人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞11β-HSD2表達(dá)調(diào)控分子機(jī)制探秘：轉(zhuǎn)錄、表觀與信號(hào)通路視角一、引言1.1研究背景人胎盤作為胎兒與母體之間進(jìn)行物質(zhì)交換、氣體交換、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物排泄的關(guān)鍵器官，在整個(gè)妊娠過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。它不僅為胎兒提供了生長(zhǎng)發(fā)育所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還承擔(dān)著維持胎兒內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、免疫保護(hù)等重要功能，是胎兒在母體內(nèi)健康成長(zhǎng)的基石。胎盤的正常功能依賴于其復(fù)雜而精細(xì)的細(xì)胞組成和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中滋養(yǎng)細(xì)胞作為胎盤的主要功能細(xì)胞，對(duì)于胎盤的發(fā)育、功能維持以及母體-胎兒間的相互作用起著核心作用。在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞眾多的關(guān)鍵分子和調(diào)控機(jī)制中，11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅱ型（11β-HSD2）逐漸成為研究的焦點(diǎn)。11β-HSD2是一種重要的酶，其主要功能是將具有生物活性的糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇（cortisol）不可逆地轉(zhuǎn)化為無活性的皮質(zhì)酮（cortisone）。在胎盤組織中，11β-HSD2的存在如同構(gòu)建了一道堅(jiān)固的“糖皮質(zhì)激素屏障”。正常情況下，母體血液中的糖皮質(zhì)激素水平相對(duì)較高，而胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)糖皮質(zhì)激素的暴露量有著嚴(yán)格的要求，過量的糖皮質(zhì)激素會(huì)對(duì)胎兒的器官發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)成熟等產(chǎn)生諸多不利影響，如導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、增加成年后患心血管疾病和代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。11β-HSD2通過高效地將母體來源的皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)酮，使得胎兒體內(nèi)的糖皮質(zhì)激素維持在一個(gè)適宜的低水平，從而為胎兒創(chuàng)造了一個(gè)穩(wěn)定且安全的生長(zhǎng)環(huán)境，對(duì)胎兒的正常發(fā)育起著至關(guān)重要的保護(hù)作用。對(duì)11β-HSD2表達(dá)調(diào)控機(jī)制的深入研究具有重大的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。從科學(xué)研究角度來看，它有助于我們從分子層面深入理解胎盤的功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及胎兒發(fā)育的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面的理論空白，為生殖生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的發(fā)展提供新的理論依據(jù)和研究方向。在臨床應(yīng)用方面，諸多妊娠相關(guān)疾病，如妊娠期高血壓疾病、胎兒生長(zhǎng)受限、妊娠期糖尿病等，都與胎盤功能異常密切相關(guān)，而11β-HSD2表達(dá)和活性的改變?cè)谶@些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。例如，在妊娠期高血壓疾病患者中，胎盤11β-HSD2的活性顯著降低，導(dǎo)致胎兒暴露于相對(duì)較高水平的糖皮質(zhì)激素環(huán)境中，進(jìn)而影響胎兒的正常發(fā)育，增加了不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)。深入探究11β-HSD2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)檫@些妊娠相關(guān)疾病的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和治療干預(yù)提供新的靶點(diǎn)和策略，有助于改善母嬰的健康預(yù)后，降低相關(guān)疾病對(duì)母嬰的危害。1.2研究目的與意義本研究旨在全面且深入地解析人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中11β-HSD2表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。通過運(yùn)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)手段，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多個(gè)層面，系統(tǒng)地探究影響11β-HSD2表達(dá)的關(guān)鍵因素及其相互作用網(wǎng)絡(luò)，明確各調(diào)控機(jī)制在正常妊娠和病理妊娠狀態(tài)下的差異與變化規(guī)律。在理論層面，深入研究11β-HSD2表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，有助于填補(bǔ)生殖生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域在胎盤功能調(diào)控方面的理論空白，為深入理解胎兒發(fā)育過程中糖皮質(zhì)激素的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制提供全新的視角和理論依據(jù)，進(jìn)一步完善胎盤功能調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)理論體系，推動(dòng)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。在臨床應(yīng)用方面，為眾多與胎盤功能異常密切相關(guān)的妊娠相關(guān)疾病，如妊娠期高血壓疾病、胎兒生長(zhǎng)受限、妊娠期糖尿病等，提供新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。通過對(duì)11β-HSD2表達(dá)調(diào)控機(jī)制的深入了解，能夠開發(fā)出更加精準(zhǔn)有效的早期診斷方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)這些疾病的早期預(yù)警和干預(yù)，降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率。還能為研發(fā)新型治療藥物和治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，有望改善母嬰的健康預(yù)后，提高人口素質(zhì)，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞11β-HSD2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制展開了廣泛而深入的研究，取得了一系列具有重要價(jià)值的研究成果。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，眾多轉(zhuǎn)錄因子被證實(shí)參與了11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。例如，維甲酸受體（RARs）能夠與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定順式作用元件相結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性。在對(duì)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RARs的表達(dá)水平發(fā)生改變時(shí)，11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)量也會(huì)隨之發(fā)生顯著變化。糖皮質(zhì)激素受體（GRs）在11β-HSD2轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也扮演著關(guān)鍵角色，它可以通過與糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件相互作用，影響11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也被報(bào)道能夠通過激活靶基因的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控11β-HSD2的表達(dá)。在炎癥刺激的條件下，NF-κB被激活并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平。表觀遺傳修飾作為一種重要的基因表達(dá)調(diào)控方式，在11β-HSD2表達(dá)調(diào)控中也發(fā)揮著不可或缺的作用。大量研究表明，DNA甲基化與11β-HSD2的表達(dá)水平之間存在著緊密的負(fù)相關(guān)關(guān)系。對(duì)胎盤組織的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島發(fā)生高甲基化時(shí)，該基因的表達(dá)會(huì)受到明顯抑制，導(dǎo)致11β-HSD2的蛋白和mRNA水平顯著降低。組蛋白修飾同樣能夠影響11β-HSD2基因的表達(dá)，如組蛋白的乙?；?、甲基化等修飾狀態(tài)的改變，會(huì)通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和可及性，進(jìn)而調(diào)控11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄活性。非編碼RNA在11β-HSD2表達(dá)調(diào)控中的作用也逐漸受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，在某些疾病狀態(tài)下，一些長(zhǎng)鏈非編碼RNA能夠通過與11β-HSD2基因的特定區(qū)域相互作用，調(diào)控其表達(dá)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化等過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，多個(gè)信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)參與了11β-HSD2的表達(dá)調(diào)控。Wnt信號(hào)通路在11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用。研究表明，Wnt信號(hào)通路的激活可以通過調(diào)控特定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而影響11β-HSD2的轉(zhuǎn)錄活性。在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，激活Wnt信號(hào)通路能夠顯著上調(diào)11β-HSD2的表達(dá)水平，而抑制該信號(hào)通路則會(huì)導(dǎo)致11β-HSD2表達(dá)下降。cAMP-PKA信號(hào)通路也參與了11β-HSD2的調(diào)控，該信號(hào)通路主要通過泛素化酶的活化來降解11β-HSD2蛋白，從而調(diào)節(jié)其蛋白水平。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過調(diào)節(jié)cAMP-PKA信號(hào)通路的活性，可以觀察到11β-HSD2蛋白穩(wěn)定性和表達(dá)量的相應(yīng)變化。盡管目前在11β-HSD2表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究方面已經(jīng)取得了豐碩的成果，但仍存在一些不足之處。不同轉(zhuǎn)錄因子之間以及轉(zhuǎn)錄因子與表觀遺傳修飾之間的相互作用機(jī)制尚未完全明確，它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控11β-HSD2的表達(dá)仍有待深入探究。對(duì)于非編碼RNA在11β-HSD2表達(dá)調(diào)控中的具體作用機(jī)制和分子靶點(diǎn)，還需要進(jìn)一步的研究來明確。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)參與11β-HSD2表達(dá)調(diào)控的信號(hào)通路，但這些信號(hào)通路之間的交叉對(duì)話和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系還不清楚。在病理妊娠狀態(tài)下，如妊娠期高血壓疾病、胎兒生長(zhǎng)受限等，11β-HSD2表達(dá)調(diào)控機(jī)制的變化及其與疾病發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系，仍缺乏系統(tǒng)而深入的研究。