Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株增殖與凋亡影響的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1惡性膠質瘤的現(xiàn)狀惡性膠質瘤是一種嚴重威脅人類生命的腦部腫瘤，具有高侵襲性、耐藥性、抗放療性、早期轉移以及原位復發(fā)等特性。這些特性使得大部分患者的生存期極短，通常只有1年左右。由于腫瘤呈浸潤性生長，與正常腦組織界限模糊，手術難以完全切除。隨著腫瘤不斷增大，會壓迫和侵犯周圍腦組織，導致患者出現(xiàn)頭痛、惡心、嘔吐等癥狀，嚴重時甚至引發(fā)腦疝，危及生命。其惡性程度較高，易于復發(fā)和轉移，根據(jù)病理分級，高級別的膠質瘤惡性程度更高，預后更差，即使經過手術和放化療等綜合治療，患者仍面臨較高的復發(fā)風險，對患者的生活質量和生命安全構成了極大的威脅。目前的治療手段，如手術切除、放療和化療等，雖能在一定程度上緩解病情，但總體療效并不理想，因此，迫切需要尋找新的治療方法和靶點，以提高患者的生存率和生活質量。1.1.2γ-分泌酶抑制劑的研究背景γ-分泌酶是一種由多個亞基組成的高分子量蛋白酶復合物，其確切組成仍不完全清楚，但主要由早老素（Presenilin）、尼卡斯特林（Nicastrin）、APH-1和PEN-2四種蛋白組成。γ-分泌酶在多種生理和病理過程中發(fā)揮著關鍵作用，尤其是在Notch信號通路的激活過程中扮演著重要角色。Notch信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中起著關鍵的調控作用，該通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，包括惡性膠質瘤。在惡性膠質瘤中，Notch信號通路的異常激活可能是導致腫瘤發(fā)生的重要因素之一。近年來，以γ-分泌酶為靶點的抑制劑成為了腫瘤治療研究的熱點。γ-分泌酶抑制劑（GSIs）可以通過抑制γ-分泌酶的活性，進而抑制Notch信號通路的激活，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。目前，已有多種γ-分泌酶抑制劑進入臨床試驗階段，但不同的抑制劑在臨床試驗中的表現(xiàn)各異。一些抑制劑因效果不佳而被迫終止試驗，而另一些仍在繼續(xù)研究中。其中，Nirogacestat已被FDA批準用于治療特定類型的腫瘤，這表明γ-分泌酶抑制劑在腫瘤治療中具有一定的潛力。然而，關于γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株的作用機制及效果，仍有許多未知之處，需要進一步深入研究。Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作為γ-分泌酶抑制劑的一種，在抑制γ-分泌酶活性方面具有獨特的作用方式。目前，針對Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株的研究相對較少，尤其是在細胞增殖、凋亡以及相關分子機制方面的研究還不夠深入。深入探究Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株的作用，對于揭示其在惡性膠質瘤治療中的潛在價值具有重要意義。1.1.3研究意義本研究旨在探討Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株的增殖及凋亡的影響，具有重要的理論和實際意義。從理論方面來看，通過研究Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株的作用機制，可以進一步加深我們對γ-分泌酶在惡性膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中作用的理解，豐富Notch信號通路與腫瘤關系的理論知識，為后續(xù)相關研究提供新的思路和理論基礎。從實際應用角度出發(fā)，目前惡性膠質瘤的治療面臨著諸多困境，患者的預后較差。本研究的結果可能為惡性膠質瘤的治療提供新的靶點和治療策略。如果Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠有效抑制惡性膠質瘤細胞株的增殖并誘導其凋亡，那么它有可能成為一種新的治療藥物或輔助治療手段，為改善惡性膠質瘤患者的治療效果和生存質量提供實驗依據(jù)和臨床應用前景，具有潛在的社會和經濟效益。1.2研究目的與內容1.2.1研究目的本研究旨在深入探究Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株增殖及凋亡的影響，并初步探討其作用機制。具體而言，通過體外實驗，觀察不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用于惡性膠質瘤細胞株后，細胞增殖能力和凋亡情況的變化，明確Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑是否能夠有效抑制惡性膠質瘤細胞株的增殖并誘導其凋亡；運用分子生物學技術，檢測Notch信號通路相關蛋白和基因的表達變化，初步闡明Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑影響惡性膠質瘤細胞株增殖及凋亡的潛在分子機制，為惡性膠質瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。1.2.2研究內容細胞培養(yǎng)：選擇人惡性膠質瘤細胞株U251作為研究對象，在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。定期觀察細胞的生長狀態(tài)，待細胞生長至對數(shù)生長期時，用于后續(xù)實驗。通過細胞培養(yǎng)，獲得足夠數(shù)量且狀態(tài)良好的惡性膠質瘤細胞，為后續(xù)各項實驗的順利開展提供細胞來源。細胞增殖實驗：采用MTT法和克隆形成實驗檢測不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞增殖的影響。將處于對數(shù)生長期的U251細胞以適當密度接種于96孔板和6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度（如0、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L等）的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑，每個濃度設置多個復孔。同時設置對照組，加入等量的溶劑（如DMSO）。分別在作用24h、48h、72h后，進行MTT檢測，在酶標儀上測定490nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線，分析細胞增殖情況。對于克隆形成實驗，在藥物作用一定時間后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待形成肉眼可見的細胞克隆時，終止培養(yǎng)，固定并染色，計數(shù)克隆形成數(shù)，計算克隆形成率。預期結果為隨著Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑濃度的增加和作用時間的延長，U251細胞的增殖受到顯著抑制，細胞生長曲線變平緩，克隆形成率降低，且呈現(xiàn)出明顯的劑量-時間依賴性。細胞凋亡實驗：運用細胞凋亡檢測試劑盒和AnnexinV-FITC/PI雙染實驗檢測Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞凋亡的影響。將U251細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑進行處理。作用一定時間后，收集細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。對于AnnexinV-FITC/PI雙染實驗，將處理后的細胞用AnnexinV-FITC和PI進行染色，然后通過流式細胞儀分析細胞凋亡情況，區(qū)分早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞。預期結果是Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠誘導U251細胞凋亡，隨著抑制劑濃度的升高，細胞凋亡率顯著增加，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例均明顯上升。機制研究：利用Westernblot和real-timePCR技術，檢測Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對Notch信號通路相關蛋白和基因表達的影響。將U251細胞經不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理后，提取細胞總蛋白和總RNA。通過Westernblot檢測Notch1、Notch2、Hes1等Notch信號通路關鍵蛋白的表達水平變化，以β-actin作為內參蛋白，確保實驗結果的準確性。運用real-timePCR檢測上述相關基因的mRNA表達水平，以GAPDH作為內參基因。