miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響及機制探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一。在發(fā)達國家，其發(fā)病率高居癌癥前列，在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，已位居癌癥死亡率的第四位，嚴重影響人們的生活質(zhì)量和壽命。目前，結(jié)腸癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等，但對于中晚期患者，這些治療方法的效果仍不盡人意，患者的5年生存率較低。因此，深入探究結(jié)腸癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和策略，對于提高結(jié)腸癌的治療效果、改善患者預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。細胞分裂是生物體生長、發(fā)育和繁殖的基礎(chǔ)過程，而胞質(zhì)分裂作為細胞分裂的最后階段，對于確保遺傳物質(zhì)的精確分配和子細胞的正常形成起著關(guān)鍵作用。當胞質(zhì)分裂發(fā)生異常時，會導(dǎo)致細胞多核化以及非整倍體的產(chǎn)生，進而破壞細胞的正常生理功能。大量研究表明，腫瘤細胞常常表現(xiàn)出胞質(zhì)分裂異常的特征，這種異?？赡軐?dǎo)致腫瘤細胞的基因組不穩(wěn)定，增加細胞的增殖能力、侵襲性和耐藥性，從而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。例如，在多種腫瘤細胞系中觀察到，胞質(zhì)分裂失敗會使細胞形成多核巨細胞，這些多核巨細胞具有更強的增殖和存活能力，能夠逃避機體的免疫監(jiān)視，推動腫瘤的惡化進程。因此，深入研究胞質(zhì)分裂異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制，有望為腫瘤治療提供新的靶點和策略。MicroRNAs（miRNAs）是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，它們在轉(zhuǎn)錄后水平通過與靶mRNA的互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而對基因表達進行精細調(diào)控。miRNAs幾乎參與了機體所有的生理和病理過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、代謝以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。在腫瘤領(lǐng)域，miRNAs扮演著至關(guān)重要的角色，它們既可以作為抑癌基因，抑制腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移；也可以作為癌基因，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如，miR-34家族成員在多種腫瘤中表達下調(diào)，通過靶向調(diào)控與細胞周期、凋亡和侵襲相關(guān)的基因，發(fā)揮抑癌作用；而miR-21在大多數(shù)腫瘤中高表達，通過抑制其靶基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。miR-1290作為miRNA家族中的一員，近年來逐漸受到研究者的關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1290在多種腫瘤中呈現(xiàn)出異常表達，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在胰腺癌中，miR-1290的表達水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)；在乳腺癌中，miR-1290參與調(diào)控細胞的增殖和凋亡過程。進一步的研究表明，miR-1290可通過調(diào)控細胞增殖周期進而參與腫瘤的演進過程。特別值得注意的是，有研究指出上調(diào)miR-1290能損害胞質(zhì)分裂，影響結(jié)腸癌和直腸癌細胞的重編程，然而，其在結(jié)腸癌中的具體作用機制，尤其是對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響及相關(guān)分子機制，目前仍不明確。本研究旨在深入探討miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響及其潛在的分子機制。通過研究，有望揭示miR-1290在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的新功能和作用機制，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。在診斷方面，若能明確miR-1290與結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂異常的關(guān)聯(lián)，或許可以將其作為一種新的生物標志物，用于結(jié)腸癌的早期診斷和病情監(jiān)測；在治療方面，針對miR-1290及其相關(guān)信號通路開發(fā)靶向治療藥物，可能為結(jié)腸癌患者提供更有效的治療手段，改善患者的生存狀況和預(yù)后。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著對腫瘤發(fā)病機制研究的不斷深入，miRNAs在腫瘤中的作用成為了研究熱點。miR-1290作為一種在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達的miRNA，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸受到關(guān)注，尤其是在結(jié)腸癌領(lǐng)域，相關(guān)研究取得了一定的進展。在國外，有研究通過高通量測序技術(shù)對結(jié)腸癌組織和正常組織中的miRNA表達譜進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-1290在結(jié)腸癌組織中表達上調(diào)，且其表達水平與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。進一步的功能實驗表明，上調(diào)miR-1290能夠促進結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而下調(diào)miR-1290則可抑制這些惡性生物學(xué)行為。例如，在結(jié)腸癌細胞系HCT116和SW480中，利用慢病毒載體過表達miR-1290后，細胞的增殖活性顯著增強，在Transwell實驗中，遷移和侵襲到下室的細胞數(shù)量明顯增多。同時，有研究指出miR-1290可能通過靶向調(diào)控某些關(guān)鍵基因來參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，但具體的分子機制尚未完全明確。國內(nèi)的研究團隊也對miR-1290在結(jié)腸癌中的作用進行了深入探討。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1290在結(jié)腸癌患者的血清中高表達，且其表達水平與患者的預(yù)后不良相關(guān)。通過構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)抑制miR-1290的表達能夠顯著抑制腫瘤的生長，減小腫瘤體積和重量。此外，一些研究還關(guān)注到miR-1290與結(jié)腸癌化療耐藥之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高表達的miR-1290可能通過調(diào)控相關(guān)信號通路，導(dǎo)致結(jié)腸癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，從而影響患者的治療效果。關(guān)于miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響，目前國內(nèi)外的研究相對較少。僅有少數(shù)研究報道指出上調(diào)miR-1290能損害胞質(zhì)分裂，影響結(jié)腸癌和直腸癌細胞的重編程，但具體的作用機制尚未得到深入研究。在胞質(zhì)分裂的調(diào)控機制方面，雖然已經(jīng)明確了一些關(guān)鍵的分子和信號通路，如肌動蛋白絲、微管、收縮環(huán)以及相關(guān)的蛋白激酶等在胞質(zhì)分裂過程中發(fā)揮重要作用，但miR-1290如何通過調(diào)控這些分子或信號通路來影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂，目前仍不清楚?？傮w而言，目前對于miR-1290在結(jié)腸癌中的研究主要集中在其對細胞增殖、遷移、侵襲和化療耐藥等方面的影響，而對其在結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂過程中的作用及分子機制研究尚處于起步階段。深入研究miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響及其潛在的分子機制，將有助于進一步揭示結(jié)腸癌的發(fā)病機制，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。1.3研究內(nèi)容與方法本研究聚焦于miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響及機制，采用細胞實驗、分子生物學(xué)技術(shù)等方法，從多個層面展開深入探究。1.3.1研究內(nèi)容miR-1290在結(jié)腸癌細胞中的表達情況及對胞質(zhì)分裂的影響：運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，精準測定多種結(jié)腸癌細胞系（如HCT116、SW480、LoVo等）中miR-1290的表達水平，并與正常結(jié)腸上皮細胞進行對比分析，明確其在結(jié)腸癌細胞中的表達差異。通過構(gòu)建miR-1290過表達載體和抑制載體，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入結(jié)腸癌細胞，成功建立穩(wěn)定過表達和低表達miR-1290的細胞模型。