本研究旨在針對(duì)現(xiàn)有研究的不足，全面而深入地探究人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中11β-HSD2表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多個(gè)層面進(jìn)行系統(tǒng)研究，明確各調(diào)控因素在正常妊娠和病理妊娠狀態(tài)下的差異與變化規(guī)律，為進(jìn)一步完善胎盤功能調(diào)控的理論體系以及相關(guān)妊娠疾病的防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。二、人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞與11β-HSD2概述2.1人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞2.1.1來源與發(fā)育過程人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞起源于受精卵著床后的早期胚胎發(fā)育階段，是胎盤形成和功能發(fā)揮的關(guān)鍵細(xì)胞成分。在受精后，精子與卵子融合形成受精卵，受精卵開始進(jìn)行快速的細(xì)胞分裂，逐漸發(fā)育成囊胚。囊胚由內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞組成，其中滋養(yǎng)層細(xì)胞便是胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的前體。隨著囊胚著床于子宮內(nèi)膜，滋養(yǎng)層細(xì)胞開始迅速增殖和分化，開啟了胎盤形成的復(fù)雜過程。在著床后的早期階段，滋養(yǎng)層細(xì)胞逐漸分化為兩層：內(nèi)層為細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞（cytotrophoblast），外層為合體滋養(yǎng)細(xì)胞（syncytiotrophoblast）。細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，它們通過有絲分裂不斷增加細(xì)胞數(shù)量，為胎盤的發(fā)育提供細(xì)胞來源。而合體滋養(yǎng)細(xì)胞則是由細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞融合形成的多核細(xì)胞，其具備獨(dú)特的生理功能，如分泌多種激素、參與物質(zhì)交換等，是胎盤執(zhí)行功能的主要細(xì)胞類型。在胎盤發(fā)育的過程中，滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)一步分化并形成復(fù)雜的絨毛結(jié)構(gòu)。細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞不斷增殖并向合體滋養(yǎng)細(xì)胞融合，使得絨毛逐漸生長(zhǎng)和分支。絨毛的形成極大地增加了胎盤與母體血液的接觸面積，有利于母體與胎兒之間的物質(zhì)交換和氣體交換。早期的絨毛主要由細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞組成，隨著發(fā)育的推進(jìn)，胚外中胚層逐漸侵入絨毛內(nèi)部，形成絨毛間質(zhì)，進(jìn)一步完善了絨毛的結(jié)構(gòu)。在受精后約第三周末，絨毛內(nèi)的中胚層分化出毛細(xì)血管，與臍血管相連，至此胎兒-胎盤循環(huán)正式建立。這一循環(huán)系統(tǒng)的建立，標(biāo)志著胎盤發(fā)育進(jìn)入了一個(gè)新的階段，為胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供了穩(wěn)定的物質(zhì)供應(yīng)和代謝支持。除了絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，還有一部分細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分化為絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞（extravilloustrophoblast）。絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，它們能夠侵入母體子宮蛻膜和螺旋動(dòng)脈壁，參與子宮螺旋動(dòng)脈的重塑過程。這一過程對(duì)于建立低阻力、高流量的母胎血液循環(huán)至關(guān)重要，能夠確保足夠的血液和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送到胎盤，滿足胎兒快速生長(zhǎng)發(fā)育的需求。絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入和血管重塑過程受到多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控，任何環(huán)節(jié)的異常都可能導(dǎo)致胎盤發(fā)育異常和妊娠并發(fā)癥的發(fā)生。2.1.2功能與重要性人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞在維持正常妊娠過程中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵功能，對(duì)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育和母體的生理適應(yīng)起著不可或缺的作用。在物質(zhì)交換方面，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建了母體與胎兒之間進(jìn)行物質(zhì)交換的關(guān)鍵界面。合體滋養(yǎng)細(xì)胞具有高度的通透性和豐富的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠高效地?cái)z取母體血液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等，并將這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒體內(nèi)，為胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞還能將胎兒產(chǎn)生的代謝廢物，如尿素、尿酸和二氧化碳等，排出到母體血液中，由母體進(jìn)行代謝和排泄，維持胎兒內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這種物質(zhì)交換功能的正常發(fā)揮，是胎兒健康成長(zhǎng)的重要保障，任何物質(zhì)交換障礙都可能導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限、發(fā)育遲緩等問題。在激素分泌方面，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞是妊娠期多種重要激素的主要來源。合體滋養(yǎng)細(xì)胞能夠分泌人絨毛膜促性腺激素（hCG）、人胎盤生乳素（hPL）、雌激素和孕激素等多種激素。hCG在妊娠早期發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠維持黃體的功能，促進(jìn)黃體分泌孕激素，從而維持妊娠的繼續(xù)進(jìn)行。hPL則參與調(diào)節(jié)母體的代謝過程，促進(jìn)母體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用，為胎兒的生長(zhǎng)提供充足的能量。雌激素和孕激素在妊娠期對(duì)母體的生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)等產(chǎn)生廣泛的影響，它們參與維持子宮內(nèi)膜的穩(wěn)定、促進(jìn)乳腺發(fā)育、調(diào)節(jié)母體的水鹽平衡和心血管功能等，對(duì)于維持正常妊娠和母體的生理適應(yīng)至關(guān)重要。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞還在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。胎兒作為半同種異體移植物，在母體內(nèi)能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育而不被母體免疫系統(tǒng)排斥，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞起到了關(guān)鍵的保護(hù)作用。滋養(yǎng)細(xì)胞能夠表達(dá)多種免疫調(diào)節(jié)分子，如人類白細(xì)胞抗原-G（HLA-G）等，這些分子可以抑制母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒的免疫攻擊，誘導(dǎo)母體產(chǎn)生免疫耐受。滋養(yǎng)細(xì)胞還能分泌一些細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)母體免疫細(xì)胞的功能和活性，營(yíng)造一個(gè)有利于胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的免疫微環(huán)境。如果胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能異常，可能會(huì)導(dǎo)致母體對(duì)胎兒產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，引發(fā)流產(chǎn)、早產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥。胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的正常功能對(duì)于維持正常妊娠至關(guān)重要。它們通過物質(zhì)交換為胎兒提供營(yíng)養(yǎng)和排出廢物，通過激素分泌調(diào)節(jié)母體和胎兒的生理過程，通過免疫調(diào)節(jié)保護(hù)胎兒免受母體免疫系統(tǒng)的攻擊。任何影響胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能的因素，都可能導(dǎo)致妊娠異常和不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，因此深入研究胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能和調(diào)控機(jī)制，對(duì)于保障母嬰健康具有重要的意義。2.211β-HSD22.2.1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)11β-HSD2屬于短鏈脫氫酶/還原酶（SDR）超家族成員，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由多個(gè)結(jié)構(gòu)域和特定的氨基酸序列組成，賦予了它獨(dú)特的催化活性和生物學(xué)功能。從氨基酸組成來看，人11β-HSD2由大約370個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。這些氨基酸通過精確的排列順序，形成了具有特定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。在其一級(jí)結(jié)構(gòu)中，某些關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)于酶的活性起著至關(guān)重要的作用。例如，活性中心的氨基酸殘基，它們參與了與底物皮質(zhì)醇的結(jié)合以及催化反應(yīng)的進(jìn)行。研究表明，位于活性中心的絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）等氨基酸殘基，通過與皮質(zhì)醇分子形成特定的氫鍵和疏水相互作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)底物的特異性識(shí)別和高效催化。在空間構(gòu)象方面，11β-HSD2呈現(xiàn)出典型的SDR超家族結(jié)構(gòu)特征。它包含一個(gè)N-端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-端結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間通過一段柔性的連接肽相連。N-端結(jié)構(gòu)域主要參與輔酶NADP?的結(jié)合，其結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，具有特定的氨基酸序列模體，能夠與NADP?形成穩(wěn)定的相互作用，確保輔酶在催化過程中發(fā)揮作用。C-端結(jié)構(gòu)域則是酶的催化活性中心所在區(qū)域，它具有高度的結(jié)構(gòu)可塑性，能夠根據(jù)底物的結(jié)合情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)皮質(zhì)醇的高效脫氫反應(yīng)。11β-HSD2的三維結(jié)構(gòu)中還存在一些重要的結(jié)構(gòu)元件，如α-螺旋和β-折疊。這些結(jié)構(gòu)元件相互交織，形成了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)框架，為酶的活性中心提供了合適的微環(huán)境。α-螺旋和β-折疊的特定排列方式，不僅有助于維持蛋白質(zhì)的整體穩(wěn)定性，還能夠影響底物與活性中心的結(jié)合親和力以及催化反應(yīng)的速率。一些位于α-螺旋或β-折疊上的氨基酸殘基，通過與活性中心的氨基酸相互作用，間接參與了酶的催化過程。11β-HSD2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是其功能發(fā)揮的基礎(chǔ)。其獨(dú)特的氨基酸組成和精確的空間構(gòu)象，使其能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合底物皮質(zhì)醇，并在輔酶NADP?的參與下，高效地催化皮質(zhì)醇向皮質(zhì)酮的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，從而在維持胎兒正常發(fā)育以及體內(nèi)糖皮質(zhì)激素平衡等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。