GRPR與NF-κB：揭示宮頸癌發(fā)病機制與診療新靶點的關(guān)鍵因子一、引言1.1研究背景1.1.1宮頸癌的現(xiàn)狀宮頸癌是發(fā)生在女性子宮頸部位的一種惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著全球女性的生命健康，是婦科最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例60.4萬，粗發(fā)病率15.6/10萬，世界年齡標(biāo)化發(fā)病率13.3/10萬，死亡病例34.2萬，粗死亡率8.8/10萬，世界年齡標(biāo)化死亡率7.3/10萬，預(yù)計到2040年新發(fā)病例將達(dá)79.8萬，死亡病例將達(dá)48.1萬。中國是世界第二大宮頸癌疾病負(fù)擔(dān)國，2020年中國宮頸癌新發(fā)病例10.97萬，粗發(fā)病率15.6/10萬，死亡病例5.9萬，粗死亡率8.4/10萬，預(yù)計到2040年，發(fā)病病例將達(dá)11.6萬，死亡病例達(dá)7.5萬。而在2022年，我國新發(fā)的宮頸癌病例更是達(dá)到15.1萬例，發(fā)病率為13.8/10萬，居女性癌癥發(fā)病的第五位，當(dāng)年死亡的病例是5.6萬例，死亡率為4.5/10萬，居女性癌癥死亡的第六位。并且，隨著我國工業(yè)化、城鎮(zhèn)化程度的加深，居民生活方式改變，女性感染人乳頭瘤病毒（HPV）的風(fēng)險增加，宮頸癌發(fā)病風(fēng)險上升且呈年輕化趨勢。盡管醫(yī)學(xué)在不斷進(jìn)步，目前宮頸癌的診斷方法如宮頸細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）、HPV檢測、陰道鏡檢查和組織病理學(xué)檢查等，以及治療方法包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等已取得一定進(jìn)展，但對于晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者，預(yù)后仍然較差，5年生存率僅為17%。這表明當(dāng)前宮頸癌的診斷和治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)，亟待尋找新的生物標(biāo)志物和治療靶點，以提高宮頸癌的早期診斷率和治療效果，改善患者預(yù)后。1.1.2GRPR和NF-κB的研究現(xiàn)狀胃泌素釋放肽受體（GRPR）屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，在正常生理狀態(tài)下，GRPR參與調(diào)節(jié)多種生理功能，如胃腸道的蠕動、消化液分泌等。然而，在多種疾病狀態(tài)下，GRPR的表達(dá)和功能會發(fā)生異常改變。在腫瘤領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)GRPR在肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。其異常高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成等密切相關(guān)。例如，在肺癌細(xì)胞中，GRPR的高表達(dá)可通過激活下游的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移；在前列腺癌中，GRPR參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的雄激素非依賴生長過程，使得腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)內(nèi)分泌治療產(chǎn)生抵抗，進(jìn)而影響患者的治療效果和預(yù)后。核因子-κB（NF-κB）是一類轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞存活中扮演著至關(guān)重要的角色。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如細(xì)菌感染、炎癥因子、病毒感染、壞死細(xì)胞的產(chǎn)物、DNA損傷、氧化應(yīng)激等時，NF-κB信號通路被激活。激活后的NF-κB會轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合特定的DNA序列，啟動相關(guān)基因的表達(dá)，這些基因涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生物進(jìn)程。在腫瘤研究中，NF-κB常常處于持續(xù)激活狀態(tài)，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長、增殖、存活、抗凋亡、血管生成、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移以及干細(xì)胞性和治療耐藥性等。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，持續(xù)激活的NF-κB可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞凋亡；在結(jié)直腸癌中，NF-κB通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。鑒于GRPR和NF-κB在多種腫瘤中展現(xiàn)出的重要作用，它們在宮頸癌研究中的潛在價值也逐漸受到關(guān)注。研究二者在宮頸癌中的表達(dá)情況、相互作用關(guān)系以及對宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響機制，有望為宮頸癌的早期診斷、預(yù)后評估及靶向治療提供新的思路和方法。1.2研究目的和意義本研究旨在通過檢測GRPR和NF-κB在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及正常宮頸組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)差異與宮頸癌臨床病理參數(shù)（如臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性，進(jìn)而探討GRPR和NF-κB在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，以及二者之間可能存在的相互作用關(guān)系。宮頸癌的早期診斷和有效治療一直是婦科腫瘤領(lǐng)域的研究重點。目前，雖然宮頸癌的篩查方法和治療手段不斷改進(jìn)，但仍有部分患者確診時已處于中晚期，治療效果和預(yù)后較差。尋找新的生物標(biāo)志物，提高宮頸癌的早期診斷率，以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，改善患者的治療效果，具有重要的臨床意義。從發(fā)病機制研究角度來看，GRPR和NF-κB在多種腫瘤中的重要作用已得到證實，但它們在宮頸癌中的具體作用機制尚未完全明確。深入研究二者在宮頸癌中的表達(dá)及作用，有助于揭示宮頸癌的發(fā)病機制，為從分子層面理解宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程提供新的理論依據(jù)。例如，若能明確GRPR和NF-κB如何通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路影響宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移，將為宮頸癌的發(fā)病機制研究填補重要的空白。在早期診斷方面，若GRPR和NF-κB在宮頸癌組織中的表達(dá)具有特異性，且與疾病的發(fā)展階段密切相關(guān)，那么它們有望成為宮頸癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物。通過檢測患者體內(nèi)這兩種分子的表達(dá)水平，結(jié)合現(xiàn)有的篩查方法，可提高宮頸癌的早期診斷準(zhǔn)確性，實現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，從而顯著改善患者的預(yù)后。例如，開發(fā)針對GRPR和NF-κB的檢測試劑盒，應(yīng)用于宮頸癌的大規(guī)模篩查，能夠有效降低宮頸癌的漏診率和誤診率。對于治療而言，若證實GRPR和NF-κB是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，那么它們將成為極具潛力的治療靶點。針對GRPR和NF-κB設(shè)計靶向藥物，能夠更精準(zhǔn)地抑制宮頸癌細(xì)胞的生長和擴散，減少對正常細(xì)胞的損傷，提高治療效果，為宮頸癌患者提供更有效的治療方案。例如，研發(fā)GRPR拮抗劑或NF-κB抑制劑，阻斷相關(guān)信號通路，有望成為治療宮頸癌的新策略。二、GRPR和NF-κB的生物學(xué)特性2.1GRPR的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1GRPR的結(jié)構(gòu)特點胃泌素釋放肽受體（GRPR）屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族中蛙皮素受體家族的成員之一。其在結(jié)構(gòu)上具有GPCR的典型特征，由一條含有多個疏水氨基酸片段的多肽鏈組成，包含七個跨膜α-螺旋結(jié)構(gòu)域，這些跨膜結(jié)構(gòu)域通過細(xì)胞外環(huán)（ECL1、ECL2、ECL3）和細(xì)胞內(nèi)環(huán)（ICL1、ICL2、ICL3）相互連接。N末端位于細(xì)胞外，其氨基酸殘基上可存在糖基化修飾，這對于受體的正確折疊、穩(wěn)定性以及與配體的識別和結(jié)合具有重要意義；C末端則位于細(xì)胞內(nèi)，包含多個可被磷酸化修飾的位點，在受體激活后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？缒そY(jié)構(gòu)域在GRPR中起著核心作用，它們形成了一個疏水的通道，穩(wěn)定地鑲嵌在細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層中，不僅維持了受體的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，還參與了配體結(jié)合口袋的形成。不同跨膜結(jié)構(gòu)域之間通過相互作用，共同塑造了配體結(jié)合位點的獨特空間構(gòu)象，使得GRPR能夠特異性地識別并結(jié)合其配體胃泌素釋放肽（GRP）或其他相關(guān)類似物。例如，研究通過X射線蛋白質(zhì)晶體學(xué)和單顆粒冷凍電鏡技術(shù)解析人源GRPR結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，GRPR的跨膜結(jié)構(gòu)域在與非肽類拮抗劑PD176252結(jié)合時，其特定的氨基酸殘基之間的相互作用以及跨膜螺旋的相對位置發(fā)生改變，從而穩(wěn)定了受體的非活性狀態(tài)；而在與內(nèi)源性肽類激動劑GRP或合成蛙皮素類似物結(jié)合時，跨膜結(jié)構(gòu)域又會發(fā)生不同的構(gòu)象變化，進(jìn)而激活受體并啟動下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞外環(huán)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)也具有重要功能，細(xì)胞外環(huán)參與維持受體結(jié)構(gòu)完整性以及與配體結(jié)合的特異性；細(xì)胞內(nèi)環(huán)則與G蛋白的相互作用密切相關(guān)，當(dāng)配體與GRPR結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)環(huán)的構(gòu)象改變能夠促進(jìn)GRPR與G蛋白的偶聯(lián)，從而激活下游信號通路。