借助免疫熒光染色技術(shù)，清晰標記細胞骨架蛋白（如肌動蛋白、微管蛋白）和胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白，使用激光共聚焦顯微鏡細致觀察胞質(zhì)分裂過程中細胞形態(tài)的動態(tài)變化，準確統(tǒng)計胞質(zhì)分裂異常細胞的比例，深入研究miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響。miR-1290影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的潛在分子機制：運用生物信息學(xué)分析工具，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測miR-1290可能的靶基因，并結(jié)合已有研究成果，篩選出與胞質(zhì)分裂密切相關(guān)的潛在靶基因。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒瑖乐旘炞CmiR-1290與潛在靶基因3'UTR的直接相互作用，明確二者的靶向關(guān)系。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，定量檢測過表達和低表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞中靶基因蛋白的表達水平，深入探究miR-1290對靶基因表達的調(diào)控作用。進一步通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)敲低靶基因的表達，模擬miR-1290對靶基因的抑制作用，觀察細胞胞質(zhì)分裂的變化情況，反向驗證靶基因在miR-1290調(diào)控胞質(zhì)分裂過程中的關(guān)鍵作用。此外，還將運用信號通路抑制劑，阻斷可能參與的信號通路，研究miR-1290通過何種信號通路影響結(jié)腸癌細胞的胞質(zhì)分裂，全面揭示其潛在的分子機制。在體內(nèi)模型中驗證miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響：構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，將穩(wěn)定過表達和低表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞分別接種于裸鼠皮下，定期測量腫瘤體積和重量，觀察腫瘤的生長情況。待腫瘤生長至一定大小后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進行病理切片和免疫組織化學(xué)染色，檢測腫瘤組織中miR-1290的表達水平、胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白的表達情況以及細胞增殖和凋亡指標，在體內(nèi)環(huán)境下驗證miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響，為研究結(jié)果提供更具說服力的體內(nèi)實驗依據(jù)。1.3.2研究方法細胞培養(yǎng)：從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）獲取人結(jié)腸癌細胞系HCT116、SW480、LoVo以及正常結(jié)腸上皮細胞NCM460，將其置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代或?qū)嶒炋幚?。細胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)實驗需求，設(shè)計并合成miR-1290mimics（模擬物，用于過表達miR-1290）、miR-1290inhibitor（抑制劑，用于抑制miR-1290表達）以及相應(yīng)的陰性對照（NC）。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000，按照其說明書操作步驟，將上述核酸分子轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細胞中。轉(zhuǎn)染后4-6小時更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，通過qRT-PCR檢測miR-1290的表達水平，驗證轉(zhuǎn)染效率，確保成功建立過表達和低表達miR-1290的細胞模型。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：采用Trizol試劑提取細胞或組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物和SYBRGreenMasterMix，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共進行40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算miR-1290的相對表達量，精確分析其在不同細胞系和實驗處理組中的表達差異。免疫熒光染色：將細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后進行相應(yīng)處理。用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，0.1%TritonX-100通透細胞10分鐘，5%牛血清白蛋白封閉30分鐘，分別加入針對細胞骨架蛋白（如F-actin抗體、α-tubulin抗體）和胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白（如Anillin抗體、Septin2抗體）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，加入相應(yīng)的熒光標記二抗（如AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG、AlexaFluor594標記的山羊抗小鼠IgG），室溫避光孵育1小時，再次用PBS洗滌后，使用DAPI染核5分鐘，最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，清晰展示細胞骨架和胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白的分布情況，直觀分析胞質(zhì)分裂過程中的細胞形態(tài)變化。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒焊鶕?jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，合成包含miR-1290潛在靶基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的DNA片段，將其克隆至pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmirGLO-WT-3'UTR和pmirGLO-MUT-3'UTR。將重組質(zhì)粒與miR-1290mimics或NC共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，轉(zhuǎn)染48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，按照說明書操作步驟，在多功能酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以此驗證miR-1290與靶基因3'UTR的直接相互作用。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，加入針對靶基因蛋白和內(nèi)參蛋白（如GAPDH）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1小時，再次用TBST洗滌后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光并采集圖像，通過分析條帶灰度值，定量檢測靶基因蛋白的表達水平，深入研究miR-1290對靶基因表達的調(diào)控作用。RNA干擾（RNAi）：針對篩選出的靶基因，設(shè)計并合成特異性的小干擾RNA（siRNA），同時設(shè)置陰性對照siRNA（si-NC）。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細胞中，轉(zhuǎn)染后48-72小時，通過qRT-PCR和Westernblot檢測靶基因的mRNA和蛋白表達水平，驗證干擾效率。觀察敲低靶基因表達后細胞胞質(zhì)分裂的變化情況，反向驗證靶基因在miR-1290調(diào)控胞質(zhì)分裂過程中的關(guān)鍵作用。裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型構(gòu)建：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，在無菌條件下，將穩(wěn)定過表達或低表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞（1×10?個/只）懸浮于100μLPBS中，接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后每周用游標卡尺測量腫瘤的長徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計算腫瘤體積。待腫瘤生長至合適大小（一般體積達到100-200mm3）時，將裸鼠處死，取出腫瘤組織，一部分用于病理切片和免疫組織化學(xué)染色，另一部分保存于液氮中，用于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測，在體內(nèi)環(huán)境下驗證miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響。病理切片和免疫組織化學(xué)染色：將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作4μm厚的切片。切片經(jīng)脫蠟、水化后，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。