親水作用色譜分離技術演講人：日期:CATALOGUE目錄02工作原理01概述與定義03實驗條件設置04應用實例05優(yōu)缺點分析06發(fā)展趨勢概述與定義01基本概念解析親水作用色譜（HILIC）定義固定相類型分離機制特點一種基于極性固定相和含水有機流動相的液相色譜技術，通過溶質在固定相表面水層與流動相之間的分配差異實現(xiàn)分離，特別適用于強極性化合物的分析。結合反相色譜（RPC）與正相色譜（NPC）的特性，利用溶質在固定相表面富集的水層中的氫鍵、靜電相互作用及親水分配等多重作用力實現(xiàn)高效分離。常用固定相包括未修飾硅膠、氨基柱、酰胺柱、兩性離子柱等，不同固定相對極性化合物的選擇性差異顯著，需根據(jù)分析物性質優(yōu)化選擇。技術發(fā)展背景歷史演進20世紀90年代為解決反相色譜對強極性化合物保留不足的問題而提出，早期應用于糖類、氨基酸分析，后逐漸擴展至代謝組學、藥物分析等領域。技術驅動因素生物醫(yī)藥領域對極性代謝物檢測需求的增長，以及質譜檢測技術的普及，推動了HILIC在復雜基質中高靈敏度分析的應用。方法標準化進展近年來通過色譜柱制造商和學術界的協(xié)作，逐步建立了HILIC方法開發(fā)的通用準則（如流動相pH、緩沖鹽選擇等），提升了方法重現(xiàn)性。主要應用領域代謝組學研究藥物與雜質分析生物大分子分離環(huán)境與食品檢測用于極性代謝物（如有機酸、核苷酸）的分離分析，常與高分辨質譜聯(lián)用，實現(xiàn)生物樣本中數(shù)百種代謝物的同時檢測。針對強極性藥物分子（如抗生素、核苷類藥物）及其降解產(chǎn)物的質量控制，尤其在藥典方法中替代離子對色譜以改善兼容性。在糖蛋白、多肽的分析中展現(xiàn)優(yōu)勢，可通過調(diào)節(jié)梯度洗脫條件實現(xiàn)糖型異構體的基線分離。應用于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等極性污染物的監(jiān)測，解決傳統(tǒng)反相色譜對這類化合物保留弱的問題。工作原理02親水作用機制極性相互作用親水作用色譜（HILIC）基于固定相表面極性基團（如硅羥基、氨基、酰胺基等）與極性分析物之間的氫鍵和偶極-偶極相互作用實現(xiàn)分離，尤其適用于強極性化合物的保留。離子交換輔助部分HILIC固定相（如氨基柱）可能同時存在弱陰離子交換作用，可通過調(diào)節(jié)pH值優(yōu)化帶電化合物的選擇性，實現(xiàn)復雜樣品的分離。水層吸附模型固定相表面會吸附一層水分子形成富水層，分析物通過分配作用在水層與流動相之間進行動態(tài)平衡，其保留行為受水層厚度和流動相含水量顯著影響。色譜分離過程溫度控制策略升高柱溫（30-60℃）可降低流動相粘度、提高傳質效率，但需評估熱不穩(wěn)定化合物的降解風險，并保持系統(tǒng)溫度穩(wěn)定性。樣品預處理要求因HILIC對樣品溶劑極性敏感，需確保進樣溶劑中有機相比例≥80%以避免峰形畸變，必要時采用揮發(fā)性鹽（如甲酸銨）避免柱效損失。流動相梯度優(yōu)化典型HILIC流動相為高比例有機相（乙腈≥70%）與水相/緩沖鹽的混合體系，通過逐步增加水相比例實現(xiàn)洗脫，需平衡有機溶劑強度與選擇性需求。關鍵影響因素固定相化學性質柱平衡時間流動相pH與添加劑硅膠純度、鍵合相類型（中性/帶電）及封端處理程度直接影響保留強度和選擇性，例如酰胺柱適合糖類分析，而兩性離子柱對酸堿化合物兼容性更佳。