2.2.2生理功能11β-HSD2的主要生理功能是催化皮質(zhì)類固醇的轉(zhuǎn)化，在這一過程中，它起著至關(guān)重要的作用，對(duì)維持胎兒正常發(fā)育具有深遠(yuǎn)意義。具體而言，11β-HSD2能夠以高度的特異性和催化效率，將具有生物活性的糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇（在嚙齒類動(dòng)物中為皮質(zhì)酮）不可逆地轉(zhuǎn)化為無活性的代謝產(chǎn)物皮質(zhì)酮（在嚙齒類動(dòng)物中為11-脫氫皮質(zhì)酮）。這一催化反應(yīng)依賴于輔酶NADP?的參與，NADP?在反應(yīng)中接受氫原子，協(xié)助完成皮質(zhì)醇的脫氫過程。11β-HSD2的活性位點(diǎn)與皮質(zhì)醇分子具有高度的親和力，通過一系列精確的化學(xué)反應(yīng)步驟，實(shí)現(xiàn)了底物的高效轉(zhuǎn)化。在胎兒發(fā)育過程中，11β-HSD2所發(fā)揮的作用尤為關(guān)鍵。母體血液中含有相對(duì)較高水平的糖皮質(zhì)激素，這些激素如果大量進(jìn)入胎兒體內(nèi)，會(huì)對(duì)胎兒的正常發(fā)育產(chǎn)生諸多不利影響。過量的糖皮質(zhì)激素可能干擾胎兒器官的正常分化和發(fā)育，影響神經(jīng)系統(tǒng)的成熟，增加胎兒出生后患心血管疾病、代謝性疾病以及神經(jīng)精神性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。11β-HSD2在胎盤組織中高度表達(dá)，它如同一個(gè)嚴(yán)密的“守護(hù)者”，通過高效地催化皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)酮，極大地降低了胎兒體內(nèi)的糖皮質(zhì)激素水平，為胎兒營(yíng)造了一個(gè)適宜的低糖皮質(zhì)激素環(huán)境。這種對(duì)糖皮質(zhì)激素的嚴(yán)格調(diào)控，確保了胎兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育，保障了胎兒各個(gè)器官系統(tǒng)的健康形成和功能完善。在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，11β-HSD2的持續(xù)高活性使得母體來源的皮質(zhì)醇在進(jìn)入胎兒循環(huán)之前被大量轉(zhuǎn)化為無活性的皮質(zhì)酮，有效地阻止了過量糖皮質(zhì)激素對(duì)胎兒的不良影響。在胎兒的關(guān)鍵發(fā)育階段，如器官形成期和神經(jīng)發(fā)育高峰期，11β-HSD2的穩(wěn)定功能對(duì)于維持胎兒的正常發(fā)育軌跡至關(guān)重要。它通過維持胎兒體內(nèi)糖皮質(zhì)激素的平衡，間接調(diào)節(jié)了胎兒的生長(zhǎng)激素軸、胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)等重要生理調(diào)節(jié)系統(tǒng)，為胎兒的健康成長(zhǎng)提供了必要的支持和保障。2.2.3在人胎盤中的分布與表達(dá)特點(diǎn)11β-HSD2在人胎盤中呈現(xiàn)出獨(dú)特的分布模式和表達(dá)變化規(guī)律，這些特點(diǎn)與胎盤的發(fā)育進(jìn)程以及其對(duì)胎兒的保護(hù)功能密切相關(guān)。在胎盤的不同部位，11β-HSD2的分布存在顯著差異。在胎盤絨毛組織中，11β-HSD2主要定位于合體滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。合體滋養(yǎng)細(xì)胞作為胎盤與母體血液直接接觸的主要細(xì)胞層，承擔(dān)著物質(zhì)交換和激素代謝的重要功能。11β-HSD2在合體滋養(yǎng)細(xì)胞中的高表達(dá)，使其能夠及時(shí)地對(duì)母體血液中的皮質(zhì)醇進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，有效地阻止了皮質(zhì)醇進(jìn)入胎兒循環(huán)，為胎兒提供了重要的保護(hù)屏障。在絨毛間質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，也檢測(cè)到了較低水平的11β-HSD2表達(dá)，這可能與這些細(xì)胞在維持胎盤微環(huán)境穩(wěn)定和調(diào)節(jié)局部糖皮質(zhì)激素水平方面的輔助作用有關(guān)。在胎盤的非絨毛區(qū)域，如絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞和胎盤基底層，11β-HSD2的表達(dá)水平相對(duì)較低，但仍具有重要的生理意義。絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞在胎盤的植入和子宮螺旋動(dòng)脈重塑過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，雖然其11β-HSD2表達(dá)水平不如合體滋養(yǎng)細(xì)胞高，但在這些細(xì)胞中，11β-HSD2的存在仍能夠在一定程度上調(diào)節(jié)局部的糖皮質(zhì)激素水平，為絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的正常功能發(fā)揮提供適宜的微環(huán)境。胎盤基底層作為胎盤與母體子宮壁連接的重要部位，11β-HSD2的低水平表達(dá)可能參與了調(diào)節(jié)母體與胎盤之間的糖皮質(zhì)激素平衡，維持了胎盤-母體界面的穩(wěn)定。隨著胎盤發(fā)育的不同階段，11β-HSD2的表達(dá)也呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。在妊娠早期，胎盤11β-HSD2的表達(dá)水平相對(duì)較低，但隨著妊娠的進(jìn)展，其表達(dá)量逐漸增加。在妊娠中期，11β-HSD2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上升，這與胎兒生長(zhǎng)發(fā)育加速、對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感性增加以及母體-胎兒之間物質(zhì)交換和代謝需求的增強(qiáng)相適應(yīng)。此時(shí)，胎盤需要更強(qiáng)的糖皮質(zhì)激素屏障功能來保護(hù)胎兒免受母體高糖皮質(zhì)激素水平的影響。到了妊娠晚期，11β-HSD2的表達(dá)繼續(xù)維持在較高水平，但在臨產(chǎn)前，其活性會(huì)出現(xiàn)一定程度的下降。這種臨產(chǎn)前的活性降低被認(rèn)為與分娩的啟動(dòng)和胎兒的成熟過程密切相關(guān)，適量的皮質(zhì)醇進(jìn)入胎兒體內(nèi)可能參與了胎兒肺成熟、腸道發(fā)育等重要生理過程，為胎兒出生后的生存做好準(zhǔn)備。三、11β-HSD2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制3.1關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵起始步驟，11β-HSD2基因的表達(dá)同樣受到多種轉(zhuǎn)錄因子的精細(xì)調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠直接或間接與基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄速率的蛋白質(zhì)分子。它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)通過與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄機(jī)器，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，進(jìn)而啟動(dòng)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄過程。在11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，多種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，共同維持著11β-HSD2基因在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的正常表達(dá)水平，確保其在胎兒發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵的保護(hù)作用。3.1.1RARs（維甲酸受體）維甲酸受體（RARs）屬于核受體超家族成員，包括RARα、RARβ和RARγ三種亞型。這些亞型在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，但在組織分布和功能上存在差異。RARs具有典型的核受體結(jié)構(gòu)特征，包含N-端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AF-1）、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）和C-端的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD）。AF-1結(jié)構(gòu)域能夠與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性；DBD結(jié)構(gòu)域含有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，通過識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，即維甲酸反應(yīng)元件（RAREs），實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的特異性調(diào)控；LBD結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)與維甲酸及其衍生物等配體結(jié)合，配體結(jié)合后會(huì)引起RARs構(gòu)象的改變，進(jìn)而影響其與其他蛋白質(zhì)的相互作用以及對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控活性。在11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域，存在多個(gè)與RARs結(jié)合的RAREs位點(diǎn)。這些位點(diǎn)通常由特定的核苷酸序列組成，具有一定的保守性。通過凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）等技術(shù)手段，研究人員證實(shí)了RARs能夠與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的RAREs位點(diǎn)特異性結(jié)合。當(dāng)RARs與配體維甲酸結(jié)合后，其構(gòu)象發(fā)生變化，與RAREs位點(diǎn)的結(jié)合親和力增強(qiáng)，進(jìn)而招募一系列轉(zhuǎn)錄輔助因子，如共激活因子（co-activators）等，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。這些共激活因子能夠通過多種方式促進(jìn)轉(zhuǎn)錄過程，如增強(qiáng)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合能力、促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝以及調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其更易于轉(zhuǎn)錄。研究表明，在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，維甲酸處理能夠顯著上調(diào)11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，而當(dāng)RARs的表達(dá)被抑制或其與RAREs位點(diǎn)的結(jié)合被阻斷時(shí)，維甲酸對(duì)11β-HSD2表達(dá)的促進(jìn)作用明顯減弱，這充分證明了RARs在維甲酸介導(dǎo)的11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄激活過程中的關(guān)鍵作用。3.1.2GRs（糖皮質(zhì)激素受體）糖皮質(zhì)激素受體（GRs）同樣屬于核受體超家族，在細(xì)胞內(nèi)以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與熱休克蛋白（HSPs）等分子伴侶結(jié)合。GRs由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包括N-端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AF-1）、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、鉸鏈區(qū)和C-端的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD）。AF-1結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活活性，能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子和共激活因子相互作用，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄；DBD結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可識(shí)別并結(jié)合糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（GREs），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的特異性調(diào)控；鉸鏈區(qū)則連接DBD和LBD，具有一定的柔性，在GRs的活化和核轉(zhuǎn)位過程中發(fā)揮重要作用；LBD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與糖皮質(zhì)激素結(jié)合，配體結(jié)合后會(huì)引起GRs構(gòu)象的改變，導(dǎo)致其與HSPs解離，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。