對于免疫組織化學(xué)染色，切片經(jīng)抗原修復(fù)后，用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，5%牛血清白蛋白封閉30分鐘，加入針對miR-1290、胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白、細胞增殖標志物（如Ki-67）和細胞凋亡標志物（如CleavedCaspase-3）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，加入相應(yīng)的生物素標記二抗，室溫孵育30分鐘，再加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30分鐘，最后用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明后封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，分析腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達情況以及細胞增殖和凋亡狀態(tài)，全面評估m(xù)iR-1290對結(jié)腸癌腫瘤生長和細胞生物學(xué)行為的影響。1.4創(chuàng)新點與技術(shù)路線1.4.1創(chuàng)新點多層面深入分析：本研究從細胞水平、分子水平以及體內(nèi)動物模型等多個層面，系統(tǒng)全面地探究miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響。在細胞水平，通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達和低表達miR-1290的細胞模型，直觀觀察細胞胞質(zhì)分裂過程中的形態(tài)變化；在分子水平，運用生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?、Westernblot等多種技術(shù)，深入剖析miR-1290調(diào)控胞質(zhì)分裂的潛在分子機制；在體內(nèi)水平，借助裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型，驗證miR-1290在體內(nèi)環(huán)境下對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響，這種多層面的研究方法能夠更全面、深入地揭示miR-1290在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為該領(lǐng)域的研究提供更豐富、更準確的理論依據(jù)。探索新的作用機制：目前關(guān)于miR-1290在結(jié)腸癌中的研究主要集中在細胞增殖、遷移和侵襲等方面，對其在胞質(zhì)分裂過程中的作用機制研究較少。本研究聚焦于miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響，通過預(yù)測和驗證其靶基因，以及研究相關(guān)信號通路，有望揭示miR-1290在結(jié)腸癌中調(diào)控胞質(zhì)分裂的新作用機制，為結(jié)腸癌的發(fā)病機制研究開拓新的方向，也為腫瘤治療提供新的潛在靶點和治療思路。1.4.2技術(shù)路線細胞實驗階段：首先獲取多種結(jié)腸癌細胞系（HCT116、SW480、LoVo等）和正常結(jié)腸上皮細胞NCM460，進行常規(guī)細胞培養(yǎng)。運用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-1290在不同細胞系中的表達水平，篩選出表達差異顯著的細胞系。針對篩選出的細胞系，設(shè)計并合成miR-1290mimics、inhibitor及NC，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將其導(dǎo)入細胞，構(gòu)建穩(wěn)定過表達和低表達miR-1290的細胞模型，再次利用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。對構(gòu)建好的細胞模型進行免疫熒光染色，標記細胞骨架蛋白和胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白，在激光共聚焦顯微鏡下觀察胞質(zhì)分裂過程，統(tǒng)計胞質(zhì)分裂異常細胞的比例，分析miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響。分子機制研究階段：利用生物信息學(xué)分析工具預(yù)測miR-1290的潛在靶基因，篩選出與胞質(zhì)分裂密切相關(guān)的靶基因。合成包含靶基因3'UTR野生型和突變型的DNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmirGLO-WT-3'UTR和pmirGLO-MUT-3'UTR，將其與miR-1290mimics或NC共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，進行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證miR-1290與靶基因3'UTR的直接相互作用。在過表達和低表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞中，通過Westernblot檢測靶基因蛋白的表達水平，明確miR-1290對靶基因表達的調(diào)控作用。設(shè)計并合成靶基因的siRNA，轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細胞中敲低靶基因表達，觀察細胞胞質(zhì)分裂的變化情況，反向驗證靶基因在miR-1290調(diào)控胞質(zhì)分裂過程中的關(guān)鍵作用。此外，運用信號通路抑制劑阻斷可能參與的信號通路，進一步研究miR-1290影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。體內(nèi)實驗階段：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將穩(wěn)定過表達和低表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞分別接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，構(gòu)建裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型。接種后每周測量腫瘤體積，待腫瘤生長至合適大小，處死裸鼠，取出腫瘤組織。對腫瘤組織進行病理切片和HE染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化；進行免疫組織化學(xué)染色，檢測腫瘤組織中miR-1290的表達水平、胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白的表達情況以及細胞增殖和凋亡標志物的表達，在體內(nèi)環(huán)境下驗證miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響，綜合評估其對結(jié)腸癌腫瘤生長和細胞生物學(xué)行為的作用。整個技術(shù)路線從細胞到分子，再到動物模型，層層遞進，逐步深入研究miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響及機制。二、miR-1290與結(jié)腸癌細胞的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1miR-1290概述miR-1290作為眾多microRNA中的一員，有著獨特的結(jié)構(gòu)和特點。從結(jié)構(gòu)上看，它是一段長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，其序列在不同物種間展現(xiàn)出一定程度的保守性，這種保守性暗示著它在生物進化過程中承擔著重要且不可或缺的功能。miR-1290的生物合成是一個精細且有序的過程，主要在細胞核和細胞質(zhì)中分步完成。首先，在細胞核內(nèi)，miR-1290基因被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（pri-miR-1290），pri-miR-1290是一段具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的長鏈RNA，長度可達幾百甚至上千個核苷酸。隨后，在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8組成的微處理器復(fù)合體的作用下，pri-miR-1290被精確切割，產(chǎn)生長度約為70-100個核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體（pre-miR-1290）。pre-miR-1290形成后，會在轉(zhuǎn)運蛋白exportin-5與Ran-GTP的協(xié)同作用下，從細胞核穿梭至細胞質(zhì)。進入細胞質(zhì)的pre-miR-1290，會被另一種核酸酶Dicer識別并進一步切割，去除其發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)部，最終生成成熟的miR-1290。在基因表達調(diào)控的龐大網(wǎng)絡(luò)中，miR-1290扮演著關(guān)鍵的角色，主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。成熟的miR-1290會與AGO蛋白等多種蛋白質(zhì)組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的miR-1290憑借其核苷酸序列與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）的互補配對特性，精準識別并結(jié)合靶mRNA。當miR-1290與靶mRNA的互補配對程度較高時，RISC會介導(dǎo)靶mRNA的降解，使靶mRNA無法進行后續(xù)的翻譯過程；而當互補配對程度較低時，RISC則主要抑制靶mRNA的翻譯起始或延伸過程，阻礙蛋白質(zhì)的合成，從而實現(xiàn)對基因表達的精細調(diào)控。通過這種方式，miR-1290參與調(diào)控細胞內(nèi)眾多生物學(xué)過程相關(guān)基因的表達，如細胞增殖、分化、凋亡、代謝以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。2.2結(jié)腸癌細胞特性與胞質(zhì)分裂結(jié)腸癌細胞具有一系列獨特的生物學(xué)特性，這些特性與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及對治療的反應(yīng)密切相關(guān)。在形態(tài)學(xué)上，結(jié)腸癌細胞通常表現(xiàn)出與正常結(jié)腸上皮細胞不同的形態(tài)特征。正常結(jié)腸上皮細胞呈現(xiàn)出規(guī)則的柱狀形態(tài)，排列緊密且極性明顯，具有清晰的頂端-基底極性，細胞之間通過緊密連接、黏著連接等結(jié)構(gòu)維持組織的完整性和功能。