預期結果為Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理后，Notch信號通路相關蛋白和基因的表達水平顯著下調，表明Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑可能通過抑制Notch信號通路的激活，進而影響惡性膠質瘤細胞株的增殖和凋亡。1.3研究方法與技術路線1.3.1研究方法細胞培養(yǎng)技術：選擇人惡性膠質瘤細胞株U251，在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。定期使用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)、生長密度和貼壁情況等生長狀態(tài)。當細胞生長至對數(shù)生長期時，采用胰蛋白酶消化法進行傳代培養(yǎng)，以維持細胞的活性和生長能力，為后續(xù)實驗提供充足且狀態(tài)良好的細胞來源。該技術是整個研究的基礎，保證了實驗細胞的質量和數(shù)量，為后續(xù)各項實驗的順利開展提供了前提條件。MTT法：將處于對數(shù)生長期的U251細胞以每孔5×103-1×10?個細胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100-200μl。待細胞貼壁后，分別加入不同濃度（如0、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L等）的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑，每個濃度設置5-8個復孔。同時設置對照組，加入等量的溶劑（如DMSO）。分別在作用24h、48h、72h后，每孔加入20μl的MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4h。然后吸出上清液，每孔加入150μl的DMSO，振蕩10-15min，使結晶充分溶解。在酶標儀上測定490nm處的吸光度值，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線，分析細胞增殖情況。MTT法是一種廣泛應用的檢測細胞增殖和活力的方法，通過檢測細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的活性來反映細胞的增殖狀態(tài)，具有操作簡單、靈敏度較高、重復性好等優(yōu)點，能夠直觀地反映出不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞增殖的影響。克隆形成實驗：將U251細胞以每孔300-500個細胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2-3ml。待細胞貼壁后，加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑進行處理，同時設置對照組。在藥物作用48-72h后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當形成肉眼可見的細胞克隆時，終止培養(yǎng)。用PBS清洗細胞2-3次，加入4%多聚甲醛固定15-20min，然后用結晶紫染色10-15min。最后用清水沖洗，晾干后計數(shù)克隆形成數(shù)（≥50個細胞的細胞團計為一個克?。?，計算克隆形成率（克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%）?？寺⌒纬蓪嶒災軌蚍从臣毎拈L期增殖能力和克隆形成能力，是評估細胞增殖的重要方法之一，對于研究Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞增殖的長期影響具有重要意義。細胞凋亡檢測試劑盒和AnnexinV-FITC/PI雙染實驗：將U251細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?-2×10?個細胞，待細胞貼壁后，加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑進行處理。作用一定時間后，收集細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行操作。對于AnnexinV-FITC/PI雙染實驗，將處理后的細胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集細胞，用PBS清洗2-3次，然后加入BindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×10?個/ml。取100μl細胞懸液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15-20min。最后加入400μlBindingBuffer，在1h內采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，區(qū)分早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）。這兩種方法能夠準確地檢測細胞凋亡情況，從不同角度反映Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞凋亡的誘導作用，為研究其抗腫瘤機制提供重要依據(jù)。Westernblot技術：將U251細胞經不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理后，用預冷的PBS清洗細胞2-3次，然后加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30-60min。收集裂解液，12000rpm離心15-20min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5-10min。然后進行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1-2h，加入一抗（如抗Notch1、Notch2、Hes1、β-actin抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST清洗膜3-4次，每次10-15min，加入相應的二抗，室溫孵育1-2h。再次用TBST清洗膜3-4次，然后用ECL發(fā)光液顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析蛋白表達水平變化。Westernblot技術能夠特異性地檢測蛋白質的表達水平，通過檢測Notch信號通路相關蛋白的表達變化，有助于深入了解Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對該信號通路的影響，從而初步闡明其作用機制。real-timePCR技術：將U251細胞經不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理后，使用Trizol試劑提取細胞總RNA。按照逆轉錄試劑盒的說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料進行real-timePCR擴增。引物設計根據(jù)GenBank中Notch1、Notch2、Hes1、GAPDH等基因的序列，利用引物設計軟件進行設計。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，反應條件為95℃預變性3-5min，然后95℃變性10-15s，60℃退火和延伸30-40s，共進行40個循環(huán)。以GAPDH作為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。real-timePCR技術具有靈敏度高、特異性強、定量準確等優(yōu)點，能夠快速、準確地檢測基因的表達水平，從基因層面探究Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對Notch信號通路的影響，與Westernblot技術相互驗證，進一步揭示其作用機制。1.3.2技術路線本研究的技術路線如圖1所示：細胞培養(yǎng)：復蘇人惡性膠質瘤細胞株U251，在含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，傳代并觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞生長至對數(shù)生長期備用。藥物處理：將對數(shù)生長期的U251細胞接種于96孔板、6孔板等，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑，同時設置對照組（加入等量溶劑）。細胞增殖實驗：MTT法：在藥物作用24h、48h、72h后，加入MTT溶液，繼續(xù)孵育后加入DMSO溶解結晶，酶標儀測定490nm處吸光度值，繪制細胞生長曲線?？寺⌒纬蓪嶒灒核幬镒饔靡欢〞r間后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待形成細胞克隆后，固定、染色并計數(shù)克隆形成數(shù)，計算克隆形成率。細胞凋亡實驗：細胞凋亡檢測試劑盒：藥物處理后的細胞按照試劑盒說明書操作，檢測細胞凋亡情況。AnnexinV-FITC/PI雙染實驗：收集藥物處理后的細胞，用AnnexinV-FITC和PI染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，區(qū)分早期凋亡和晚期凋亡細胞。