第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用（一）微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)01能闡明無菌技術(shù)的類型、適用范圍和操作方法。02能概述不同類型培養(yǎng)基的特點及適用場景。03能嘗試完成微生物的純培養(yǎng)實驗的操作。

一些人會在家里自制酸奶。自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導(dǎo)致腸胃不適的事例屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢？防止雜菌污染，獲得純凈的微生物實驗室培養(yǎng)微生物的需要做到？

從社會中來實驗室培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基確保其它微生物無法混入分離需要的微生物無菌技術(shù)純化培養(yǎng)提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件

從社會中來1.培養(yǎng)基的概念和作用（1）概念：

人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，即培養(yǎng)基。（2）培養(yǎng)基的作用：

用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。一、培養(yǎng)基的配制2.培養(yǎng)基分類按物理性質(zhì)液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基瓊脂無動力有動力(彌散)半固體培養(yǎng)基化學(xué)成分來源劃分培養(yǎng)基種類特點用途功能用途劃分含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)分類、鑒定天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基用已知成分的化學(xué)物質(zhì)配制在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進(jìn)所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物培養(yǎng)基中加入能與目的菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的指示劑，用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基【任務(wù)一】

結(jié)合提供的資料和教材中“表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成”，分析培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類和營養(yǎng)構(gòu)成。組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g碳源、磷酸鹽和維生素蛋白胨10g氮源和維生素等NaCl5g無機(jī)鹽H2O定容至1000mL水3.培養(yǎng)基的配制(1)基本成分：碳源、氮源、水、無機(jī)鹽①碳源無機(jī)碳源：有機(jī)碳源：CO2、CO32-、HCO3-葡萄糖等糖類、油/脂肪、石油等自養(yǎng)異養(yǎng)②氮源無機(jī)氮源：有機(jī)氮源：NH4＋、NO3-、硝酸鹽、銨鹽尿素、玉米漿、蛋白胨等③水④無機(jī)鹽：磷酸鹽、Ca、Mg、K、Na、Fe、微量元素等為什么培養(yǎng)基需要氮源？培養(yǎng)基中的氮元素是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的。(2)還需滿足微生物對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣的需求培養(yǎng)乳酸菌需要添加維生素培養(yǎng)霉菌時需將PH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌時將PH調(diào)至中性或微堿性培養(yǎng)厭氧微生物時需要提供無氧條件生長因子:

通常是指微生物自身不能合成或合成量不足，但又是微生物生長和代謝所必需的小分子。

如某些維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。酵母浸粉、牛肉浸膏或植物組織提取液等天然物質(zhì)中含有不同的生長因子。微生物碳源氮源能源藍(lán)細(xì)菌硝化細(xì)菌根瘤菌大腸桿菌CO2NH4＋、NO3-等光能CO2NH3NH3的氧化糖類等有機(jī)物N2有機(jī)物糖類、蛋白質(zhì)等有機(jī)物蛋白質(zhì)等有機(jī)物1.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物培養(yǎng)基的主要差別在于

；2.無機(jī)氮源不但能給自養(yǎng)型微生物提供

，也能作為

，3.含有C、H、O、N的有機(jī)物可作為

微生物的碳源、氮源、能源；碳源氮源能源物質(zhì)異養(yǎng)型完成下面表格并分析：4.常見的細(xì)菌培養(yǎng)基——

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g蛋白胨10gNaCl5gH2O定容至1000mL水1000mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成碳源、氮源、磷酸鹽和維生素等氮源、碳源和維生素等無機(jī)鹽微生物接種操作時為什么要“全副武裝”和在專門的設(shè)備內(nèi)進(jìn)行？二、無菌技術(shù)1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染。2.無菌技術(shù)應(yīng)圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括消毒和滅菌。①消毒課外拓展芽孢：有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫作芽孢。

芽孢壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。孢子：細(xì)菌、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的生殖細(xì)胞。能直接長成新個體。

課外拓展消毒(1)煮沸消毒法針對某些實驗器具、餐具、飲用水等，在100℃下煮沸5~6min，可以殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞和一部分芽孢。(2)巴氏消毒法

62~65℃下煮30min或80~90℃處理30s~1min，適合不耐高溫的液體，如牛奶?？梢詺⑺琅Ｄ讨械慕^大多數(shù)微生物，并且不破壞牛奶的營養(yǎng)成分。(3)化學(xué)藥物消毒法(4)紫外線消毒法

紫外線可以使蛋白質(zhì)變性并損傷生物的DNA。接種室、接種箱或超凈工作臺可用紫外線照射30min。在照射前，適量噴灑石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，加強消毒效果。70％-75%酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等。滅菌(1)濕熱滅菌這是一種利用沸水、流通蒸汽或高壓蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。其中高壓蒸汽滅菌效果最好。實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋，就是以水蒸氣為介質(zhì)在壓力為100kPa、溫度為121℃條件下，維持15~30min來滅菌的。(2)干熱滅菌

將滅菌物品放入密閉容器如干熱滅菌箱，在160~170℃的熱空氣中維持2~3h可以達(dá)到滅菌的目的。耐高溫的和需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（如吸管、培養(yǎng)皿）、金屬用具等，可以采用這種方法滅菌。(3)灼燒滅菌類型理化因素作用強度消滅微生物數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒滅菌

較為溫和強烈部分微生物全部微生物一般不能能1.

