C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡皮損檢測中的應(yīng)用與價值探究一、引言1.1研究背景與意義大皰性類天皰瘡（BullousPemphigoid，BP）是一種較為常見的自身免疫性大皰性皮膚病，多發(fā)生于老年人，其確切發(fā)病率因地域和研究人群而異，總體呈上升趨勢。BP的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要是機(jī)體產(chǎn)生針對半橋粒成分BP180和BP230的自身抗體，這些抗體與表皮基底膜帶的抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)等一系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致表皮與真皮分離，形成水皰。BP對患者的健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。在皮膚損害方面，患者皮膚上會出現(xiàn)緊張性水皰和大皰，皰壁較厚，不易破裂，周圍常有紅斑。水皰可發(fā)生于身體的任何部位，常見于胸腹、四肢屈側(cè)等，嚴(yán)重影響皮膚的完整性和美觀。隨著病情進(jìn)展，水皰破裂后會形成糜爛面，容易繼發(fā)感染，增加患者的痛苦和治療難度。瘙癢是BP患者常見且困擾的癥狀之一，其程度往往較為劇烈，嚴(yán)重干擾患者的睡眠和日常生活。長期的瘙癢會導(dǎo)致患者精神狀態(tài)不佳，出現(xiàn)焦慮、抑郁等心理問題，進(jìn)一步降低生活質(zhì)量。而且，BP患者由于皮膚屏障功能受損，蛋白質(zhì)從水皰中丟失，容易并發(fā)低蛋白血癥，影響機(jī)體的營養(yǎng)狀況和免疫功能。此外，皮膚破損后的繼發(fā)感染還可能引發(fā)敗血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，對患者的生命健康構(gòu)成威脅。目前，BP的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)檢查以及免疫病理學(xué)檢測。其中，免疫病理學(xué)檢測對于BP的確診和鑒別診斷具有關(guān)鍵作用。直接免疫熒光（DIF）是檢測BP免疫病理改變的經(jīng)典方法，可在表皮基底膜帶檢測到IgG和C3的線狀沉積，但該方法存在一些局限性，如需要新鮮組織、操作復(fù)雜、結(jié)果判讀主觀性較強(qiáng)等。C3d和C4d是補(bǔ)體激活途徑中的重要成分。在BP的發(fā)病過程中，補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，C3d和C4d會沉積在表皮基底膜帶。通過免疫酶組織化學(xué)染色檢測皮損組織中的C3d和C4d，能夠直觀地觀察到補(bǔ)體激活的部位和程度，為BP的診斷提供重要依據(jù)。這種檢測方法具有獨特的優(yōu)勢，它可以在石蠟包埋組織切片上進(jìn)行，對組織的保存條件要求相對較低，便于臨床樣本的收集和回顧性研究。免疫酶組織化學(xué)染色操作相對簡便，結(jié)果易于觀察和判斷，能夠為臨床醫(yī)生提供更快速、準(zhǔn)確的診斷信息。準(zhǔn)確診斷BP對于制定合理的治療方案至關(guān)重要。如果誤診或漏診，可能導(dǎo)致患者接受不恰當(dāng)?shù)闹委?，延誤病情，增加患者的痛苦和醫(yī)療費用。而及時、準(zhǔn)確的診斷能夠使患者盡早接受有效的治療，如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，控制病情發(fā)展，減少并發(fā)癥的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量和生存率。C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測在BP的診斷中具有重要的輔助作用，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)診斷方法的不足，為臨床醫(yī)生提供更全面、準(zhǔn)確的診斷信息，對BP患者的治療和預(yù)后具有積極的指導(dǎo)意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，大皰性類天皰瘡的研究起步較早，對其發(fā)病機(jī)制的探索較為深入。眾多研究表明，BP患者血清中存在針對BP180和BP230的自身抗體，這些抗體與抗原結(jié)合后激活補(bǔ)體系統(tǒng)，其中經(jīng)典途徑和旁路途徑在BP的發(fā)病過程中均發(fā)揮重要作用。在診斷方面，直接免疫熒光作為傳統(tǒng)的診斷方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用多年，但由于其局限性，促使研究者不斷尋找新的輔助診斷方法。C3d和C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)在國外也受到了較多關(guān)注。相關(guān)研究通過對大量BP患者皮損組織的檢測，發(fā)現(xiàn)C3d和C4d在表皮基底膜帶的沉積與BP的病情活動密切相關(guān)。一些研究還將該技術(shù)與其他診斷方法進(jìn)行對比，評估其在BP診斷中的準(zhǔn)確性和可靠性，為臨床診斷提供了更多的參考依據(jù)。在國內(nèi)，大皰性類天皰瘡的研究也取得了一定的進(jìn)展。隨著對自身免疫性皮膚病認(rèn)識的不斷提高，對BP的臨床診斷和治療經(jīng)驗逐漸積累。國內(nèi)學(xué)者在研究BP的發(fā)病機(jī)制時，不僅關(guān)注補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，還對細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞等在BP發(fā)病中的作用進(jìn)行了探討，為深入理解BP的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。在C3d和C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的應(yīng)用研究方面，國內(nèi)也有不少學(xué)者開展了相關(guān)工作。通過對不同地區(qū)、不同年齡段的BP患者進(jìn)行研究，進(jìn)一步驗證了該技術(shù)在輔助診斷BP中的價值，為國內(nèi)臨床醫(yī)生提供了更適合本土患者的診斷方法。盡管國內(nèi)外在大皰性類天皰瘡和C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的研究方面取得了一定成果，但仍存在一些不足。一方面，對于C3d和C4d在BP發(fā)病機(jī)制中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)一步深入研究。另一方面，目前關(guān)于C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善，不同研究之間的結(jié)果可能存在一定差異，影響了該技術(shù)在臨床中的廣泛應(yīng)用。本研究將在國內(nèi)外現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡皮損檢測中的應(yīng)用價值。通過優(yōu)化實驗方法，制定標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，提高該技術(shù)的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，結(jié)合臨床資料，深入分析C3d、C4d的表達(dá)與BP患者病情嚴(yán)重程度、治療效果及預(yù)后的相關(guān)性，為大皰性類天皰瘡的診斷、治療和預(yù)后評估提供更有力的支持。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡皮損檢測中的具體應(yīng)用及價值。通過對大皰性類天皰瘡患者皮損組織進(jìn)行C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色，分析其在表皮基底膜帶的沉積情況，明確該檢測方法在BP診斷中的敏感性和特異性。結(jié)合患者的臨床資料，如病情嚴(yán)重程度、治療效果、預(yù)后等，探討C3d、C4d的表達(dá)與這些臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性，為BP的臨床診斷、治療方案的制定以及預(yù)后評估提供科學(xué)依據(jù)。在研究過程中，本研究具有多方面的創(chuàng)新點。在樣本選取上，將納入不同年齡段、不同病情嚴(yán)重程度以及不同治療階段的大皰性類天皰瘡患者，使樣本更具代表性，能夠全面反映C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在不同情況下的應(yīng)用價值。與以往研究相比，本研究不僅關(guān)注C3d、C4d在BP診斷中的作用，還將深入探討其與患者治療效果及預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療和病情監(jiān)測提供更全面的信息。