在糖皮質(zhì)激素存在的情況下，糖皮質(zhì)激素與GRs的LBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，引發(fā)GRs的構(gòu)象變化，使其與HSPs分離，并暴露核定位信號(hào)（NLS）。隨后，GRs通過NLS被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的GREs位點(diǎn)結(jié)合。GRs與GREs的結(jié)合可以直接影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合效率，從而調(diào)控11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄活性。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞暴露于高濃度的糖皮質(zhì)激素時(shí)，GRs與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的GREs結(jié)合增強(qiáng)，導(dǎo)致11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，其mRNA和蛋白表達(dá)水平下降。這可能是由于GRs與GREs結(jié)合后，招募了共抑制因子（co-repressors），這些共抑制因子通過抑制RNA聚合酶的活性或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，阻礙了基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸過程。然而，也有研究表明，在某些生理?xiàng)l件下，低水平的糖皮質(zhì)激素激活GRs后，可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用，對(duì)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄起到一定的促進(jìn)作用，這表明GRs對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用可能受到多種因素的影響，包括糖皮質(zhì)激素的濃度、細(xì)胞類型以及其他轉(zhuǎn)錄因子的存在等。3.1.3NF-κB等其他轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB（NF-κB）是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NF-κB通常以同源二聚體或異源二聚體的形式存在，常見的亞基包括p50、p65（RelA）、RelB、c-Rel和p52等。其中，p65/p50異源二聚體是最為常見的活性形式。NF-κB在未激活狀態(tài)下，與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到多種刺激，如炎癥細(xì)胞因子（如腫瘤壞死因子-α，TNF-α）、細(xì)菌脂多糖（LPS）等的作用時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，進(jìn)而磷酸化IκB，使其與NF-κB解離。解離后的NF-κB暴露核定位信號(hào)，迅速轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過程。在11β-HSD2表達(dá)調(diào)控中，NF-κB也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥刺激等病理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)的NF-κB被激活并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合。通過一系列實(shí)驗(yàn)，如EMSA和ChIP-qPCR等，證實(shí)了NF-κB與11β-HSD2基因啟動(dòng)子的特異性結(jié)合。當(dāng)NF-κB與κB位點(diǎn)結(jié)合后，能夠招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而調(diào)控11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄。在TNF-α刺激人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隨著NF-κB的激活，11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降，這表明NF-κB在炎癥條件下對(duì)11β-HSD2的表達(dá)具有抑制作用。其具體機(jī)制可能是NF-κB與11β-HSD2基因啟動(dòng)子結(jié)合后，招募了具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的輔助因子，或者干擾了其他促進(jìn)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制了基因的轉(zhuǎn)錄過程。除了NF-κB，還有其他一些轉(zhuǎn)錄因子也參與了11β-HSD2的表達(dá)調(diào)控。如早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1（Egr-1），它是一種即刻早期基因產(chǎn)物，在細(xì)胞受到多種刺激后能夠迅速誘導(dǎo)表達(dá)。Egr-1含有三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可特異性識(shí)別并結(jié)合富含GC的DNA序列，即Egr-1結(jié)合位點(diǎn)。在11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域存在Egr-1的結(jié)合位點(diǎn)，研究表明Egr-1能夠與該位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄起到正向調(diào)控作用。在某些細(xì)胞模型中，過表達(dá)Egr-1能夠顯著上調(diào)11β-HSD2的表達(dá)，而抑制Egr-1的表達(dá)則導(dǎo)致11β-HSD2表達(dá)下降，這說明Egr-1在維持11β-HSD2正常表達(dá)水平中具有重要作用。又如特異性蛋白1（Sp1），它是一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別并結(jié)合富含GC的啟動(dòng)子元件。在11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域也存在多個(gè)Sp1的結(jié)合位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Sp1與11β-HSD2基因啟動(dòng)子的結(jié)合可以促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。通過基因沉默技術(shù)降低Sp1的表達(dá)水平，會(huì)導(dǎo)致11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著減少，這表明Sp1在11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中是一個(gè)重要的正向調(diào)控因子。這些轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在復(fù)雜的相互作用，它們通過協(xié)同或拮抗的方式，共同調(diào)節(jié)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄，以適應(yīng)不同的生理和病理?xiàng)l件。3.2轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在11β-HSD2表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄水平，RARs、GRs和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子并非孤立地發(fā)揮作用，它們之間存在著復(fù)雜而精細(xì)的相互作用，共同構(gòu)成了一個(gè)嚴(yán)密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行精確調(diào)控。RARs與GRs之間存在著潛在的相互作用關(guān)系。RARs和GRs都屬于核受體超家族成員，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上有一定的相似性。在某些情況下，RARs和GRs可能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的相近或重疊的DNA序列元件。研究發(fā)現(xiàn)，在特定的細(xì)胞環(huán)境中，當(dāng)RARs被維甲酸激活后，它與啟動(dòng)子區(qū)域RAREs位點(diǎn)的結(jié)合能力增強(qiáng)，此時(shí)會(huì)抑制GRs與GREs位點(diǎn)的結(jié)合，從而影響GRs對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用。這種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的機(jī)制可能是由于RARs和GRs在與DNA結(jié)合時(shí)，它們的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）與相應(yīng)的DNA序列元件之間存在空間位阻效應(yīng)。當(dāng)RARs結(jié)合到RAREs位點(diǎn)后，會(huì)改變?cè)搮^(qū)域的DNA構(gòu)象，使得GRs的DBD難以接近并結(jié)合到GREs位點(diǎn)上，進(jìn)而影響了GRs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。RARs和GRs還可能通過與共同的轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，間接影響彼此對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。一些共激活因子或共抑制因子能夠同時(shí)與RARs和GRs結(jié)合，當(dāng)RARs與這些輔助因子結(jié)合后，會(huì)改變輔助因子的構(gòu)象或活性，從而影響其與GRs的相互作用，最終對(duì)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生協(xié)同或拮抗的調(diào)控效應(yīng)。RARs與NF-κB之間也存在著復(fù)雜的相互作用。在炎癥刺激等病理?xiàng)l件下，NF-κB被激活并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核。研究表明，激活的NF-κB可以通過與RARs相互作用，影響RARs對(duì)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。NF-κB的p65亞基可以與RARs的某些結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合，這種結(jié)合會(huì)改變RARs的構(gòu)象，影響其與RAREs位點(diǎn)的結(jié)合親和力。在TNF-α刺激的人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，NF-κB被激活后，其p65亞基與RARα結(jié)合，導(dǎo)致RARα與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域RAREs位點(diǎn)的結(jié)合減少，進(jìn)而抑制了RARα對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的激活作用。RARs也可能通過調(diào)節(jié)NF-κB的活性來影響11β-HSD2的表達(dá)。維甲酸激活RARs后，可以上調(diào)某些抑制NF-κB活性的蛋白表達(dá)，如IκBα等。IκBα能夠與NF-κB結(jié)合，抑制其活性并阻止其核轉(zhuǎn)位，從而間接影響NF-κB對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。GRs與NF-κB之間同樣存在相互作用。在炎癥和應(yīng)激條件下，GRs和NF-κB的相互作用尤為明顯。通常情況下，GRs與NF-κB之間存在相互抑制的關(guān)系。GRs可以通過與NF-κB的p65亞基結(jié)合，抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性和轉(zhuǎn)錄激活功能。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，GRs被激活后，其與NF-κB的p65亞基結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物無法與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制了NF-κB對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的激活作用。NF-κB也可以通過調(diào)節(jié)GRs的表達(dá)和活性來影響其對(duì)11β-HSD2基因的調(diào)控。