pH值（2.5-7.5范圍）通過改變化合物電離狀態(tài)影響保留，緩沖鹽濃度（5-50mM）需優(yōu)化以平衡柱效與質譜兼容性，避免使用磷酸鹽等非揮發(fā)性添加劑。因固定相水合過程緩慢，初次使用或流動相變更后需10-20倍柱體積平衡以確保重現(xiàn)性，系統(tǒng)適應性測試中保留時間偏差應＜2%。實驗條件設置03色譜柱類型選擇硅膠基色譜柱具有高表面積和均勻的孔徑分布，適用于極性化合物的分離，尤其對糖類、氨基酸等親水性物質有良好保留能力。氨基鍵合相色譜柱通過氨基官能團與樣品分子間的氫鍵作用增強親水性分離效果，適合分析多羥基化合物和核苷酸類物質。兩性離子色譜柱兼具陰離子和陽離子交換特性，可減少非特異性吸附，適用于復雜生物樣品中極性分子的分離?；旌夏Ｊ缴V柱結合親水作用與反相保留機制，擴展分離范圍，適用于同時含疏水和親水組分的樣品分析。流動相優(yōu)化方法有機相比例調(diào)節(jié)通過調(diào)整乙腈或甲醇比例（通常為60%-95%）控制親水作用強度，高有機相比例可增強極性化合物保留。01緩沖鹽種類與濃度選用甲酸銨、乙酸銨等揮發(fā)性緩沖鹽（5-50mM），調(diào)節(jié)pH至3-6以優(yōu)化電離平衡，同時避免柱效損失。添加劑使用添加0.1%-1%的甲酸或氨水可改善峰形，而離子對試劑（如三氟乙酸）能增強特定化合物的選擇性。梯度洗脫程序設計線性或分段梯度以平衡分離效率與分析時間，初始高有機相比例逐步降低以實現(xiàn)組分洗脫。020304樣品制備要求采用固相萃取或蛋白沉淀法去除蛋白質、脂類等干擾物，尤其對生物體液樣本需嚴格去雜質處理?；|凈化濃度控制穩(wěn)定性測試樣品溶解溶劑需與流動相初始條件匹配（如高比例乙腈），避免溶劑效應導致峰變形或保留時間漂移。上樣濃度通常低于1mg/mL，過高濃度易導致柱過載或峰展寬，影響分離分辨率。對易降解樣品需評估其在進樣前溶劑中的穩(wěn)定性，必要時添加抗氧化劑或低溫保存以維持分析物完整性。溶劑兼容性應用實例04生物樣品分離蛋白質與多肽分離核酸及其衍生物分析代謝組學研究親水作用色譜（HILIC）通過極性固定相與高有機相流動相的協(xié)同作用，可有效分離復雜生物樣品中的親水性蛋白質和多肽，尤其適用于低豐度蛋白的富集與鑒定。HILIC技術能夠保留和分離極性代謝物（如氨基酸、糖類、有機酸等），為代謝通路分析和疾病標志物篩查提供高靈敏度、高分辨率的檢測平臺。該技術可分離核苷、核苷酸及修飾堿基等極性核酸組分，在表觀遺傳學和基因表達調(diào)控研究中具有重要應用價值。藥物分析應用極性藥物及代謝物檢測HILIC對高極性藥物（如抗生素、心血管藥物）及其代謝產(chǎn)物具有優(yōu)異保留能力，可解決反相色譜中早期洗脫導致的分離度不足問題。手性藥物拆分通過鍵合環(huán)糊精或纖維素衍生物的HILIC固定相，可實現(xiàn)極性手性藥物的對映體分離，為藥物純度控制和藥效研究提供技術支持。中藥活性成分分析適用于黃酮苷、生物堿等水溶性中藥成分的定量分析，其高有機相條件能顯著提升質譜檢測離子化效率。環(huán)境污染物檢測農(nóng)藥殘留監(jiān)測針對草甘膦、甲胺磷等強極性農(nóng)藥，HILIC技術相比傳統(tǒng)C18柱展現(xiàn)出更優(yōu)的保留特性，配合質譜檢測可實現(xiàn)環(huán)境樣品中痕量殘留的精準測定。持久性有機污染物富集通過HILIC柱預富集與后續(xù)分析聯(lián)用，可提升全氟化合物、短鏈氯化石蠟等新型污染物的檢測靈敏度。