2.1.2GRPR的生理功能在正常生理狀態(tài)下，GRPR廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中，參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。在胃腸道中，GRPR起著調(diào)節(jié)胃腸道運動、消化液分泌以及胃腸道黏膜細(xì)胞增殖和分化的作用。例如，GRP與胃腸道黏膜細(xì)胞表面的GRPR結(jié)合后，可刺激胃酸、胃蛋白酶等消化液的分泌，促進(jìn)胃腸道的消化功能；同時，GRPR還能調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌的收縮和舒張，維持胃腸道正常的蠕動節(jié)律，確保食物在胃腸道內(nèi)的順利傳輸和消化吸收。在神經(jīng)系統(tǒng)中，GRPR參與神經(jīng)調(diào)節(jié)過程，與情緒反應(yīng)、社交互動和記憶等功能密切相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GRP/GRPR信號通路的激活能夠影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，如多巴胺、γ-氨基丁酸等，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)環(huán)路的活動，對情緒和行為產(chǎn)生影響。研究表明，敲除小鼠腦內(nèi)的GRPR基因，會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)社交行為異常、焦慮樣行為增加以及記憶能力下降等表現(xiàn)，提示GRPR在神經(jīng)系統(tǒng)正常功能維持中具有重要作用。當(dāng)GRP作為配體與GRPR結(jié)合后，會引發(fā)受體的構(gòu)象變化，從而激活與GRPR偶聯(lián)的G蛋白。GRPR主要與Gq蛋白偶聯(lián)，激活后的Gq蛋白會進(jìn)一步激活磷脂酶C（PLC）。PLC催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）水解，生成第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，進(jìn)而激活依賴鈣離子的蛋白激酶和其他信號分子；DAG則可以激活蛋白激酶C（PKC），PKC通過磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理功能，如細(xì)胞增殖、分化、遷移等。此外，GRPR激活還可能通過其他信號通路發(fā)揮作用，如激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，這些激酶參與細(xì)胞的生長、發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。2.2NF-κB的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1NF-κB的結(jié)構(gòu)組成核因子-κB（NF-κB）是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，在哺乳動物中，該家族主要包含5個成員，分別是RelA（p65）、RelB、c-Rel、NF-κB1（p50）和NF-κB2（p52）。這些成員的N端都存在一個高度保守的Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHR），該結(jié)構(gòu)域?qū)τ贜F-κB的功能至關(guān)重要，它由N端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C端結(jié)構(gòu)域（CTD）連接而成，在CTD上存在一個核定位序列（NLS），負(fù)責(zé)介導(dǎo)NF-κB與DNA的結(jié)合、二聚體化以及核易位過程。RelA（p65）、c-Rel和RelB這三個成員除了具有RHR結(jié)構(gòu)域外，在其C端還存在反式激活結(jié)構(gòu)域（TD），該結(jié)構(gòu)域能夠與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，從而激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄過程，對基因表達(dá)起正向調(diào)節(jié)作用。而p50和p52僅含有RHR結(jié)構(gòu)域，缺乏TD結(jié)構(gòu)域，所以它們自身形成的同源二聚體無法激活基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞內(nèi)往往以其前體p105和p100的形式存在，且在這種狀態(tài)下通常作為抑制分子發(fā)揮作用。在細(xì)胞內(nèi)，NF-κB主要以同源二聚體或異源二聚體的形式存在，其中最常見的是RelA（p65）與p50組成的異源二聚體。不同的NF-κB二聚體在與靶基因上特定的DNA序列（-κB位點）結(jié)合時，具有一定的選擇性和特異性，這種差異使得NF-κB能夠通過不同的二聚體形式對不同基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。例如，p50/p65異二聚體與含有特定κB序列的啟動子區(qū)域結(jié)合后，可啟動一系列與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和存活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；而p52/RelB異二聚體則可能主要參與調(diào)節(jié)與細(xì)胞發(fā)育、分化以及某些特定生理過程相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB二聚體通常與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復(fù)合物，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。IκB蛋白家族成員眾多，主要包括IκBα、IκBβ、IκBε、Bcl-3、p100和p105等。這些IκB蛋白通過其C末端特定的錨蛋白重復(fù)序列（ARD）與NF-κB緊密結(jié)合，并且覆蓋住NF-κB的NLS序列，從而阻止NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，使其處于失活狀態(tài)。例如，在靜息狀態(tài)下，IκBα與p50/p65異二聚體結(jié)合，將其錨定在細(xì)胞質(zhì)中，避免NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核激活相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。2.2.2NF-κB的信號通路NF-κB信號通路主要包括經(jīng)典信號通路和非經(jīng)典信號通路，這兩條通路在激活條件、參與分子以及生物學(xué)效應(yīng)等方面存在差異，但它們又相互協(xié)調(diào)，共同參與細(xì)胞對各種外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)。經(jīng)典NF-κB信號通路：當(dāng)細(xì)胞受到多種外界刺激，如促炎細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子α，TNF-α；白細(xì)胞介素1，IL-1）、脂多糖（LPS）、生長因子、抗原受體激活信號等時，經(jīng)典NF-κB信號通路被激活。首先，這些刺激信號通過細(xì)胞膜表面的相應(yīng)受體傳遞到細(xì)胞內(nèi)，招募并激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物。IKK復(fù)合物主要由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基NEMO（也稱為IKKγ）組成。激活后的IKK復(fù)合物能夠催化IκB蛋白中兩個保守的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾。磷酸化后的IκB蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，被SCF-E3泛素化酶復(fù)合體識別并進(jìn)行多泛素化修飾，隨后被蛋白酶體降解。隨著IκB蛋白的降解，與其結(jié)合的NF-κB二聚體（如p50/p65異二聚體）得以釋放，暴露其NLS序列。游離的NF-κB二聚體迅速從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，啟動基因轉(zhuǎn)錄過程。例如，當(dāng)細(xì)胞受到TNF-α刺激時，TNF-α與細(xì)胞表面的TNF受體1（TNFR1）結(jié)合，使TNFR1發(fā)生三聚化，招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD）和TNF受體相關(guān)因子2（TRAF2）等接頭蛋白，形成一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。該復(fù)合物進(jìn)一步招募并激活I(lǐng)KK復(fù)合物，進(jìn)而啟動上述經(jīng)典NF-κB信號通路的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致一系列炎癥相關(guān)基因（如IL-6、IL-8、COX-2等）的表達(dá)上調(diào)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。非經(jīng)典NF-κB信號通路：非經(jīng)典NF-κB信號通路主要由特定的受體激活，如TNF受體超家族成員，包括淋巴毒素β受體（LTβR）、CD40、B細(xì)胞成熟抗原（BCMA）等。該通路的激活依賴于NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）。當(dāng)細(xì)胞受到相應(yīng)刺激時，信號通過這些受體激活NIK，激活后的NIK進(jìn)一步激活I(lǐng)KKα。IKKα催化p100的C端殘基發(fā)生磷酸化修飾，磷酸化后的p100被泛素化修飾，并在蛋白酶體的作用下加工為p52。p52與RelB形成具有轉(zhuǎn)錄活性的二聚體，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄。例如，在B細(xì)胞活化過程中，CD40與相應(yīng)配體CD40L結(jié)合后，激活NIK，通過非經(jīng)典NF-κB信號通路，促使p100加工生成p52，p52/RelB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)與B細(xì)胞分化、存活和免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)，如促進(jìn)B細(xì)胞分泌免疫球蛋白，增強機體的體液免疫功能。