醫(yī)學(xué)生物實驗常用技術(shù)日期:演講人：目錄01細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)02分子生物學(xué)技術(shù)03免疫學(xué)實驗方法04顯微鏡與成像技術(shù)05生物信息學(xué)分析06動物模型實驗細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)01無菌操作規(guī)范實驗環(huán)境消毒細(xì)胞培養(yǎng)需在超凈工作臺或生物安全柜中進行，實驗前需用75%乙醇擦拭臺面及器械，并開啟紫外線照射30分鐘以上以滅菌。個人防護措施操作者需穿戴無菌手套、口罩及實驗服，避免說話或咳嗽污染樣本，所有操作需在酒精燈火焰旁進行以減少空氣污染風(fēng)險。器械滅菌管理金屬器械（如鑷子、剪刀）需高溫高壓滅菌，塑料耗材（如移液管、培養(yǎng)皿）需使用一次性無菌包裝產(chǎn)品，避免交叉污染。培養(yǎng)基配制方法基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇過濾與分裝添加劑與緩沖液根據(jù)細(xì)胞類型選擇DMEM、RPMI-1640或MEM等培養(yǎng)基，添加10-20%胎牛血清（FBS）以提供生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)。補充1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液防止細(xì)菌污染，加入HEPES緩沖液（10-25mM）維持pH穩(wěn)定性，必要時添加L-谷氨酰胺（2-4mM）支持細(xì)胞代謝。配制完成的培養(yǎng)基需通過0.22μm濾膜過濾除菌，分裝至無菌瓶中并于4℃保存，使用前需預(yù)熱至37℃以避免溫度應(yīng)激。細(xì)胞傳代與凍存流程傳代操作步驟棄舊培養(yǎng)基后用PBS清洗細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化1-5分鐘，終止消化后離心收集細(xì)胞，按1:2至1:4比例分裝至新培養(yǎng)瓶。凍存液配制使用含10%DMSO和90%FBS的凍存保護液，緩慢降溫至-80℃過夜后轉(zhuǎn)移至液氮罐長期保存，避免冰晶損傷細(xì)胞。復(fù)蘇注意事項從液氮中取出凍存管后迅速置于37℃水浴中融化，離心去除凍存液后重懸于新鮮培養(yǎng)基，接種后觀察24小時確認(rèn)細(xì)胞活性。分子生物學(xué)技術(shù)02PCR原理與應(yīng)用場景基本原理PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）通過變性、退火、延伸三個步驟循環(huán)擴增目標(biāo)DNA片段，依賴DNA聚合酶、引物和dNTPs完成指數(shù)級復(fù)制。診斷應(yīng)用用于病原體檢測（如新冠病毒、HIV）、遺傳病篩查（如地中海貧血基因突變）和法醫(yī)學(xué)DNA鑒定。科研應(yīng)用在基因克隆、突變分析、表達量檢測（qPCR）及二代測序文庫構(gòu)建中發(fā)揮核心作用。工業(yè)應(yīng)用應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物檢測、食品安全監(jiān)測（如食源性致病菌鑒定）和生物制藥質(zhì)控。DNA/RNA提取步驟使用含SDS的裂解液破壞膜結(jié)構(gòu)，配合蛋白酶K消化蛋白質(zhì)，RNA提取需額外加入RNase抑制劑。裂解階段分離純化質(zhì)量檢測組織需勻漿處理，細(xì)胞培養(yǎng)物需離心收集，血液樣本需紅細(xì)胞裂解，確保釋放核酸物質(zhì)。通過苯酚-氯仿抽提去除蛋白質(zhì)，乙醇/異丙醇沉淀核酸，或采用硅膠膜吸附柱特異性結(jié)合核酸。用Nanodrop測定A260/A280比值評估純度，凝膠電泳或生物分析儀檢測完整性（如RNA的RIN值）。樣本預(yù)處理蛋白質(zhì)電泳技術(shù)SDS原理染色方法應(yīng)用場景特殊電泳技術(shù)十二烷基硫酸鈉使蛋白質(zhì)變性并均勻帶負(fù)電，聚丙烯酰胺凝膠按分子量大小分離蛋白條帶?？捡R斯亮藍染色適用于常規(guī)檢測（靈敏度~100ng），銀染色提高至1ng級，熒光染色兼容下游質(zhì)譜分析。用于蛋白純度鑒定（如抗體純化）、分子量測定、WesternBlot前處理及差異蛋白篩選。雙向電泳（2D）結(jié)合等電聚焦和SDS，可分離復(fù)雜樣本中的數(shù)千種蛋白質(zhì)。免疫學(xué)實驗方法03ELISA檢測流程包被抗原或抗體將特異性抗原或抗體固定在微孔板表面，通常使用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）進行包被，并在4℃過夜或37℃孵育2小時，以確保充分吸附。封閉非特異性結(jié)合位點使用含5%脫脂奶粉或1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS緩沖液封閉微孔板，防止后續(xù)步驟中非特異性結(jié)合導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，封閉時間通常為1-2小時。