基于同步熒光光譜技術(shù)的蔬菜抗生素檢測(cè)研究目錄TOC\o"1-3"\h\u16631基于同步熒光光譜技術(shù)的蔬菜抗生素檢測(cè)研究 1112981實(shí)驗(yàn) 1198741.1實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備 1271471.1.1樣品 1215691.1.2配制溶液 1206721.2實(shí)現(xiàn)方法 2321441.3實(shí)驗(yàn)流程 2218021.4選取最佳波長(zhǎng)差 295792結(jié)果與分析 571432.1蔬菜中抗生素殘留熒光光譜特征 5230382.2預(yù)測(cè)驗(yàn)證 1143912.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 121實(shí)驗(yàn)本章主要基于同步熒光光譜技術(shù)對(duì)蔬菜中的春雷霉素、阿維菌素、多殺菌素三種農(nóng)業(yè)上常用的抗生素進(jìn)行檢測(cè)和研究。1.1實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備1.1.1樣品抗生素樣品：瓶裝藥品100ml，有效成分為5％的阿維菌素、瓶裝藥品100ml，有效成分為4％的春雷霉素、規(guī)格為袋裝10ml的多殺菌素（網(wǎng)絡(luò)上購(gòu)買）；蔬菜樣品：番茄（大型菜市場(chǎng)購(gòu)買）。1.1.2配制溶液（1）番茄汁稀釋液番茄搗碎，經(jīng)過(guò)紗布多次過(guò)濾以后，取1ml番茄汁溶解于20ml自來(lái)水中，配置成濃度為0.048的番茄稀釋液。（2）阿維菌素稀釋液取0.3ml阿維菌素溶解于100ml自來(lái)水中，在此基礎(chǔ)上取50ml溶液加入50ml自來(lái)水配制成標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗生素藥液。（3）多殺菌素稀釋液取0.1ml阿維菌素溶解于100ml自來(lái)水中，在此基礎(chǔ)上取10ml溶液加入100ml自來(lái)水配制成標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗生素藥液。（4）春雷霉素稀釋液取2ml阿維菌素溶解于100ml自來(lái)水中配制成標(biāo)準(zhǔn)濃度的抗生素藥液。1.2實(shí)現(xiàn)方法利用LS55熒光分光光度計(jì)對(duì)三種稀釋液進(jìn)行實(shí)物檢測(cè)，LS55熒光分光光度計(jì)連接到電腦后用FL-winlab軟件分別得出實(shí)物的光譜數(shù)據(jù)。所得初始數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Origin軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)的平滑處理以及繪制出光譜圖像，選取其中幾組數(shù)據(jù)建立函數(shù)模型并進(jìn)行分析，最終得到一元函數(shù)。1.3實(shí)驗(yàn)流程（1）配置合適濃度的番茄汁水溶液 將番茄切碎用紗布層層過(guò)濾，濾除雜質(zhì)得到較為純凈的液體，用注射劑精確稱取番茄汁，用自來(lái)水溶解稀釋，并轉(zhuǎn)移到燒杯中搖勻。配制成標(biāo)準(zhǔn)濃度的番茄汁水溶液，將番茄汁水溶液保存在干燥陰涼通風(fēng)處保存。（2）配置合適濃度的抗生素水溶液用注射劑分別稱取待測(cè)抗生素，把抗生素加入到燒杯中用自來(lái)水進(jìn)行稀釋，期間充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙獬浞?。配置好的抗生素水溶液放在固定的位置以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。（3）熒光光譜的掃描在熒光比色皿中加入3/4的儲(chǔ)備液進(jìn)行第一次掃描，掃描后取出熒光比色皿的溶液倒回量杯中，再加入1-2ml的抗生素稀釋液到量杯中，充分?jǐn)嚢韬笤偃×勘械娜芤杭尤氲奖壬笾?，重?fù)多次進(jìn)行，并對(duì)溶液進(jìn)行掃描，即可得到熒光光譜圖。（4）Origin平滑與建模選用Origin8.5軟件的數(shù)據(jù)平滑處理功能對(duì)熒光掃描后的初始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，再繪制出番茄儲(chǔ)備液加入不同濃度抗生素的圖像，可得到當(dāng)濃度逐漸增加時(shí)熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的二維曲線，通過(guò)Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模處理，得出熒光強(qiáng)度和樣品濃度的一元函數(shù)關(guān)系。