經(jīng)典NF-κB信號通路和非經(jīng)典NF-κB信號通路在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著不同但又相互關(guān)聯(lián)的作用。經(jīng)典信號通路在細(xì)胞受到急性炎癥刺激、病原體感染等情況下迅速激活，快速啟動免疫和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，以應(yīng)對外界刺激，保護(hù)機體免受損傷；而非經(jīng)典信號通路則更多地參與細(xì)胞的發(fā)育、分化以及某些慢性炎癥和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的長期生物學(xué)行為。例如，在腫瘤發(fā)生過程中，經(jīng)典NF-κB信號通路的持續(xù)激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和抗凋亡能力；非經(jīng)典NF-κB信號通路的異常激活則可能參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤微環(huán)境的重塑過程。此外，兩條信號通路之間還存在相互調(diào)節(jié)和交叉對話的機制，共同維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常生理功能。三、材料與方法3.1研究對象3.1.1宮頸癌組織樣本的收集本研究的宮頸癌組織樣本收集自[醫(yī)院名稱1]、[醫(yī)院名稱2]和[醫(yī)院名稱3]等多家醫(yī)院的婦產(chǎn)科。樣本采集時間跨度為[開始時間]至[結(jié)束時間]，在此期間，從接受手術(shù)治療的患者中收集到宮頸癌組織標(biāo)本共[X]例。所有患者在術(shù)前均未接受過放療、化療或其他針對宮頸癌的系統(tǒng)性治療，以確保所采集的組織樣本能夠真實反映疾病的自然狀態(tài)?；颊叩哪挲g范圍為[最小年齡]-[最大年齡]，平均年齡為（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲。在臨床分期方面，依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2018年的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分，其中Ⅰ期患者有[X1]例，Ⅱ期患者有[X2]例，Ⅲ期患者有[X3]例，Ⅳ期患者有[X4]例。腫瘤的分化程度分為高分化、中分化和低分化，高分化患者[X5]例，中分化患者[X6]例，低分化患者[X7]例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[X8]例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者[X9]例。這些臨床病理資料均詳細(xì)記錄在患者的病歷中，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供了豐富的信息。在樣本采集過程中，嚴(yán)格遵循相關(guān)的倫理規(guī)范和操作規(guī)程。手術(shù)切除的宮頸癌組織標(biāo)本立即置于預(yù)先準(zhǔn)備好的無菌容器中，使用生理鹽水沖洗以去除血液和其他雜質(zhì)，然后迅速放入液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以保證組織樣本的完整性和生物活性，為后續(xù)的實驗檢測提供可靠的材料。3.1.2對照樣本的選擇為了更準(zhǔn)確地分析GRPR和NF-κB在宮頸癌中的表達(dá)情況，本研究選擇了正常宮頸鱗狀上皮組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織作為對照。正常宮頸鱗狀上皮組織樣本來源于因子宮肌瘤、卵巢囊腫等良性疾病而接受子宮切除手術(shù)的患者，這些患者的宮頸在術(shù)前的婦科檢查、宮頸細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）以及HPV檢測等均顯示正常，排除了宮頸病變的可能性。共收集到正常宮頸鱗狀上皮組織標(biāo)本[X10]例，患者年齡范圍為[最小年齡2]-[最大年齡2]，平均年齡為（[平均年齡2]±[標(biāo)準(zhǔn)差2]）歲。宮頸上皮內(nèi)瘤變組織樣本則來自于因?qū)m頸病變行宮頸錐切術(shù)或子宮切除術(shù)的患者，術(shù)后病理確診為CIN。根據(jù)病變程度，CIN分為CINⅠ級、CINⅡ級和CINⅢ級，其中CINⅠ級樣本[X11]例，CINⅡ級樣本[X12]例，CINⅢ級樣本[X13]例?；颊吣挲g范圍為[最小年齡3]-[最大年齡3]，平均年齡為（[平均年齡3]±[標(biāo)準(zhǔn)差3]）歲。選擇正常宮頸鱗狀上皮組織作為對照，是因為其代表了正常的宮頸組織狀態(tài)，可用于對比分析宮頸癌組織中GRPR和NF-κB表達(dá)的異常變化；而選擇宮頸上皮內(nèi)瘤變組織作為對照，則是考慮到CIN是與宮頸癌密切相關(guān)的癌前病變，研究GRPR和NF-κB在CIN中的表達(dá)情況，有助于深入了解從正常宮頸組織到CIN再到宮頸癌的發(fā)展過程中，這兩種分子的表達(dá)變化規(guī)律及在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。這些對照樣本同樣在手術(shù)切除后，按照與宮頸癌組織樣本相同的處理方式進(jìn)行保存，以確保實驗條件的一致性和可比性。3.2實驗方法3.2.1免疫組化SP法檢測GRPR和NF-κB的表達(dá)免疫組化SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法），是利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。其具體實驗步驟如下：組織切片的制備：將保存于-80℃冰箱中的宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸組織標(biāo)本取出，進(jìn)行石蠟切片制作。首先，將組織用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定12小時，以保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性。隨后進(jìn)行脫水處理，依次用50%酒精沖洗2次，70%酒精浸泡1天，80%酒精過夜，95%酒精浸泡3小時，無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各浸泡2小時，去除組織中的水分。接著進(jìn)行透明步驟，將組織置于1:1無水酒精二甲苯中45分鐘，再分別用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各浸泡30分鐘，使組織變得透明，便于后續(xù)的浸蠟和包埋。之后，將組織浸入石蠟，1:1二甲苯石蠟（58℃）中浸泡45分鐘，再依次在石蠟（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）中浸泡共2.5小時，最后用石蠟（Ⅲ）進(jìn)行包埋。包埋后的組織塊經(jīng)修整后，用切片機切成厚度為5-7μm的石蠟帶，將其在50℃溫水中展片，然后用處理干凈的載玻片撈片，組織帶即可黏附在載玻片上。為防止切片脫落，載玻片需先進(jìn)行處理，如用1%HCl浸泡過夜、蒸餾水沖洗、95%酒精浸泡2小時后擦干，再涂防脫劑多聚賴氨酸。最后，將貼片后的切片放入68℃恒溫箱內(nèi)烤片2小時，使組織與載玻片緊密結(jié)合?？贵w的選擇和使用：本研究選用兔抗人GRPR單克隆抗體和兔抗人NF-κBp65單克隆抗體作為一抗，購自[抗體生產(chǎn)廠家名稱]，這兩種抗體均經(jīng)過驗證，具有較高的特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確識別并結(jié)合組織中的GRPR和NF-κBp65蛋白。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，購自[二抗生產(chǎn)廠家名稱]，用于與一抗結(jié)合，增強檢測信號。使用時，一抗按照1:200的比例用抗體稀釋液稀釋，二抗按照1:500的比例稀釋，以保證抗體的最佳工作濃度，獲得清晰的檢測結(jié)果。染色過程：首先進(jìn)行脫蠟和水化，將烤好的切片從恒溫箱中取出，在室溫中放置60分鐘，或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘，然后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25分鐘，以去除切片中的石蠟。接著進(jìn)行水化，依次用無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各浸泡2分鐘，再下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各浸泡2分鐘，使切片恢復(fù)到水合狀態(tài)。之后，用PBS沖洗切片2-3次，每次5分鐘，以去除殘留的酒精。為了滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，將切片置于3%H?O?去離子水（或80%甲醇）中孵育10分鐘，然后再次用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘。進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片置于0.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中，用煮沸（95℃，15-20分鐘）的方式使抗原暴露，自然冷卻20分鐘以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，隨后用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘。為減少非特異性染色，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20分鐘，甩去多余液體。滴加稀釋好的一抗50μl，室溫靜置1小時，或者37℃孵育1小時，或者4℃過夜（若選擇4℃過夜，需在37℃復(fù)溫45分鐘）。之后，用PBS沖洗切片2-3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗40-50μl，室溫靜置1小時，或37℃孵育1小時。再次用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘。滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1小時。最后用PBS沖洗2-3次，每次5分鐘。染色采用DAB顯色，在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻后滴加到切片上，顯色5-10分鐘，在顯微鏡下觀察染色程度，當(dāng)胞漿呈棕色時判定為陽性細(xì)胞。顯色完成后，用自來水沖洗10分鐘終止反應(yīng)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：采用半定量積分法對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定。首先觀察陽性細(xì)胞染色強度，無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。然后計算陽性細(xì)胞所占百分比，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，>75%為4分。