在某些炎癥相關(guān)的疾病狀態(tài)下，NF-κB的持續(xù)激活可以下調(diào)GRs的表達(dá)水平，使得GRs對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控能力減弱?；谶@些轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用，我們可以構(gòu)建出它們調(diào)控11β-HSD2表達(dá)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，RARs、GRs和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子通過直接的蛋白-蛋白相互作用、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA序列元件以及對(duì)共同轉(zhuǎn)錄輔助因子的調(diào)控等多種方式，相互影響、協(xié)同作用，共同決定了11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄水平。在正常生理?xiàng)l件下，這些轉(zhuǎn)錄因子之間保持著微妙的平衡，使得11β-HSD2基因維持在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平，以確保胎盤的正常功能和胎兒的健康發(fā)育。而在病理?xiàng)l件下，如炎癥、應(yīng)激等，這種平衡被打破，轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用發(fā)生改變，導(dǎo)致11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄異常，進(jìn)而影響胎盤功能和胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。通過深入研究這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們能夠更全面地理解11β-HSD2表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，為相關(guān)妊娠疾病的防治提供更深入的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。3.3轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究3.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為了深入探究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)11β-HSD2表達(dá)的調(diào)控作用，本研究綜合運(yùn)用了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等多種方法。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系（如BeWo細(xì)胞、JEG-3細(xì)胞等）作為研究對(duì)象。這些細(xì)胞系具有與原代胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，能夠較好地模擬胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能和代謝過程。首先，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將編碼RARs、GRs、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入滋養(yǎng)細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的過表達(dá)。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）將表達(dá)質(zhì)粒高效地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。具體操作步驟如下：將適量的表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑按照一定比例混合，在室溫下孵育一段時(shí)間，使其形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間，以確保質(zhì)粒能夠成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)，設(shè)立陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，以排除質(zhì)粒載體本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。為了抑制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，采用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)。針對(duì)RARs、GRs、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的mRNA序列，設(shè)計(jì)并合成特異性的siRNA。將siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入滋養(yǎng)細(xì)胞中，使其與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對(duì)，從而誘導(dǎo)mRNA的降解，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的沉默。同樣，設(shè)立陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組，以驗(yàn)證siRNA干擾的特異性。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h等），收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)11β-HSD2的mRNA表達(dá)水平。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性的引物對(duì)11β-HSD2基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物的設(shè)計(jì)遵循引物設(shè)計(jì)原則，確保其特異性和擴(kuò)增效率。同時(shí)，選擇合適的內(nèi)參基因（如GAPDH）作為對(duì)照，用于校正不同樣本間的RNA上樣量差異。通過比較不同轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組之間11β-HSD2mRNA表達(dá)水平的差異，分析轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)或沉默對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的影響。為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子與11β-HSD2基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)。首先，使用甲醛對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)處理，使轉(zhuǎn)錄因子與DNA在體內(nèi)的結(jié)合狀態(tài)固定下來。然后，通過超聲破碎等方法將染色質(zhì)打斷成適當(dāng)大小的片段。接著，加入針對(duì)RARs、GRs、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的特異性抗體，孵育過夜，使抗體與結(jié)合在DNA上的轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合。通過免疫沉淀技術(shù)，將與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA片段富集下來。對(duì)富集得到的DNA片段進(jìn)行純化和PCR擴(kuò)增，使用位于11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳或qPCR等方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的含量，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合以及結(jié)合的強(qiáng)度。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選擇妊娠小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在妊娠的不同階段，通過腹腔注射等方式給予小鼠維甲酸（RARs的配體）、糖皮質(zhì)激素（GRs的配體）或炎癥刺激劑（如LPS，用于激活NF-κB）等處理。設(shè)立相應(yīng)的對(duì)照組，給予等量的溶劑注射。在處理后的特定時(shí)間點(diǎn)，處死小鼠，收集胎盤組織。對(duì)胎盤組織進(jìn)行RNA提取和蛋白質(zhì)提取，分別采用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。用特異性的11β-HSD2抗體進(jìn)行孵育，再用相應(yīng)的二抗孵育，通過化學(xué)發(fā)光等方法檢測(cè)11β-HSD2蛋白的表達(dá)條帶，并進(jìn)行定量分析。同時(shí)，對(duì)胎盤組織進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與11β-HSD2基因啟動(dòng)子的結(jié)合情況，以驗(yàn)證在體內(nèi)環(huán)境下轉(zhuǎn)錄因子對(duì)11β-HSD2表達(dá)的調(diào)控作用。3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，獲得了一系列關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子對(duì)11β-HSD2表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)RARs過表達(dá)時(shí)，qRT-PCR結(jié)果顯示11β-HSD2的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，與陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在RARs過表達(dá)的BeWo細(xì)胞中，11β-HSD2的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的2.5倍左右。而當(dāng)RARs被siRNA沉默后，11β-HSD2的mRNA表達(dá)水平明顯下降，僅為對(duì)照組的0.4倍左右。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RARs能夠與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的RAREs位點(diǎn)特異性結(jié)合，在RARs過表達(dá)的細(xì)胞中，與啟動(dòng)子結(jié)合的RARs蛋白量顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了RARs對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的激活作用。對(duì)于GRs，當(dāng)細(xì)胞中GRs過表達(dá)且給予糖皮質(zhì)激素刺激后，11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在GRs過表達(dá)并經(jīng)糖皮質(zhì)激素處理的JEG-3細(xì)胞中，11β-HSD2的mRNA表達(dá)量降至對(duì)照組的0.3倍，蛋白表達(dá)水平也明顯降低。ChIP實(shí)驗(yàn)顯示，GRs與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的GREs位點(diǎn)結(jié)合增強(qiáng)，且這種結(jié)合在糖皮質(zhì)激素存在的情況下更為顯著，說明GRs在糖皮質(zhì)激素刺激下對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。當(dāng)NF-κB被激活后（如通過LPS刺激），11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。在LPS刺激的人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，11β-HSD2的mRNA表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.2倍，蛋白表達(dá)水平也大幅下降。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，激活的NF-κB能夠與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，且結(jié)合量隨著NF-κB激活程度的增加而增多，表明NF-κB激活對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄具有明顯的抑制作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予妊娠小鼠維甲酸處理后，胎盤組織中11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。與對(duì)照組相比，維甲酸處理組小鼠胎盤11β-HSD2的mRNA表達(dá)量增加了1.8倍左右，蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)。ChIP實(shí)驗(yàn)表明，在維甲酸處理的小鼠胎盤中，RARs與11β-HSD2基因啟動(dòng)子的結(jié)合增強(qiáng)。