1.4選取最佳波長(zhǎng)差想要獲得強(qiáng)度較高的熒光信號(hào)，需要選擇合適的波長(zhǎng)間隔Δλ，波長(zhǎng)間隔決定了光譜的形狀。當(dāng)Δλ數(shù)值非常小時(shí)，同步光譜會(huì)出現(xiàn)不成峰等情況，當(dāng)數(shù)值較小時(shí)峰型很窄，當(dāng)波長(zhǎng)間隔與激發(fā)峰的波長(zhǎng)相吻合時(shí)光譜形狀比較理想。阿維菌素：設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)范圍為：200-600nm，因?yàn)椴煌ㄩL(zhǎng)差會(huì)影響光譜的光滑度和成像效果，所以為了熒光強(qiáng)度達(dá)到理想狀態(tài)，對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的波長(zhǎng)差進(jìn)行選擇，并選取成像效果最好的波長(zhǎng)差進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選擇了波長(zhǎng)差Δ在λ:5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80nm時(shí)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。從圖1.2可以看出，不同Δλ值對(duì)熒光光譜有較大影響，當(dāng)Δλ=5nm、10nm、15nm時(shí)，熒光光譜偏差最大，成像效果最差，隨著波長(zhǎng)差的數(shù)值不斷增大，阿維菌素的熒光強(qiáng)度處在一個(gè)上升的狀態(tài)，在波長(zhǎng)差Δλ＝60nm時(shí)，最佳激發(fā)為476nm，此時(shí)熒光強(qiáng)度最大，波形最光滑，熒光光譜最好。在發(fā)射波長(zhǎng)550～600nm范圍內(nèi)的熒光光譜曲線光滑平整且無(wú)毛刺。當(dāng)大于60nm時(shí)，特征峰的熒光強(qiáng)度又出現(xiàn)回落，綜合上述分析，選擇Δλ=60nm作為波長(zhǎng)間隔最利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。圖1.2阿維菌素波長(zhǎng)差春雷霉素：設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)范圍為：200-600nm，因?yàn)椴煌ㄩL(zhǎng)差會(huì)影響光譜的光滑度和成像效果，所以為了熒光強(qiáng)度達(dá)到理想狀態(tài)，對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的波長(zhǎng)差進(jìn)行選擇，選取成像效果最好的波長(zhǎng)差進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選擇了波長(zhǎng)差Δλ在:5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80nm時(shí)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。從圖1可以看出，不同Δλ值對(duì)熒光光譜有較大影響，當(dāng)Δλ=5nm和10nm時(shí)，熒光光譜偏差最大，成像效果最差，隨著波長(zhǎng)差的數(shù)值不斷增大，春雷霉素的熒光強(qiáng)度處在一個(gè)上升的狀態(tài)，在波長(zhǎng)差Δλ＝70nm時(shí)，最佳激發(fā)為318nm，此時(shí)熒光強(qiáng)度最大，波形最光滑，同步熒光光譜最好。在發(fā)射波長(zhǎng)400～600nm范圍內(nèi)的熒光光譜曲線光滑平整且無(wú)毛刺。當(dāng)大于70nm時(shí)，特征峰的熒光強(qiáng)度又出現(xiàn)回落，綜合上述分析，選擇Δλ=70nm作為波長(zhǎng)間隔最利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。圖1.2春雷霉素波長(zhǎng)差多殺菌素：設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)范圍為：200-600nm，因?yàn)椴煌ㄩL(zhǎng)差會(huì)影響光譜的光滑度和成像效果，所以為了熒光強(qiáng)度達(dá)到理想狀態(tài)，對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的波長(zhǎng)差進(jìn)行選擇，選擇了波長(zhǎng)差Δλ在:5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55nm時(shí)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。