在檢測方法上，本研究將對C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過對比不同的抗體濃度、孵育時間、顯色條件等，確定最佳的實驗參數(shù)，提高檢測的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。引入圖像分析技術(shù)，對染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，減少人為因素對結(jié)果判讀的影響，使結(jié)果更加客觀、可靠。此外，本研究還將嘗試聯(lián)合其他檢測指標(biāo)，如BP180、BP230抗體水平等，綜合評估其在BP診斷和病情評估中的價值，為臨床提供更全面、準(zhǔn)確的診斷方案。二、大皰性類天皰瘡概述2.1疾病定義與發(fā)病機(jī)制大皰性類天皰瘡是一種自身免疫性大皰性皮膚病，主要累及皮膚，好發(fā)于老年人。其發(fā)病機(jī)制與自身免疫密切相關(guān)，具體過程較為復(fù)雜。機(jī)體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常時，會產(chǎn)生針對皮膚基底膜帶成分的自身抗體，其中主要是抗BP180和BP230抗體。BP180是一種跨膜蛋白，其胞外部分位于基底膜帶的透明板區(qū)域，而BP230則是一種位于半橋粒的胞內(nèi)蛋白，它們在維持表皮與真皮的連接中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)自身抗體與BP180和BP230結(jié)合后，會激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體激活主要通過經(jīng)典途徑和旁路途徑。在經(jīng)典途徑中，抗體與抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，激活C1q，進(jìn)而依次激活C1r、C1s，形成C3轉(zhuǎn)化酶，使C3裂解為C3a和C3b，C3b又可進(jìn)一步參與形成C5轉(zhuǎn)化酶，啟動后續(xù)補(bǔ)體成分的級聯(lián)反應(yīng)。旁路途徑則可不依賴抗體，通過C3b與微生物表面的激活物結(jié)合，形成旁路途徑C3轉(zhuǎn)化酶，激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體激活后產(chǎn)生的多種活性片段，如C3a、C5a等，具有趨化作用，能夠吸引中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞聚集到表皮基底膜帶。這些炎癥細(xì)胞釋放多種蛋白水解酶和活性氧等物質(zhì)，導(dǎo)致基底膜帶的結(jié)構(gòu)破壞，使表皮與真皮分離，最終形成水皰。嗜酸性粒細(xì)胞還能釋放主要堿性蛋白等毒性物質(zhì)，進(jìn)一步損傷皮膚組織，加重炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子在大皰性類天皰瘡的發(fā)病中也起到重要作用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)增加，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化和增殖，加劇炎癥反應(yīng)，破壞皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。2.2臨床癥狀與皮損特點大皰性類天皰瘡患者在水皰出現(xiàn)前，常存在前驅(qū)癥狀。約半數(shù)以上患者會出現(xiàn)不同程度的瘙癢，這種瘙癢可輕可重，輕者可能只是偶爾感到皮膚輕微瘙癢，重者則會因瘙癢而難以入睡，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。瘙癢可呈全身性分布，也可局限于某些部位，如四肢、軀干等。部分患者還會出現(xiàn)非特異性皮損，持續(xù)時間從數(shù)周乃至數(shù)月不等。這些皮損形態(tài)多樣，常見的有濕疹樣皮損，表現(xiàn)為皮膚紅斑、丘疹、丘皰疹，伴有滲出、結(jié)痂，邊界一般不太清晰；蕁麻疹樣皮損則表現(xiàn)為大小不等的風(fēng)團(tuán)，風(fēng)團(tuán)顏色可呈淡紅色或蒼白色，形態(tài)不規(guī)則，可在數(shù)小時內(nèi)自行消退，但會反復(fù)出現(xiàn)。隨著病情發(fā)展，患者會出現(xiàn)典型的皮膚損害。在紅斑、蕁麻疹樣皮損或看似正常的皮膚上，會出現(xiàn)緊張性大皰，這些大皰的大小差異較大，小的如櫻桃般大小，直徑可能僅有1-2厘米，大的則可達(dá)到核桃甚至鴨蛋大小，直徑能超過5厘米。大皰皰壁較厚，呈半球狀，質(zhì)地堅韌，一般不易破裂，皰液清亮，少數(shù)情況下可呈血性。水皰通常在一周內(nèi)泛發(fā)全身，嚴(yán)重影響患者外觀。水皰多在一周內(nèi)破潰，形成糜爛面，隨后逐漸結(jié)痂愈合。痂皮脫落后，局部會有色素沉著，但一般不會留下瘢痕。皮損往往成批出現(xiàn)，此起彼伏，新的水皰不斷產(chǎn)生，舊的水皰逐漸愈合，使得病情遷延不愈。大皰性類天皰瘡的皮損具有一定的好發(fā)部位，大致呈對稱分布。軀干是常見的發(fā)病部位之一，包括胸部、腹部、背部等區(qū)域；四肢屈側(cè)，如上肢的內(nèi)側(cè)、下肢的后側(cè)等部位也容易受累；褶皺部位，像腋窩、腹股溝、頸部的褶皺處等，由于皮膚較為潮濕、溫暖，且容易受到摩擦，也常出現(xiàn)皮損。雖然大部分患者主要累及皮膚，但仍有少部分患者會出現(xiàn)黏膜受累的情況，其中口腔黏膜是較為常見的受累部位，患者可能會出現(xiàn)口腔黏膜的水皰、糜爛、疼痛等癥狀，影響進(jìn)食和吞咽；生殖器黏膜也可能受累，導(dǎo)致局部不適、疼痛，對患者的生活和心理造成較大影響。2.3傳統(tǒng)診斷方法局限性臨床觀察在大皰性類天皰瘡的診斷中雖具有一定的初步篩查作用，但存在明顯的局限性。大皰性類天皰瘡在發(fā)病初期，癥狀往往不典型，前驅(qū)癥狀如瘙癢、非特異性皮損等容易與其他皮膚病混淆。濕疹樣皮損與濕疹難以區(qū)分，蕁麻疹樣皮損與蕁麻疹也有相似之處，這就導(dǎo)致僅依靠臨床觀察很難準(zhǔn)確判斷是否為大皰性類天皰瘡。而且在疾病發(fā)展過程中，部分患者的水皰形態(tài)、分布等特征也可能不典型，一些患者的水皰可能較小，或者分布較為局限，這也增加了臨床觀察診斷的難度。組織病理學(xué)檢查是大皰性類天皰瘡診斷的重要依據(jù)之一，但也存在不足之處。組織病理學(xué)檢查需要對患者的皮損組織進(jìn)行取材，這是一種有創(chuàng)操作，可能會給患者帶來一定的痛苦和不適，尤其是對于一些年齡較大、身體狀況較差的患者，耐受性較差。在病理切片制作過程中，可能會出現(xiàn)組織固定不佳、切片厚度不均勻等問題，影響病理結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且，大皰性類天皰瘡的組織病理學(xué)表現(xiàn)有時缺乏特異性，在某些情況下，表皮下水皰的表現(xiàn)可能與其他大皰性皮膚病相似，難以僅通過組織病理學(xué)檢查進(jìn)行明確診斷。直接免疫熒光作為傳統(tǒng)的免疫病理學(xué)檢測方法，雖然在大皰性類天皰瘡的診斷中應(yīng)用廣泛，但也存在一些缺點。該方法需要新鮮的組織樣本，這就要求在取材后盡快進(jìn)行檢測，對樣本的保存和運(yùn)輸條件要求較高，限制了其在一些基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)或樣本獲取困難地區(qū)的應(yīng)用。直接免疫熒光操作過程較為復(fù)雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員和設(shè)備，如熒光顯微鏡等，這增加了檢測的成本和技術(shù)門檻。而且，結(jié)果判讀主觀性較強(qiáng)，不同的觀察者可能會對同一熒光圖像的判讀存在差異，尤其是對于一些熒光強(qiáng)度較弱或沉積形態(tài)不典型的情況，容易出現(xiàn)誤診或漏診。三、C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)剖析3.1技術(shù)基本原理C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)基于抗原抗體特異性結(jié)合以及酶催化顯色的原理。在大皰性類天皰瘡的發(fā)病過程中，機(jī)體免疫系統(tǒng)針對皮膚基底膜帶成分產(chǎn)生自身抗體，進(jìn)而激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體激活后，C3和C4會被裂解為多個片段，其中C3d和C4d是重要的裂解產(chǎn)物。在免疫酶組織化學(xué)染色過程中，首先將組織切片進(jìn)行處理，使其中的抗原暴露。然后加入特異性的抗C3d和抗C4d抗體，這些抗體能夠與組織切片中的C3d和C4d抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。接著，加入與一抗特異性結(jié)合的二抗，二抗上標(biāo)記有酶，如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）。當(dāng)加入相應(yīng)的酶底物時，酶會催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。