比較消毒和滅菌對微生物作用效果的差異2.無菌操作的對象是什么？培養(yǎng)皿接種環(huán)培養(yǎng)基操作的空間、操作者的衣著和手等討

論：1.牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法，與煮沸消毒法相比，這兩種方法的優(yōu)點是什么？在達(dá)到消毒目的的同時，營養(yǎng)物質(zhì)損失較少。2.為什么體積分?jǐn)?shù)為70%～75%的酒精殺菌效果最好？若酒精濃度過高，菌體表面蛋白質(zhì)變性過快而凝固成一層保護(hù)膜，酒精不能滲入其中；若酒精濃度過低，殺菌能力減弱。3.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么作用？無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。想一想：3.防止雜菌污染的措施（1）實驗前：①對操作空間、操作人員消毒；②對所用器皿、接種用具和培養(yǎng)基滅菌。①避免已滅菌處理材料用具與周圍物品接觸造成污染；②為避免周圍微生物污染，實驗操作都應(yīng)在超凈工作臺并在酒精燈火焰旁進(jìn)行。（2）操作時：（3）實驗后：使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。

濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）干熱滅菌灼燒滅菌化學(xué)藥物消毒（酒精）紫外線消毒巴氏消毒法1.以下所采用的滅菌或消毒方法依次是化學(xué)藥物消毒（次氯酸鈉）培養(yǎng)基培養(yǎng)皿接種環(huán)實驗操作者的雙手實驗室牛奶

有活性生物材料平板劃線法

稀釋涂布平板法1.原理：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法能將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)得到的單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。微生物群分散或稀釋單個細(xì)胞單個菌落繁殖2.獲得單菌落的方法：探究

·

實踐：酵母菌的純培養(yǎng)酵母菌菌落：濕潤，粘稠，易挑起，表面光華，比細(xì)菌的菌落大而厚。三、微生物的純培養(yǎng)去皮切塊加水(1000mL)加熱煮沸軟爛馬鈴薯紗布過濾加瓊脂（15～20g）酵母菌培養(yǎng)基加水定容(1000mL)稱取馬鈴薯(200g)馬鈴薯塊濾液加葡萄糖/蔗糖（20g）

調(diào)pH①

②

3.方法步驟：第1步

制備培養(yǎng)基

：配制培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基接種與分離培養(yǎng)培養(yǎng)基——高壓蒸汽滅菌轉(zhuǎn)移滅菌15~30min皮筋勒緊包牛皮紙放入高壓蒸汽滅菌鍋中（100kPa、121℃）酵母菌培養(yǎng)基錐形瓶加棉塞高壓蒸汽滅菌鍋1.避免因水蒸氣凝結(jié)而浸濕棉塞。2.

避免再次污染第2步

滅菌

培養(yǎng)皿——干熱滅菌滅菌2h幾層牛皮紙包緊放入干熱滅菌箱（160～170℃）5～8套培養(yǎng)皿干熱滅菌箱培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。1拔出錐形瓶的棉塞。2將瓶口迅速通過火焰。3用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿（10～20mL），立即蓋上皿蓋。4等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒過來放置。1.防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)。2.防止皿蓋上冷凝水滴落，造成污染。通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。不能完全打開，以免雜菌污染培養(yǎng)基。第3步

倒平板：

（1）培養(yǎng)基滅菌后，需冷卻至50℃左右時才能倒平板，溫度過高會燙手，溫度過低培養(yǎng)基又會凝固。（2）整個操作在酒精燈火焰旁附近進(jìn)行，避免周圍環(huán)境中微生物的污染。（3）平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。（4）倒平板時不要將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間，否則此培養(yǎng)基不能用來培養(yǎng)微生物，因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。（5）將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。【倒平板的注意事項】倒平板注意事項：①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置分離的方法——平板劃線法

通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。經(jīng)過數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到單菌落。連續(xù)劃線法分區(qū)劃線法第4步

接種和分離酵母菌平板劃線法的具體操作1將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)的金屬絲燒紅。2在火焰旁冷卻接種環(huán)。同時，拔出裝有酵母菌培養(yǎng)液的試管的棉塞。將試管口通過火焰。34在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液。防止溫度太高殺死菌種。5將試管口通過火焰，并塞上棉塞。在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，用接種環(huán)在培養(yǎng)基表面基表面迅速劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。6

灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復(fù)以上操作，作第三、四、五次劃線。注意不要將最后一次的劃線與第一次的劃線相連。7將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。1.劃五次線，接種環(huán)需要灼燒幾次？12345第1次劃線接種環(huán)滅菌第2次劃線接種環(huán)滅菌第3次劃線接種前接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌第4次劃線接種環(huán)滅菌第5次劃線接種環(huán)滅菌需要灼燒6次?！舅伎寂c討論】2.為什么每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？第一次劃線前：殺死接種環(huán)上的微生物，避免污染培養(yǎng)物。第二次及以后劃線前：殺死上次劃線時殘留菌種，保證每次劃線菌種來自上次劃線末端。3.劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？殺死殘留菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者。4.第二次及以后的劃線時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？5.為什么不能將最后一次的劃線與第一次的劃線相連？將聚集的菌種逐步稀釋，以便獲得單菌落。線條末端酵母菌的數(shù)目比起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使酵母菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到單菌落。菌種經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，分離得到單菌落。第一次劃線酵母菌數(shù)量多，最后一次劃線酵母菌數(shù)量少，首尾相連，不容易得到單個菌落。第5步

培養(yǎng)酵母菌

完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h。

在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。警示對照：說明培養(yǎng)基是否被雜菌污染。

未接種的培養(yǎng)基是不能有菌生長的，如果有菌生長，則說明受到污染或者滅菌不徹底。

正確的做法是，配好培養(yǎng)基之后，將培養(yǎng)基放在溫箱里