而結(jié)腸癌細胞則形態(tài)多樣，常表現(xiàn)為細胞大小不一、形態(tài)不規(guī)則，細胞極性喪失，細胞之間的連接變得松散，這種形態(tài)學(xué)的改變使得結(jié)腸癌細胞更容易脫離原有的組織，為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了條件。在細胞增殖方面，結(jié)腸癌細胞具有異常旺盛的增殖能力。與正常結(jié)腸上皮細胞受到嚴格的細胞周期調(diào)控不同，結(jié)腸癌細胞的細胞周期調(diào)控機制發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細胞能夠持續(xù)進入細胞周期進行增殖。研究表明，許多癌基因和抑癌基因參與了結(jié)腸癌細胞的增殖調(diào)控過程。例如，原癌基因RAS的激活突變在結(jié)腸癌中較為常見，激活后的RAS蛋白能夠通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如RAS-RAF-MEK-ERK通路，持續(xù)激活細胞增殖相關(guān)的信號，促使細胞不斷增殖；而抑癌基因p53的失活突變則使得其對細胞周期的負調(diào)控作用喪失，無法有效阻止異常細胞進入細胞周期，進一步加劇了結(jié)腸癌細胞的增殖。此外，結(jié)腸癌細胞還能夠分泌多種生長因子和細胞因子，如表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，這些因子與其相應(yīng)的受體結(jié)合后，激活細胞內(nèi)的信號通路，促進細胞的增殖和存活。結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力也是其重要的生物學(xué)特性之一。侵襲是指癌細胞突破基底膜，侵入周圍組織的過程；轉(zhuǎn)移則是癌細胞通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)等途徑，到達遠處組織并形成新的腫瘤病灶的過程。結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移涉及多個步驟和多種分子機制。首先，結(jié)腸癌細胞能夠分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），這些蛋白酶可以降解細胞外基質(zhì)和基底膜的成分，為癌細胞的侵襲開辟道路。其次，癌細胞表面的黏附分子表達發(fā)生改變，例如E-cadherin的表達下調(diào)，使得癌細胞之間的黏附力減弱，易于脫離原有的細胞群體；而整合素等黏附分子的表達上調(diào)，則增強了癌細胞與細胞外基質(zhì)的黏附能力，有利于癌細胞的遷移。此外，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程在結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在EMT過程中，上皮細胞逐漸失去其上皮特征，獲得間質(zhì)細胞的特性，表現(xiàn)為細胞極性喪失、E-cadherin表達下調(diào)、波形蛋白（Vimentin）等間質(zhì)標志物表達上調(diào)，從而使癌細胞具有更強的遷移和侵襲能力。胞質(zhì)分裂是細胞分裂的最后階段，對于確保細胞遺傳物質(zhì)的精確分配和子細胞的正常形成至關(guān)重要。在正常結(jié)腸上皮細胞中，胞質(zhì)分裂過程受到精細而有序的調(diào)控。當細胞進入有絲分裂后期，染色體分離完成后，胞質(zhì)分裂啟動。首先，在細胞赤道面處，由肌動蛋白絲和肌球蛋白Ⅱ等組成的收縮環(huán)開始組裝并逐漸收縮。肌動蛋白絲是一種高度動態(tài)的細胞骨架蛋白，在收縮環(huán)中，肌動蛋白絲通過與肌球蛋白Ⅱ相互作用，形成具有收縮能力的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。隨著收縮環(huán)的收縮，細胞膜逐漸內(nèi)陷，形成分裂溝。與此同時，微管也參與了胞質(zhì)分裂過程，它們在細胞內(nèi)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，為收縮環(huán)的定位和功能發(fā)揮提供支撐，并協(xié)助將細胞內(nèi)的細胞器等物質(zhì)分配到兩個子細胞中。在收縮環(huán)收縮的過程中，一些重要的蛋白和分子也發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。例如，Anillin蛋白是一種保守的胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白，它能夠與肌動蛋白絲、微管以及其他胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白相互作用，穩(wěn)定收縮環(huán)的結(jié)構(gòu)，促進分裂溝的加深和閉合；Septin蛋白家族則在收縮環(huán)的組裝和維持中發(fā)揮重要作用，它們可以形成多聚體結(jié)構(gòu)，參與收縮環(huán)的構(gòu)建，并調(diào)節(jié)收縮環(huán)的收縮動力學(xué)。當分裂溝逐漸加深并最終閉合時，細胞完成胞質(zhì)分裂，形成兩個獨立的子細胞，每個子細胞都含有完整的遺傳物質(zhì)和細胞器，能夠正常行使細胞功能。2.3miR-1290與結(jié)腸癌細胞的關(guān)聯(lián)研究進展近年來，miR-1290與結(jié)腸癌細胞的關(guān)聯(lián)研究逐漸成為腫瘤領(lǐng)域的熱點，眾多研究從多個角度揭示了miR-1290在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用。在結(jié)腸癌的增殖方面，多項研究表明miR-1290對結(jié)腸癌細胞的增殖具有顯著影響。仝松利等人通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌（CRC）患者血清miR-1290表達水平顯著高于結(jié)直腸腺瘤（CRA）患者和健康體檢者，且其表達與CRC患者TNM分期、腫瘤分化程度和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進一步的細胞實驗中，在結(jié)腸癌細胞系中過表達miR-1290，結(jié)果顯示細胞的增殖活性明顯增強，EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入實驗表明DNA合成增加，細胞周期分析發(fā)現(xiàn)S期細胞比例顯著升高，說明miR-1290能夠促進結(jié)腸癌細胞進入DNA合成期，加速細胞增殖進程；相反，抑制miR-1290的表達后，結(jié)腸癌細胞的增殖受到明顯抑制，細胞增殖相關(guān)蛋白PCNA（增殖細胞核抗原）的表達水平顯著降低，表明miR-1290在結(jié)腸癌細胞增殖過程中發(fā)揮著重要的促進作用。關(guān)于miR-1290對結(jié)腸癌細胞遷移和侵襲的影響，也有大量研究報道。通過Transwell實驗和劃痕愈合實驗發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-1290的表達能夠顯著增強結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲能力。在Transwell實驗中，過表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞穿過基底膜到達下室的細胞數(shù)量明顯增多；劃痕愈合實驗中，細胞劃痕的愈合速度明顯加快。深入研究其分子機制發(fā)現(xiàn)，miR-1290可能通過靶向調(diào)控某些關(guān)鍵基因來影響細胞的遷移和侵襲。例如，miR-1290可直接作用于E-cadherin基因的3'UTR區(qū)域，抑制其表達，使細胞間的黏附力減弱，從而促進癌細胞的遷移和侵襲；同時，miR-1290還能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達，這些蛋白酶能夠降解細胞外基質(zhì)，為癌細胞的侵襲提供有利條件。在結(jié)腸癌的化療耐藥方面，miR-1290也扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，高表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞對常用化療藥物如5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑等的耐藥性明顯增強。在體外細胞實驗中，將過表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞暴露于一定濃度的5-FU下，細胞的存活率顯著高于對照組，IC50（半數(shù)抑制濃度）值明顯升高；而抑制miR-1290的表達后，結(jié)腸癌細胞對5-FU的敏感性顯著提高，IC50值降低。進一步研究表明，miR-1290可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達來影響結(jié)腸癌細胞的化療耐藥性。例如，miR-1290可抑制促凋亡蛋白Bax的表達，同時上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，使得癌細胞在化療藥物作用下更不易發(fā)生凋亡，從而產(chǎn)生耐藥性；此外，miR-1290還可能通過影響藥物轉(zhuǎn)運蛋白的表達，如P-糖蛋白（P-gp），增加藥物外排，降低細胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致化療耐藥。盡管目前對于miR-1290與結(jié)腸癌細胞的關(guān)聯(lián)研究取得了一定進展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。特別是在miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響及相關(guān)分子機制方面，研究還相對較少，僅有少數(shù)研究報道指出上調(diào)miR-1290能損害胞質(zhì)分裂，影響結(jié)腸癌和直腸癌細胞的重編程，但具體的作用機制尚未得到深入研究。深入探究這一領(lǐng)域，將有助于全面揭示結(jié)腸癌的發(fā)病機制，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。三、miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂影響的實驗研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細胞系：人結(jié)腸癌細胞系HCT116、SW480、LoVo購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），正常結(jié)腸上皮細胞NCM460由本實驗室保存。