如果組織中存在C3d和C4d抗原，經(jīng)過上述步驟后，在抗原存在的部位就會出現(xiàn)顯色反應(yīng)，通過顯微鏡即可觀察到。在大皰性類天皰瘡皮損組織中，由于補(bǔ)體系統(tǒng)被激活，C3d和C4d會沉積在表皮基底膜帶。通過免疫酶組織化學(xué)染色，能夠使這些沉積的C3d和C4d顯色，從而直觀地觀察到其在皮損組織中的分布和沉積情況。這種技術(shù)可以在細(xì)胞和組織水平上對C3d和C4d進(jìn)行定位和定性分析，為研究大皰性類天皰瘡的發(fā)病機(jī)制和診斷提供重要依據(jù)。3.2染色操作流程詳解免疫酶組織化學(xué)染色操作流程較為復(fù)雜，需要嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。取材固定是實驗的第一步，至關(guān)重要。在大皰性類天皰瘡患者皮損部位選取標(biāo)本時，應(yīng)盡量選擇典型的水皰邊緣或早期紅斑部位，避免取到已經(jīng)破潰或感染的區(qū)域。標(biāo)本大小一般控制在0.5cm×0.5cm×0.2cm左右，以保證能夠充分反映病變情況，同時便于后續(xù)處理。使用10%中性緩沖甲醛液作為固定液，其pH值應(yīng)保持在7.2-7.4，這是因為在該pH條件下，能夠較好地保存組織的形態(tài)和抗原性。固定時間以4-6小時為宜，時間過短，組織固定不充分，抗原容易丟失，影響后續(xù)染色效果；時間過長，則可能導(dǎo)致組織過度固定，抗原被掩蓋，同樣不利于實驗結(jié)果。固定后的標(biāo)本需進(jìn)行切片處理。先將標(biāo)本進(jìn)行脫水，使用梯度乙醇從低濃度到高濃度依次處理，如70%乙醇1小時、80%乙醇1小時、95%乙醇1小時、無水乙醇1小時，以徹底去除組織中的水分。然后進(jìn)行浸蠟，將脫水后的組織放入融化的石蠟中，在60℃左右的溫度下浸蠟2-3小時，使石蠟充分滲透到組織內(nèi)部。切片時，使用切片機(jī)將浸蠟后的組織切成厚度為3-5μm的薄片，切片要平整、連續(xù)，避免出現(xiàn)褶皺或斷裂，否則會影響觀察。切片完成后進(jìn)行脫蠟水化。將石蠟切片放入60℃烤箱中烘烤20分鐘，使切片與載玻片緊密貼合。立即放入二甲苯Ⅰ中脫蠟15分鐘，再轉(zhuǎn)入二甲苯Ⅱ中脫蠟15分鐘，以確保石蠟完全去除。隨后依次經(jīng)過無水乙醇Ⅰ5分鐘、無水乙醇Ⅱ5分鐘、95%乙醇5分鐘、85%乙醇5分鐘、75%乙醇5分鐘進(jìn)行水化，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)，便于后續(xù)抗體等試劑與組織中抗原結(jié)合。若脫蠟和水化不全，易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，產(chǎn)生非特異性背景著色?？乖迯?fù)是為了使在固定過程中被封閉的抗原重新暴露。由于大皰性類天皰瘡相關(guān)抗原在甲醛固定過程中，蛋白之間發(fā)生交聯(lián)及醛基封閉，導(dǎo)致抗原性部分喪失。常用的修復(fù)方法有高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)等。本實驗采用微波修復(fù)法，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的容器中，中火微波6分鐘，重復(fù)4次。修復(fù)后自然冷卻30分鐘左右，待修復(fù)液溫度達(dá)到室溫即可。不當(dāng)?shù)目乖迯?fù)會導(dǎo)致抗原定位改變，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。細(xì)胞通透旨在使抗體能夠充分進(jìn)入胞內(nèi)與抗原結(jié)合。使用0.3%TritonX-100溶液處理切片15分鐘，TritonX-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)，使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)。在細(xì)胞免疫組化中，TritonX-100能有效提高抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的效率，從而增強(qiáng)染色效果。在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，因此需進(jìn)行滅活處理。采用3%過氧化氫溶液處理切片10分鐘，可有效滅活內(nèi)源性過氧化物酶。使用甲醇配置過氧化氫，不僅能起到滅活作用，還對保護(hù)抗原和固定組織有一定好處。但過氧化氫孵育時間過長易引起脫片，需現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4℃避光保存。為防止一抗與組織切片上剩余位點非特異性結(jié)合，造成假陽性結(jié)果，需進(jìn)行血清封閉。使用與二抗同一來源的血清，如二抗為羊抗鼠抗體，則使用羊血清進(jìn)行封閉。一般在室溫或37℃下孵育10-30分鐘，使血清中的動物自身抗體與組織中有交叉反應(yīng)的位點充分結(jié)合。也可以用小牛血清、BSA等，但不能與一抗來源一致。一抗孵育是免疫酶組織化學(xué)染色的關(guān)鍵步驟之一。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將抗C3d和抗C4d抗體稀釋至合適濃度，如1:100-1:500。滴加一抗工作液于切片上，每張切片約50-100μl，確保抗體均勻覆蓋組織。將切片放入濕盒中，37℃孵育1-2小時，或4℃孵育過夜。4℃孵育過夜效果更佳，但需注意從冰箱取出后，應(yīng)在37℃復(fù)溫45分鐘，使抗體與抗原充分結(jié)合。孵育時間和抗體濃度需根據(jù)實際情況進(jìn)行摸索，以獲得最佳染色效果。二抗孵育時，使用與一抗對應(yīng)的二抗，如抗鼠IgG的二抗。二抗一般為工作液，若為濃縮液則需進(jìn)行稀釋。將二抗滴加在切片上，每張切片50-100μl，在室溫或37℃下孵育30分鐘-1小時。具體時間和濃度需根據(jù)實驗情況摸索確定。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片5分鐘，重復(fù)3次，以洗去未結(jié)合的二抗。DAB顯色是使抗原抗體復(fù)合物顯色的關(guān)鍵步驟。DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）在辣根過氧化物酶的催化下，與過氧化氫反應(yīng)生成棕色沉淀，從而使抗原所在部位顯色。將適量DAB顯色液滴加在切片上，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色，一般顯色時間為1-5分鐘。若顯色時間過短，可能導(dǎo)致陽性結(jié)果不明顯；若顯色時間過長，則背景會加深，影響結(jié)果判斷。復(fù)染的目的是使細(xì)胞輪廓更加清晰，便于對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。常用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，蘇木素是一種堿性染料，可使細(xì)胞核染成藍(lán)色。將切片放入蘇木素染液中染色2分鐘，然后用流水沖洗5分鐘，以洗去多余的蘇木素。此時，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，與陽性結(jié)果的棕色形成鮮明對比，便于在顯微鏡下觀察。復(fù)染后的切片需進(jìn)行脫水透明和封片。依次經(jīng)過梯度酒精脫水，即從低濃度到高濃度的酒精，如75%乙醇5分鐘、85%乙醇5分鐘、95%乙醇5分鐘、無水乙醇Ⅰ5分鐘、無水乙醇Ⅱ5分鐘，徹底去除組織中的水分。再將切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各透明15分鐘，使切片變得透明，便于光線透過。最后用中性樹膠封片，將蓋玻片覆蓋在切片上，使切片能夠長期保存。3.3技術(shù)優(yōu)勢與可靠性分析C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)在大皰性類天皰瘡皮損檢測中展現(xiàn)出多方面的顯著優(yōu)勢。從特異性角度來看，該技術(shù)基于抗原抗體特異性結(jié)合原理，抗C3d和抗C4d抗體能夠精準(zhǔn)地識別并結(jié)合組織中的C3d和C4d抗原。這種高度的特異性使得染色結(jié)果能夠準(zhǔn)確地反映出C3d和C4d在皮損組織中的存在情況，有效避免了與其他無關(guān)抗原的交叉反應(yīng)，從而為大皰性類天皰瘡的診斷提供了可靠的依據(jù)。在大皰性類天皰瘡的發(fā)病過程中，補(bǔ)體激活后C3d和C4d會特異性地沉積在表皮基底膜帶，通過該技術(shù)能夠清晰地顯示出這一特征性的沉積部位，有助于與其他類似皮膚病進(jìn)行鑒別診斷。在敏感性方面，免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)具有較高的靈敏度，能夠檢測到微量的C3d和C4d抗原。通過抗原抗體的特異性結(jié)合以及酶催化顯色的放大作用，即使組織中C3d和C4d的含量較低，也能夠通過顯色反應(yīng)被檢測出來。這使得該技術(shù)能夠在疾病的早期階段，當(dāng)抗原表達(dá)量可能相對較少時，依然能夠準(zhǔn)確地檢測到相關(guān)抗原，為疾病的早期診斷提供了有力支持。