而給予小鼠糖皮質(zhì)激素處理后，胎盤11β-HSD2的表達(dá)水平顯著降低，mRNA和蛋白表達(dá)量分別降至對(duì)照組的0.4倍和0.3倍左右，同時(shí)GRs與啟動(dòng)子的結(jié)合增加。當(dāng)給予小鼠LPS刺激后，胎盤11β-HSD2的表達(dá)受到明顯抑制，mRNA和蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.15倍和0.2倍左右，且NF-κB與啟動(dòng)子的結(jié)合顯著增強(qiáng)。綜合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：RARs對(duì)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄具有正向調(diào)控作用，通過與啟動(dòng)子區(qū)域的RAREs位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)11β-HSD2的表達(dá)；GRs在糖皮質(zhì)激素刺激下對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄起抑制作用，通過與GREs位點(diǎn)結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致11β-HSD2表達(dá)下降；NF-κB激活后對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄具有強(qiáng)烈的抑制作用，通過與κB位點(diǎn)結(jié)合，阻礙基因轉(zhuǎn)錄，使11β-HSD2表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子在11β-HSD2表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵作用，為深入理解11β-HSD2表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。四、11β-HSD2表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制4.1DNA甲基化DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它主要是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的催化下，將甲基基團(tuán)添加到DNA分子中特定的核苷酸位點(diǎn)上，最常見的是在CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）殘基上發(fā)生甲基化修飾。這種修飾通常發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)域、編碼區(qū)以及一些調(diào)控元件上，能夠改變DNA的物理和化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)水平。在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，11β-HSD2基因的表達(dá)同樣受到DNA甲基化的精細(xì)調(diào)控。4.1.111β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)分析為了深入了解11β-HSD2基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，我們首先運(yùn)用重亞硫酸鹽測(cè)序（BisulfiteSequencingPCR，BSP）技術(shù)，對(duì)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了全面而細(xì)致的分析。BSP技術(shù)是一種常用的檢測(cè)DNA甲基化水平的方法，其原理基于重亞硫酸鹽能夠?qū)⑽醇谆陌奏ぃ–）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶則保持不變。通過對(duì)處理后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，我們可以根據(jù)測(cè)序結(jié)果中C和T的分布情況，準(zhǔn)確地判斷出DNA序列中各個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們首先提取了人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的基因組DNA，然后將其進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。為了確保處理效果的準(zhǔn)確性和一致性，我們嚴(yán)格控制了重亞硫酸鹽的濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度等條件。處理后的DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用TA克隆技術(shù)連接到載體上，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)化和篩選，獲得了含有目的片段的陽性克隆。對(duì)這些陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，我們得到了11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化圖譜。通過對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析，我們發(fā)現(xiàn)11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)CpG位點(diǎn)，且這些位點(diǎn)的甲基化程度存在差異。在正常妊娠的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，部分CpG位點(diǎn)呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)，而另一些位點(diǎn)則處于較高的甲基化水平。具體而言，在啟動(dòng)子區(qū)域靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的一段富含CpG的區(qū)域，大約有30%的CpG位點(diǎn)處于低甲基化狀態(tài)，這些低甲基化位點(diǎn)可能與基因的轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。而在啟動(dòng)子的遠(yuǎn)端區(qū)域，CpG位點(diǎn)的甲基化程度相對(duì)較高，約有70%的位點(diǎn)被甲基化修飾。我們還進(jìn)一步分析了不同妊娠狀態(tài)下11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的變化。在妊娠期高血壓疾病、胎兒生長(zhǎng)受限等病理妊娠狀態(tài)下的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化模式發(fā)生了顯著改變。與正常妊娠組相比，病理妊娠組中啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化位點(diǎn)數(shù)量明顯減少，而高甲基化位點(diǎn)的比例顯著增加。在妊娠期高血壓疾病患者的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，啟動(dòng)子區(qū)域靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的低甲基化CpG位點(diǎn)比例降至10%左右，而遠(yuǎn)端區(qū)域的高甲基化位點(diǎn)比例則上升至85%以上。這些結(jié)果表明，11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)在不同妊娠狀態(tài)下存在明顯差異，且這種差異可能與11β-HSD2的表達(dá)調(diào)控以及妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。4.1.2甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響及機(jī)制DNA甲基化對(duì)11β-HSD2基因表達(dá)的影響主要通過改變轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力來實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄速率的蛋白質(zhì)分子。當(dāng)11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化修飾時(shí)，會(huì)導(dǎo)致DNA序列的空間構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合親和力。具體來說，甲基化的CpG位點(diǎn)會(huì)增加DNA分子的空間位阻，使得一些轉(zhuǎn)錄因子難以接近并結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域的相應(yīng)位點(diǎn)上。RARs作為11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的重要激活因子，其與啟動(dòng)子區(qū)域RAREs位點(diǎn)的結(jié)合對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RAREs位點(diǎn)附近的CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化時(shí)，RARs與該位點(diǎn)的結(jié)合能力顯著下降。通過凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）等技術(shù)手段，證實(shí)了甲基化修飾后的DNA序列與RARs的結(jié)合活性明顯降低，從而抑制了RARs對(duì)11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的激活作用。這是因?yàn)榧谆揎椄淖兞薉NA的局部結(jié)構(gòu)，使得RARs的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域難以與RAREs位點(diǎn)形成穩(wěn)定的相互作用，從而阻礙了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝，最終導(dǎo)致11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄水平下降。甲基化還可以通過招募一些具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的蛋白因子來間接抑制基因轉(zhuǎn)錄。在DNA甲基化過程中，一些甲基化結(jié)合蛋白（如MeCP2等）能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到甲基化的CpG位點(diǎn)上。MeCP2含有甲基化結(jié)合結(jié)構(gòu)域（MBD），它可以與甲基化的CpG位點(diǎn)緊密結(jié)合。一旦MeCP2結(jié)合到11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化位點(diǎn)上，就會(huì)招募一系列轉(zhuǎn)錄抑制因子，如組蛋白去乙?；福℉DACs）等。HDACs能夠去除組蛋白上的乙?；?，使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加緊密，從而抑制了轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合以及RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性，最終導(dǎo)致11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。這種由甲基化結(jié)合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制機(jī)制，進(jìn)一步說明了DNA甲基化在11β-HSD2基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用。在病理妊娠狀態(tài)下，如妊娠期高血壓疾病和胎兒生長(zhǎng)受限等，11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)水平顯著降低。由于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合受阻以及轉(zhuǎn)錄抑制因子的招募，使得11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄活性受到極大抑制，進(jìn)而導(dǎo)致11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯減少。這可能會(huì)破壞胎盤對(duì)糖皮質(zhì)激素的正常代謝和屏障功能，使胎兒暴露于相對(duì)較高水平的糖皮質(zhì)激素環(huán)境中，增加胎兒生長(zhǎng)發(fā)育異常的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步加重妊娠相關(guān)疾病的病情。4.2組蛋白修飾4.2.1常見組蛋白修飾類型（乙?；?、甲基化等）對(duì)11β-HSD2表達(dá)的影響組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分，主要發(fā)生在組蛋白的N端尾部區(qū)域，通過在組蛋白上添加或去除特定的化學(xué)基團(tuán)，改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響基因的表達(dá)。在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，組蛋白H3和H4的乙?；⒓谆揎棇?duì)11β-HSD2基因的表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。