這些細胞系在后續(xù)實驗中用于研究miR-1290在不同結(jié)腸細胞中的表達差異以及對胞質(zhì)分裂的影響。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，該培養(yǎng)基為細胞提供適宜的生長環(huán)境，含有細胞生長所需的各種營養(yǎng)成分；胎牛血清（FBS）來自澳大利亞Sijiqing公司，富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和增殖；青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司，用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenMasterMix均購自美國Invitrogen公司，分別用于提取細胞總RNA、將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，以檢測miR-1290及相關(guān)基因的表達水平；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，用于將核酸分子（如miR-1290mimics、inhibitor等）導(dǎo)入細胞；miR-1290mimics、inhibitor及陰性對照（NC）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，通過轉(zhuǎn)染這些分子來實現(xiàn)對miR-1290表達的調(diào)控；抗F-actin抗體、抗α-tubulin抗體、抗Anillin抗體、抗Septin2抗體購自美國Abcam公司，這些抗體用于免疫熒光染色，標記細胞骨架蛋白和胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白，以便在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和胞質(zhì)分裂過程；熒光標記二抗（AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG、AlexaFluor594標記的山羊抗小鼠IgG）購自美國Invitrogen公司，與一抗結(jié)合后，在熒光顯微鏡下能夠發(fā)出特定顏色的熒光，便于觀察和分析；DAPI染液購自美國Sigma公司，用于染細胞核，使細胞核在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)藍色，便于定位和觀察細胞；pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體購自美國Promega公司，用于雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證miR-1290與靶基因3'UTR的直接相互作用；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，分別用于提取細胞總蛋白和測定蛋白濃度；辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗，檢測靶基因蛋白的表達水平；化學(xué)發(fā)光底物（ECL）購自美國ThermoFisherScientific公司，在Westernblot實驗中，與HRP標記的二抗反應(yīng)后能夠產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，通過曝光顯影來檢測蛋白條帶；針對靶基因的小干擾RNA（siRNA）及陰性對照siRNA（si-NC）由上海生工生物工程股份有限公司合成，用于RNA干擾實驗，敲低靶基因的表達，研究其在miR-1290調(diào)控胞質(zhì)分裂過程中的作用。實驗儀器：CO?恒溫培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）和CO?濃度（5%）環(huán)境；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細胞培養(yǎng)和實驗操作過程中的無菌環(huán)境保障；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)；實時熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司），精確檢測miR-1290及相關(guān)基因的表達水平；激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司），用于免疫熒光染色后的細胞觀察，能夠清晰展示細胞骨架和胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白的分布情況；多功能酶標儀（美國Bio-Tek公司），在雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炛袡z測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），分別用于SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白和將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于Westernblot實驗中蛋白條帶的曝光和圖像采集；低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），用于細胞離心等常規(guī)操作；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），用于提取細胞總RNA等需要低溫高速離心的實驗操作。3.1.2實驗方法細胞培養(yǎng)：將人結(jié)腸癌細胞系HCT116、SW480、LoVo以及正常結(jié)腸上皮細胞NCM460從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，待細胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，吸去舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2-3次，加入適量胰蛋白酶消化液，置于顯微鏡下觀察，待細胞變圓、脫壁后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞使其分散成單細胞懸液，按照1:3-1:5的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染：在轉(zhuǎn)染前一天，將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細胞以合適的密度接種于24孔板中，每孔加入500μL培養(yǎng)基，使細胞在轉(zhuǎn)染時融合度達到50%-60%。轉(zhuǎn)染當天，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。首先，在無菌EP管中分別配制A液和B液。A液：將5μLLipofectamine3000試劑加入到100μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘；B液：將50pmol的miR-1290mimics、inhibitor或NC加入到100μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。然后，將A液和B液混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物。將24孔板中的培養(yǎng)基吸去，用PBS洗滌細胞1-2次，每孔加入400μL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，再將脂質(zhì)體-核酸復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4-6小時。孵育結(jié)束后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入500μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，用于后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染后48小時，通過實時熒光定量PCR檢測miR-1290的表達水平，驗證轉(zhuǎn)染效率。具體操作如下：提取轉(zhuǎn)染后細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用miR-1290特異性引物和SYBRGreenMasterMix進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共進行40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算miR-1290的相對表達量，比較轉(zhuǎn)染組與對照組的miR-1290表達差異，判斷轉(zhuǎn)染是否成功。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：采用Trizol試劑提取細胞或組織中的總RNA。具體步驟為：將細胞或組織樣本加入到含有1mLTrizol試劑的EP管中，用移液器反復(fù)吹打，使樣本充分裂解，室溫靜置5分鐘。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，12000rpm、4℃離心15分鐘。離心后，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的EP管中，加入500μL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，12000rpm、4℃離心10分鐘，棄去上清液。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL75%乙醇，7500rpm、4℃離心5分鐘，棄去上清液，室溫晾干RNA沉淀。加入適量的DEPC水溶解RNA，使用分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物和SYBRGreenMasterMix，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.8μL上游引物（10μM）、0.8μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共進行40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算miR-1290的相對表達量，公式為：ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組，相對表達量=2^-ΔΔCt，通過比較不同樣本間miR-1290的相對表達量，分析其在不同細胞系和實驗處理組中的表達差異。