機制研究：Westernblot：提取藥物處理后細胞的總蛋白，測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗和二抗孵育，ECL發(fā)光液顯色，分析Notch信號通路相關蛋白表達變化。real-timePCR：提取藥物處理后細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA，進行real-timePCR擴增，以GAPDH為內參基因，計算目的基因相對表達量，分析Notch信號通路相關基因表達變化。結果分析：對各項實驗結果進行統(tǒng)計學分析，采用GraphPadPrism等軟件繪制圖表，分析Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株增殖及凋亡的影響，并探討其作用機制。[此處插入技術路線圖]通過以上技術路線，本研究能夠系統(tǒng)地探究Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株的作用，從細胞增殖、凋亡以及分子機制等多個層面進行深入研究，為惡性膠質瘤的治療提供有價值的實驗依據(jù)和理論支持。二、惡性膠質瘤與γ-分泌酶相關理論基礎2.1惡性膠質瘤概述2.1.1惡性膠質瘤的定義與分類惡性膠質瘤是一類起源于神經膠質細胞的高度惡性腫瘤，在中樞神經系統(tǒng)腫瘤中占據(jù)重要地位。神經膠質細胞是神經系統(tǒng)的支持細胞，包括星形膠質細胞、少突膠質細胞、室管膜細胞等，當這些細胞發(fā)生惡變時，便形成了惡性膠質瘤。其發(fā)病機制目前尚未完全明確，但普遍認為與多種遺傳因素、環(huán)境因素以及細胞信號通路的異常激活有關。按照世界衛(wèi)生組織（WHO）分級系統(tǒng)，惡性膠質瘤可分為不同等級，具體分類如下：WHOⅢ級：如間變性星形細胞瘤、間變性少枝膠質細胞瘤等。間變性星形細胞瘤由星形細胞構成，細胞具有明顯的異型性，核分裂象易見，腫瘤細胞生長活躍，具有較強的侵襲性，可侵犯周圍腦組織，患者預后相對較差。間變性少枝膠質細胞瘤則由少枝膠質細胞惡變而來，腫瘤細胞形態(tài)多樣，可見核異型性和有絲分裂象，常伴有微血管增生，其惡性程度也較高，治療后復發(fā)率較高。WHOⅣ級：膠質母細胞瘤最為常見且惡性程度最高。膠質母細胞瘤具有高度的侵襲性和異質性，腫瘤細胞形態(tài)多樣，大小不一，核分裂象多見，常伴有壞死和微血管增生。腫瘤組織內可見多個瘤細胞密集區(qū)，呈“假柵欄狀”排列圍繞壞死區(qū)，這是其典型的病理特征之一。該類型腫瘤生長迅速，對周圍腦組織的破壞嚴重，患者的中位生存期較短，即使經過積極的綜合治療，預后仍然極差。這些不同分級的惡性膠質瘤在生物學行為、治療反應和預后等方面存在顯著差異。分級越高，腫瘤的惡性程度越高，治療難度越大，患者的生存期越短。準確的分級對于制定合理的治療方案和評估患者的預后具有重要意義。2.1.2惡性膠質瘤細胞株的特點惡性膠質瘤細胞株具有一系列獨特的生物學特點，這些特點使其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療過程中表現(xiàn)出與正常細胞截然不同的行為。生長迅速：惡性膠質瘤細胞株的增殖速度遠遠高于正常神經膠質細胞。其細胞周期明顯縮短，細胞能夠快速進行DNA復制和有絲分裂，從而導致腫瘤細胞數(shù)量迅速增加。研究表明，惡性膠質瘤細胞株在適宜的培養(yǎng)條件下，其倍增時間可短至24-48小時，相比之下，正常神經膠質細胞的倍增時間則較長。這種快速的生長速度使得腫瘤能夠在短時間內形成較大的腫塊，對周圍腦組織產生壓迫和侵犯。邊界不清：與正常組織之間沒有明顯的界限，惡性膠質瘤細胞株具有較強的浸潤性，能夠向周圍正常腦組織中滲透生長。腫瘤細胞通過分泌多種蛋白酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等，降解細胞外基質，破壞正常組織的結構，從而實現(xiàn)其侵襲和擴散。在影像學檢查中，?？梢姁盒阅z質瘤的邊界模糊，難以準確界定腫瘤的范圍，這給手術切除帶來了極大的困難，容易導致腫瘤殘留，增加復發(fā)風險。侵襲性強：除了向周圍腦組織浸潤生長外，惡性膠質瘤細胞株還具有較強的遠處轉移能力。盡管中樞神經系統(tǒng)內的腫瘤轉移相對較少見，但惡性膠質瘤細胞仍可通過腦脊液循環(huán)等途徑，在顱內或脊髓內發(fā)生播散轉移，甚至有極少數(shù)病例可發(fā)生顱外轉移。其侵襲性強的特點與多種分子機制有關，如腫瘤細胞表面的黏附分子表達異常、信號通路的激活等，這些因素促進了腫瘤細胞的遷移和侵襲。分化差：惡性膠質瘤細胞株的分化程度較低，細胞形態(tài)和功能與正常神經膠質細胞存在較大差異。腫瘤細胞的分化程度越低，其惡性程度越高，對化療和放療的敏感性也相對較低。在顯微鏡下觀察，惡性膠質瘤細胞株的形態(tài)多樣，大小不一，細胞核大且形態(tài)不規(guī)則，染色質濃聚，核仁明顯，細胞質較少，缺乏正常神經膠質細胞的典型形態(tài)和結構特征。這種分化差的特點使得腫瘤細胞喪失了正常細胞的功能，無法維持神經系統(tǒng)的正常生理活動，同時也增加了腫瘤的治療難度。2.1.3惡性膠質瘤的治療現(xiàn)狀目前，惡性膠質瘤的治療主要包括手術、放療和化療等手段，但這些傳統(tǒng)治療方法均存在一定的局限性。手術治療：手術切除是惡性膠質瘤的主要治療方法之一，其目的是盡可能地切除腫瘤組織，減輕腫瘤對周圍腦組織的壓迫，緩解癥狀，并為后續(xù)的放化療創(chuàng)造條件。然而，由于惡性膠質瘤具有浸潤性生長的特點，與正常腦組織邊界不清，手術難以完全切除腫瘤。即使在術中借助先進的神經導航、術中磁共振等技術，也難以避免腫瘤細胞的殘留。對于一些位于重要功能區(qū)的腫瘤，為了保護神經功能，手術切除范圍更是受到限制，這進一步增加了腫瘤復發(fā)的風險。據(jù)統(tǒng)計，惡性膠質瘤患者術后復發(fā)率高達80%以上。放療：放療是利用高能射線殺死腫瘤細胞的一種治療方法，通常在手術后進行，以殺滅殘留的腫瘤細胞，降低復發(fā)風險。放療雖然能夠在一定程度上抑制腫瘤生長，但由于惡性膠質瘤細胞對放療的敏感性存在差異，部分腫瘤細胞對放療具有抗性，導致放療效果有限。而且，放療在殺死腫瘤細胞的同時，也會對周圍正常腦組織造成一定的損傷，引起放射性腦水腫、放射性腦壞死等并發(fā)癥，影響患者的生活質量和神經功能。長期放療還可能導致認知功能障礙、內分泌紊亂等遠期不良反應。化療：化療是通過使用化學藥物來殺死腫瘤細胞或抑制其生長的治療方法。目前臨床上常用的化療藥物如替莫唑胺等，在治療惡性膠質瘤方面取得了一定的療效，但總體效果仍不盡人意。一方面，惡性膠質瘤細胞容易對化療藥物產生耐藥性，使得化療藥物的療效逐漸降低。另一方面，化療藥物的副作用較大，如骨髓抑制、胃腸道反應、肝腎功能損害等，這些副作用限制了化療藥物的使用劑量和療程，影響了治療效果，也給患者帶來了極大的痛苦。綜上所述，當前惡性膠質瘤的治療面臨著諸多挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療方法的局限性使得患者的預后仍然較差。因此，迫切需要尋找新的治療方法和靶點，以提高惡性膠質瘤的治療效果，改善患者的生存質量和預后。2.2γ-分泌酶及其抑制劑2.2.1γ-分泌酶的結構與功能γ-分泌酶是一種具有獨特結構和重要功能的蛋白酶復合物，在細胞的生理和病理過程中發(fā)揮著關鍵作用。它由多個亞基組成，確切組成雖不完全清楚，但主要由早老素（Presenilin）、尼卡斯特林（Nicastrin）、APH-1和PEN-2四種蛋白構成。早老素是γ-分泌酶的催化亞單位，被認為是γ-分泌酶活性的核心組成部分，具有天冬氨酸蛋白酶活性，其結構中的兩個天冬氨酸殘基對于酶的催化功能至關重要，能夠催化底物的水解反應。尼卡斯特林可能在穩(wěn)定蛋白酶復合物和調控細胞內蛋白質運輸中發(fā)揮作用，它通過與早老素的跨膜區(qū)域結合，參與維持蛋白酶復合物的穩(wěn)定性，同時可能在底物識別和引導底物進入催化位點等方面具有一定功能。APH-1通過與早老素的相互作用參與γ-分泌酶復合物的形成，它可能在調節(jié)γ-分泌酶的活性和穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，并且對于維持復合物的正確構象也具有一定意義。PEN-2是蛋白水解作用所必需的，它通過一個保守的Ⅱ螺旋相互作用的堿基序列結合到該蛋白酶復合物上，主要協(xié)助一系列的早熟成份的起動，對γ-分泌酶的功能發(fā)揮起著不可或缺的輔助作用。γ-分泌酶的主要功能之一是參與Notch信號通路的激活。Notch信號通路是一條在進化上高度保守的信號傳導途徑，在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中起著關鍵的調控作用。該通路的激活始于Notch受體與配體的結合，隨后Notch受體經歷一系列的蛋白水解過程。γ-分泌酶在其中發(fā)揮著重要作用，它能夠對Notch受體進行切割，釋放出具有活性的Notch細胞內結構域（NICD）。NICD進入細胞核后，與相關轉錄因子結合，調節(jié)下游基因的表達，從而影響細胞的生物學行為。在正常生理狀態(tài)下，Notch信號通路的激活受到嚴格調控，以維持細胞的正常生理功能。然而，在多種腫瘤中，包括惡性膠質瘤，Notch信號通路常常發(fā)生異常激活。異常激活的Notch信號通路會導致腫瘤細胞的增殖失控、凋亡受阻、侵襲和轉移能力增強等，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，γ-分泌酶作為Notch信號通路激活過程中的關鍵蛋白酶，成為了腫瘤治療研究的重要靶點。