組蛋白乙酰化是一種常見的修飾方式，它能夠使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加基因的可及性，通常與基因的激活相關(guān)。在11β-HSD2基因的調(diào)控中，組蛋白H3和H4的乙酰化水平變化對(duì)其表達(dá)有著顯著影響。研究表明，當(dāng)組蛋白H3和H4在11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生高度乙酰化時(shí)，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更為開放，轉(zhuǎn)錄因子更容易與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而促進(jìn)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄。這是因?yàn)橐阴；揎椖軌蛑泻徒M蛋白尾部的正電荷，減弱組蛋白與帶負(fù)電荷的DNA之間的靜電相互作用，使得染色質(zhì)纖維展開，暴露更多的DNA結(jié)合位點(diǎn)，有利于轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過程。在一些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過使用組蛋白去乙?；敢种苿?，抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，導(dǎo)致組蛋白H3和H4在11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的乙?；缴撸Y(jié)果發(fā)現(xiàn)11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了組蛋白乙?；瘜?duì)11β-HSD2基因表達(dá)的促進(jìn)作用。組蛋白甲基化則是另一種重要的修飾方式，其修飾位點(diǎn)和修飾程度的不同可以對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生不同的影響。在11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域，組蛋白H3的賴氨酸殘基（如H3K4、H3K9、H3K27等）的甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)密切相關(guān)。一般來說，H3K4的甲基化通常與基因的激活相關(guān)，而H3K9和H3K27的甲基化則多與基因的抑制相關(guān)。H3K4的甲基化能夠招募一些與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的蛋白復(fù)合物，這些復(fù)合物可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，增強(qiáng)RNA聚合酶的活性，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。在11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域，當(dāng)H3K4發(fā)生甲基化修飾時(shí)，11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，其mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。相反，H3K9和H3K27的甲基化會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，形成抑制性的染色質(zhì)環(huán)境，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。在某些病理狀態(tài)下，如妊娠期高血壓疾病患者的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9和H3K27甲基化水平顯著升高，同時(shí)11β-HSD2的表達(dá)水平明顯降低，這表明H3K9和H3K27的甲基化在病理狀態(tài)下對(duì)11β-HSD2基因表達(dá)具有抑制作用。組蛋白修飾通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)11β-HSD2基因的表達(dá)產(chǎn)生重要影響。組蛋白H3和H4的乙?；约癏3K4的甲基化能夠促進(jìn)11β-HSD2基因的表達(dá)，而H3K9和H3K27的甲基化則傾向于抑制其表達(dá)。這些修飾之間相互協(xié)調(diào)、相互影響，共同維持著11β-HSD2基因在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的正常表達(dá)水平，確保胎盤對(duì)糖皮質(zhì)激素的正常代謝和胎兒的健康發(fā)育。4.2.2組蛋白修飾酶在其中的作用組蛋白修飾酶在組蛋白修飾過程中起著核心作用，它們通過催化特定的化學(xué)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)組蛋白的修飾，進(jìn)而調(diào)控11β-HSD2基因的表達(dá)。這些修飾酶主要包括組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）、組蛋白去乙?；福℉DACs）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMTs）和組蛋白去甲基化酶（HDMs）等。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）能夠?qū)⒁阴］o酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白的特定賴氨酸殘基上，從而使組蛋白發(fā)生乙?；揎?。在11β-HSD2基因表達(dá)調(diào)控中，HATs發(fā)揮著促進(jìn)基因表達(dá)的重要作用。HATs家族成員眾多，如p300/CBP相關(guān)因子（PCAF）、p300和CREB結(jié)合蛋白（CBP）等。這些HATs可以被多種信號(hào)通路激活，然后與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)合，催化組蛋白H3和H4的乙?；Ｒ詐300為例，它能夠與一些轉(zhuǎn)錄因子（如RARs、Sp1等）相互作用，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。當(dāng)這些轉(zhuǎn)錄因子與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合時(shí)，p300也被招募到啟動(dòng)子區(qū)域，利用其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，將組蛋白H3和H4的賴氨酸殘基乙?；＿@種乙?；揎検沟萌旧|(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合親和力，促進(jìn)了RNA聚合酶的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始，最終導(dǎo)致11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄水平的升高。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)p300能夠顯著提高11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白H3和H4的乙?；?，同時(shí)上調(diào)11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)；而抑制p300的活性，則會(huì)降低組蛋白乙?；剑瑢?dǎo)致11β-HSD2表達(dá)下降。組蛋白去乙?；福℉DACs）的作用與HATs相反，它們能夠去除組蛋白上的乙?；?，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于緊密，通常與基因的抑制相關(guān)。HDACs家族包括多個(gè)成員，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可分為四類。在11β-HSD2基因表達(dá)調(diào)控中，HDACs通過降低組蛋白的乙?；絹硪种苹蜣D(zhuǎn)錄。一些HDACs可以與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合，形成復(fù)合物，被招募到11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域。在某些情況下，NF-κB激活后，它可以招募HDACs到11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域。HDACs通過去除組蛋白H3和H4上的乙酰基，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，阻礙了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制了RNA聚合酶的活性，從而導(dǎo)致11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄水平下降。使用HDACs抑制劑能夠阻止組蛋白去乙?；?，增加組蛋白乙酰化水平，進(jìn)而上調(diào)11β-HSD2的表達(dá)，這進(jìn)一步證實(shí)了HDACs在抑制11β-HSD2基因表達(dá)中的作用。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMTs）負(fù)責(zé)催化組蛋白的甲基化修飾，它們能夠?qū)⒓谆鶊F(tuán)從S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移到組蛋白的特定氨基酸殘基上。不同的HMTs具有底物特異性，能夠識(shí)別并修飾不同的組蛋白位點(diǎn)。在11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域，一些HMTs參與了組蛋白H3K4、H3K9和H3K27等位點(diǎn)的甲基化修飾。例如，混合譜系白血病蛋白1（MLL1）是一種重要的HMT，它能夠特異性地催化H3K4的甲基化。在11β-HSD2基因表達(dá)調(diào)控中，MLL1可以與一些轉(zhuǎn)錄激活因子相互作用，被招募到11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域。MLL1利用其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，使H3K4發(fā)生甲基化修飾，這種修飾能夠招募與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的蛋白復(fù)合物，促進(jìn)11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄。相反，一些催化H3K9和H3K27甲基化的HMTs，如SUV39H1（主要催化H3K9甲基化）和EZH2（主要催化H3K27甲基化），它們的作用是抑制基因轉(zhuǎn)錄。在某些病理狀態(tài)下，SUV39H1和EZH2的表達(dá)或活性升高，導(dǎo)致11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K9和H3K27甲基化水平增加，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，從而抑制了11β-HSD2基因的表達(dá)。組蛋白去甲基化酶（HDMs）則能夠去除組蛋白上的甲基基團(tuán)，逆轉(zhuǎn)組蛋白甲基化修飾的狀態(tài)。HDMs的發(fā)現(xiàn)使得組蛋白甲基化修飾不再被認(rèn)為是一種不可逆的修飾方式，進(jìn)一步豐富了組蛋白修飾調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制。在11β-HSD2基因表達(dá)調(diào)控中，HDMs可以通過去除抑制性的甲基化修飾（如H3K9和H3K27的甲基化），或者維持激活型的甲基化修飾（如H3K4的甲基化），來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性。賴氨酸特異性去甲基化酶1（LSD1）能夠特異性地去除H3K4的單甲基和二甲基修飾。在某些情況下，LSD1的活性升高可能會(huì)降低11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K4的甲基化水平，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄；而另一些HDMs，如UTX（能夠去除H3K27的甲基化），當(dāng)它的活性增強(qiáng)時(shí)，可以去除11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域H3K27的甲基化修飾，使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白修飾酶通過催化組蛋白的乙?；⑷ヒ阴；?、甲基化和去甲基化等修飾過程，在11β-HSD2基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它們之間相互協(xié)作、相互制約，共同維持著組蛋白修飾的平衡，進(jìn)而調(diào)控11β-HSD2基因在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)，確保胎盤功能的正常發(fā)揮和胎兒的健康發(fā)育。4.3非編碼RNA的調(diào)控作用4.3.1miRNA對(duì)11β-HSD2表達(dá)的影響微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。miRNA通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)mRNA的降解或抑制其翻譯過程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的負(fù)向調(diào)控。