加入待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品將稀釋后的待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品加入微孔板中，孵育1小時，使目標(biāo)分子與包被的抗原或抗體特異性結(jié)合，隨后洗滌去除未結(jié)合物質(zhì)。加入酶標(biāo)二抗和底物加入與目標(biāo)分子結(jié)合的酶標(biāo)二抗（如HRP標(biāo)記的二抗），孵育后洗滌，再加入TMB或OPD等顯色底物，通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，最后用終止液終止反應(yīng)并測定吸光度值。流式細(xì)胞術(shù)操作要點樣本制備將細(xì)胞懸液用PBS洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6/mL，并用70%乙醇或4%多聚甲醛固定，以保持細(xì)胞形態(tài)和抗原表位的完整性，同時避免細(xì)胞聚集影響檢測結(jié)果。01抗體標(biāo)記根據(jù)實驗需求選擇熒光標(biāo)記的一抗或二抗，孵育時間通常為30分鐘至1小時，避光條件下進行，以防止熒光淬滅，孵育后需用PBS充分洗滌去除未結(jié)合抗體。流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)在檢測前需使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校準(zhǔn)儀器，調(diào)整PMT電壓和補償參數(shù)，確保各熒光通道的信號分離和檢測靈敏度，避免光譜重疊導(dǎo)致的假陽性或假陰性。數(shù)據(jù)分析和解讀使用FlowJo或BDFACSDiva等專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)，通過設(shè)門策略區(qū)分目標(biāo)細(xì)胞群，統(tǒng)計熒光陽性細(xì)胞比例和平均熒光強度（MFI），并結(jié)合生物學(xué)重復(fù)驗證結(jié)果的可靠性。020304免疫組化染色技術(shù)組織切片制備：將石蠟包埋的組織切成4-5μm厚度的切片，貼附于防脫載玻片上，60℃烘烤2小時使組織牢固附著，隨后進行脫蠟和水化處理以恢復(fù)組織形態(tài)?？乖迯?fù)：采用熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)（HIER）或酶消化法（如胰蛋白酶消化）暴露被掩蔽的抗原表位，常用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）或EDTA緩沖液（pH8.0）進行高壓修復(fù)或微波修復(fù)。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和非特異性結(jié)合：使用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，再用5%正常血清（如山羊血清）封閉非特異性結(jié)合位點，減少背景染色干擾?？贵w孵育和顯色：滴加一抗（如抗Ki-67或抗CD20抗體）4℃過夜或室溫孵育1小時，洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色后蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，最后脫水封片并在顯微鏡下觀察結(jié)果。顯微鏡與成像技術(shù)04光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)應(yīng)用樣本制備與觀察光學(xué)顯微鏡適用于觀察染色或未染色的生物樣本，需通過切片、固定、染色等步驟優(yōu)化樣本對比度，如蘇木精-伊紅（H&E）染色用于組織學(xué)分析。相差與微分干涉（DIC）技術(shù)相差顯微鏡通過光程差轉(zhuǎn)換相位差，可視化透明細(xì)胞結(jié)構(gòu)；DIC利用偏振光干涉生成三維浮雕效果圖像，常用于活細(xì)胞動態(tài)研究。明場與暗場成像明場模式下光線直接穿透樣本，適合高對比度結(jié)構(gòu)觀察；暗場模式通過斜射光增強透明樣本邊緣散射光，適用于活細(xì)胞或未染色微生物觀察。熒光顯微鏡操作規(guī)范熒光標(biāo)記選擇根據(jù)目標(biāo)分子特性選擇特異性熒光染料或抗體（如FITC、TRITC），需考慮激發(fā)/發(fā)射波長匹配、光穩(wěn)定性及背景干擾控制。多色熒光成像需嚴(yán)格校準(zhǔn)濾光片組和激光強度，避免通道間串?dāng)_，例如使用DAPI（藍色）、GFP（綠色）和mCherry（紅色）同步標(biāo)記細(xì)胞核、胞質(zhì)及特定蛋白。光漂白與光毒性管理限制曝光時間和激光功率，添加抗淬滅劑（如DABCO），并采用快速成像模式（如轉(zhuǎn)盤共聚焦）以減少樣本損傷。