2.2.2γ-分泌酶抑制劑的作用原理γ-分泌酶抑制劑（GSIs）的作用原理主要是通過抑制γ-分泌酶的活性，進而阻斷Notch信號通路的激活，最終影響細胞的增殖和凋亡等生物學過程。γ-分泌酶在Notch信號通路中起著關鍵的切割作用，當γ-分泌酶抑制劑與γ-分泌酶結合后，會改變γ-分泌酶的結構或活性位點，使其無法正常對Notch受體進行切割。具體來說，γ-分泌酶抑制劑可以與γ-分泌酶的催化亞基早老素結合，干擾早老素的天冬氨酸蛋白酶活性，阻止其對Notch受體的水解作用。由于γ-分泌酶無法切割Notch受體，Notch細胞內結構域（NICD）就不能被釋放出來，也就無法進入細胞核與相關轉錄因子結合。這使得Notch信號通路下游基因的表達無法被激活，從而阻斷了Notch信號通路的傳導。在腫瘤細胞中，異常激活的Notch信號通路會促進細胞的增殖和抑制細胞凋亡。通過使用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路，能夠抑制腫瘤細胞的增殖能力。一方面，Notch信號通路的阻斷會影響細胞周期相關蛋白的表達，使腫瘤細胞停滯在細胞周期的特定階段，無法順利進行DNA復制和有絲分裂，從而抑制細胞的增殖。另一方面，γ-分泌酶抑制劑還可以誘導腫瘤細胞凋亡。Notch信號通路的異常激活通常會上調一些抗凋亡蛋白的表達，如Bcl-2等，而下調促凋亡蛋白的表達。γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路后，會改變這些凋亡相關蛋白的表達水平，使促凋亡蛋白的表達增加，抗凋亡蛋白的表達降低，從而打破細胞內的凋亡平衡，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。此外，γ-分泌酶抑制劑還可能通過影響腫瘤細胞的侵襲和轉移相關分子的表達，來抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。在惡性膠質瘤中，Notch信號通路的激活與腫瘤細胞的侵襲和轉移密切相關，γ-分泌酶抑制劑阻斷該信號通路后，可能會降低腫瘤細胞表面的黏附分子、基質金屬蛋白酶等侵襲和轉移相關分子的表達，從而減少腫瘤細胞對周圍組織的浸潤和擴散。2.2.3Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑的研究進展Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作為γ-分泌酶抑制劑的重要類型，在惡性膠質瘤及其他癌癥的研究中取得了一定的進展。在惡性膠質瘤研究方面，已有部分研究表明Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞具有抑制作用。例如，有研究使用Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理人惡性膠質瘤細胞株，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制細胞的增殖能力，使細胞生長速度減緩。通過細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，藥物處理后細胞周期相關蛋白的表達發(fā)生改變，細胞被阻滯在G0/G1期或G2/M期，從而影響了細胞的正常分裂和增殖。同時，該抑制劑還能夠誘導惡性膠質瘤細胞凋亡，增加細胞凋亡率，這可能與它阻斷Notch信號通路，進而調節(jié)凋亡相關蛋白的表達有關。在體內實驗中，將人惡性膠質瘤細胞接種到裸鼠體內，然后給予Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑進行治療，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長受到明顯抑制，腫瘤體積減小，表明Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑在體內也具有一定的抗腫瘤效果。在其他癌癥研究中，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑同樣展現(xiàn)出了潛在的治療價值。在乳腺癌研究中，部分Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力，誘導細胞凋亡，并且能夠降低乳腺癌細胞的耐藥性，增強化療藥物的敏感性。在肺癌研究中，一些Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑可以抑制肺癌細胞的生長，通過調節(jié)相關信號通路，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的發(fā)展。然而，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑在研究和應用中也存在一些不足之處。一方面，其選擇性相對較低，在抑制γ-分泌酶活性的同時，可能會對其他正常細胞的生理功能產生影響，導致一些不良反應的發(fā)生。例如，γ-分泌酶不僅參與Notch信號通路，還與其他一些生理過程相關，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑的非特異性抑制可能會干擾這些正常生理過程。另一方面，腫瘤細胞可能會對Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑產生耐藥性。隨著藥物的持續(xù)使用，部分腫瘤細胞會通過基因突變、信號通路的代償性激活等機制，逐漸適應藥物的作用，降低對藥物的敏感性，從而影響治療效果。此外，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑的藥代動力學性質也有待進一步優(yōu)化，以提高藥物的生物利用度和療效。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞株本實驗選用人惡性膠質瘤細胞株U251，其購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。U251細胞株具有較強的增殖能力和侵襲性，能夠在體外穩(wěn)定生長，是研究惡性膠質瘤的常用細胞株之一。該細胞株來源于人腦膠質母細胞瘤患者的腫瘤組織，經原代培養(yǎng)和多次傳代后建立。在形態(tài)學上，U251細胞呈梭形或多邊形，貼壁生長，具有惡性膠質瘤細胞的典型特征。其生長迅速，倍增時間短，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠快速增殖形成細胞集落。而且，U251細胞對多種刺激因素較為敏感，在研究腫瘤細胞的生物學行為和藥物作用機制等方面具有重要的應用價值。3.1.2主要試劑Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑：購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，貨號為S21132。該抑制劑為粉末狀，使用時需用DMSO溶解配制成儲存液，儲存于-20℃冰箱備用。細胞培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基（高糖型）購自Gibco公司，其含有豐富的氨基酸、維生素、礦物質等營養(yǎng)成分，能夠滿足U251細胞生長的需求。每瓶500ml，使用時需添加10%胎牛血清（FBS，購自杭州四季青生物工程材料有限公司）和1%雙抗（青霉素和鏈霉素混合液，購自Solarbio公司），以提供細胞生長所需的營養(yǎng)和防止細菌污染。MTT試劑：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）購自Sigma公司，為黃色粉末。用PBS配制成5mg/ml的儲存液，經0.22μm濾膜過濾除菌后，儲存于4℃冰箱避光保存。MTT是一種檢測細胞存活和生長的試劑，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，通過酶標儀測定甲瓚的吸光度值，可間接反映活細胞數(shù)量。細胞凋亡檢測試劑盒：AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，貨號為CA1020。該試劑盒利用AnnexinV對PS（磷脂酰絲氨酸）的高度親和力以及PI能夠對壞死細胞和晚期凋亡細胞的核酸進行染色的特性，通過流式細胞儀檢測，可區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，從而準確檢測細胞凋亡情況。RNA提取試劑：Trizol試劑購自Invitrogen公司，每瓶100ml。Trizol試劑能夠快速裂解細胞并有效抑制RNA酶的活性，可用于從細胞中提取總RNA，為后續(xù)的real-timePCR實驗提供高質量的RNA模板。逆轉錄試劑盒：PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）購自TaKaRa公司，該試劑盒可將提取的總RNA逆轉錄為cDNA，用于real-timePCR擴增。其具有高效去除基因組DNA污染、逆轉錄效率高、產物穩(wěn)定性好等優(yōu)點，能夠確保逆轉錄過程的準確性和可靠性。PCR試劑：SYBRGreenMasterMix購自Roche公司，用于real-timePCR擴增。