從圖1可以看出，不同Δλ值所得到的熒光光譜存在一定的差異，當(dāng)Δλ=5nm、10nm、15nm時(shí)，熒光光譜偏差最大，成像效果最差，隨著波長(zhǎng)差的數(shù)值不斷增大，同步熒光的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，在波長(zhǎng)差Δλ＝45nm時(shí)，最佳激發(fā)為292nm，此時(shí)熒光強(qiáng)度最大，波形最光滑，同步熒光光譜最好。在發(fā)射波長(zhǎng)400～600nm范圍內(nèi)的熒光光譜曲線光滑平整且無(wú)毛刺。當(dāng)大于45nm時(shí)，特征峰的熒光強(qiáng)度又出現(xiàn)回落，綜合上述分析，選擇Δλ=45nm作為波長(zhǎng)間隔最利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。圖1.2多殺菌素波長(zhǎng)差2結(jié)果與分析2.1蔬菜中抗生素殘留熒光光譜特征2.1.1阿維菌素-番茄汁混合原液熒光光譜準(zhǔn)備兩個(gè)量杯，一個(gè)量杯盛有配置好的番茄稀釋液，另一杯盛有配置好的阿維菌素稀釋液，利用滴管添加一定量的番茄稀釋液放于熒光比色皿中，測(cè)得一條番茄汁的熒光曲線，測(cè)得曲線后取出比色皿中的稀釋液放回盛有番茄稀釋液的量杯中，取阿維菌素稀釋液加入1~2ml量杯中，進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬笮纬砂⒕S菌素-純蔬菜混合原液，每次檢測(cè)前需要把比色皿中的稀釋液取回，在攪拌均勻的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)防止誤差。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中在FL-winlab軟件中設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)，根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知在波長(zhǎng)差Δλ=60nm處熒光光譜成像效果最好，當(dāng)掃描范圍在600nm后圖像逐漸衰減，因此設(shè)置范圍為200nm~600nm，設(shè)置好參數(shù)后對(duì)阿維菌素-番茄汁混合原液進(jìn)行掃描，得出同步熒光光譜，結(jié)果如圖2.1所示。在選取的數(shù)據(jù)中，阿維菌素的加入量逐漸增大，濃度也隨之升高，由圖可知，番茄汁在280左右有一個(gè)熒光特征峰，但是加入阿維菌素之后，特征峰強(qiáng)度明顯變小，370nm是混合溶液的激發(fā)峰，圖片中其對(duì)應(yīng)蔬菜阿維菌素的殘留濃度依次為：0，0.0000125mg/ml，0.0000214mg/ml，0.0000280mg/ml，0.0000332mg/ml，0.0000408mg/ml；因?yàn)榧尤氲陌⒕S菌素稀釋液逐漸增多，在定量情況下濃度增大，熒光強(qiáng)度逐漸接近不含番茄汁的阿維菌素稀釋液。由軟件處理得到的同步熒光光譜圖中清楚看到在476nm的波長(zhǎng)處存在明顯凸起，此凸起就代表是阿維菌素的熒光特征峰。圖2.1阿維菌素-番茄汁同步熒光光譜圖實(shí)驗(yàn)最終目的是為了探究阿維菌素的熒光強(qiáng)度和溶液濃度是否存在聯(lián)系，借助Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，輸入阿維菌素?zé)晒鈴?qiáng)度和溶液濃度后，得出一元函數(shù)關(guān)系式和線性曲線如圖2.2所示。一元函數(shù)關(guān)系為Y=3671890*X+9.57897，其中Y代表熒光強(qiáng)度Intensity，X代表溶液濃度Concentration，變量之間線性相關(guān)程度為0.9947。所得到的直線處于上升趨勢(shì)且光滑平整無(wú)突降，因此可以說(shuō)明熒光強(qiáng)度隨著濃度的增大而增大。