在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，多種miRNA參與了11β-HSD2表達(dá)的調(diào)控，它們通過與11β-HSD2mRNA的3'UTR特異性結(jié)合，影響11β-HSD2的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)胎盤對(duì)糖皮質(zhì)激素的代謝功能。以miR-122-5p為例，研究發(fā)現(xiàn)它與11β-HSD2mRNA的3'UTR存在互補(bǔ)配對(duì)序列。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，證實(shí)了miR-122-5p能夠直接結(jié)合到11β-HSD2mRNA的3'UTR上。當(dāng)miR-122-5p與11β-HSD2mRNA結(jié)合后，會(huì)招募RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），其中的核酸內(nèi)切酶Ago2會(huì)對(duì)11β-HSD2mRNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致其降解，從而減少11β-HSD2的mRNA水平。在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系中，過表達(dá)miR-122-5p后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)11β-HSD2的mRNA表達(dá)水平顯著降低，僅為對(duì)照組的0.3倍左右；同時(shí)，通過Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)11β-HSD2的蛋白表達(dá)水平也明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)了miR-122-5p對(duì)11β-HSD2表達(dá)的抑制作用。這種抑制作用在妊娠期高血壓疾病等病理妊娠狀態(tài)下可能更為明顯，研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠期高血壓疾病患者的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，miR-122-5p的表達(dá)水平顯著升高，而11β-HSD2的表達(dá)水平則明顯降低，提示miR-122-5p可能通過抑制11β-HSD2的表達(dá)，參與了妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展過程。除了介導(dǎo)mRNA降解，miRNA還可以通過抑制翻譯過程來調(diào)控11β-HSD2的表達(dá)。以miR-21-5p為例，它同樣能夠與11β-HSD2mRNA的3'UTR結(jié)合。雖然miR-21-5p與11β-HSD2mRNA結(jié)合后不會(huì)導(dǎo)致mRNA的降解，但會(huì)阻礙核糖體在mRNA上的移動(dòng)，抑制蛋白質(zhì)的翻譯起始或延伸過程。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將miR-21-5p模擬物轉(zhuǎn)染到人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11β-HSD2的mRNA水平?jīng)]有明顯變化，但蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明miR-21-5p主要通過抑制翻譯來下調(diào)11β-HSD2的表達(dá)。在正常妊娠和病理妊娠狀態(tài)下，miR-21-5p與11β-HSD2表達(dá)之間的關(guān)系也存在差異。在胎兒生長(zhǎng)受限患者的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，miR-21-5p的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)11β-HSD2的蛋白表達(dá)水平下降，這說明miR-21-5p可能通過抑制11β-HSD2的翻譯，影響胎盤對(duì)糖皮質(zhì)激素的代謝，進(jìn)而導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限等病理妊娠情況的發(fā)生。miRNA在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中通過與11β-HSD2mRNA的3'UTR互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)mRNA的降解或抑制其翻譯過程，從而對(duì)11β-HSD2的表達(dá)發(fā)揮重要的負(fù)向調(diào)控作用。不同的miRNA在正常妊娠和病理妊娠狀態(tài)下對(duì)11β-HSD2表達(dá)的調(diào)控存在差異，深入研究這些miRNA的作用機(jī)制，有助于揭示胎盤功能調(diào)控的分子機(jī)制以及相關(guān)妊娠疾病的發(fā)病機(jī)制，為臨床診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和思路。4.3.2lncRNA與11β-HSD2基因的相互作用長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它們?cè)诨虮磉_(dá)調(diào)控中發(fā)揮著多樣化的作用。在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，一些lncRNA通過與11β-HSD2基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相互作用，參與了11β-HSD2表達(dá)的調(diào)控，在維持胎盤正常功能和胎兒發(fā)育過程中具有重要意義。以lncRNAMEG3為例，它可以與11β-HSD2基因的啟動(dòng)子區(qū)域形成RNA-DNA復(fù)合物。通過染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)（3C）及其衍生技術(shù)（如4C、5C等）研究發(fā)現(xiàn)，MEG3能夠特異性地與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列相互作用。這種相互作用會(huì)影響染色質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，使11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域形成一種更緊密的染色質(zhì)構(gòu)象，從而阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄。在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系中，敲低MEG3的表達(dá)后，11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)11β-HSD2的mRNA表達(dá)量是對(duì)照組的2.5倍左右；同時(shí)，Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示11β-HSD2的蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)，這表明MEG3通過與11β-HSD2基因啟動(dòng)子相互作用，對(duì)11β-HSD2的表達(dá)起到負(fù)向調(diào)控作用。在妊娠期糖尿病患者的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，MEG3的表達(dá)水平顯著升高，而11β-HSD2的表達(dá)水平則明顯降低，提示MEG3可能通過抑制11β-HSD2的表達(dá)，參與了妊娠期糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程，影響胎盤對(duì)糖皮質(zhì)激素的代謝和胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。lncRNA還可以通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用來調(diào)控11β-HSD2基因的表達(dá)。例如，lncRNAH19可以與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合。Sp1是11β-HSD2基因轉(zhuǎn)錄的重要激活因子，它能夠與11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。當(dāng)H19與Sp1結(jié)合后，會(huì)改變Sp1的構(gòu)象或影響其與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子的相互作用，從而抑制Sp1與11β-HSD2基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力。通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）和RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（RIP）等技術(shù)手段證實(shí)，在存在H19的情況下，Sp1與11β-HSD2基因啟動(dòng)子的結(jié)合量明顯減少。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)H19會(huì)導(dǎo)致11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低；而敲低H19的表達(dá)，則會(huì)使11β-HSD2的表達(dá)水平升高，這表明H19通過與Sp1相互作用，間接抑制了11β-HSD2基因的轉(zhuǎn)錄。在正常妊娠和病理妊娠狀態(tài)下，H19與11β-HSD2表達(dá)之間的關(guān)系也有所不同。在子癇前期患者的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中，H19的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)11β-HSD2的表達(dá)水平下降，這說明H19可能通過抑制11β-HSD2的表達(dá)，影響胎盤的功能，參與了子癇前期的發(fā)病機(jī)制。lncRNA在人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中通過與11β-HSD2基因形成RNA-DNA復(fù)合物或與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用等方式，對(duì)11β-HSD2的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。不同的lncRNA在正常妊娠和病理妊娠狀態(tài)下對(duì)11β-HSD2表達(dá)的調(diào)控機(jī)制存在差異，深入研究這些lncRNA的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示胎盤功能調(diào)控的分子機(jī)制以及相關(guān)妊娠疾病的發(fā)病機(jī)制，為臨床防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。4.4表觀遺傳調(diào)控相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究4.4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為了深入探究表觀遺傳調(diào)控對(duì)11β-HSD2表達(dá)的影響，本研究設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且全面的實(shí)驗(yàn)，涵蓋了DNA甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA調(diào)控等多個(gè)方面。在DNA甲基化相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，選用人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系（如BeWo細(xì)胞、JEG-3細(xì)胞）作為研究對(duì)象。為了改變細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化狀態(tài)，采用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-dC）進(jìn)行處理。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滋養(yǎng)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至一定密度后，更換含有不同濃度5-aza-dC（如0μM、5μM、10μM、20μM）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。在處理過程中，設(shè)置空白對(duì)照組，僅加入等量的溶劑（如PBS）。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，提取基因組DNA，運(yùn)用重亞硫酸鹽測(cè)序（BSP）技術(shù)檢測(cè)11β-HSD2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平。同時(shí)，提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot技術(shù)檢測(cè)11β-HSD2的mRNA和蛋白表達(dá)水平，分析DNA甲基化狀態(tài)改變對(duì)11β-HSD2表達(dá)的影響。針對(duì)組蛋白修飾，利用組蛋白修飾酶抑制劑來研究其對(duì)11β-HSD2表達(dá)的調(diào)控作用。對(duì)于組蛋白乙?；揎?，選用組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A（TSA）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)至合適密度后，加入不同濃度的TSA（如0nM、10nM、50nM、100