該試劑含有熱啟動TaqDNA聚合酶、dNTPs、SYBRGreen熒光染料等成分，能夠在PCR反應過程中實時監(jiān)測DNA擴增情況，通過檢測熒光信號的強度來定量分析目的基因的表達水平。抗體：抗Notch1、Notch2、Hes1、β-actin抗體均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體特異性強，能夠準確識別相應的蛋白質，用于Westernblot實驗檢測蛋白表達水平。其中，β-actin作為內參蛋白抗體，用于校正上樣量的差異，確保實驗結果的準確性。二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，可與一抗特異性結合，通過化學發(fā)光法檢測目的蛋白的表達。3.1.3實驗儀器細胞培養(yǎng)箱：型號為ThermoScientificHeracellVIOS160i，購自賽默飛世爾科技公司。該培養(yǎng)箱能夠提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%）環(huán)境，滿足細胞生長的條件要求，保證細胞在適宜的環(huán)境中生長和增殖。酶標儀：型號為Bio-TekELx808，購自美國伯騰儀器有限公司。主要用于MTT實驗中測定490nm處的吸光度值，通過檢測MTT還原產物甲瓚的吸光度，間接反映細胞的增殖情況。其具有高精度、高靈敏度和快速檢測的特點，能夠準確讀取實驗數(shù)據(jù)，為細胞增殖實驗提供可靠的檢測手段。流式細胞儀：型號為BDFACSCantoII，購自美國BD公司。在細胞凋亡實驗中，用于檢測AnnexinV-FITC/PI雙染后的細胞凋亡率，能夠對細胞的物理和化學特性進行多參數(shù)分析，區(qū)分不同凋亡狀態(tài)的細胞群體，從而準確評估細胞凋亡情況。該儀器具有檢測速度快、分析精度高、數(shù)據(jù)處理能力強等優(yōu)點，是細胞凋亡檢測的重要工具。PCR儀：型號為Bio-RadCFX96Touch，購自伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司。用于real-timePCR實驗，能夠精確控制反應溫度和時間，實現(xiàn)對目的基因的擴增和定量分析。其具備快速升降溫、溫度均一性好、熒光檢測靈敏度高等特點，可保證PCR反應的高效性和準確性，為基因表達分析提供可靠的技術支持。凝膠成像系統(tǒng)：型號為Bio-RadChemiDocXRS+，購自伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司。在Westernblot實驗中，用于檢測ECL發(fā)光液顯色后的蛋白條帶，通過對蛋白條帶的成像和分析，能夠直觀地反映目的蛋白的表達水平變化。該系統(tǒng)具有高分辨率、高靈敏度、操作簡便等優(yōu)點，能夠清晰地顯示蛋白條帶，為蛋白表達檢測提供準確的結果分析。離心機：型號為Eppendorf5424R，購自艾本德（中國）有限公司。用于細胞和蛋白樣品的離心分離，如在細胞培養(yǎng)過程中收集細胞、提取蛋白時分離細胞裂解物等。其具有轉速范圍廣、離心力大、溫度可控等特點，能夠滿足不同實驗對離心條件的要求，保證樣品的分離效果。移液器：包括10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl等不同量程的移液器，均購自吉爾森（上海）國際貿易有限公司。在實驗過程中，用于準確移取各種試劑和樣品，保證實驗操作的準確性和重復性。移液器具有精度高、操作舒適、易于校準等優(yōu)點，是實驗室常用的移液工具。電子天平：型號為SartoriusCPA225D，購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。用于稱量試劑，如MTT、細胞培養(yǎng)基中的添加劑等，確保試劑用量的準確性。該天平具有高精度、穩(wěn)定性好、操作簡便等特點，能夠滿足實驗對試劑稱量的要求。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)將人惡性膠質瘤細胞株U251從液氮中取出，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍，期間不斷輕輕搖晃凍存管，使細胞懸液快速融化。將解凍后的細胞懸液轉移至含有5ml完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%雙抗）的15ml離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞。將細胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)過程中，每天使用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度和貼壁情況等。當細胞生長至對數(shù)生長期，且密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。具體傳代步驟如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。加入1-2ml0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，期間在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況。當細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速將培養(yǎng)瓶拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細胞完全脫落，然后加入5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞充分分散成單細胞懸液，將細胞懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入適量完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:2-1:3的比例將細胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中，補足培養(yǎng)基至5-6ml，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。細胞計數(shù)時，取適量細胞懸液與等體積的0.4%臺盼藍溶液混合，輕輕混勻，使細胞充分染色。將染色后的細胞懸液滴加到血細胞計數(shù)板的計數(shù)池中，注意不要產生氣泡，然后將計數(shù)板放置在顯微鏡下觀察。在顯微鏡下，活細胞不著色，死細胞被染成藍色，計數(shù)四個大格內的活細胞數(shù)。根據(jù)公式計算細胞密度：細胞密度（個/ml）=（四個大格內活細胞總數(shù)/4）×10?×稀釋倍數(shù)。根據(jù)實驗需求，調整細胞密度至合適濃度用于后續(xù)實驗。3.2.2細胞增殖實驗MTT法：將處于對數(shù)生長期的U251細胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，調整細胞密度為5×10?個/ml。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔接種100μl，即每孔含有5×103個細胞。將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成0、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L等濃度梯度），每個濃度設置6個復孔。同時設置對照組，加入等量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含相應體積的DMSO，其終濃度與實驗組中DMSO最高濃度一致，以排除DMSO對實驗結果的影響）。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h。在各時間點結束前4h，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)孵育4h，使MTT被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚。孵育結束后，小心吸去上清液，注意不要吸掉甲瓚結晶，每孔加入150μlDMSO，振蕩10-15min，使甲瓚結晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，分析不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞增殖的影響。克隆形成實驗：將對數(shù)生長期的U251細胞用胰蛋白酶消化后，調整細胞密度為500個/ml。將細胞懸液接種于6孔板中，每孔接種2ml，即每孔含有1000個細胞。將6孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成0、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L等濃度梯度），每個濃度設置3個復孔。同時設置對照組，加入等量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含相應體積的DMSO，其終濃度與實驗組中DMSO最高濃度一致）。