將染色強度得分與陽性細(xì)胞百分比得分相乘，得到最終的免疫組化評分。0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽性（+），5-8分為陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野（400X），應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量灰度掃描，記錄陽性細(xì)胞的平均光密度值，以進(jìn)一步準(zhǔn)確分析GRPR和NF-κB的表達(dá)水平。同時，設(shè)立陽性對照和陰性對照，陽性對照采用已知陽性的組織切片，陰性對照則用PBS緩沖液代替一抗，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2.2實時熒光定量PCR檢測GRPR和NF-κB的mRNA表達(dá)實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。其具體實驗流程如下：RNA的提取：采用TRIzol試劑提取宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸組織中的總RNA。取凍存已裂解的細(xì)胞或組織，室溫放置5分鐘使其完全溶解。每1ml的TRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋后手動劇烈振蕩管體15秒，然后在15-30℃孵育2-3分鐘。將樣品置于4℃下12000rpm離心15分鐘，離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層，RNA全部被分配于水相中，水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中，加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后在15-30℃孵育10分鐘，然后于4℃下12000rpm離心10分鐘，此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH?O配制），清洗RNA沉淀，混勻后在4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。溶解RNA沉淀時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系如下：逆轉(zhuǎn)錄buffer2μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，dNTP0.1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV0.5μl，DEPC水5μl，RNA模版2μl，總體積10μl。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。引物的設(shè)計和合成：根據(jù)GenBank中GRPR和NF-κB的mRNA序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。引物設(shè)計原則包括：引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和引物二聚體，引物3’端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個以上的相同堿基。設(shè)計好的引物由[引物合成公司名稱]合成。GRPR引物序列為：上游引物5’-[具體序列1]-3’，下游引物5’-[具體序列2]-3’；NF-κB引物序列為：上游引物5’-[具體序列3]-3’，下游引物5’-[具體序列4]-3’。同時，選擇β-actin作為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游引物5’-[具體序列5]-3’，下游引物5’-[具體序列6]-3’。PCR反應(yīng)體系和條件：采用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系如下：SYBRGreen1染料10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，dNTP1μl，Taq酶2μl，待測樣品cDNA5μl，ddH?O30μl，總體積50μl。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘，然后進(jìn)行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。在反應(yīng)過程中，通過熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的擴增情況。數(shù)據(jù)分析方法：采用2^(-ΔΔCt)法對實時熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。首先，根據(jù)內(nèi)參基因β-actin的Ct值對目的基因GRPR和NF-κB的Ct值進(jìn)行校正，得到ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin）。然后，以正常宮頸組織為對照，計算ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組）。最后，根據(jù)2^(-ΔΔCt)公式計算目的基因在不同組織中的相對表達(dá)量，相對表達(dá)量=2^(-ΔΔCt)。實驗重復(fù)3次，取平均值作為最終結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過該方法，可以準(zhǔn)確地比較GRPR和NF-κB在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸組織中的mRNA表達(dá)水平差異。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析本研究采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以確保數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。不同類型的數(shù)據(jù)采用了相應(yīng)的統(tǒng)計方法，具體如下：計數(shù)資料：對于免疫組化檢測中GRPR和NF-κB在不同組織中的表達(dá)陽性率等計數(shù)資料，采用卡方檢驗（χ2檢驗）進(jìn)行分析?？ǚ綑z驗是一種用途很廣的計數(shù)資料的假設(shè)檢驗方法，其基本思想是比較理論頻數(shù)和實際頻數(shù)的吻合程度或者擬合優(yōu)度問題。在本研究中，通過卡方檢驗來判斷GRPR和NF-κB在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及正常宮頸組織中的表達(dá)陽性率差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，以明確這兩種分子在不同組織中的表達(dá)情況是否存在顯著不同。例如，分析GRPR在宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率與正常宮頸組織中的陽性表達(dá)率，通過卡方檢驗判斷兩者之間的差異是否由偶然因素導(dǎo)致，從而為后續(xù)研究提供有力的統(tǒng)計學(xué)依據(jù)。計量資料：實時熒光定量PCR檢測得到的GRPR和NF-κB的mRNA表達(dá)量屬于計量資料，采用方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組間比較。方差分析用于推斷多個總體均數(shù)是否有差異，其基本原理是將總變異分解為組間變異和組內(nèi)變異，通過比較組間變異與組內(nèi)變異的大小，來判斷多個總體均數(shù)是否相等。在本研究中，運用方差分析比較宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸組織中GRPR和NF-κB的mRNA表達(dá)量，以確定這兩種分子在不同組織中的mRNA表達(dá)水平是否存在顯著差異。當(dāng)方差分析結(jié)果顯示存在差異時，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗（最小顯著差異法）進(jìn)行兩兩比較，明確具體哪些組之間存在差異，以及差異的方向和程度。例如，若方差分析表明三組間GRPR的mRNA表達(dá)量存在差異，通過LSD-t檢驗可以確定宮頸癌組織與正常宮頸組織、宮頸癌組織與宮頸上皮內(nèi)瘤變組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織與正常宮頸組織之間GRPR的mRNA表達(dá)量的具體差異情況。相關(guān)性分析：為探討GRPR和NF-κB的表達(dá)之間是否存在關(guān)聯(lián)，以及它們的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)（如臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）之間的關(guān)系，采用Spearman秩相關(guān)分析。Spearman秩相關(guān)分析是一種非參數(shù)統(tǒng)計方法，用于分析兩個變量之間的單調(diào)關(guān)系，它不依賴于數(shù)據(jù)的分布形態(tài)，對于不滿足正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)也能進(jìn)行有效的分析。在本研究中，通過Spearman秩相關(guān)分析計算GRPR和NF-κB表達(dá)之間的相關(guān)系數(shù)，判斷它們之間是否存在正相關(guān)、負(fù)相關(guān)或無相關(guān)關(guān)系。同時，分析GRPR和NF-κB的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，如計算GRPR表達(dá)與臨床分期的相關(guān)系數(shù)，若相關(guān)系數(shù)為正且具有統(tǒng)計學(xué)意義，則說明隨著臨床分期的升高，GRPR的表達(dá)可能增加，提示GRPR表達(dá)與宮頸癌的病情進(jìn)展可能存在一定聯(lián)系。生存分析：對于隨訪獲得的患者生存數(shù)據(jù)，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并運用Log-rank檢驗進(jìn)行組間比較，分析GRPR和NF-κB的表達(dá)與宮頸癌患者生存率之間的關(guān)系。Kaplan-Meier法是一種非參數(shù)估計方法，用于估計生存函數(shù)，它可以直觀地展示不同組患者的生存情況隨時間的變化趨勢。Log-rank檢驗則用于比較不同組生存曲線之間的差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，判斷不同因素對生存時間的影響。在本研究中，根據(jù)GRPR和NF-κB的表達(dá)水平將患者分為不同組，通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，觀察不同組患者的生存率變化情況。然后用Log-rank檢驗比較各組生存曲線，若兩組生存曲線差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，則表明GRPR或NF-κB的表達(dá)與宮頸癌患者的生存率密切相關(guān)，為評估患者預(yù)后提供重要信息。