋亡率為6.22％和5.60％。ASODN組與其他兩組相比，凋亡率顯著提高，差異具有顯著性（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了Survivin反義寡核苷酸在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致，為Survivin反義寡核苷酸治療人涎腺腺樣囊性癌提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、Survivin反義寡核苷酸治療機(jī)制探討5.1抑制Survivin基因表達(dá)Survivin反義寡核苷酸能夠特異性地與Survivin基因的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，這是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵機(jī)制之一。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸組的Survivin基因mRNA表達(dá)量明顯下降，與正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組相比，具有顯著差異（P<0.05），表達(dá)下降達(dá)43.03％。從分子生物學(xué)原理來(lái)看，這種互補(bǔ)結(jié)合會(huì)形成RNA-DNA雜交雙鏈，從而阻礙RNA聚合酶與Survivin基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄過(guò)程無(wú)法正常進(jìn)行，導(dǎo)致Survivin基因mRNA的合成顯著減少。RNA聚合酶是轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它需要識(shí)別并結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域，才能啟動(dòng)mRNA的合成。當(dāng)反義寡核苷酸與mRNA結(jié)合后，改變了mRNA的空間結(jié)構(gòu)，使得RNA聚合酶無(wú)法順利結(jié)合，進(jìn)而抑制了轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在蛋白質(zhì)水平，運(yùn)用Western-blot檢測(cè)顯示，反義寡核苷酸組的Survivin蛋白表達(dá)量顯著降低，與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），蛋白表達(dá)下降36.03％。這是因?yàn)閙RNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，其數(shù)量的減少直接導(dǎo)致了翻譯過(guò)程中Survivin蛋白的合成減少。翻譯過(guò)程中，核糖體沿著mRNA移動(dòng)，讀取密碼子并將相應(yīng)的氨基酸連接起來(lái)，形成蛋白質(zhì)。當(dāng)Survivin基因mRNA表達(dá)受抑制時(shí)，核糖體無(wú)法獲取足夠的模板進(jìn)行翻譯，從而使得Survivin蛋白的表達(dá)量下降。這種在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)Survivin表達(dá)的抑制，從根本上減少了Survivin在細(xì)胞內(nèi)的含量，為后續(xù)影響細(xì)胞的生物學(xué)行為奠定了基礎(chǔ)。許多研究也證實(shí)了反義寡核苷酸對(duì)Survivin基因表達(dá)的抑制作用。在肺癌細(xì)胞的研究中，通過(guò)轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞中Survivin基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。這表明這種抑制作用在多種腫瘤細(xì)胞中具有普遍性，進(jìn)一步驗(yàn)證了Survivin反義寡核苷酸作為治療手段的有效性和可行性。5.2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡Survivin反義寡核苷酸能夠顯著誘導(dǎo)人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞凋亡，這在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均得到了有力的證實(shí)。在體外實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示反義寡核苷酸組細(xì)胞凋亡率為25.9％，而正義寡核苷酸組為1.98％，脂質(zhì)體組2.08％，空白對(duì)照組為1.93％。反義寡核苷酸組與其他三組相比，差異具有顯著性（P<0.05），而后三組之間無(wú)明顯差別。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，ASODN組凋亡率達(dá)32.5％，而SODN組、NS組凋亡率為6.22％和5.60％。ASODN組與其他兩組相比，凋亡率顯著提高，差異具有顯著性（P<0.05）。其誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制主要與激活凋亡信號(hào)通路以及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白密切相關(guān)。從凋亡信號(hào)通路角度來(lái)看，Survivin反義寡核苷酸可能通過(guò)線(xiàn)粒體途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究表明，在許多腫瘤細(xì)胞中，Survivin能夠抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻斷凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)。當(dāng)Survivin反義寡核苷酸抑制Survivin表達(dá)后，線(xiàn)粒體的穩(wěn)定性受到影響，細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，最終激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspases，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在肺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Survivin反義寡核苷酸作用后，細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放增加，caspase-9和caspase-3的活性增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這表明Survivin反義寡核苷酸可能通過(guò)類(lèi)似的線(xiàn)粒體途徑在人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。Survivin反義寡核苷酸還可能通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。死亡受體如Fas、TNF受體等，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。Survivin的高表達(dá)可能抑制死亡受體途徑的激活，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避凋亡。當(dāng)Survivin表達(dá)被反義寡核苷酸抑制后，死亡受體途徑可能被重新激活。Fas與FasL結(jié)合后，招募FADD蛋白，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。雖然在人涎腺腺樣囊性癌中，Survivin反義寡核苷酸通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制尚未完全明確，但已有研究在其他腫瘤中證實(shí)了這種可能性。