在一些早期大皰性類天皰瘡患者的皮損組織中，C3d和C4d的沉積量可能較少，但免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)仍能有效地將其檢測出來，有助于早期發(fā)現(xiàn)和診斷疾病，及時采取治療措施。定位準(zhǔn)確也是C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的重要優(yōu)勢之一。該技術(shù)可以在細(xì)胞和組織水平上對C3d和C4d進(jìn)行精確定位，直觀地顯示出它們在表皮基底膜帶的沉積位置和分布情況。通過顯微鏡觀察染色后的切片，能夠清晰地看到C3d和C4d在皮膚組織中的具體位置，這對于了解疾病的發(fā)病機(jī)制和病理變化具有重要意義。通過定位分析，可以進(jìn)一步研究C3d和C4d與其他皮膚組織成分之間的關(guān)系，深入探討它們在大皰性類天皰瘡發(fā)病過程中的作用。為了進(jìn)一步說明該技術(shù)的可靠性，將其與其他常見的檢測方法進(jìn)行對比具有重要意義。與直接免疫熒光（DIF）這一經(jīng)典的檢測方法相比，C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)具有明顯優(yōu)勢。DIF需要新鮮組織，對樣本的保存和運(yùn)輸條件要求較高，而免疫酶組織化學(xué)染色可以在石蠟包埋組織切片上進(jìn)行，對組織的保存條件要求相對較低。這使得免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)在臨床樣本的收集和回顧性研究中具有更大的優(yōu)勢，能夠更方便地獲取和分析樣本。免疫酶組織化學(xué)染色操作相對簡便，結(jié)果易于觀察和判斷。DIF結(jié)果判讀主觀性較強(qiáng)，不同的觀察者可能會對同一熒光圖像的判讀存在差異，而免疫酶組織化學(xué)染色的顯色結(jié)果直觀清晰，減少了人為因素對結(jié)果判讀的影響，提高了診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。在質(zhì)量控制方面，本研究采取了一系列嚴(yán)格的措施來確保C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的可靠性。在實驗過程中，使用已知陽性和陰性的對照樣本同步進(jìn)行染色。陽性對照樣本可以驗證實驗體系的有效性，確保實驗過程中抗原抗體反應(yīng)正常，染色步驟無誤；陰性對照樣本則用于檢測是否存在非特異性染色，排除假陽性結(jié)果的干擾。通過設(shè)置對照樣本，可以及時發(fā)現(xiàn)實驗中可能出現(xiàn)的問題，保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。定期對實驗儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，確保儀器的性能穩(wěn)定。顯微鏡的分辨率和成像質(zhì)量對染色結(jié)果的觀察和分析至關(guān)重要，定期校準(zhǔn)顯微鏡可以保證圖像的清晰度和準(zhǔn)確性，避免因儀器誤差導(dǎo)致的結(jié)果誤判。對實驗人員進(jìn)行嚴(yán)格的培訓(xùn)，使其熟練掌握實驗操作流程和技巧，減少人為操作誤差。實驗人員的操作熟練程度和規(guī)范程度會直接影響實驗結(jié)果的可靠性，通過培訓(xùn)可以提高實驗人員的操作水平，確保實驗操作的一致性和準(zhǔn)確性。通過以上對比分析和質(zhì)量控制措施，可以充分說明C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)在大皰性類天皰瘡皮損檢測中具有較高的可靠性，能夠為臨床診斷和研究提供準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)。四、C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測大皰性類天皰瘡皮損的應(yīng)用實例4.1實例一：某醫(yī)院多病例研究某三甲醫(yī)院皮膚科對大皰性類天皰瘡的診斷和治療進(jìn)行了深入研究，收集了50例臨床疑似大皰性類天皰瘡患者的皮膚組織標(biāo)本。這些患者年齡范圍在60-85歲之間，平均年齡為72歲，其中男性28例，女性22例。所有患者均出現(xiàn)了不同程度的皮膚水皰、大皰，部分患者伴有瘙癢、紅斑等癥狀。研究人員對這些標(biāo)本進(jìn)行了C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測。在染色過程中，嚴(yán)格按照前文所述的操作流程進(jìn)行，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。取材時，選取典型的水皰邊緣或早期紅斑部位，用10%中性緩沖甲醛液固定4-6小時。然后進(jìn)行切片、脫蠟水化、抗原修復(fù)、細(xì)胞通透、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、復(fù)染以及脫水透明封片等步驟。檢測結(jié)果顯示，在50例患者中，有45例患者的皮膚組織基底膜帶檢測到C3d和C4d的沉積，沉積率達(dá)到90%。這些患者的C3d和C4d主要呈線狀沉積于表皮基底膜帶，顏色為棕色，與周圍組織形成明顯對比，在顯微鏡下清晰可見。其中，30例患者的C3d和C4d沉積強(qiáng)度較強(qiáng)，表現(xiàn)為深棕色的連續(xù)線狀染色；15例患者的沉積強(qiáng)度相對較弱，但仍能明確觀察到。通過對這45例患者的臨床資料進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，C3d和C4d沉積陽性的患者，其病情嚴(yán)重程度與沉積強(qiáng)度存在一定關(guān)聯(lián)。沉積強(qiáng)度較強(qiáng)的30例患者中，有20例患者的皮損面積較大，超過體表面積的30%，且水皰、大皰的數(shù)量較多，瘙癢癥狀也較為劇烈，對生活質(zhì)量影響較大。而在沉積強(qiáng)度相對較弱的15例患者中，僅有5例患者的皮損面積超過體表面積的30%，其余患者的皮損相對較輕，水皰、大皰數(shù)量較少，瘙癢癥狀也相對較輕。在治療方面，對于C3d和C4d沉積陽性的患者，醫(yī)生根據(jù)病情給予了相應(yīng)的治療方案。對于病情較輕的患者，采用局部外用糖皮質(zhì)激素治療，如糠酸莫米松乳膏等，每日涂抹1-2次，經(jīng)過1-2周的治療，大部分患者的水皰、大皰逐漸干涸、結(jié)痂，瘙癢癥狀明顯緩解。對于病情較重的患者，除了外用糖皮質(zhì)激素外，還給予口服糖皮質(zhì)激素治療，如潑尼松，初始劑量根據(jù)患者的體重和病情確定，一般為1mg/（kg?d）。經(jīng)過2-4周的治療，患者的病情得到有效控制，水皰、大皰不再新發(fā)，原有皮損逐漸愈合。在這45例患者中，有38例患者在治療后病情得到明顯改善，水皰、大皰消失，皮膚恢復(fù)正常，瘙癢癥狀消失。通過再次對這些患者進(jìn)行C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測，發(fā)現(xiàn)其中30例患者的C3d和C4d沉積明顯減弱或消失，表現(xiàn)為染色強(qiáng)度降低或僅見微弱的線狀染色。這表明C3d和C4d的沉積情況與患者的治療效果密切相關(guān)，隨著病情的好轉(zhuǎn)，C3d和C4d的沉積也相應(yīng)減少。通過對這50例臨床疑似大皰性類天皰瘡患者的研究，充分證明了C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測在大皰性類天皰瘡診斷中的重要輔助作用。該技術(shù)能夠準(zhǔn)確檢測到皮膚組織基底膜帶中C3d和C4d的沉積情況，為大皰性類天皰瘡的診斷提供有力依據(jù)。C3d和C4d的沉積情況還與患者的病情嚴(yán)重程度和治療效果相關(guān)，有助于醫(yī)生制定個性化的治療方案，評估治療效果，對大皰性類天皰瘡患者的臨床診療具有重要的指導(dǎo)意義。4.2實例二：與其他皮膚病對比研究為了深入探究C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡診斷中的特異性及鑒別診斷價值，研究人員選取了多種具有相似臨床表現(xiàn)的皮膚病進(jìn)行對比研究，其中包括家族性良性天皰瘡、大皰性表皮松解癥等。研究共納入20例大皰性類天皰瘡患者、9例大皰性表皮松解癥患者以及4例家族性慢性良性天皰瘡患者。對這些患者的石蠟包埋組織切片，均采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行C3d、C4d檢測。在實驗過程中，嚴(yán)格把控每一個操作環(huán)節(jié)，確保實驗條件的一致性和準(zhǔn)確性。從標(biāo)本的取材部位、固定時間和方法，到切片的厚度、脫蠟水化的步驟，再到抗原修復(fù)、抗體孵育的條件等，都按照標(biāo)準(zhǔn)化的流程進(jìn)行操作。檢測結(jié)果顯示出明顯的差異。在20例大皰性類天皰瘡患者中，19例患者的石蠟包埋切片在真表皮交界基底膜處檢測到C3d、C4d沉積，沉積率高達(dá)95%。這些沉積呈現(xiàn)出典型的線狀分布，顏色為棕色，在顯微鏡下清晰可辨，與大皰性類天皰瘡的發(fā)病機(jī)制中補(bǔ)體在基底膜帶的激活和沉積相符合。