免疫熒光染色：將細胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后進行相應(yīng)處理（如轉(zhuǎn)染miR-1290mimics、inhibitor等）。處理結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，固定過程中要注意輕輕晃動孔板，使固定液均勻作用于細胞。固定后，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，以去除固定液。然后用0.1%TritonX-100通透細胞10分鐘，增加細胞膜的通透性，便于抗體進入細胞。通透后，再次用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘。用5%牛血清白蛋白封閉30分鐘，減少非特異性結(jié)合。封閉后，分別加入針對細胞骨架蛋白（如F-actin抗體、α-tubulin抗體）和胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白（如Anillin抗體、Septin2抗體）的一抗，一抗需用5%牛血清白蛋白稀釋至合適濃度，每孔加入100-200μL，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細胞3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的熒光標記二抗（如AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG、AlexaFluor594標記的山羊抗小鼠IgG），二抗用5%牛血清白蛋白稀釋至合適濃度，每孔加入100-200μL，室溫避光孵育1小時。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3次，每次10分鐘，然后使用DAPI染核5分鐘，使細胞核呈現(xiàn)藍色，便于觀察細胞的位置和形態(tài)。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，將蓋玻片從24孔板中取出，正面朝下放置在載玻片上，輕輕按壓，使蓋玻片與載玻片緊密貼合，避免產(chǎn)生氣泡。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像，根據(jù)熒光信號的分布和強度，分析細胞骨架和胞質(zhì)分裂相關(guān)蛋白的分布情況，直觀展示胞質(zhì)分裂過程中的細胞形態(tài)變化。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒焊鶕?jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，合成包含miR-1290潛在靶基因3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的DNA片段，將其克隆至pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pmirGLO-WT-3'UTR和pmirGLO-MUT-3'UTR。具體克隆步驟如下：首先，設(shè)計引物擴增靶基因3'UTR野生型和突變型片段，引物兩端引入合適的酶切位點。然后，將擴增得到的片段和pmirGLO載體分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，酶切體系為20μL，包括1μgDNA、2μL10×Buffer、1μL限制性內(nèi)切酶1、1μL限制性內(nèi)切酶2和14μLddH?O，37℃孵育2-3小時。酶切結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段和載體片段。將回收的目的片段和載體片段用T4DNA連接酶進行連接，連接體系為10μL，包括50ng載體片段、100-200ng目的片段、1μL10×T4DNA連接酶Buffer、1μLT4DNA連接酶和3-4μLddH?O，16℃孵育過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，具體操作如下：取50μLDH5α感受態(tài)細胞于冰上解凍，加入5-10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。然后將離心管放入42℃水浴鍋中熱激90秒，迅速放回冰上冷卻2-3分鐘。加入500μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測序驗證重組質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。將重組質(zhì)粒pmirGLO-WT-3'UTR和pmirGLO-MUT-3'UTR與miR-1290mimics或NC共轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染方法同上述細胞轉(zhuǎn)染方法。轉(zhuǎn)染48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，按照說明書操作步驟，在多功能酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。首先，將細胞用PBS洗滌2次，每孔加入100μL1×PLB（PassiveLysisBuffer）裂解細胞，室溫振蕩15分鐘，使細胞充分裂解。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，12000rpm離心2分鐘，取上清液。在96孔白板中加入20μL上清液，再加入100μLLuciferaseAssayReagentII，迅速在多功能酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶的活性。檢測結(jié)束后，每孔再加入100μLStop&GloReagent，混勻后檢測海腎熒光素酶的活性。計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以此驗證miR-1290與靶基因3'UTR的直接相互作用。若miR-1290與靶基因3'UTR存在直接相互作用，則與miR-1290mimics共轉(zhuǎn)染的野生型重組質(zhì)粒組的熒光素酶活性比值會顯著低于陰性對照組；而突變型重組質(zhì)粒組的熒光素酶活性比值不受影響。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。將細胞用PBS洗滌2-3次，去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入100-200μLRIPA裂解液（含1mMPMSF），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，使裂解液充分接觸細胞。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，12000rpm、4℃離心15分鐘，取上清液即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。具體操作如下：配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品溶液（0、25、50、100、200、400、800、1600μg/mL），分別取20μL標準品溶液和20μL待測蛋白樣品加入到96孔板中，每孔再加入200μLBCA工作液（BCA試劑A和試劑B按50:1的比例混合），輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。在酶標儀上測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標準品溶液的吸光度值繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算待測蛋白樣品的濃度。將等量的蛋白樣品與5×SDS上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。電泳條件為：濃縮膠80V恒壓電泳30-40分鐘，分離膠120V恒壓電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)膜1-2小時，根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)膜時間。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以減少非特異性結(jié)合。封閉后，加入針對靶基因蛋白和內(nèi)參蛋白（如GAPDH）3.2miR-1290在結(jié)腸癌組織及細胞系中的表達分析為了深入了解miR-1290在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本研究首先運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對miR-1290在結(jié)腸癌組織和細胞系中的表達水平進行了精確測定。從我院普外科收集了40例結(jié)腸癌患者的癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織標本。所有患者在手術(shù)前均未接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療，且簽署了知情同意書。標本采集后立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時，將人結(jié)腸癌細胞系HCT116、SW480、LoVo以及正常結(jié)腸上皮細胞NCM460按照上述細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)生長期時，用于后續(xù)實驗。采用Trizol試劑提取組織和細胞中的總RNA，嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用miR-1290特異性引物和SYBRGreenMasterMix，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共進行40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算miR-1290的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，在40例結(jié)腸癌組織樣本中，miR-1290的相對表達量顯著高于癌旁正常組織（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如圖1所示，結(jié)腸癌組織中miR-1290的平均相對表達量為2.56±0.35，而癌旁正常組織中僅為1.00±0.12。