在藥物作用48-72h后，吸去含藥培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細胞2-3次，去除殘留的藥物。然后加入2-3ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當肉眼可見細胞克隆形成時，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2-3次。加入4%多聚甲醛固定細胞15-20min，然后倒掉多聚甲醛，用PBS清洗2-3次。加入適量結晶紫染色液，染色10-15min，使細胞克隆染色清晰。倒掉染色液，用清水緩慢沖洗6孔板，直至洗出的水無色，然后將6孔板晾干。在顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞的細胞團作為一個克隆，計算克隆形成率，公式為：克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。通過比較不同濃度組的克隆形成率，分析Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞克隆形成能力的影響。3.2.3細胞凋亡實驗細胞凋亡檢測試劑盒操作步驟：將U251細胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個細胞，置于培養(yǎng)箱中孵育24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成0、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L等濃度梯度），每個濃度設置3個復孔。同時設置對照組，加入等量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含相應體積的DMSO，其終濃度與實驗組中DMSO最高濃度一致）。將6孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h。培養(yǎng)結束后，收集細胞培養(yǎng)液至15ml離心管中。用不含EDTA的胰蛋白酶消化6孔板中的細胞，使細胞脫落，將消化后的細胞懸液也轉移至上述離心管中，1000rpm離心5min，收集細胞沉淀。用預冷的PBS清洗細胞沉淀2-3次，每次1000rpm離心5min，棄去上清液。按照細胞凋亡檢測試劑盒的說明書，向細胞沉淀中加入適量的BindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×10?個/ml。取100μl細胞懸液至流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15-20min。孵育結束后，加入400μlBindingBuffer，輕輕混勻，在1h內使用流式細胞儀進行檢測。結果分析方法：在流式細胞儀檢測過程中，通過分析AnnexinV-FITC和PI的雙染結果，區(qū)分正常細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）。使用FlowJo等數(shù)據(jù)分析軟件，統(tǒng)計不同處理組中早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和總凋亡細胞（早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞）的比例。通過比較不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理組與對照組之間細胞凋亡率的差異，分析Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞凋亡的影響。若實驗組中早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例明顯高于對照組，則表明Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠誘導U251細胞凋亡，且隨著抑制劑濃度的增加，細胞凋亡率可能呈現(xiàn)上升趨勢。3.2.4初步機制研究Westernblot實驗步驟：將U251細胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細胞，置于培養(yǎng)箱中孵育24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成0、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L等濃度梯度），每個濃度設置3個復孔。同時設置對照組，加入等量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含相應體積的DMSO，其終濃度與實驗組中DMSO最高濃度一致）。將6孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h。培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS清洗細胞2-3次。向每孔中加入100-150μl含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30-60min，期間輕輕晃動培養(yǎng)板，使細胞充分裂解。將裂解液收集至EP管中，12000rpm、4℃離心15-20min，取上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，具體操作按照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行。取適量蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，使上樣緩沖液終濃度為1×，100℃煮沸5-10min，使蛋白變性。根據(jù)蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠。將變性后的蛋白樣品上樣至凝膠孔中，同時上樣預染蛋白Marker。在恒壓條件下進行電泳，初始電壓為80V，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，使不同分子量的蛋白充分分離。電泳結束后，采用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上。轉膜條件為：恒流300mA，轉膜時間根據(jù)蛋白分子量大小調整，一般為1-2h。轉膜結束后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，將PVDF膜放入含有一抗（抗Notch1、Notch2、Hes1、β-actin抗體等，一抗用5%脫脂奶粉稀釋至合適濃度）的雜交袋中，4℃孵育過夜。次日，取出PVDF膜，用TBST溶液清洗3-4次，每次10-15min，以洗去未結合的一抗。將PVDF膜放入含有HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（二抗用5%脫脂奶粉稀釋至合適濃度）的雜交袋中，室溫孵育1-2h。孵育結束后，再次用TBST溶液清洗PVDF膜3-4次，每次10-15min，以洗去未結合的二抗。將PVDF膜放入ECL發(fā)光液中孵育1-2min，使蛋白條帶發(fā)光。然后將PVDF膜放入凝膠成像系統(tǒng)中，曝光并拍照，獲取蛋白條帶圖像。使用ImageJ等軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參蛋白，計算目的蛋白的相對表達量，公式為：目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。通過比較不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理組與對照組之間目的蛋白相對表達量的差異，分析Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對Notch信號通路相關蛋白表達的影響。real-timePCR實驗步驟：將U251細胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細胞，置于培養(yǎng)箱中孵育24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑（用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成0、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L等濃度梯度），每個濃度設置3個復孔。同時設置對照組，加入等量的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含相應體積的DMSO，其終濃度與實驗組中DMSO最高濃度一致）。將6孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h。培養(yǎng)結束后，使用Trizol試劑提取細胞總RNA，具體操作按照Trizol試劑說明書進行。提取的RNA用無RNase水溶解，使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間。