與之形成鮮明對比的是，9例大皰性表皮松解癥患者中，真表皮交界基底膜處C3d、C4d陽性率為0%。大皰性表皮松解癥是一種遺傳性大皰性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制主要與編碼皮膚結(jié)構(gòu)蛋白的基因突變有關(guān)，導(dǎo)致皮膚結(jié)構(gòu)蛋白缺陷，使皮膚在受到輕微摩擦等外力作用下就容易發(fā)生水皰。在這種疾病中，補(bǔ)體系統(tǒng)并未像在大皰性類天皰瘡中那樣被激活，因此在基底膜帶檢測不到C3d、C4d的沉積。4例家族性慢性良性天皰瘡患者的基底膜帶也均未檢測到C3d、C4d沉積。家族性慢性良性天皰瘡是一種常染色體顯性遺傳性皮膚病，由ATP2C1基因突變導(dǎo)致，主要病理改變?yōu)楸砥ぜ?xì)胞間連接結(jié)構(gòu)異常，引起棘層松解，從而形成水皰。其發(fā)病機(jī)制與補(bǔ)體系統(tǒng)的激活無關(guān)，所以在免疫酶組織化學(xué)染色檢測中，基底膜帶無C3d、C4d沉積。通過對這些不同皮膚病患者的研究結(jié)果對比分析，可以清晰地看出C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡與其他類似皮膚病的鑒別診斷中具有重要價值。大皰性類天皰瘡患者皮損組織中C3d、C4d在基底膜帶的特異性沉積，為臨床醫(yī)生在面對具有相似臨床表現(xiàn)的皮膚病時，提供了一種可靠的鑒別診斷依據(jù)。當(dāng)臨床上遇到疑似大皰性皮膚病的患者時，通過C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測，若在基底膜帶檢測到C3d、C4d沉積，則高度提示大皰性類天皰瘡的診斷；若未檢測到沉積，則需要進(jìn)一步結(jié)合其他臨床特征、實驗室檢查等，考慮是否為大皰性表皮松解癥、家族性慢性良性天皰瘡等其他皮膚病。這種檢測方法能夠幫助臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地診斷疾病，避免誤診和漏診，為患者制定更合適的治療方案，具有重要的臨床意義。4.3實例三：治療監(jiān)測中的應(yīng)用在一項針對大皰性類天皰瘡患者治療監(jiān)測的研究中，納入了30例接受系統(tǒng)治療的患者。這些患者均被確診為大皰性類天皰瘡，年齡范圍在65-80歲之間，平均年齡為72歲?；颊咴诖_診后，均接受了糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑的治療方案。糖皮質(zhì)激素的初始劑量根據(jù)患者的病情和體重確定，一般為潑尼松0.5-1mg/（kg?d），免疫抑制劑則選用硫唑嘌呤，劑量為1-2mg/（kg?d）。在治療過程中，定期對患者進(jìn)行C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測。檢測時間點分別為治療前、治療1個月后、治療3個月后以及治療6個月后。每次檢測時，均從患者的皮損部位取新鮮組織，按照嚴(yán)格的免疫酶組織化學(xué)染色操作流程進(jìn)行檢測。治療前，30例患者的皮損組織中均檢測到C3d和C4d在表皮基底膜帶的明顯沉積。其中，C3d沉積強(qiáng)度評分為3分（評分標(biāo)準(zhǔn)：無沉積為0分，輕度沉積為1分，中度沉積為2分，重度沉積為3分）的患者有18例，C4d沉積強(qiáng)度評分為3分的患者有16例。隨著治療的進(jìn)行，檢測結(jié)果發(fā)生了顯著變化。治療1個月后，10例患者的C3d沉積強(qiáng)度有所下降，其中3例患者下降至2分；C4d沉積強(qiáng)度下降的患者有8例，2例患者下降至2分。此時，患者的臨床癥狀也有了一定程度的改善，如瘙癢癥狀減輕，水皰、大皰的數(shù)量減少。治療3個月后，C3d沉積強(qiáng)度進(jìn)一步下降，評分為3分的患者減少至5例，評分為2分的患者增加至15例；C4d沉積強(qiáng)度評分為3分的患者減少至4例，評分為2分的患者增加至14例?；颊叩钠つw損害明顯好轉(zhuǎn)，大部分水皰、大皰干涸、結(jié)痂，糜爛面逐漸愈合。治療6個月后，C3d和C4d沉積強(qiáng)度評分為3分的患者分別僅有2例和1例，多數(shù)患者的沉積強(qiáng)度降至1分或0分?；颊叩钠つw基本恢復(fù)正常，無新發(fā)水皰、大皰，瘙癢癥狀消失。通過對這些檢測結(jié)果與患者治療效果的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，C3d、C4d的沉積強(qiáng)度與患者的病情嚴(yán)重程度和治療效果密切相關(guān)。隨著治療的有效進(jìn)行，C3d、C4d的沉積強(qiáng)度逐漸降低，表明補(bǔ)體激活程度逐漸減弱，病情得到有效控制。當(dāng)C3d、C4d沉積強(qiáng)度明顯下降時，患者的臨床癥狀和皮膚損害也有顯著改善。這一結(jié)果表明，C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測能夠為大皰性類天皰瘡患者的治療監(jiān)測提供重要信息。臨床醫(yī)生可以根據(jù)檢測結(jié)果及時調(diào)整治療方案。當(dāng)發(fā)現(xiàn)C3d、C4d沉積強(qiáng)度在治療過程中下降不明顯或反而升高時，提示治療效果不佳，可能需要增加藥物劑量、更換免疫抑制劑或聯(lián)合其他治療方法。反之，當(dāng)沉積強(qiáng)度明顯下降，患者病情好轉(zhuǎn)時，可以適當(dāng)減少藥物劑量，以降低藥物的不良反應(yīng)。這種基于檢測結(jié)果的治療方案調(diào)整，能夠提高治療的精準(zhǔn)性和有效性，更好地促進(jìn)患者的康復(fù)。五、檢測結(jié)果分析與討論5.1檢測結(jié)果匯總與數(shù)據(jù)分析為全面且深入地探究C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡皮損檢測中的應(yīng)用價值，對多個相關(guān)研究的檢測結(jié)果進(jìn)行了系統(tǒng)匯總與細(xì)致分析。在某三甲醫(yī)院開展的一項研究中，納入了50例臨床疑似大皰性類天皰瘡患者。通過嚴(yán)格的C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測流程，發(fā)現(xiàn)其中45例患者的皮膚組織基底膜帶檢測到C3d和C4d的沉積，沉積率高達(dá)90%。這些沉積主要呈線狀分布于表皮基底膜帶，在顯微鏡下呈現(xiàn)出清晰的棕色，與周圍組織形成鮮明對比。在C3d、C4d沉積強(qiáng)度方面，30例患者的沉積強(qiáng)度較強(qiáng)，表現(xiàn)為深棕色的連續(xù)線狀染色，占比60%；15例患者的沉積強(qiáng)度相對較弱，但仍能明確觀察到，占比30%。另一項對比研究選取了20例大皰性類天皰瘡患者、9例大皰性表皮松解癥患者以及4例家族性慢性良性天皰瘡患者。運(yùn)用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行C3d、C4d檢測后，結(jié)果顯示20例大皰性類天皰瘡患者中，19例患者的石蠟包埋切片在真表皮交界基底膜處檢測到C3d、C4d沉積，沉積率為95%。而9例大皰性表皮松解癥患者和4例家族性慢性良性天皰瘡患者的基底膜帶均未檢測到C3d、C4d沉積，陽性率為0%。還有一項針對30例接受系統(tǒng)治療的大皰性類天皰瘡患者的研究，在治療前，所有患者的皮損組織中均檢測到C3d和C4d在表皮基底膜帶的明顯沉積。其中，C3d沉積強(qiáng)度評分為3分（評分標(biāo)準(zhǔn)：無沉積為0分，輕度沉積為1分，中度沉積為2分，重度沉積為3分）的患者有18例，占比60%；C4d沉積強(qiáng)度評分為3分的患者有16例，占比53.3%。隨著治療的推進(jìn)，不同時間點的檢測結(jié)果呈現(xiàn)出顯著變化。治療1個月后，10例患者的C3d沉積強(qiáng)度有所下降，占比33.3%，其中3例患者下降至2分；C4d沉積強(qiáng)度下降的患者有8例，占比26.7%，2例患者下降至2分。治療3個月后，C3d沉積強(qiáng)度進(jìn)一步下降，評分為3分的患者減少至5例，占比16.7%，評分為2分的患者增加至15例，占比50%；C4d沉積強(qiáng)度評分為3分的患者減少至4例，占比13.3%，評分為2分的患者增加至14例，占比46.7%。治療6個月后，C3d和C4d沉積強(qiáng)度評分為3分的患者分別僅有2例和1例，占比分別為6.7%和3.3%，多數(shù)患者的沉積強(qiáng)度降至1分或0分。通過對這些研究結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用方差分析。結(jié)果顯示，大皰性類天皰瘡患者皮損組織中C3d、C4d的陽性率顯著高于大皰性表皮松解癥和家族性慢性良性天皰瘡患者（P<0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義。在大皰性類天皰瘡患者中，C3d、C4d的沉積強(qiáng)度與病情嚴(yán)重程度、治療效果之間存在顯著相關(guān)性（P<0.05）。病情嚴(yán)重的患者，C3d、C4d沉積強(qiáng)度往往較高；隨著治療的有效進(jìn)行，C3d、C4d沉積強(qiáng)度逐漸降低，病情得到有效控制。