圖2.2阿維菌素-番茄汁熒光強(qiáng)度和濃度函數(shù)模型針對(duì)一元函數(shù)模型進(jìn)行準(zhǔn)確度的分析實(shí)驗(yàn)，選取模型之外的數(shù)據(jù)代入函數(shù)進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試采用輸入濃度后得出的熒光強(qiáng)度與所測(cè)值進(jìn)行對(duì)比分析，當(dāng)X=0.0000125時(shí)，Y=52.33683922（實(shí)際檢測(cè)值Y=56.635，回收率102.35%），當(dāng)X=0.0000392時(shí)，Y=153.38941611（實(shí)際檢測(cè)值Y=153.841，回收率100.29%），由于受到各種條件影響，回收率并非100%，但誤差均在10%以內(nèi)，不屬于較大誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果處在合理的偏差范圍內(nèi)，因?yàn)槟Ｐ蜏?zhǔn)確。2.1.2春雷霉素-番茄汁混合原液熒光光譜準(zhǔn)備兩個(gè)量杯，一個(gè)量杯盛有配置好的番茄稀釋液，另一杯盛有配置好的春雷霉素稀釋液，利用滴管添加一定量的番茄稀釋液放于熒光比色皿中，測(cè)得一條番茄汁的熒光曲線，測(cè)得曲線后取出比色皿中的稀釋液放回盛有番茄稀釋液的量杯中，取春雷霉素稀釋液加入1~2ml量杯中，進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬笮纬纱豪酌顾?純蔬菜混合原液，每次檢測(cè)前需要把比色皿中的稀釋液取回，使其充分混合均勻。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中在FL-winlab軟件中設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)，根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知在波長(zhǎng)差Δλ=70nm處熒光光譜成像效果最好，當(dāng)掃描范圍在600nm后圖像逐漸衰減，因此設(shè)置范圍為200nm~600nm，設(shè)置好參數(shù)后對(duì)春雷霉素-番茄汁混合原液進(jìn)行掃描，得出同步熒光光譜，結(jié)果如圖2.3所示。在選取的數(shù)據(jù)中，阿維菌素的加入量逐漸增大，濃度也隨之升高，由圖可知，番茄汁在280左右有一個(gè)熒光特征峰，但是加入春雷霉素之后，特征峰強(qiáng)度明顯變小，圖片中其對(duì)應(yīng)蔬菜春雷霉素的殘留濃度依次為：0，0.0001810mg/ml，0.0003229mg/ml，0.0004108mg/ml，0.0004706mg/ml，0.0005313mg/ml；因?yàn)榧尤氲拇豪酌顾叵♂屢褐饾u增多，在定量情況下濃度增大，熒光強(qiáng)度逐漸接近不含番茄汁的春雷霉素稀釋液。由軟件處理得到的同步熒光光譜圖中清楚看到在318nm的波長(zhǎng)處存在明顯凸起，此凸起就代表是春雷霉素的熒光特征峰。圖2.3春雷霉素-番茄汁同步熒光光譜圖實(shí)驗(yàn)最終目的是為了探究阿維菌素的熒光強(qiáng)度和溶液濃度是否存在聯(lián)系，借助Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，輸入阿維菌素?zé)晒鈴?qiáng)度和溶液濃度后，得出一元函數(shù)關(guān)系式和線性曲線如圖2.4所示。一元函數(shù)關(guān)系為Y=199187.6728*X+51.43301，其中Y代表熒光強(qiáng)度Intensity，X代表溶液濃度Concentration，變量之間線性相關(guān)程度為0.99478。所得到的直線處于上升趨勢(shì)且光滑平整無(wú)突降，因此可以說(shuō)明熒光強(qiáng)度隨著濃度的增大而增大。圖2.4春雷霉素-番茄汁熒光強(qiáng)度和濃度函數(shù)模型針對(duì)一元函數(shù)模型進(jìn)行準(zhǔn)確度的分析實(shí)驗(yàn)，選取模型之外的數(shù)據(jù)代入函數(shù)進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試采用輸入濃度后得出的熒光強(qiáng)度與所測(cè)值進(jìn)行對(duì)比分析，當(dāng)X=0.0002941時(shí)，Y=110.0165944（實(shí)際檢測(cè)值Y=111.428，回收率101.28%），當(dāng)X=0.0004706時(shí)，Y=142.1667451（實(shí)際檢測(cè)值Y=146.493，回收率100.91%），由于受到各種條件影響，回收率并非100%，但誤差均在10%以內(nèi)，不屬于較大誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果處在合理的偏差范圍內(nèi)，因?yàn)槟Ｐ蜏?zhǔn)確。