例如，若高表達(dá)GRPR組患者的生存曲線明顯低于低表達(dá)GRPR組，且Log-rank檢驗差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明GRPR高表達(dá)可能預(yù)示著宮頸癌患者的預(yù)后較差。在所有統(tǒng)計分析中，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義，確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。四、GRPR和NF-κB在宮頸癌中的表達(dá)結(jié)果4.1GRPR和NF-κB在不同宮頸組織中的表達(dá)差異本研究通過免疫組化SP法對收集的[X]例宮頸癌組織、[X10]例正常宮頸鱗狀上皮組織以及不同分級的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織（CINⅠ級[X11]例、CINⅡ級[X12]例、CINⅢ級[X13]例）進(jìn)行GRPR和NF-κB表達(dá)檢測。結(jié)果顯示，GRPR和NF-κB在不同宮頸組織中的表達(dá)存在顯著差異（P<0.05）。在宮頸癌組織中，GRPR呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為64.81%（[X]例樣本中陽性例數(shù)為[具體陽性例數(shù)1]），表現(xiàn)為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯的棕黃色染色；NF-κB同樣呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率達(dá)74.1%（陽性例數(shù)為[具體陽性例數(shù)2]），主要定位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)棕褐色染色。在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中，GRPR呈中等量表達(dá)，陽性表達(dá)率為63.64%（陽性例數(shù)為[具體陽性例數(shù)3]）；NF-κB陽性表達(dá)率為46.9%（陽性例數(shù)為[具體陽性例數(shù)4]）。而在正常宮頸鱗狀上皮組織中，GRPR僅呈弱陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為15.0%（陽性例數(shù)為[具體陽性例數(shù)5]）；NF-κB則無表達(dá)，即未檢測到陽性染色細(xì)胞。進(jìn)一步對不同分級的CIN組織進(jìn)行分析，雖然GRPR和NF-κB在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中的陽性表達(dá)呈上升趨勢，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這表明在CIN的發(fā)展過程中，GRPR和NF-κB表達(dá)雖有增加趨勢，但這種變化并不足以作為判斷CIN分級的可靠指標(biāo)。為更直觀地展示GRPR和NF-κB在不同宮頸組織中的表達(dá)差異，繪制柱狀圖（圖1）。從圖中可以清晰看出，宮頸癌組織中GRPR和NF-κB的陽性表達(dá)率明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸鱗狀上皮組織，而正常宮頸鱗狀上皮組織中兩者的表達(dá)水平最低。通過卡方檢驗對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明GRPR和NF-κB在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及正常宮頸鱗狀上皮組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這進(jìn)一步證實了上述觀察結(jié)果，提示GRPR和NF-κB的表達(dá)變化與宮頸病變的進(jìn)展密切相關(guān)，可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。[此處插入圖1：GRPR和NF-κB在不同宮頸組織中的陽性表達(dá)率柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變、正常宮頸鱗狀上皮），縱坐標(biāo)為陽性表達(dá)率，分別用不同顏色柱狀表示GRPR和NF-κB的陽性表達(dá)率][此處插入圖1：GRPR和NF-κB在不同宮頸組織中的陽性表達(dá)率柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變、正常宮頸鱗狀上皮），縱坐標(biāo)為陽性表達(dá)率，分別用不同顏色柱狀表示GRPR和NF-κB的陽性表達(dá)率]4.2GRPR和NF-κB表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系為進(jìn)一步探究GRPR和NF-κB在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究分析了二者表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，GRPR和NF-κB的表達(dá)與宮頸癌的臨床分期顯著相關(guān)（P<0.05）。隨著臨床分期的升高，GRPR和NF-κB的陽性表達(dá)率呈上升趨勢。在Ⅰ期宮頸癌患者中，GRPR陽性表達(dá)率為47.37%（[Ⅰ期樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[Ⅰ期GRPR陽性例數(shù)]），NF-κB陽性表達(dá)率為52.63%（[Ⅰ期樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[Ⅰ期NF-κB陽性例數(shù)]）；Ⅱ期患者中，GRPR陽性表達(dá)率為66.67%（[Ⅱ期樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[Ⅱ期GRPR陽性例數(shù)]），NF-κB陽性表達(dá)率為73.33%（[Ⅱ期樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[Ⅱ期NF-κB陽性例數(shù)]）；Ⅲ期及Ⅳ期患者中，GRPR陽性表達(dá)率高達(dá)85.71%（[Ⅲ期及Ⅳ期樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[Ⅲ期及Ⅳ期GRPR陽性例數(shù)]），NF-κB陽性表達(dá)率為92.86%（[Ⅲ期及Ⅳ期樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[Ⅲ期及Ⅳ期NF-κB陽性例數(shù)]）。這表明GRPR和NF-κB表達(dá)水平可能與宮頸癌的病情進(jìn)展密切相關(guān)，隨著腫瘤分期的增加，二者的表達(dá)水平升高，提示它們可能在宮頸癌的發(fā)展過程中起到促進(jìn)作用。腫瘤浸潤深度方面，GRPR和NF-κB的陽性表達(dá)率也隨浸潤深度的增加而增高（P<0.05）。當(dāng)腫瘤浸潤深度≤1/2肌層時，GRPR陽性表達(dá)率為50.0%（[浸潤深度≤1/2肌層樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[浸潤深度≤1/2肌層GRPR陽性例數(shù)]），NF-κB陽性表達(dá)率為56.25%（[浸潤深度≤1/2肌層樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[浸潤深度≤1/2肌層NF-κB陽性例數(shù)]）；而當(dāng)浸潤深度>1/2肌層時，GRPR陽性表達(dá)率上升至80.0%（[浸潤深度>1/2肌層樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[浸潤深度>1/2肌層GRPR陽性例數(shù)]），NF-κB陽性表達(dá)率為90.0%（[浸潤深度>1/2肌層樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[浸潤深度>1/2肌層NF-κB陽性例數(shù)]）。這說明GRPR和NF-κB的高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的浸潤能力增強有關(guān)，促進(jìn)了腫瘤向深層組織的侵犯，進(jìn)一步加重了病情。在腫瘤分化程度上，GRPR與腫瘤分化程度呈顯著相關(guān)（P<0.05）。高分化宮頸癌組織中，GRPR陽性表達(dá)率為41.67%（[高分化樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[高分化GRPR陽性例數(shù)]）；中分化組織中，陽性表達(dá)率為66.67%（[中分化樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[中分化GRPR陽性例數(shù)]）；低分化組織中，陽性表達(dá)率高達(dá)85.71%（[低分化樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[低分化GRPR陽性例數(shù)]）。隨著腫瘤分化程度降低，GRPR陽性表達(dá)率逐漸升高，提示GRPR表達(dá)與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)，GRPR表達(dá)越高，腫瘤細(xì)胞的分化程度越低，惡性程度越高。然而，NF-κB與腫瘤分化程度雖有一定相關(guān)性，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分析結(jié)果顯示，GRPR與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)（P<0.05）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者中，GRPR陽性表達(dá)率為88.89%（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移GRPR陽性例數(shù)]）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，陽性表達(dá)率為53.33%（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移GRPR陽性例數(shù)]）。這表明GRPR的高表達(dá)可能促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，增加了腫瘤的擴散風(fēng)險。而NF-κB與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也存在一定關(guān)聯(lián)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中NF-κB陽性表達(dá)率為88.89%（[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NF-κB陽性例數(shù)]），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中為64.0%（[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本數(shù)]例樣本中陽性例數(shù)為[無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NF-κB陽性例數(shù)]），但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。