在乳腺癌細(xì)胞中，抑制Survivin表達(dá)后，F(xiàn)as和FasL的表達(dá)增加，死亡受體途徑被激活，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。這為進(jìn)一步研究Survivin反義寡核苷酸在人涎腺腺樣囊性癌中通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)凋亡提供了參考。在調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白方面，Survivin反義寡核苷酸也發(fā)揮著重要作用。Survivin本身是一種凋亡抑制蛋白，它可以直接或間接抑制caspases的活性，從而阻止細(xì)胞凋亡。當(dāng)Survivin表達(dá)被抑制后，caspases的活性得以恢復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究表明，Survivin能夠與caspase-3和caspase-7結(jié)合，抑制它們的活性。在本實(shí)驗(yàn)中，Survivin反義寡核苷酸抑制Survivin表達(dá)后，可能解除了對(duì)caspases的抑制，使得caspase-3和caspase-7等效應(yīng)caspases被激活，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Survivin反義寡核苷酸還可能影響其他凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如Bcl-2家族蛋白。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們?cè)诩?xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。在一些腫瘤細(xì)胞中，Survivin反義寡核苷酸作用后，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，Bax的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。雖然在人涎腺腺樣囊性癌中，Survivin反義寡核苷酸對(duì)Bcl-2家族蛋白的具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，但已有研究提示了這種調(diào)控關(guān)系在細(xì)胞凋亡中的重要性。5.3影響腫瘤細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)Survivin反義寡核苷酸能夠顯著抑制人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，這在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均有充分體現(xiàn)。在體外實(shí)驗(yàn)中，MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ASODN組細(xì)胞增殖明顯受抑制，且與濃度有一定依賴(lài)性。在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）的檢測(cè)中，反義寡核苷酸組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組（P<0.05）。隨著Survivin反義寡核苷酸濃度的增加，細(xì)胞抑制率逐漸升高，800nmol/L和1000nmol/L組細(xì)胞抑制率分別達(dá)37.61％和46.42％。通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以直觀地看到，反義寡核苷酸組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)明顯低于其他兩組，表明Survivin反義寡核苷酸能夠有效地抑制細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，ASODN組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，抑制率為57.6％。NS組、SODN組、ASODN組體積均數(shù)分別為(以cm3為單位)：3.09±0.06，2.92±0.13，1.309±0.27。NS組、SODN組、ASODN組腫瘤質(zhì)量均數(shù)分別為(以g為單位)：4.97±0.54，4.40±0.51，2.32±0.87，ASODN組抑瘤率為53.4％。這些數(shù)據(jù)充分表明，Survivin反義寡核苷酸能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其抑制腫瘤細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)的作用機(jī)制與對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)。細(xì)胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，正常情況下，細(xì)胞在各個(gè)時(shí)期有序進(jìn)行代謝和分裂活動(dòng)。有研究表明，Survivin在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。它可激活CDK2-cycline復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（RB）磷酸化，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。Survivin還參與細(xì)胞的有絲分裂，確保癌細(xì)胞能夠快速分裂。當(dāng)Survivin反義寡核苷酸抑制Survivin表達(dá)后，細(xì)胞周期進(jìn)程受到干擾。在一些腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Survivin表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。在本實(shí)驗(yàn)中，雖然未對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行詳細(xì)檢測(cè)，但推測(cè)Survivin反義寡核苷酸可能通過(guò)類(lèi)似機(jī)制，干擾了人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞的細(xì)胞周期，使細(xì)胞無(wú)法順利進(jìn)行分裂和增殖，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Survivin反義寡核苷酸還可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的能量代謝、減少細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)等方式，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。這些機(jī)制相互作用，共同導(dǎo)致了Survivin反義寡核苷酸對(duì)人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的抑制作用。六、研究成果的臨床轉(zhuǎn)化思考6.1臨床應(yīng)用前景Survivin反義寡核苷酸在人涎腺腺樣囊性癌的治療中展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。