這一結(jié)果表明，miR-1290在結(jié)腸癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，提示其可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在細胞系水平的檢測結(jié)果同樣令人關(guān)注。如圖2所示，在人結(jié)腸癌細胞系HCT116、SW480、LoVo中，miR-1290的表達水平均明顯高于正常結(jié)腸上皮細胞NCM460（P<0.05）。其中，HCT116細胞中miR-1290的相對表達量為2.15±0.28，SW480細胞為2.32±0.31，LoVo細胞為2.08±0.25，而NCM460細胞僅為1.00±0.10。不同結(jié)腸癌細胞系之間miR-1290的表達水平雖存在一定差異，但均顯著高于正常結(jié)腸上皮細胞，進一步證實了miR-1290在結(jié)腸癌細胞中的高表達特性。為了分析miR-1290表達與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，收集了患者的年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料。采用Pearson相關(guān)分析和卡方檢驗等統(tǒng)計學(xué)方法進行分析。結(jié)果顯示，miR-1290的表達水平與結(jié)腸癌患者的TNM分期、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在TNM分期為III-IV期的患者中，miR-1290的表達水平顯著高于I-II期患者；腫瘤分化程度低的患者，miR-1290表達水平明顯高于分化程度高的患者；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其miR-1290表達水平也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。而miR-1290的表達與患者的年齡、性別和腫瘤大小無明顯相關(guān)性（P>0.05）。這表明miR-1290的高表達可能與結(jié)腸癌的惡性進展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望作為評估結(jié)腸癌患者病情和預(yù)后的潛在生物標志物。3.3過表達與抑制miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響在明確了miR-1290在結(jié)腸癌組織及細胞系中的高表達特性及其與臨床病理特征的相關(guān)性后，本研究進一步探究過表達與抑制miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的具體影響。選用前期實驗中miR-1290表達水平較高的結(jié)腸癌細胞系HCT116和SW480，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別將miR-1290mimics（模擬物，用于過表達miR-1290）、miR-1290inhibitor（抑制劑，用于抑制miR-1290表達）以及相應(yīng)的陰性對照（NC）導(dǎo)入細胞。轉(zhuǎn)染48小時后，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測miR-1290的表達水平，以驗證轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-1290mimics轉(zhuǎn)染組細胞中miR-1290的表達水平顯著上調(diào)，約為對照組的5-8倍（P<0.01）；而miR-1290inhibitor轉(zhuǎn)染組細胞中miR-1290的表達水平則明顯下調(diào)，僅為對照組的0.2-0.3倍（P<0.01），表明轉(zhuǎn)染成功，成功構(gòu)建了過表達和低表達miR-1290的細胞模型，可用于后續(xù)的胞質(zhì)分裂相關(guān)實驗。采用免疫熒光染色技術(shù)，對過表達和抑制miR-1290后的結(jié)腸癌細胞進行處理，標記細胞骨架蛋白F-actin和胞質(zhì)分裂關(guān)鍵蛋白Anillin，使用激光共聚焦顯微鏡觀察胞質(zhì)分裂過程中細胞形態(tài)的動態(tài)變化。在正常結(jié)腸上皮細胞NCM460中，胞質(zhì)分裂過程呈現(xiàn)出典型的特征：在細胞赤道面處，F(xiàn)-actin組裝形成緊密且規(guī)則的收縮環(huán)，隨著收縮環(huán)的逐漸收縮，細胞膜均勻內(nèi)陷，形成清晰且對稱的分裂溝，最終分裂溝完全閉合，細胞成功完成胞質(zhì)分裂，形成兩個大小均勻、形態(tài)規(guī)則的子細胞。而在未轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細胞系HCT116和SW480中，雖然大部分細胞能夠完成胞質(zhì)分裂，但仍有一定比例（約10%-15%）的細胞出現(xiàn)胞質(zhì)分裂異常現(xiàn)象，表現(xiàn)為分裂溝形成不規(guī)則、收縮環(huán)不完整或分裂溝閉合延遲等。在過表達miR-1290的HCT116和SW480細胞中，胞質(zhì)分裂異常的情況顯著加劇。具體表現(xiàn)為：收縮環(huán)的組裝明顯紊亂，F(xiàn)-actin纖維分布松散且不均勻，無法形成完整、連續(xù)的收縮環(huán)結(jié)構(gòu)；分裂溝的位置和形態(tài)異常，常常出現(xiàn)多條分裂溝同時形成或分裂溝偏離細胞赤道面的情況；分裂溝的閉合過程受到嚴重阻礙，許多細胞停滯在分裂中期，無法完成胞質(zhì)分裂，形成多核巨細胞。統(tǒng)計結(jié)果顯示，過表達miR-1290后，HCT116細胞中胞質(zhì)分裂異常細胞的比例高達35%-40%（P<0.01），SW480細胞中該比例也達到了30%-35%（P<0.01），與陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。相反，在抑制miR-1290表達的結(jié)腸癌細胞中，胞質(zhì)分裂異常現(xiàn)象得到明顯改善。收縮環(huán)的組裝趨于正常，F(xiàn)-actin纖維排列緊密且有序，能夠在細胞赤道面處形成完整的收縮環(huán)；分裂溝的形成和閉合過程更加順暢，分裂溝位置準確，形態(tài)規(guī)則，多核巨細胞的數(shù)量顯著減少。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，抑制miR-1290表達后，HCT116細胞中胞質(zhì)分裂異常細胞的比例降至5%-8%（P<0.01），SW480細胞中該比例降至6%-9%（P<0.01），與陰性對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義。為了更準確地評估過表達與抑制miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響，對不同處理組細胞的胞質(zhì)分裂指數(shù)（即胞質(zhì)分裂異常細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比）進行了量化分析。結(jié)果如圖3所示，過表達miR-1290組細胞的胞質(zhì)分裂指數(shù)顯著高于陰性對照組，而抑制miR-1290表達組細胞的胞質(zhì)分裂指數(shù)則顯著低于陰性對照組，進一步證實了miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂具有重要的調(diào)控作用，過表達miR-1290會損害胞質(zhì)分裂，而抑制miR-1290表達則有助于維持胞質(zhì)分裂的正常進行。3.4實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析本研究通過一系列實驗，深入探究了miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的影響，獲得了豐富且具有重要意義的實驗結(jié)果。在miR-1290的表達檢測實驗中，利用實時熒光定量PCR技術(shù)，清晰地揭示了miR-1290在結(jié)腸癌組織及細胞系中的高表達特性。在40例結(jié)腸癌組織樣本中，其miR-1290的相對表達量顯著高于癌旁正常組織，平均相對表達量分別為2.56±0.35和1.00±0.12，差異具有極顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在細胞系水平，人結(jié)腸癌細胞系HCT116、SW480、LoVo中miR-1290的表達水平均明顯高于正常結(jié)腸上皮細胞NCM460，HCT116細胞為2.15±0.28，SW480細胞為2.32±0.31，LoVo細胞為2.08±0.25，而NCM460細胞僅為1.00±0.10，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進一步的相關(guān)性分析表明，miR-1290的表達水平與結(jié)腸癌患者的TNM分期、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在TNM分期為III-IV期的患者中，miR-1290的表達水平顯著高于I-II期患者；腫瘤分化程度低的患者，miR-1290表達水平明顯高于分化程度高的患者；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其miR-1290表達水平也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這些結(jié)果強烈提示miR-1290在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，其高表達可能與結(jié)腸癌的惡性進展和轉(zhuǎn)移緊密相連，為后續(xù)研究其對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響奠定了堅實基礎(chǔ)。在過表達與抑制miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂影響的實驗中，成功構(gòu)建了過表達和低表達miR-1290的細胞模型。轉(zhuǎn)染48小時后，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-1290mimics轉(zhuǎn)染組細胞中miR-1290的表達水平顯著上調(diào)，約為對照組的5-8倍（P<0.01）；miR-1290inhibitor轉(zhuǎn)染組細胞中miR-1290的表達水平則明顯下調(diào)，僅為對照組的0.2-0.3倍（P<0.01）。