2.1.3多殺菌素-番茄汁混合原液熒光光譜準(zhǔn)備兩個(gè)量杯，一個(gè)量杯盛有配置好的番茄稀釋液，另一杯盛有配置好的多殺菌素稀釋液，利用滴管添加一定量的番茄稀釋液放于熒光比色皿中，測(cè)得一條番茄汁的熒光曲線，測(cè)得曲線后取出比色皿中的稀釋液放回盛有番茄稀釋液的量杯中，取多殺菌素稀釋液加入1~2ml量杯中，進(jìn)行充分?jǐn)嚢韬笮纬啥鄽⒕?純蔬菜混合原液，每次檢測(cè)前需要把比色皿中的稀釋液取回，使其充分混合均勻。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中在FL-winlab軟件中設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)，根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知在波長(zhǎng)差Δλ=45nm處熒光光譜成像效果最好，當(dāng)掃描范圍在600nm后圖像逐漸衰減，因此設(shè)置范圍為200nm~600nm，設(shè)置好參數(shù)后對(duì)春雷霉素-番茄汁混合原液進(jìn)行掃描，得出同步熒光光譜，結(jié)果如圖2.5所示。在選取的數(shù)據(jù)中，阿維菌素的加入量逐漸增大，濃度也隨之升高，由圖可知，番茄汁在280左右有一個(gè)熒光特征峰，但是加入多殺菌素之后，特征峰發(fā)生偏移并且強(qiáng)度明顯變大，圖片中其對(duì)應(yīng)蔬菜多殺菌素的殘留濃度依次為：0，0.0014130mg/ml，0.0018167mg/ml，0.0022441mg/ml，0.0027250mg/ml，0.0031792mg/ml；因?yàn)榧尤氲亩鄽⒕叵♂屢褐饾u增多，在定量情況下濃度增大，熒光強(qiáng)度逐漸接近不含番茄汁的多殺菌素稀釋液。由軟件處理得到的同步熒光光譜圖中清楚看到在292nm的波長(zhǎng)處存在明顯凸起，此凸起就代表是多殺菌素的熒光特征峰。圖2.5多殺菌素-番茄汁同步熒光光譜圖實(shí)驗(yàn)最終目的是為了探究阿維菌素的熒光強(qiáng)度和溶液濃度是否存在聯(lián)系，借助Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，輸入阿維菌素?zé)晒鈴?qiáng)度和溶液濃度后，得出一元函數(shù)關(guān)系式和線性曲線如圖2.4所示。一元函數(shù)關(guān)系為Y=73462.30301*X+178.50246，其中Y代表熒光強(qiáng)度Intensity，X代表溶液濃度Concentration，變量之間線性相關(guān)程度為0.9789。所得到的直線處于上升趨勢(shì)且光滑平整無(wú)突降，因此可以說(shuō)明熒光強(qiáng)度隨著濃度的增大而增大。圖2.6多殺菌素-番茄汁熒光強(qiáng)度和濃度函數(shù)模型針對(duì)一元函數(shù)模型進(jìn)行準(zhǔn)確度的分析實(shí)驗(yàn)，選取模型之外的數(shù)據(jù)代入函數(shù)進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試采用輸入濃度后得出的熒光強(qiáng)度與所測(cè)值進(jìn)行對(duì)比分析，X=0.0023357時(shí)，Y=350.0964177（實(shí)際檢測(cè)值Y=341.381，回收率101.66%），當(dāng)X=0.0031792時(shí)，Y=412.0609025（實(shí)際檢測(cè)值Y=408.296，回收率100.92%），由于受到各種條件影響，回收率并非100%，但誤差均在5%以內(nèi)，不屬于較大誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果處在合理的偏差范圍內(nèi)，因?yàn)槟Ｐ蜏?zhǔn)確。2.2預(yù)測(cè)驗(yàn)證考慮到阿維菌素、春雷霉素、多殺菌素在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在分析誤差或操作不當(dāng)引起的誤差，為了評(píng)價(jià)模型是否可靠，使用回收率分析法進(jìn)行分析研究。在實(shí)驗(yàn)環(huán)境相同條件下對(duì)以上三種抗生素配置成多種不同濃度的混合溶液。利用同樣的方法獲取此時(shí)混合溶液的熒光光譜圖，記錄在特征峰時(shí)的熒光強(qiáng)度數(shù)值大小，代回到一元函數(shù)模型中得出X（溶液濃度），用預(yù)測(cè)濃度除實(shí)際濃度得到回收率，回收率保留兩位小數(shù)，如表2.1。對(duì)多種混合溶液的回收率進(jìn)行平均計(jì)算，得出阿維菌素平均回收率為98.90%，春雷霉素平均回收率為98.82%，多殺菌素平均回收率為99.73%?；厥章什桓哂?%且不低于5%，因此可以確定