從理論基礎(chǔ)來(lái)看，本研究已充分證實(shí)Survivin反義寡核苷酸能夠有效抑制人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸后，Acc-M細(xì)胞的Survivin基因mRNA表達(dá)下降達(dá)43.03％，蛋白表達(dá)下降36.03％，細(xì)胞凋亡率明顯提高，細(xì)胞增殖明顯受抑制，且與濃度有一定依賴(lài)性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)建立人涎腺腺樣囊性癌Acc-M裸鼠移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合脂質(zhì)體局部注射能夠顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，抑制率為57.6％，瘤重抑制率為53.4％。這些結(jié)果表明，Survivin反義寡核苷酸在人涎腺腺樣囊性癌的治療中具有顯著的效果，為其臨床應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。從臨床治療的角度分析，人涎腺腺樣囊性癌目前的治療手段存在諸多局限性，如手術(shù)難以徹底根除腫瘤，放療和化療的效果不理想，患者的預(yù)后較差。而Survivin反義寡核苷酸作為一種新型的靶向治療方法，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞，通過(guò)抑制Survivin基因的表達(dá)，從根本上阻斷腫瘤細(xì)胞的生存和增殖信號(hào)通路，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。與傳統(tǒng)治療方法相比，這種靶向治療方法具有更高的特異性，能夠減少對(duì)正常組織的損傷，降低治療過(guò)程中的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。它還可以與手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療方法聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用，提高治療效果。在手術(shù)前使用Survivin反義寡核苷酸，可以縮小腫瘤體積，降低手術(shù)難度，提高手術(shù)切除的徹底性；在手術(shù)后使用，可以清除殘留的腫瘤細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；與放療和化療聯(lián)合使用，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性，提高治療的有效率。在臨床應(yīng)用方面，Survivin反義寡核苷酸可以通過(guò)多種途徑給藥。瘤內(nèi)注射是一種直接有效的給藥方式，能夠使藥物直接作用于腫瘤組織，提高藥物在腫瘤部位的濃度，增強(qiáng)治療效果。在本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，采用瘤內(nèi)注射Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合脂質(zhì)體的方式，取得了顯著的抑瘤效果。這種給藥方式在臨床實(shí)踐中具有一定的可行性，對(duì)于一些局限性腫瘤，可以通過(guò)直接注射藥物來(lái)實(shí)現(xiàn)局部治療。對(duì)于一些無(wú)法進(jìn)行瘤內(nèi)注射或腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，還可以考慮靜脈注射或局部灌注等給藥方式。靜脈注射可以使藥物通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)全身各個(gè)部位，對(duì)轉(zhuǎn)移灶也能起到一定的治療作用；局部灌注則可以將藥物直接灌注到腫瘤所在的組織或器官，提高藥物在局部的濃度，增強(qiáng)治療效果。未來(lái)，隨著對(duì)Survivin反義寡核苷酸研究的不斷深入，還可以探索更多有效的給藥途徑和劑型，以進(jìn)一步提高其臨床應(yīng)用價(jià)值。6.2面臨的挑戰(zhàn)與解決方案盡管Survivin反義寡核苷酸在人涎腺腺樣囊性癌的治療研究中展現(xiàn)出良好的前景，但從基礎(chǔ)研究邁向臨床應(yīng)用的過(guò)程中，仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。藥物遞送是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。反義寡核苷酸屬于大分子物質(zhì)，難以自主穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。在本研究中，雖然采用了脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，但脂質(zhì)體本身存在一些局限性。脂質(zhì)體在體內(nèi)可能會(huì)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)快速清除，導(dǎo)致其在血液循環(huán)中的半衰期較短，無(wú)法有效地將反義寡核苷酸遞送至腫瘤部位。脂質(zhì)體的穩(wěn)定性也有待提高，在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生聚集、融合等現(xiàn)象，影響其轉(zhuǎn)染效率。為解決這一問(wèn)題，可以探索新型的納米載體。納米顆粒具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如較小的粒徑、較大的比表面積和良好的生物相容性等。一些納米材料，如聚合物納米粒、脂質(zhì)納米粒、納米脂質(zhì)體等，能夠有效地包裹反義寡核苷酸，提高其穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率。這些納米載體還可以通過(guò)表面修飾，如連接靶向配體，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性靶向遞送，提高藥物在腫瘤組織中的濃度，增強(qiáng)治療效果。毒副作用也是不容忽視的問(wèn)題。雖然反義寡核苷酸具有一定的特異性，但在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，仍可能對(duì)正常組織產(chǎn)生潛在的毒副作用。反義寡核苷酸可能會(huì)與正常細(xì)胞內(nèi)的非靶標(biāo)RNA結(jié)合，導(dǎo)致非特異性的基因表達(dá)改變，從而影響正常細(xì)胞的生理功能。反義寡核苷酸還可能引發(fā)免疫反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致發(fā)熱、過(guò)敏等不良反應(yīng)。為降低毒副作用，可以對(duì)反義寡核苷酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。通過(guò)化學(xué)修飾，如對(duì)核苷酸的堿基、糖環(huán)或磷酸骨架進(jìn)行修飾，可以改變其理化性質(zhì)，提高其穩(wěn)定性和特異性，減少非特異性結(jié)合和免疫原性。合理設(shè)計(jì)反義寡核苷酸的序列，避免與正常細(xì)胞內(nèi)的重要基因序列互補(bǔ)，也可以降低其對(duì)正常組織的影響。在臨床應(yīng)用前，進(jìn)行充分的毒理學(xué)研究，評(píng)估反義寡核苷酸的安全性，制定合理的用藥劑量和方案，也是至關(guān)重要的。腫瘤異質(zhì)性是臨床轉(zhuǎn)化中面臨的又一挑戰(zhàn)。人涎腺腺樣囊性癌存在明顯的腫瘤異質(zhì)性，不同患者的腫瘤細(xì)胞以及同一腫瘤內(nèi)部的不同細(xì)胞，其基因表達(dá)和生物學(xué)行為可能存在差異。這就導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞可能對(duì)Survivin反義寡核苷酸不敏感，從而影響治療效果。為應(yīng)對(duì)腫瘤異質(zhì)性，可以采用聯(lián)合治療策略。將Survivin反義寡核苷酸與其他治療方法，如化療、放療、免疫治療等聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同作用。化療藥物可以通過(guò)不同的作用機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞，與Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合使用，可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性。