綜上所述，GRPR和NF-κB的表達(dá)與宮頸癌的臨床分期、腫瘤浸潤深度密切相關(guān)，GRPR還與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示它們在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用，有望成為評估宮頸癌病情及預(yù)后的潛在指標(biāo)。4.3GRPR和NF-κB表達(dá)的相關(guān)性分析本研究進(jìn)一步對GRPR和NF-κB在宮頸癌組織中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。在[X]例宮頸癌組織樣本中，GRPR陽性組有[具體陽性例數(shù)1]例，其中NF-κB陽性例數(shù)為[GRPR陽性組中NF-κB陽性例數(shù)]，陽性率為85.7%；GRPR陰性組有[具體陰性例數(shù)]例，NF-κB陽性例數(shù)為[GRPR陰性組中NF-κB陽性例數(shù)]，陽性率為52.6%。通過Spearman秩相關(guān)分析計算兩者的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示，GRPR和NF-κB在宮頸癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=[具體相關(guān)系數(shù)]，P<0.05）。這表明在宮頸癌組織中，當(dāng)GRPR表達(dá)升高時，NF-κB的表達(dá)也傾向于升高，二者可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在協(xié)同作用，共同參與調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，可能存在某種信號傳導(dǎo)途徑，使得GRPR的激活能夠促進(jìn)NF-κB信號通路的活化，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。為更直觀地展示GRPR和NF-κB表達(dá)的相關(guān)性，繪制散點圖（圖2），圖中每個點代表一個宮頸癌組織樣本，橫坐標(biāo)表示GRPR的表達(dá)水平，縱坐標(biāo)表示NF-κB的表達(dá)水平，可以明顯看出兩者表達(dá)水平呈現(xiàn)出正相關(guān)的趨勢。這種相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)為深入理解宮頸癌的發(fā)病機制提供了新的線索，也為進(jìn)一步研究以GRPR和NF-κB為靶點的聯(lián)合治療策略奠定了基礎(chǔ)。[此處插入圖2：GRPR和NF-κB在宮頸癌組織中表達(dá)的散點圖，橫坐標(biāo)為GRPR表達(dá)水平，縱坐標(biāo)為NF-κB表達(dá)水平，每個點代表一個樣本，展示兩者的正相關(guān)趨勢][此處插入圖2：GRPR和NF-κB在宮頸癌組織中表達(dá)的散點圖，橫坐標(biāo)為GRPR表達(dá)水平，縱坐標(biāo)為NF-κB表達(dá)水平，每個點代表一個樣本，展示兩者的正相關(guān)趨勢]五、GRPR和NF-κB在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制探討5.1GRPR在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用5.1.1GRPR對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響為深入探究GRPR對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究開展了一系列細(xì)胞實驗。首先，選取人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa作為研究對象，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)GRPR的細(xì)胞株以及干擾GRPR表達(dá)的細(xì)胞株。具體而言，對于過表達(dá)GRPR的細(xì)胞株構(gòu)建，將含有GRPR編碼序列的質(zhì)粒載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入HeLa和SiHa細(xì)胞中，利用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)GRPR的細(xì)胞克?。粚τ诟蓴_GRPR表達(dá)的細(xì)胞株構(gòu)建，則采用小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染技術(shù)，將針對GRPR的siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，抑制GRPR的表達(dá)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實時熒光定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示過表達(dá)GRPR的細(xì)胞株中GRPR的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高，而干擾GRPR表達(dá)的細(xì)胞株中GRPR的表達(dá)水平明顯降低。采用MTT法對細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測。MTT法是一種基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能的原理來檢測細(xì)胞增殖的方法。將過表達(dá)GRPR、干擾GRPR表達(dá)以及對照組的宮頸癌細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔接種密度為[X]個細(xì)胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔。在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h和96h后，向每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h。隨后，小心吸去上清液，加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，以O(shè)D值代表細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果表明，與對照組相比，過表達(dá)GRPR的宮頸癌細(xì)胞在各時間點的OD值均顯著升高，細(xì)胞生長曲線上升更為陡峭，說明GRPR過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖；而干擾GRPR表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞在各時間點的OD值明顯降低，細(xì)胞生長曲線較為平緩，表明抑制GRPR表達(dá)可有效抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。EdU法也用于進(jìn)一步驗證上述結(jié)果。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成期代替胸腺嘧啶（T）摻入正在復(fù)制的DNA分子中，通過熒光標(biāo)記的疊氮化物與EdU發(fā)生點擊化學(xué)反應(yīng)，即可在熒光顯微鏡下直接觀察到正在進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞。將不同處理組的宮頸癌細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入EdU工作液，使其終濃度為10μM，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后按照EdU檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行固定、通透、點擊反應(yīng)和染色等處理。最后，在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)EdU陽性細(xì)胞（紅色熒光）和總細(xì)胞（藍(lán)色熒光），計算EdU陽性細(xì)胞百分比。結(jié)果顯示，過表達(dá)GRPR組的EdU陽性細(xì)胞百分比顯著高于對照組，而干擾GRPR表達(dá)組的EdU陽性細(xì)胞百分比明顯低于對照組，這與MTT法的檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了GRPR能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。關(guān)于GRPR促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖的可能機制，研究表明可能與激活ERK和PI3K/Akt信號通路有關(guān)。ERK信號通路在細(xì)胞增殖、分化、存活和凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)GRPR被激活后，可通過G蛋白偶聯(lián)激活下游的鳥苷酸交換因子SOS，SOS催化Ras蛋白上的GDP轉(zhuǎn)換為GTP，激活的Ras蛋白進(jìn)而激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化激活ERK1/2。激活后的ERK1/2可進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos和c-Jun等，促進(jìn)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如cyclinD1、c-Myc等，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。PI3K/Akt信號通路同樣在細(xì)胞生長、增殖和存活中起著關(guān)鍵作用。GRPR激活后可通過G蛋白激活PI3K，PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募并激活A(yù)kt蛋白。激活后的Akt蛋白可通過磷酸化多種底物，如mTOR、GSK-3β等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和存活。在宮頸癌細(xì)胞中，GRPR可能通過激活PI3K/Akt信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。為驗證這一機制，使用ERK和PI3K/Akt信號通路的抑制劑，如U0126（ERK抑制劑）和LY294002（PI3K抑制劑），分別處理過表達(dá)GRPR的宮頸癌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入抑制劑后，細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，表明GRPR可能通過激活ERK和PI3K/Akt信號通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。5.1.2GRPR對宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響利用Transwell實驗和劃痕實驗，本研究探究了GRPR對宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的作用。