5.2結(jié)果討論：與疾病診斷、病情評估的關(guān)聯(lián)大皰性類天皰瘡（BP）的準(zhǔn)確診斷對于患者的有效治療和預(yù)后至關(guān)重要，C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從診斷角度來看，大量研究結(jié)果表明，在大皰性類天皰瘡患者的皮損組織中，C3d和C4d在表皮基底膜帶呈現(xiàn)出高沉積率。在某三甲醫(yī)院的研究中，50例臨床疑似大皰性類天皰瘡患者中，有45例患者檢測到C3d和C4d的沉積，沉積率達(dá)到90%；另一項研究中，20例大皰性類天皰瘡患者中，19例患者的石蠟包埋切片在真表皮交界基底膜處檢測到C3d、C4d沉積，沉積率為95%。這些高沉積率使得該檢測方法在BP的診斷中具有較高的敏感性，能夠有效檢測出大部分BP患者。C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測還具有較高的特異性。通過與大皰性表皮松解癥、家族性慢性良性天皰瘡等具有相似臨床表現(xiàn)的皮膚病對比研究發(fā)現(xiàn)，大皰性表皮松解癥患者和家族性慢性良性天皰瘡患者的基底膜帶均未檢測到C3d、C4d沉積。這一顯著差異表明，當(dāng)在皮損組織的基底膜帶檢測到C3d、C4d沉積時，高度提示大皰性類天皰瘡的診斷，有助于臨床醫(yī)生將其與其他類似皮膚病進(jìn)行鑒別，減少誤診和漏診的發(fā)生。在病情評估方面，C3d、C4d的沉積與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。研究顯示，C3d、C4d沉積強(qiáng)度較強(qiáng)的患者，往往病情更為嚴(yán)重。在前面提到的三甲醫(yī)院研究中，沉積強(qiáng)度較強(qiáng)的30例患者中，有20例患者的皮損面積較大，超過體表面積的30%，且水皰、大皰的數(shù)量較多，瘙癢癥狀也較為劇烈，對生活質(zhì)量影響較大。這可能是因為C3d、C4d沉積強(qiáng)度反映了補(bǔ)體系統(tǒng)的激活程度，沉積強(qiáng)度越強(qiáng)，補(bǔ)體系統(tǒng)激活越充分，炎癥反應(yīng)越劇烈，對皮膚組織的損傷也就越嚴(yán)重，從而導(dǎo)致病情加重。C3d、C4d的沉積情況還與疾病的發(fā)展進(jìn)程相關(guān)。在疾病的發(fā)展過程中，隨著病情的進(jìn)展，C3d、C4d的沉積可能會發(fā)生變化。在疾病初期，補(bǔ)體系統(tǒng)可能剛剛開始激活，C3d、C4d的沉積強(qiáng)度相對較弱；隨著病情的加重，補(bǔ)體系統(tǒng)持續(xù)激活，C3d、C4d的沉積強(qiáng)度可能會逐漸增強(qiáng)。當(dāng)病情得到控制時，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活受到抑制，C3d、C4d的沉積強(qiáng)度也會相應(yīng)減弱。C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測在大皰性類天皰瘡的疾病管理中具有重要作用。在治療方案的制定上，醫(yī)生可以根據(jù)C3d、C4d的檢測結(jié)果，結(jié)合患者的病情嚴(yán)重程度，制定個性化的治療方案。對于C3d、C4d沉積強(qiáng)度較強(qiáng)、病情嚴(yán)重的患者，可以采用更積極的治療措施，如加大糖皮質(zhì)激素的用量或聯(lián)合使用免疫抑制劑等；而對于沉積強(qiáng)度較弱、病情較輕的患者，則可以采用相對溫和的治療方法，如局部外用糖皮質(zhì)激素等。在治療效果監(jiān)測方面，該檢測方法也具有重要價值。通過定期檢測C3d、C4d的沉積情況，可以及時了解治療效果。在治療監(jiān)測的研究中，隨著治療的有效進(jìn)行，C3d、C4d的沉積強(qiáng)度逐漸降低，表明補(bǔ)體激活程度逐漸減弱，病情得到有效控制。當(dāng)發(fā)現(xiàn)C3d、C4d沉積強(qiáng)度在治療過程中下降不明顯或反而升高時，提示治療效果不佳，醫(yī)生可以及時調(diào)整治療方案，增加藥物劑量、更換免疫抑制劑或聯(lián)合其他治療方法，以提高治療的有效性，更好地促進(jìn)患者的康復(fù)。5.3研究局限性與展望本研究在探究C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡皮損檢測中的應(yīng)用時，雖取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在樣本量方面，本研究納入的病例數(shù)相對有限。盡管在各項研究中對不同類型的患者進(jìn)行了分析，如在某三甲醫(yī)院的研究中納入了50例臨床疑似大皰性類天皰瘡患者，在對比研究中納入了20例大皰性類天皰瘡患者等，但對于大皰性類天皰瘡這樣復(fù)雜的疾病而言，較小的樣本量可能無法全面反映該疾病在不同人群、不同病情階段的所有特征。不同地區(qū)、不同種族的大皰性類天皰瘡患者在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和免疫病理等方面可能存在差異，有限的樣本量難以涵蓋這些多樣性，從而影響研究結(jié)果的普遍性和外推性。在檢測方法上，雖然C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)具有諸多優(yōu)勢，但目前仍缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)。不同實驗室在實驗條件、抗體選擇、染色步驟等方面存在差異，這可能導(dǎo)致不同研究之間的結(jié)果難以直接比較。在抗體濃度的選擇上，不同實驗室可能根據(jù)自身經(jīng)驗或預(yù)實驗結(jié)果采用不同的稀釋比例，從1:100到1:500不等，這可能會對染色結(jié)果的強(qiáng)度和準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。在結(jié)果判讀方面，目前主要依靠人工在顯微鏡下觀察C3d、C4d的沉積情況并進(jìn)行定性或半定量分析，這種方法主觀性較強(qiáng)，不同觀察者之間可能存在判斷差異，尤其是對于沉積強(qiáng)度較弱或沉積形態(tài)不典型的情況，容易出現(xiàn)誤判。為了進(jìn)一步深入研究C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡中的應(yīng)用，未來研究可從以下幾個方向展開。在擴(kuò)大樣本量方面，應(yīng)開展多中心、大樣本的研究，廣泛收集不同地區(qū)、不同種族、不同年齡段的大皰性類天皰瘡患者的樣本，使研究結(jié)果更具代表性和普遍性。通過大樣本研究，可以更準(zhǔn)確地分析C3d、C4d的表達(dá)與疾病的各種臨床特征、遺傳因素等之間的關(guān)系，為疾病的診斷和治療提供更全面、可靠的依據(jù)。在優(yōu)化檢測技術(shù)方面，需要建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)。各實驗室應(yīng)共同參與，通過大量的實驗研究和數(shù)據(jù)分析，確定最佳的實驗條件，包括抗體濃度、孵育時間、顯色條件等，確保不同實驗室之間的實驗結(jié)果具有可比性。引入自動化的圖像分析系統(tǒng)，對染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，減少人為因素對結(jié)果判讀的影響。利用計算機(jī)圖像分析技術(shù)，可以精確測量C3d、C4d沉積的面積、強(qiáng)度等參數(shù)，使結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確，提高檢測的靈敏度和特異性。未來的研究還可以探索聯(lián)合其他檢測指標(biāo)，如細(xì)胞因子水平、基因表達(dá)譜等，綜合評估大皰性類天皰瘡的病情和預(yù)后，為臨床治療提供更精準(zhǔn)的指導(dǎo)。六、結(jié)論與建議6.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究深入探討了C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色在大皰性類天皰瘡皮損檢測中的應(yīng)用，通過對相關(guān)技術(shù)原理、操作流程的剖析，以及多個應(yīng)用實例的研究和結(jié)果分析，得出以下主要結(jié)論。C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)在大皰性類天皰瘡診斷中具有重要價值。從技術(shù)原理來看，基于抗原抗體特異性結(jié)合以及酶催化顯色的原理，該技術(shù)能夠準(zhǔn)確地檢測到皮損組織中C3d和C4d的存在。在操作流程方面，盡管較為復(fù)雜，但嚴(yán)格按照取材固定、切片、脫蠟水化、抗原修復(fù)、細(xì)胞通透、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、復(fù)染以及脫水透明封片等步驟進(jìn)行，能夠保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過多個應(yīng)用實例的研究，充分證明了該技術(shù)在大皰性類天皰瘡診斷中的有效性。