DB15Quarantineprotocolfortrichuri2020-02-25發(fā)布內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布本標準按照GB/T1.1-2009給I動物毛尾線蟲病檢疫技術規(guī)范本標準規(guī)定了動物毛尾線蟲病病原的形態(tài)學鑒定法、普通PCR檢測法和實時熒光PCR檢測法。本標準適用于動物毛尾線蟲病病原及蟲卵的形態(tài)學鑒定和分子生物學診斷。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T6682分析實驗室用水規(guī)下列術語和定義適用于本文件。注：蟲體主要寄生于豬、牛、羊、駱駝等多種哺乳動物。由毛尾線蟲引起的毛聚合酶鏈式反應polymerasechainreactio用于擴增位于已知序列之間脫氧核糖核酸（deoxyrib注：模板DNA經(jīng)過高溫變性成單鏈，在DNA聚合酶和適宜的溫度下，兩條互不DNA兩條鏈上的一段互補序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶的催化下以4種脫氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP）為底物，使退火引物得以延伸，如此反復變性、退火和DNA合成這一循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)擴增，經(jīng)25～30個擴增循環(huán)，擴增倍數(shù)達到106。實時熒光聚合酶鏈式反應real-timepolymerasechainre在聚合酶鏈式反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，并通過標準曲線對位置模板進行定量分析的方法。1每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4縮略語DNA：脫氧核糖核酸deoxyribonuleicaFAM：6-羧基熒光素6-carboxyfluorescTAMRA：6-羧基四甲基羅丹明6-carboxytetramethylrhoda5試劑和材料）：5.9無水乙醇。5.12dNTPs：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脫氧腺苷三磷酸）、dTTP（deoxythymiditriphosphate，脫氧胸腺三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脫氧胞（deoxyguanosinetriphospha），）：）：25’-AACGGCGGATCACTTGGC-3’5’-GTAGCGCCGACATGTTTGATC-3’5’-AACGGCGGATCACTTGGC-3’5’-GTAGCGCCGACATGTTTGATC-3’FAM-ACTTTGAACGCACATTGCAGCGTCGATC-TAM6.6冰箱（2℃~8℃和-20℃)。取新鮮糞便樣品2g放在小燒杯中，用鑷子或玻璃棒壓碎，加入10倍量的飽和食鹽水，攪拌混合，320mm～80mm范圍內(nèi)。尾部卷曲，有一根交合刺被包圍在交合刺蟲：體長在35mm～70mm范圍內(nèi)，尾部較直。陰門開口于蟲體粗細交界處，根據(jù)種類不有小刺或結節(jié)。肛門位于蟲體最后端，蟲體形態(tài)參見附錄C中圖C未檢出典型蟲卵，且在剖檢時未檢到成蟲，即可判定陰性，報告為未檢出采用CTAB提取法或相關商品化試劑盒提取法，見附C=A×N×50/1000……………（1）N——核酸稀釋倍數(shù)。當A260/A280比值在1.7～1.9之間時，適宜于PCR擴增。-5522-5-45-11-5-擴增曲線，可以判斷樣品結果為陽性，表述為實時熒光PCR檢測毛尾線Ct≧40.0，可以判斷樣品結果為陰性，表述為實時熒光P9檢測過程中防止交叉污染的措施檢測過程中的廢棄物，收集后在焚燒爐中焚6A.1CTAB提取法A.1.1樣品準備A.2商品化試劑盒提取法7AACGGCGGATCACTTGGCTCGTAGGTCGTTGAAGAACGACGTGACACTCGAGAATT