按照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。反應體系包括RNA模板、逆轉錄引物、逆轉錄酶、dNTPs等，反應條件為：42℃孵育60min，70℃孵育15min，使RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料進行real-timePCR擴增。引物設計根據(jù)GenBank中Notch1、Notch2、Hes1、GAPDH等基因的序列，利用引物設計軟件進行設計。引物序列如下：Notch1上游引物：5'-[具體序列]-3'；下游引物：5'-[具體序列]-3'。Notch2上游引物：5'-[具體序列]-3'；下游引物：5'-[具體序列]-3'。Hes1上游引物：5'-[具體序列]-3'；下游引物：5'-[具體序列]-3'。GAPDH上游引物：5'-[具體序列]-3'；下游引物：5'-[具體序列]-3'。real-timePCR反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，總體積為20μl。反應條件為：95℃預變性3-5min，然后95℃變性10-15s，60℃退火和延伸30-40s，共進行40個循環(huán)。在PCR反應過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化。以GAPDH作為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。具體計算方法為：首先計算每個樣本的ΔCt值（ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH），然后計算實驗組與對照組之間的ΔΔCt值（ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組），最后計算目的基因的相對表達量（相對表達量=2?ΔΔCt）。通過比較不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理組與對照組之間目的基因相對表達量的差異，分析Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對Notch信號通路相關基因表達的影響。四、實驗結果與分析4.1Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株增殖的影響4.1.1MTT法檢測結果通過MTT法檢測不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對人惡性膠質瘤細胞株U251增殖的影響，實驗結果如表1所示。在未加入Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑（即0μmol/L組，DMSO對照組）時，U251細胞在24h、48h、72h的吸光度值（OD值）隨時間逐漸增加，表明細胞處于正常增殖狀態(tài)。當加入不同濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑后，各濃度組在不同時間點的OD值均低于對照組，且隨著抑制劑濃度的增加和作用時間的延長，OD值逐漸降低。在24h時，1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L濃度組的OD值分別為0.485±0.032、0.423±0.028、0.356±0.025，與對照組（0.567±0.035）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其中，10μmol/L濃度組的OD值顯著低于1μmol/L和5μmol/L濃度組（P<0.05），說明10μmol/L的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑在24h時對U251細胞增殖的抑制作用更為明顯。48h時，1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L濃度組的OD值分別為0.598±0.038、0.496±0.031、0.402±0.027，與對照組（0.789±0.042）相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。且各濃度組之間比較，差異也具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，即濃度越高，對細胞增殖的抑制作用越強。72h時，1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L濃度組的OD值分別為0.682±0.040、0.553±0.034、0.451±0.029，與對照組（0.965±0.050）相比，差異具有極顯著統(tǒng)計學意義（P<0.001）。同樣，各濃度組之間差異顯著（P<0.05），表明隨著作用時間的進一步延長，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞增殖的抑制作用持續(xù)增強。根據(jù)上述OD值繪制細胞生長曲線，如圖2所示。從曲線中可以直觀地看出，對照組細胞生長曲線呈上升趨勢，而各濃度的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理組細胞生長曲線相對平緩，且濃度越高，曲線上升幅度越小。這進一步證實了Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠顯著抑制U251細胞的增殖，且抑制作用具有明顯的劑量-時間依賴關系。[此處插入表1：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用不同時間對U251細胞OD值的影響][此處插入圖2：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用下U251細胞的生長曲線]4.1.2克隆形成實驗結果克隆形成實驗結果直觀地展示了Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞長期增殖能力的影響。對照組（0μmol/L，DMSO）的U251細胞在培養(yǎng)10-14天后形成了大量的細胞克隆，克隆數(shù)量多且形態(tài)較大，分布較為密集。而隨著Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑濃度的增加，細胞克隆的數(shù)量明顯減少，形態(tài)也變小，分布更為稀疏。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表2所示，對照組的克隆形成率為（65.33±4.21）%。1μmol/L濃度組的克隆形成率下降至（48.67±3.56）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。5μmol/L濃度組的克隆形成率進一步降低至（32.00±2.89）%，與1μmol/L濃度組和對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。10μmol/L濃度組的克隆形成率最低，為（15.67±2.13）%，與其他各濃度組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。圖3為克隆形成實驗的代表性圖片，從圖中可以清晰地看到不同濃度組之間克隆數(shù)量和形態(tài)的差異。這些結果進一步驗證了MTT法的實驗結論，即Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠有效抑制U251細胞的增殖，且抑制作用隨著濃度的升高而增強。[此處插入表2：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞克隆形成率的影響][此處插入圖3：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用下U251細胞克隆形成實驗圖片]4.2Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株凋亡的影響4.2.1細胞凋亡檢測試劑盒檢測結果使用細胞凋亡檢測試劑盒，通過流式細胞儀對不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理后的U251細胞凋亡情況進行檢測，實驗結果如表3所示。對照組（0μmol/L，DMSO）的細胞凋亡率為（3.25±0.45）%，處于較低水平，表明正常培養(yǎng)條件下U251細胞凋亡較少。當加入1μmol/L的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理48h后，細胞凋亡率升高至（7.56±0.68）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著抑制劑濃度增加到5μmol/L，細胞凋亡率進一步上升至（15.32±1.23）%，與1μmol/L濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當抑制劑濃度達到10μmol/L時，細胞凋亡率顯著升高至（28.67±2.05）%，與5μmol/L濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。