共聚焦顯微鏡成像原理點掃描與光學(xué)切片通過激光逐點掃描樣本，結(jié)合針孔濾除離焦光信號，獲取高分辨率Z軸光學(xué)切片，實現(xiàn)三維重構(gòu)（如神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)解析）。多光子激發(fā)技術(shù)利用長波長紅外激光激發(fā)深層組織熒光，減少散射和光毒性，適用于活體組織成像（如小鼠腦皮層血管動態(tài)觀測）。超分辨率擴展應(yīng)用結(jié)合STED（受激發(fā)射損耗）或PALM（光激活定位顯微術(shù)），突破衍射極限，實現(xiàn)納米級分辨率（如線粒體嵴膜結(jié)構(gòu)解析）。生物信息學(xué)分析05序列比對工具使用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）用于快速比對核酸或蛋白質(zhì)序列，支持局部比對和全局比對，廣泛應(yīng)用于基因功能注釋和進化分析?？赏ㄟ^調(diào)整參數(shù)（如E值、打分矩陣）優(yōu)化比對結(jié)果。ClustalOmega多序列比對工具，適用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和保守區(qū)域分析。支持大規(guī)模數(shù)據(jù)集處理，采用漸進比對算法提高準(zhǔn)確性和效率。Bowtie與HISAT2專為高通量測序數(shù)據(jù)設(shè)計的短序列比對工具，適用于RNA-seq和ChIP-seq分析。通過索引參考基因組實現(xiàn)快速定位，支持多種輸出格式（如SAM/BAM）。高通量數(shù)據(jù)解析方法RNA-seq差異表達分析單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)聚類ChIP-seq峰值檢測利用DESeq2或edgeR軟件包對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計檢驗，識別差異表達基因。需考慮批次效應(yīng)校正和多重假設(shè)檢驗控制（如FDR）。采用MACS2或HOMER算法識別蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合位點，結(jié)合motif分析預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合模式。需評估信號噪聲比和峰值富集顯著性。使用Seurat或Scanpy工具進行降維（PCA/t-SNE）和細(xì)胞亞群劃分，整合Marker基因注釋細(xì)胞類型。需處理稀疏數(shù)據(jù)和技術(shù)偏差。數(shù)據(jù)庫檢索與管理綜合型生物數(shù)據(jù)庫，提供GenBank、UniProt等子庫，支持關(guān)鍵詞、序列或ID檢索。需掌握高級查詢語法（如布爾運算符）和批量下載技巧。NCBI與EMBL-EBIKEGG與GO功能注釋本地數(shù)據(jù)庫構(gòu)建通過通路富集分析（超幾何檢驗）關(guān)聯(lián)基因列表與生物學(xué)功能，使用DAVID或clusterProfiler工具實現(xiàn)可視化。需注意版本更新和物種特異性。利用MySQL或SQLite搭建定制化數(shù)據(jù)庫，整合公共數(shù)據(jù)與實驗數(shù)據(jù)。需設(shè)計規(guī)范化表結(jié)構(gòu)并優(yōu)化查詢性能，配合Biopython腳本實現(xiàn)自動化更新。動物模型實驗06動物選擇與倫理準(zhǔn)則物種匹配性原則根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇生理結(jié)構(gòu)、代謝特征與人類高度相似的動物模型，如嚙齒類動物（小鼠、大鼠）用于基礎(chǔ)研究，非人靈長類動物用于復(fù)雜疾病機制探索。倫理審查與3R原則實驗方案需通過機構(gòu)動物倫理委員會審批，嚴(yán)格遵守替代（Replacement）、減少（Reduction）和優(yōu)化（Refinement）原則，確保動物福利最大化。遺傳背景標(biāo)準(zhǔn)化優(yōu)先選用近交系或基因編輯動物，確保遺傳一致性，減少個體差異對實驗結(jié)果的影響，同時需明確記錄品系來源和基因型信息。手術(shù)操作與給藥技術(shù)無菌操作規(guī)范手術(shù)器械需高溫高壓滅菌，操作環(huán)境達到百級潔凈標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)中使用抗生素沖洗液降低感染風(fēng)險，術(shù)后監(jiān)測切口愈合情況。精準(zhǔn)給藥方法靜脈注射需控制流速避免血栓形成，腹腔注射注意避開臟器，腦內(nèi)給藥需通過立體定位儀確定靶區(qū)坐標(biāo)，確保藥物遞送準(zhǔn)確性。術(shù)中生命體征監(jiān)測實時記錄心率、血氧飽和度、體溫等參數(shù)，采用加熱墊維持動物體溫，必要時使用呼吸機輔助通氣，確保手術(shù)安全性