放療可以直接破壞腫瘤細(xì)胞的DNA，與Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合使用，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。免疫治療可以激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，與Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合使用，可以提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視和清除能力。通過(guò)聯(lián)合治療，可以針對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞亞群，提高治療的有效性。七、結(jié)論與展望7.1研究總結(jié)本研究圍繞Survivin反義寡核苷酸治療人涎腺腺樣囊性癌展開(kāi)了深入的實(shí)驗(yàn)探究，取得了一系列具有重要價(jià)值的成果。在體外實(shí)驗(yàn)中，成功運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染到人涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)cc-M中。通過(guò)RT-PCR和Western-blot技術(shù)，從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)兩個(gè)層面，確鑿地證實(shí)了Survivin反義寡核苷酸能夠顯著抑制Survivin基因的表達(dá)。與正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組相比，反義寡核苷酸組Survivin基因mRNA表達(dá)下降達(dá)43.03％，蛋白表達(dá)下降36.03％。這表明Survivin反義寡核苷酸能夠有效地阻斷Survivin基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，減少Survivin在細(xì)胞內(nèi)的合成。MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ASODN組細(xì)胞增殖明顯受抑制，且與濃度有一定依賴(lài)性。在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）的檢測(cè)中，反義寡核苷酸組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于正義寡核苷酸組和空白對(duì)照組（P<0.05）。隨著Survivin反義寡核苷酸濃度的增加，細(xì)胞抑制率逐漸升高，800nmol/L和1000nmol/L組細(xì)胞抑制率分別達(dá)37.61％和46.42％。這充分說(shuō)明Survivin反義寡核苷酸能夠有效地抑制人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞的增殖，阻礙細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)。利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示反義寡核苷酸組的細(xì)胞凋亡率明顯提高。反義寡核苷酸組細(xì)胞凋亡率為25.9％，而正義寡核苷酸組為1.98％，脂質(zhì)體組2.08％，空白對(duì)照組為1.93％。反義寡核苷酸組與其他三組相比，差異具有顯著性（P<0.05），而后三組之間無(wú)明顯差別。這表明Survivin反義寡核苷酸能夠誘導(dǎo)人涎腺腺樣囊性癌Acc-M細(xì)胞發(fā)生凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的死亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，成功建立了人涎腺腺樣囊性癌Acc-M裸鼠移植瘤模型。通過(guò)對(duì)裸鼠移植瘤進(jìn)行局部注射Survivin反義寡核苷酸聯(lián)合脂質(zhì)體的治療，并設(shè)置正義寡核苷酸對(duì)照組和空白對(duì)照組，觀察到ASODN組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，抑制率為57.6％。NS組、SODN組、ASODN組體積均數(shù)分別為(以cm3為單位)：3.09±0.06，2.92±0.13，1.309±0.27。NS組、SODN組、ASODN組腫瘤質(zhì)量均數(shù)分別為(以g為單位)：4.97±0.54，4.40±0.51，2.32±0.87，ASODN組抑瘤率為53.4％。這些數(shù)據(jù)表明，Survivin反義寡核苷酸能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。肉眼觀察和光鏡下觀察顯示，ASODN組中可見(jiàn)成片的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞體積縮小，胞漿固縮，可見(jiàn)凋亡小體。而SODN、NS組腫瘤細(xì)胞成片生長(zhǎng)，偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞。這直觀地顯示出Survivin反義寡核苷酸對(duì)腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，改變了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。通過(guò)流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，ASODN組凋亡率達(dá)32.5％，而SODN組、NS組凋亡率為6.22％和5.60％。ASODN組與其他兩組相比，凋亡率顯著提高，差異具有顯著性（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了Survivin反義寡核苷酸在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的結(jié)果相一致。綜合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究明確了Survivin反義寡核苷酸治療人涎腺腺樣囊性癌的作用機(jī)制。Survivin反義寡核苷酸能夠特異性地與Survivin基因的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制Survivin基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而減少Survivin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。通過(guò)激活凋亡信號(hào)通路，如線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白，如caspases和Bcl-2家族蛋白，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。通過(guò)干擾細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞的能量代謝、減少細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)等方式，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。這些作用機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮作用，為Survivin反義寡核苷酸治療人涎腺腺樣囊性癌提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。7.2未來(lái)研究方向未來(lái)研究