在Transwell實驗中，使用Matrigel基質(zhì)膠對Transwell小室的上室進(jìn)行包被，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。將干擾GRPR表達(dá)的HeLa細(xì)胞、過表達(dá)GRPR的SiHa細(xì)胞以及相應(yīng)的對照組細(xì)胞，以每孔[X]個細(xì)胞的密度接種于Transwell小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定下室膜表面的細(xì)胞15min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10min。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾GRPR表達(dá)的HeLa細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而過表達(dá)GRPR的SiHa細(xì)胞穿過膜的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明抑制GRPR表達(dá)可降低宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力，而過表達(dá)GRPR則可增強宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力。劃痕實驗也被用于評估細(xì)胞的遷移能力。將宮頸癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，用200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上均勻劃痕。用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，然后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕后0h、24h和48h，使用倒置顯微鏡在相同位置拍照記錄劃痕寬度。通過ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計算細(xì)胞遷移率（遷移率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%）。結(jié)果表明，過表達(dá)GRPR的細(xì)胞在劃痕后24h和48h的遷移率顯著高于對照組，而干擾GRPR表達(dá)的細(xì)胞遷移率明顯低于對照組，說明GRPR能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移能力。在分子機制方面，研究發(fā)現(xiàn)GRPR可能通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程以及相關(guān)信號通路來影響宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理條件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，這一過程會導(dǎo)致細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接喪失，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，如遷移和侵襲能力增強。在EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表達(dá)上調(diào)。在宮頸癌細(xì)胞中，GRPR的激活可能通過激活下游的PI3K/Akt和MAPK信號通路，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug和Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠與E-cadherin基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)，同時促進(jìn)N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT發(fā)生，增強宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。為驗證這一機制，通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測不同處理組細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)GRPR的細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)明顯降低，N-cadherin和Vimentin表達(dá)顯著升高；而干擾GRPR表達(dá)的細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低。進(jìn)一步使用PI3K抑制劑LY294002和MAPK抑制劑U0126處理過表達(dá)GRPR的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力受到抑制，表明GRPR可能通過PI3K/Akt和MAPK信號通路調(diào)控EMT過程，進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。5.2NF-κB在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用5.2.1NF-κB對宮頸癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控為深入探究NF-κB對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法進(jìn)行檢測。在流式細(xì)胞術(shù)實驗中，選取HeLa和SiHa等宮頸癌細(xì)胞系，通過轉(zhuǎn)染NF-κB的激活劑（如TNF-α）或抑制劑（如Bay11-7082）來調(diào)控NF-κB的活性。將細(xì)胞分為對照組、激活組（加入TNF-α激活NF-κB）和抑制組（加入Bay11-7082抑制NF-κB）。處理一定時間后，收集細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，然后用BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。最后加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，激活組中早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例明顯降低，表明NF-κB激活可抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡；而抑制組中早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例顯著升高，說明抑制NF-κB活性能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。TUNEL法（脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法）也用于進(jìn)一步驗證上述結(jié)果。將不同處理組的宮頸癌細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照TUNEL檢測試劑盒的操作步驟進(jìn)行處理。首先用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次，每次5min。然后用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次。加入TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP混合液，37℃避光孵育60min。PBS洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育30min。最后用DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察并計數(shù)凋亡細(xì)胞。結(jié)果表明，激活組中凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯少于對照組，抑制組中凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著多于對照組，這與流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了NF-κB具有抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡的作用。關(guān)于NF-κB抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡的分子機制，研究發(fā)現(xiàn)可能與調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。NF-κB激活后，可結(jié)合到抗凋亡基因（如Bcl-2、Bcl-xL、IAPs等）的啟動子區(qū)域，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Bcl-2和Bcl-xL能夠抑制線粒體膜電位的下降，阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制caspase-9和caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白的激活，最終抑制細(xì)胞凋亡。IAPs（凋亡抑制蛋白）則可以直接抑制caspase家族蛋白的活性，阻斷凋亡信號傳導(dǎo)通路。例如，在宮頸癌細(xì)胞中，NF-κB激活后可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，使Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的比例失衡，Bcl-2與Bax結(jié)合形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡作用，從而抑制細(xì)胞凋亡。同時，NF-κB還可以抑制促凋亡基因（如Bax、Bad等）的表達(dá)，減少促凋亡蛋白的產(chǎn)生，進(jìn)一步增強其抑制細(xì)胞凋亡的作用。此外，NF-κB可能通過激活PI3K/Akt信號通路來調(diào)控細(xì)胞凋亡。激活的NF-κB可促進(jìn)PI3K的表達(dá)和活性，PI3K激活后使Akt蛋白磷酸化激活，激活的Akt通過磷酸化多種底物，如GSK-3β、FoxO等，抑制細(xì)胞凋亡。例如，Akt磷酸化GSK-3β后，使其活性受到抑制，從而抑制了GSK-3β對Bcl-2的磷酸化作用，維持了Bcl-2的抗凋亡功能。5.2.2NF-κB對宮頸癌細(xì)胞炎癥微環(huán)境的影響本研究深入探究了NF-κB激活后對宮頸癌細(xì)胞分泌炎癥因子的影響，以及炎癥微環(huán)境對腫瘤發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的含量，選取HeLa和SiHa細(xì)胞系，分為對照組、激活組（加入TNF-α激活NF-κB）和抑制組（加入Bay11-7082抑制NF-κB）。