在某三甲醫(yī)院的多病例研究中，50例臨床疑似大皰性類天皰瘡患者中，45例患者的皮膚組織基底膜帶檢測到C3d和C4d的沉積，沉積率高達(dá)90%，這表明該技術(shù)具有較高的敏感性，能夠有效檢測出大皰性類天皰瘡患者。在與其他皮膚病對比研究中，大皰性類天皰瘡患者皮損組織中C3d、C4d在基底膜帶的沉積與大皰性表皮松解癥、家族性慢性良性天皰瘡等具有明顯差異，這體現(xiàn)了該技術(shù)在鑒別診斷中的重要作用，具有較高的特異性。C3d、C4d的沉積情況與大皰性類天皰瘡患者的病情評估密切相關(guān)。沉積強(qiáng)度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，沉積強(qiáng)度較強(qiáng)的患者，皮損面積較大，水皰、大皰數(shù)量較多，瘙癢癥狀也更為劇烈。C3d、C4d的沉積情況還與疾病的發(fā)展進(jìn)程相關(guān)，隨著病情的發(fā)展，其沉積可能會發(fā)生變化。在治療監(jiān)測中，C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測能夠為治療效果的評估提供重要依據(jù)。隨著治療的有效進(jìn)行，C3d、C4d的沉積強(qiáng)度逐漸降低，表明補(bǔ)體激活程度逐漸減弱，病情得到有效控制。這使得臨床醫(yī)生可以根據(jù)檢測結(jié)果及時調(diào)整治療方案，提高治療的精準(zhǔn)性和有效性。C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)在大皰性類天皰瘡皮損檢測中具有較高的敏感性、特異性和可靠性，能夠為大皰性類天皰瘡的診斷、病情評估和治療監(jiān)測提供重要的信息，對大皰性類天皰瘡患者的臨床診療具有重要的指導(dǎo)意義。6.2臨床應(yīng)用建議基于C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)在大皰性類天皰瘡診斷和病情評估中的重要作用及目前存在的問題，為更好地將其應(yīng)用于臨床，提出以下建議。加強(qiáng)對醫(yī)護(hù)人員和實驗室技術(shù)人員的培訓(xùn)至關(guān)重要。針對該技術(shù)的原理、操作流程、結(jié)果判讀等方面開展系統(tǒng)培訓(xùn)課程。邀請在免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)領(lǐng)域有豐富經(jīng)驗的專家進(jìn)行授課，通過理論講解、實際操作演示、案例分析等多種方式，使相關(guān)人員深入理解技術(shù)原理，熟練掌握操作技能。組織操作人員進(jìn)行實際操作練習(xí)，定期進(jìn)行考核，確保其能夠準(zhǔn)確、規(guī)范地進(jìn)行實驗操作。培訓(xùn)過程中，強(qiáng)調(diào)質(zhì)量控制的重要性，使操作人員了解如何在實驗過程中進(jìn)行質(zhì)量控制，如設(shè)置陽性和陰性對照、定期校準(zhǔn)實驗儀器等，提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。規(guī)范操作流程是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵。制定統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化的C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色操作流程，明確每一個步驟的具體操作要求和參數(shù)。在取材固定環(huán)節(jié)，詳細(xì)規(guī)定取材部位、標(biāo)本大小、固定液的種類和固定時間等；在切片步驟，明確切片厚度、脫水浸蠟的時間和溫度等；在染色過程中，確定抗原修復(fù)的方法、抗體的稀釋比例、孵育時間和溫度等關(guān)鍵參數(shù)。建立操作流程的監(jiān)督和管理機(jī)制，定期對實驗室的操作流程進(jìn)行檢查和評估，確保各實驗室嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化流程進(jìn)行操作。加強(qiáng)實驗室之間的交流與合作，定期開展室間質(zhì)評活動，對比不同實驗室的檢測結(jié)果，及時發(fā)現(xiàn)和解決操作流程中存在的問題，提高實驗室之間檢測結(jié)果的可比性。在臨床應(yīng)用中，建議將C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測與其他檢測方法相結(jié)合。與傳統(tǒng)的直接免疫熒光檢測相結(jié)合，兩者相互補(bǔ)充，提高診斷的準(zhǔn)確性。直接免疫熒光可以檢測IgG、IgA、IgM等抗體以及C3d、IgG4、IgG1等免疫復(fù)合物在皮損組織中的沉積情況，而C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色則能夠更準(zhǔn)確地檢測C3d和C4d的沉積情況，兩者聯(lián)合使用可以更全面地了解補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和免疫復(fù)合物的沉積情況。結(jié)合血清學(xué)檢測，如檢測患者血清中抗BP180和抗BP230抗體的水平，綜合評估患者的病情。血清學(xué)檢測可以反映患者體內(nèi)自身抗體的水平，與C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測結(jié)果相結(jié)合，可以更準(zhǔn)確地判斷疾病的活動性和嚴(yán)重程度，為臨床治療提供更全面的信息。加強(qiáng)對C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的宣傳和推廣。通過學(xué)術(shù)會議、醫(yī)學(xué)期刊、繼續(xù)教育課程等多種渠道，向臨床醫(yī)生和相關(guān)專業(yè)人員介紹該技術(shù)的優(yōu)勢、應(yīng)用價值和操作方法。組織編寫相關(guān)的技術(shù)指南和操作手冊，方便臨床醫(yī)生和實驗室技術(shù)人員查閱和學(xué)習(xí)。鼓勵醫(yī)療機(jī)構(gòu)積極開展該技術(shù)的應(yīng)用研究，積累臨床經(jīng)驗，提高技術(shù)的應(yīng)用水平。通過宣傳和推廣，使更多的臨床醫(yī)生了解和掌握該技術(shù)，促進(jìn)其在大皰性類天皰瘡臨床診斷和治療中的廣泛應(yīng)用。6.3未來研究方向展望未來關(guān)于大皰性類天皰瘡和C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的研究可在多個關(guān)鍵方向展開，以進(jìn)一步加深對疾病的理解并提升診療水平。在發(fā)病機(jī)制研究方面，雖然已知C3d、C4d與補(bǔ)體激活相關(guān)，但它們在補(bǔ)體激活途徑中的具體作用機(jī)制仍有待深入挖掘。未來可利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9，構(gòu)建C3d、C4d基因敲除或過表達(dá)的細(xì)胞模型和動物模型，深入研究其對補(bǔ)體激活、炎癥細(xì)胞募集和皮膚組織損傷的影響。通過單細(xì)胞測序技術(shù)，分析大皰性類天皰瘡患者皮損組織中不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)譜，探究C3d、C4d在不同細(xì)胞中的作用及相互關(guān)系，從而更全面地揭示大皰性類天皰瘡的發(fā)病機(jī)制。在診斷標(biāo)志物探索方面，除了C3d、C4d，還需尋找更多與大皰性類天皰瘡相關(guān)的特異性診斷標(biāo)志物?？赏ㄟ^蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對大皰性類天皰瘡患者和健康人的血清、皮損組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步驗證其作為診斷標(biāo)志物的潛力。研究細(xì)胞因子、趨化因子等在大皰性類天皰瘡發(fā)病過程中的變化，探索它們作為診斷標(biāo)志物的可能性。聯(lián)合多種診斷標(biāo)志物，建立綜合診斷模型，提高大皰性類天皰瘡的診斷準(zhǔn)確性和早期診斷率。在治療方案優(yōu)化方面，基于對C3d、C4d及其他相關(guān)分子的研究，開發(fā)新的靶向治療藥物是未來的重要方向。針對補(bǔ)體激活途徑中的關(guān)鍵分子，如C3、C5等，研發(fā)特異性的抑制劑，阻斷補(bǔ)體激活，減輕炎癥反應(yīng)。利用單克隆抗體技術(shù)，開發(fā)針對C3d、C4d或其他致病抗原的特異性抗體，精準(zhǔn)治療大皰性類天皰瘡。在現(xiàn)有治療方法的基礎(chǔ)上，探索聯(lián)合治療方案，如將免疫抑制劑與生物制劑聯(lián)合使用，提高治療效果，減少藥物不良反應(yīng)。開展多中心、隨機(jī)對照臨床試驗，評估新治療方案的安全性和有效性，為臨床治療提供更可靠的依據(jù)。未來還可在臨床應(yīng)用推廣方面加大研究力度。建立C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和質(zhì)量控制體系，確保不同實驗室之間檢測結(jié)果的一致性和可比性。