工業(yè)廢水分析能夠有效分離染料中間體、表面活性劑等親水性工業(yè)污染物，為水體污染溯源和治理效果評估提供可靠方法。優(yōu)缺點分析05技術優(yōu)勢總結高極性化合物保留能力強親水作用色譜（HILIC）對極性化合物具有優(yōu)異的保留能力，特別適用于糖類、氨基酸、核苷酸等強極性物質的分離分析，彌補了反相色譜在極性化合物分離中的不足。與質譜兼容性好HILIC使用的流動相通常為高比例有機相（如乙腈）與低比例水相，這種組合在電噴霧質譜（ESI-MS）中具有較高的離子化效率，顯著提升檢測靈敏度。分離選擇性可調(diào)通過調(diào)節(jié)固定相類型（如硅膠、氨基、酰胺等）和流動相組成（如緩沖鹽濃度、pH值），可靈活調(diào)整分離選擇性，滿足復雜樣品的分析需求。低柱壓操作相比反相色譜，HILIC通常在較低背壓下運行，延長色譜柱壽命并降低儀器損耗。常見局限性平衡時間較長HILIC色譜柱需要較長的平衡時間以確保重現(xiàn)性，尤其在梯度洗脫后，可能需數(shù)倍柱體積的流動相沖洗才能恢復初始條件，影響分析效率。保留機制復雜HILIC的保留行為受多種因素影響（如分配、吸附、離子交換等），可能導致峰形拖尾或保留時間不穩(wěn)定，對方法開發(fā)提出更高要求。溶劑效應敏感樣品溶劑與流動相組成差異較大時（如高水相樣品注入高有機相流動相），易引起峰形畸變或保留時間漂移，需嚴格優(yōu)化進樣條件。適用pH范圍受限多數(shù)HILIC固定相在堿性條件下不穩(wěn)定，限制了其在寬pH范圍內(nèi)的應用，尤其是對堿性化合物的分析。改進策略探討新型固定相開發(fā)設計兼具高親水性和化學穩(wěn)定性的固定相（如兩性離子型、混合模式填料），以擴展pH適用范圍并提升分離效率。01優(yōu)化流動相添加劑引入揮發(fā)性鹽（如甲酸銨）或離子對試劑（如三氟乙酸），改善峰形并增強質譜兼容性，同時減少系統(tǒng)污染風險。智能化方法開發(fā)結合實驗設計（DoE）和建模軟件預測保留行為，快速篩選最佳色譜條件，降低方法開發(fā)的時間成本。聯(lián)用技術整合將HILIC與其它分離模式（如反相色譜、離子色譜）聯(lián)用，構建多維分離系統(tǒng)，解決復雜基質中極性化合物的共洗脫問題。020304發(fā)展趨勢06技術創(chuàng)新進展通過引入極性基團或納米材料修飾，提升固定相對親水性化合物的選擇性吸附能力，顯著改善分離效率和峰形對稱性。新型固定相材料開發(fā)結合質譜、核磁共振等檢測手段，構建多維分離分析平臺，實現(xiàn)復雜樣品中痕量親水性物質的高靈敏度鑒定與定量。多維聯(lián)用技術優(yōu)化采用人工智能算法優(yōu)化色譜條件參數(shù)，自動匹配最佳流動相比例與梯度程序，縮短方法開發(fā)周期并提高重現(xiàn)性。智能化數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)新興應用方向生物醫(yī)藥領域用于單克隆抗體、多肽及代謝產(chǎn)物的純度分析與雜質監(jiān)控，尤其在糖基化修飾藥物的質量控制中發(fā)揮關鍵作用。食品營養(yǎng)研究解析天然產(chǎn)物中水溶性維生素、黃酮類化合物的分布規(guī)律，為功能性食品開發(fā)提供科學依據(jù)。環(huán)境污染物檢測針對極性農(nóng)藥、抗生素及內(nèi)分泌干擾物等水溶性污染物，建