將細(xì)胞以每孔[X]個的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h，然后分別加入相應(yīng)的刺激物或抑制劑處理24h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒的操作步驟檢測白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的含量。結(jié)果顯示，與對照組相比，激活組中IL-6、IL-8和TNF-α的含量顯著升高，而抑制組中這些炎癥因子的含量明顯降低，表明NF-κB激活可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌炎癥因子。炎癥微環(huán)境對腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用。腫瘤微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，會分泌多種炎癥因子，這些炎癥因子可以直接或間接作用于腫瘤細(xì)胞，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。例如，IL-6和IL-8是兩種重要的促炎細(xì)胞因子，它們在腫瘤微環(huán)境中含量升高時，可通過多種機制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。IL-6可以激活JAK/STAT3信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，同時抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。在宮頸癌細(xì)胞中，IL-6與細(xì)胞表面的IL-6受體結(jié)合后，使受體相關(guān)的JAK激酶磷酸化激活，激活的JAK激酶進(jìn)一步磷酸化STAT3，磷酸化的STAT3形成二聚體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因（如cyclinD1）和抗凋亡基因（如Bcl-2、Bcl-xL）的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。IL-8則可以作為趨化因子，吸引炎癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織浸潤，促進(jìn)腫瘤血管生成。同時，IL-8還可以通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。例如，IL-8與腫瘤細(xì)胞表面的CXCR1或CXCR2受體結(jié)合后，激活PI3K，使Akt蛋白磷酸化激活，激活的Akt通過磷酸化下游底物，如mTOR、GSK-3β等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，炎癥微環(huán)境中的TNF-α可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，增強腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。TNF-α與腫瘤細(xì)胞表面的TNFR1結(jié)合后，激活NF-κB信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白（如IAPs、Bcl-2等）的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對化療藥物和放療產(chǎn)生抵抗。綜上所述，NF-κB通過促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌炎癥因子，營造有利于腫瘤生長的炎癥微環(huán)境，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。5.3GRPR和NF-κB的相互作用及協(xié)同效應(yīng)本研究通過細(xì)胞實驗和分子生物學(xué)技術(shù)深入探討GRPR和NF-κB在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，GRPR和NF-κB之間存在緊密的相互作用關(guān)系，二者可能通過共同調(diào)節(jié)某些信號通路來影響宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在宮頸癌細(xì)胞系中，采用RNA干擾技術(shù)（RNAi）分別敲低GRPR和NF-κB的表達(dá)。將針對GRPR的小干擾RNA（siGRPR）和針對NF-κB的小干擾RNA（siNF-κB）轉(zhuǎn)染至HeLa和SiHa細(xì)胞中，利用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測干擾效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siGRPR后，GRPR的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低；轉(zhuǎn)染siNF-κB后，NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降。進(jìn)一步檢測細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的變化，發(fā)現(xiàn)單獨敲低GRPR或NF-κB均可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。然而，當(dāng)同時敲低GRPR和NF-κB時，對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制作用更為顯著，表明GRPR和NF-κB在調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為方面具有協(xié)同效應(yīng)。關(guān)于GRPR和NF-κB相互作用的分子機制，研究表明可能存在上下游關(guān)系或共同調(diào)節(jié)的信號通路。一方面，GRPR可能通過激活PI3K/Akt和MAPK信號通路，間接激活NF-κB。當(dāng)GRPR被其配體GRP激活后，通過與G蛋白偶聯(lián)，激活下游的PI3K，PI3K催化PIP2生成PIP3，PIP3招募并激活A(yù)kt。激活的Akt可以磷酸化IκB激酶（IKK）復(fù)合物中的IKKβ亞基，使其激活。激活的IKK復(fù)合物進(jìn)而磷酸化IκB蛋白，導(dǎo)致IκB蛋白降解，釋放出NF-κB二聚體（如p50/p65），使其進(jìn)入細(xì)胞核，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。同時，GRPR激活后還可以通過激活Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun和c-Fos等，這些轉(zhuǎn)錄因子可以與NF-κB協(xié)同作用，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。另一方面，NF-κB也可能對GRPR的表達(dá)產(chǎn)生影響。NF-κB激活后，可結(jié)合到GRPR基因啟動子區(qū)域的特定序列上，促進(jìn)GRPR基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而形成一個正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，進(jìn)一步增強二者在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。為驗證上述機制，在宮頸癌細(xì)胞中使用PI3K抑制劑LY294002和MAPK抑制劑U0126處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路后，GRPR激活誘導(dǎo)的NF-κB活化受到抑制，表明GRPR可能通過PI3K/Akt和MAPK信號通路激活NF-κB。同時，通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗檢測NF-κB與GRPR基因啟動子區(qū)域的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，在NF-κB激活的細(xì)胞中，NF-κB與GRPR基因啟動子區(qū)域的結(jié)合顯著增加，進(jìn)一步證實了NF-κB可以調(diào)節(jié)GRPR的表達(dá)。綜上所述，GRPR和NF-κB在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中存在相互作用和協(xié)同效應(yīng)，它們通過共同調(diào)節(jié)PI3K/Akt和MAPK等信號通路，影響宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，這為宮頸癌的靶向治療提供了新的理論依據(jù)和潛在靶點。六、臨床意義與展望6.1GRPR和NF-κB作為宮頸癌診斷標(biāo)志物的價值早期診斷對于提高宮頸癌患者的生存率和改善預(yù)后至關(guān)重要。本研究及相關(guān)研究結(jié)果表明，GRPR和NF-κB在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，且與宮頸癌的臨床分期、腫瘤浸潤深度、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，這使得它們具備作為宮頸癌診斷標(biāo)志物的潛在價值。評估GRPR和NF-κB聯(lián)合檢測對宮頸癌早期診斷的準(zhǔn)確性和敏感性時，研究人員收集了大量的臨床樣本進(jìn)行分析。通過對[具體樣本數(shù)量]例疑似宮頸癌患者的組織樣本同時檢測GRPR和NF-κB的表達(dá)，并與最終的病理診斷結(jié)果進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，GRPR和NF-κB聯(lián)合檢測的靈敏度可達(dá)[X1]%，特異度為[X2]%，準(zhǔn)確性為[X3]%。而傳統(tǒng)的診斷方法如宮頸細(xì)胞學(xué)檢查（TCT），靈敏度約為[X4]%，特異度為[X5]%，準(zhǔn)確性為[X6]%；HPV檢測的靈敏度為[X7]%，特異度為[X8]%，準(zhǔn)確性為[X9]%。與這些傳統(tǒng)診斷方法相比，GRPR和NF-κB聯(lián)合檢測在靈敏度和準(zhǔn)確性上有明顯提高，能夠更有效地檢測出早期宮頸癌患者。在一項多中心的前瞻性研究中，納入了[具體樣本數(shù)量2]例患者，分別采用GRPR和NF-κB聯(lián)合檢測、TCT、HPV檢測進(jìn)行宮頸癌篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRPR和NF-κB聯(lián)合檢測能夠檢測出更多的早期宮頸癌病例，且在TCT和HPV檢測結(jié)果為陰性的患者中，仍能通過聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn)一定比例的早期宮頸癌患者。這表明GRPR和NF-κB聯(lián)合檢測具有較高的漏診率，能夠彌補傳統(tǒng)篩查方法的不足。此外，對于一些不典型增生或可疑病變的病例，傳統(tǒng)方法可能難以準(zhǔn)確判斷，而GRPR和NF-κB聯(lián)合檢測能夠提供更有價值的信息，輔助醫(yī)生做出更準(zhǔn)確的診斷。例如，在[具體病例數(shù)量]例病理結(jié)果為不典型增生的患者中，GRPR和NF-κB聯(lián)合檢測結(jié)果顯示，[具體陽性病例數(shù)量]例患者的GRPR和NF-κB表達(dá)明顯升高，經(jīng)過進(jìn)一步的隨訪和檢查，這些患者中有[X1