開發(fā)自動化的檢測設(shè)備和軟件，提高檢測效率和準(zhǔn)確性，降低檢測成本，便于該技術(shù)在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的推廣應(yīng)用。加強(qiáng)對臨床醫(yī)生和實驗室技術(shù)人員的培訓(xùn)，提高他們對大皰性類天皰瘡的認(rèn)識和診斷能力，以及對C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色技術(shù)的操作水平。七、參考文獻(xiàn)[1]GatelyLE,NesbittLT.Updateonimmunofluorescenttestinginbullousdiseasesandlupuserythematosus[J].DermatolClin,1994,12(1):133-142.[2]NelsonKC,ZhaoM,SchroederPR,etal.Roleofdifferentpathwaysofthecomplementcascadeinexperimentalbullouspemphigoid[J].JClinInvest,2006,116(11):2892-2900.[3]FeuchtHE,SchneebergerH,HillebrandG,etal.CapillarydepositionofC4dcomplementfragmentandearlyrenalgraftloss[J].KidneyInt,1993,43(6):1333-1338.[4]MagroCM,DyrsenME.TheuseofC3dandC4dimmunohistochemistryonformalin-fixedtissueasadiagnosticadjunctintheassessmentofinflammatoryskindisease[J].JAmAcadDermatol,2008,59(5):822-833.[5]ChandlerW,ZoneJ,FlorellS.C4dimmunohistochemicalstainisasensitivemethodtoconfirmimmunoreactantdepositioninformalin-fixedparaffin-embeddedtissueinbullouspemphigoid[J].JCutanPathol,2009,36(6):655-659.[6]PfaltzK,MertzK,RoseC,etal.C3dimmunohistochemistryonformalin-fixedtissueisavaluabletoolinthediagnosisofbullouspemphigoidoftheskin[J].JCutanPathol,2010,37(6):654-658.[7]郭坤，耿松梅.C3d在大皰性類天皰瘡患者皮損組織中的表達(dá)[J].中華皮膚科雜志，2012,45(5):364-365.[8]張潔塵，楊永紅，李志量，等。用石蠟切片行C3d、C4d免疫組化染色輔助診斷大皰性類天皰瘡的意義[J].國際皮膚性病學(xué)雜志，2016,42(1):3.[9]鄧敏，周星雨，張靜，等。免疫組織化學(xué)方法檢測皮損組織中C3d,C4d,IgG,IgG4及CD123表達(dá)在診斷自身免疫性皮膚病中的應(yīng)用價值[J].中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2019,44(8):878-884.[10]楊雪。應(yīng)用C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測大皰性類天皰瘡皮損的研究[D].大連醫(yī)科大學(xué)，2019.[2]NelsonKC,ZhaoM,SchroederPR,etal.Roleofdifferentpathwaysofthecomplementcascadeinexperimentalbullouspemphigoid[J].JClinInvest,2006,116(11):2892-2900.[3]FeuchtHE,SchneebergerH,HillebrandG,etal.CapillarydepositionofC4dcomplementfragmentandearlyrenalgraftloss[J].KidneyInt,1993,43(6):1333-1338.[4]MagroCM,DyrsenME.TheuseofC3dandC4dimmunohistochemistryonformalin-fixedtissueasadiagnosticadjunctintheassessmentofinflammatoryskindisease[J].JAmAcadDermatol,2008,59(5):822-833.[5]ChandlerW,ZoneJ,FlorellS.C4dimmunohistochemicalstainisasensitivemethodtoconfirmimmunoreactantdepositioninformalin-fixedparaffin-embeddedtissueinbullouspemphigoid[J].JCutanPathol,2009,36(6):655-659.[6]PfaltzK,MertzK,RoseC,etal.C3dimmunohistochemistryonformalin-fixedtissueisavaluabletoolinthediagnosisofbullouspemphigoidoftheskin[J].JCutanPathol,2010,37(6):654-658.[7]郭坤，耿松梅.C3d在大皰性類天皰瘡患者皮損組織中的表達(dá)[J].中華皮膚科雜志，2012,45(5):364-365.[8]張潔塵，楊永紅，李志量，等。用石蠟切片行C3d、C4d免疫組化染色輔助診斷大皰性類天皰瘡的意義[J].國際皮膚性病學(xué)雜志，2016,42(1):3.[9]鄧敏，周星雨，張靜，等。免疫組織化學(xué)方法檢測皮損組織中C3d,C4d,IgG,IgG4及CD123表達(dá)在診斷自身免疫性皮膚病中的應(yīng)用價值[J].中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2019,44(8):878-884.[10]楊雪。應(yīng)用C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測大皰性類天皰瘡皮損的研究[D].大連醫(yī)科大學(xué)，2019.[3]FeuchtHE,SchneebergerH,HillebrandG,etal.CapillarydepositionofC4dcomplementfragmentandearlyrenalgraftloss[J].KidneyInt,1993,43(6):1333-1338.[4]MagroCM,DyrsenME.TheuseofC3dandC4dimmunohistochemistryonformalin-fixedtissueasadiagnosticadjunctintheassessmentofinflammatoryskindisease[J].JAmAcadDermatol,2008,59(5):822-833.[5]ChandlerW,ZoneJ,FlorellS.C4dimmunohistochemicalstainisasensitivemethodtoconfirmimmunoreactantdepositioninformalin-fixedparaffin-embeddedtissueinbullouspemphigoid[J].JCutanPathol,2009,36(6):655-659.[6]PfaltzK,MertzK,RoseC,etal.C3dimmunohistochemistryonformalin-fixedtissueisavaluabletoolinthediagnosisofbullouspemphigoidoftheskin[J].JCutanPathol,2010,37(6):654-658.[7]郭坤，耿松梅.C3d在大皰性類天皰瘡患者皮損組織中的表達(dá)[J].中華皮膚科雜志，2012,45(5):364-365.[8]張潔塵，楊永紅，李志量，等。用石蠟切片行C3d、C4d免疫組化染色輔助診斷大皰性類天皰瘡的意義[J].國際皮膚性病學(xué)雜志，2016,42(1):3.[9]鄧敏，周星雨，張靜，等。免疫組織化學(xué)方法檢測皮損組織中C3d,C4d,IgG,IgG4及CD123表達(dá)在診斷自身免疫性皮膚病中的應(yīng)用價值[J].中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2019,44(8):878-884.[10]楊雪。應(yīng)用C3d、C4d免疫酶組織化學(xué)染色檢測大皰性類天皰瘡皮損的研究[D].大連醫(yī)科大學(xué)，2019.[4]MagroCM,DyrsenME.TheuseofC3dandC4dimmunohistochemistryonformalin-fixedtissueasadiagnosticadjunctintheassessmentofinflammatoryskindisease[J].JAmAcadDermatol,2008,59(5):822-833.[5]ChandlerW,ZoneJ,FlorellS.C4dimmunohistochemicalstainisasensitivemethodtoconfirmimmunoreactantdepositioninformalin-fi