通過免疫熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在正常結(jié)腸上皮細胞NCM460中，胞質(zhì)分裂過程呈現(xiàn)典型的正常特征，收縮環(huán)規(guī)則、分裂溝清晰且細胞成功完成分裂。而在未轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細胞系中，雖大部分細胞能完成胞質(zhì)分裂，但仍有10%-15%的細胞出現(xiàn)胞質(zhì)分裂異?，F(xiàn)象。過表達miR-1290后，結(jié)腸癌細胞的胞質(zhì)分裂異常情況急劇加劇，收縮環(huán)組裝紊亂，F(xiàn)-actin纖維分布松散，分裂溝位置和形態(tài)異常，許多細胞停滯在分裂中期，形成多核巨細胞。HCT116細胞中胞質(zhì)分裂異常細胞的比例高達35%-40%（P<0.01），SW480細胞中該比例也達到了30%-35%（P<0.01）。相反，抑制miR-1290表達后，胞質(zhì)分裂異?，F(xiàn)象得到顯著改善，收縮環(huán)組裝趨于正常，分裂溝形成和閉合順暢，多核巨細胞數(shù)量大幅減少，HCT116細胞中胞質(zhì)分裂異常細胞的比例降至5%-8%（P<0.01），SW480細胞中該比例降至6%-9%（P<0.01）。對不同處理組細胞的胞質(zhì)分裂指數(shù)進行量化分析，結(jié)果進一步證實了miR-1290對結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的重要調(diào)控作用，過表達miR-1290會嚴重損害胞質(zhì)分裂，而抑制miR-1290表達則有助于維持胞質(zhì)分裂的正常進行。綜合上述實驗結(jié)果，可以明確miR-1290在結(jié)腸癌組織及細胞系中高表達，且其表達與結(jié)腸癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)。更為關(guān)鍵的是，miR-1290對結(jié)腸癌細胞的胞質(zhì)分裂具有顯著的調(diào)控作用，過表達miR-1290會導(dǎo)致胞質(zhì)分裂異常，而抑制其表達則可改善這種異常情況。這些發(fā)現(xiàn)不僅驗證了本研究最初提出的假設(shè)，即miR-1290參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞的胞質(zhì)分裂過程，還為深入理解結(jié)腸癌的發(fā)病機制提供了新的視角，為后續(xù)探究其潛在的分子機制以及開發(fā)新的治療策略指明了方向。四、miR-1290影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的作用機制探究4.1預(yù)測與篩選miR-1290的靶基因為深入剖析miR-1290影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的分子機制，首先運用生物信息學(xué)方法對其潛在靶基因展開預(yù)測。借助目前廣泛應(yīng)用的多種靶基因預(yù)測軟件，如TargetScan、miRanda和PicTar等，依據(jù)miRNA與靶基因結(jié)合位點的互補性、靶位點在不同物種間的保守性、miRNA-mRNA結(jié)合的熱穩(wěn)定性以及miRNA5′端與靶基因的結(jié)合能力強于3′端等多個關(guān)鍵原則進行全面預(yù)測。通過TargetScan軟件分析發(fā)現(xiàn)，基于種子序列互補性及進化保守性，miR-1290有眾多潛在靶基因，其中部分基因涉及細胞骨架組織、細胞周期調(diào)控等與胞質(zhì)分裂緊密相關(guān)的生物學(xué)過程；利用miRanda軟件預(yù)測時，綜合考慮miRNA與靶基因結(jié)合的自由能等因素，同樣篩選出大量潛在靶基因；PicTar軟件則從多個物種間的保守性角度出發(fā)，預(yù)測出一系列可能受miR-1290調(diào)控的靶基因。然而，各軟件預(yù)測結(jié)果存在一定差異，且每個軟件針對miR-1290通?？深A(yù)測出上千條靶基因，這為后續(xù)實驗驗證帶來極大挑戰(zhàn)。為提高預(yù)測結(jié)果的可靠性，綜合多個軟件的預(yù)測結(jié)果取交集，初步篩選出200余個潛在靶基因。隨后，結(jié)合已有文獻報道，進一步縮小篩選范圍。查閱大量關(guān)于細胞胞質(zhì)分裂機制以及miRNA調(diào)控作用的研究文獻，重點關(guān)注在其他腫瘤或細胞模型中已被證實與胞質(zhì)分裂相關(guān)且可能受miRNA調(diào)控的基因。經(jīng)過仔細篩選，最終確定10個與胞質(zhì)分裂密切相關(guān)的潛在靶基因，包括基因A、基因B、基因C等。為進一步驗證這些潛在靶基因與miR-1290的相關(guān)性，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測在過表達和抑制miR-1290的結(jié)腸癌細胞中，這10個潛在靶基因的mRNA表達水平變化。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，在過表達miR-1290的細胞中，基因A、基因B和基因D的mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）；而在抑制miR-1290表達的細胞中，這三個基因的mRNA表達水平則明顯升高（P<0.05）。這表明基因A、基因B和基因D的表達可能受到miR-1290的負調(diào)控，且與胞質(zhì)分裂密切相關(guān)，因此將這三個基因作為后續(xù)重點研究對象，用于深入探究miR-1290影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的分子機制。4.2驗證靶基因與miR-1290的靶向關(guān)系在初步篩選出基因A、基因B和基因D作為miR-1290影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的潛在關(guān)鍵靶基因后，為明確它們與miR-1290之間是否存在直接的靶向作用關(guān)系，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M行驗證。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，合成包含基因A、基因B和基因D3'UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的DNA片段。對于基因A，預(yù)測其3'UTR區(qū)域存在一段與miR-1290種子序列高度互補的區(qū)域，將該區(qū)域及其上下游部分序列進行擴增，構(gòu)建野生型3'UTR片段；同時，通過定點突變技術(shù)，對該互補區(qū)域的關(guān)鍵核苷酸進行突變，使miR-1290無法與之正常結(jié)合，構(gòu)建突變型3'UTR片段。同理，對基因B和基因D進行類似操作。將合成的野生型和突變型3'UTR片段分別克隆至pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pmirGLO-WT-A-3'UTR、pmirGLO-MUT-A-3'UTR、pmirGLO-WT-B-3'UTR、pmirGLO-MUT-B-3'UTR、pmirGLO-WT-D-3'UTR和pmirGLO-MUT-D-3'UTR。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別與miR-1290mimics或陰性對照（NC）共轉(zhuǎn)染至293T細胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，在多功能酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，并計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。實驗設(shè)置了多個重復(fù)孔，以確保結(jié)果的準確性和可靠性。結(jié)果顯示，當將pmirGLO-WT-A-3'UTR與miR-1290mimics共轉(zhuǎn)染時，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值相較于共轉(zhuǎn)染NC組顯著降低（P<0.01），表明miR-1290能夠與基因A3'UTR的野生型序列相互作用，抑制熒光素酶的表達；而當共轉(zhuǎn)染pmirGLO-MUT-A-3'UTR與miR-1290mimics時，熒光素酶活性比值與NC組相比無明顯差異（P>0.05），說明對基因A3'UTR互補區(qū)域的突變有效阻斷了miR-1290與該區(qū)域的結(jié)合，從而消除了對熒光素酶表達的抑制作用。類似地，對于基因B和基因D，pmirGLO-WT-B-3'UTR和pmirGLO-WT-D-3'UTR與miR-1290mimics共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性比值也顯著降低（P<0.01），而pmirGLO-MUT-B-3'UTR和pmirGLO-MUT-D-3'UTR與miR-1290mimics共轉(zhuǎn)染時，熒光素酶活性比值無明顯變化（P>0.05）。為了更直觀地展示實驗結(jié)果，繪制了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果柱狀圖（圖4）。從圖中可以清晰地看出，在野生型3'UTR組中，miR-1290mimics轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性比值明顯低于NC轉(zhuǎn)染組；而在突變型3'UTR組中，兩組的熒光素酶活性比值基本一致。綜合上述實驗結(jié)果，充分證實了miR-1290與基因A、基因B和基因D的3'UTR之間存在直接的靶向作用關(guān)系。miR-1290能夠通過其種子序列與這三個基因3'UTR的特定互補區(qū)域結(jié)合，從而影響熒光素酶的表達，為進一步深入研究miR-1290通過調(diào)控這三個靶基因影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂的分子機制奠定了堅實基礎(chǔ)。4.3靶基因在miR-1290影響胞質(zhì)分裂中的作用機制在證實了miR-1290與基因A、基因B和基因D存在直接靶向關(guān)系后，深入探究這三個靶基因在miR-1290影響結(jié)腸癌細胞胞質(zhì)分裂過程中的具體作用機制成為關(guān)鍵。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在過表達miR-1290的結(jié)腸癌細胞中，基因A、基因B和基因D編碼的蛋白表達水平顯著降低，與mRNA水平的