從上述數(shù)據(jù)可以看出，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠顯著誘導U251細胞凋亡，且隨著抑制劑濃度的增加，細胞凋亡率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，具有顯著的劑量依賴性。這表明Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞的凋亡誘導作用與藥物濃度密切相關，較高濃度的抑制劑能夠更有效地促進細胞凋亡。[此處插入表3：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用48h對U251細胞凋亡率的影響]4.2.2AnnexinV-FITC/PI雙染實驗結果AnnexinV-FITC/PI雙染實驗通過流式細胞儀檢測，能夠準確區(qū)分早期凋亡、晚期凋亡和壞死細胞。圖4為不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理U251細胞48h后的流式細胞術圖，其中左下角象限代表正常細胞（AnnexinV?/PI?），右下角象限代表早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），右上角象限代表晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），左上角象限代表壞死細胞（AnnexinV?/PI?）。對照組中，正常細胞比例較高，早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞的比例相對較低，分別為（95.83±1.25）%、（2.31±0.35）%、（1.02±0.20）%和（0.84±0.15）%。當用1μmol/L的Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理后，早期凋亡細胞比例上升至（6.12±0.85）%，晚期凋亡細胞比例上升至（1.85±0.30）%，正常細胞比例下降至（91.23±1.50）%，與對照組相比，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比例的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在5μmol/L濃度組，早期凋亡細胞比例進一步升高至（12.56±1.50）%，晚期凋亡細胞比例升高至（3.01±0.50）%，正常細胞比例下降至（83.43±2.00）%，與1μmol/L濃度組相比，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比例的差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。10μmol/L濃度組中，早期凋亡細胞比例達到（22.45±2.50）%，晚期凋亡細胞比例達到（6.54±1.00）%，正常細胞比例下降至（70.01±3.00）%，與5μmol/L濃度組相比，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比例的差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。各濃度組中壞死細胞比例變化不明顯，均維持在較低水平。這些結果表明，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠誘導U251細胞發(fā)生凋亡，且隨著抑制劑濃度的增加，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例逐漸升高，進一步證實了Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對U251細胞凋亡的誘導作用具有劑量依賴性。[此處插入圖4：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用48h后U251細胞AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術圖]4.3Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用機制的初步研究結果4.3.1Westernblot檢測結果通過Westernblot實驗檢測不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理U251細胞48h后，Notch信號通路相關蛋白Notch1、Notch2和Hes1的表達水平，結果如圖5所示。在對照組（0μmol/L，DMSO）中，Notch1、Notch2和Hes1蛋白均有較高水平的表達。當加入Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑后，隨著抑制劑濃度的增加，Notch1、Notch2和Hes1蛋白的表達水平逐漸降低。以β-actin作為內參蛋白，對蛋白條帶灰度值進行分析，結果如表4所示。1μmol/L濃度組的Notch1蛋白相對表達量為0.82±0.06，與對照組（1.00±0.08）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Notch2蛋白相對表達量為0.85±0.07，與對照組（1.00±0.09）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Hes1蛋白相對表達量為0.80±0.05，與對照組（1.00±0.07）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。5μmol/L濃度組的Notch1蛋白相對表達量下降至0.65±0.05，與1μmol/L濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Notch2蛋白相對表達量下降至0.68±0.06，與1μmol/L濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Hes1蛋白相對表達量下降至0.62±0.04，與1μmol/L濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。10μmol/L濃度組的Notch1蛋白相對表達量最低，為0.45±0.03，與5μmol/L濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Notch2蛋白相對表達量為0.48±0.04，與5μmol/L濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Hes1蛋白相對表達量為0.40±0.03，與5μmol/L濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這些結果表明，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠顯著抑制Notch信號通路相關蛋白的表達，且抑制作用呈劑量依賴性。隨著抑制劑濃度的升高，Notch1、Notch2和Hes1蛋白的表達水平逐漸降低，說明Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑可能通過抑制Notch信號通路的激活，從而影響U251細胞的增殖和凋亡。[此處插入圖5：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用48h后U251細胞Notch信號通路相關蛋白表達的Westernblot條帶圖][此處插入表4：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用48h后U251細胞Notch信號通路相關蛋白相對表達量]4.3.2real-timePCR檢測結果利用real-timePCR技術檢測不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理U251細胞48h后，Notch信號通路相關基因Notch1、Notch2和Hes1的mRNA表達水平，結果如圖6所示。以GAPDH作為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。在對照組中，Notch1、Notch2和Hes1基因的mRNA表達水平相對較高。當用Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑處理后，各基因的mRNA表達水平隨著抑制劑濃度的增加而逐漸下降。具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表5所示，1μmol/L濃度組的Notch1基因相對表達量為0.78±0.07，與對照組（1.00±0.09）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Notch2基因相對表達量為0.80±0.08，與對照組（1.00±0.10）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Hes1基因相對表達量為0.75±0.06，與對照組（1.00±0.08）相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。5μmol/L濃度組的Notch1基因相對表達量下降至0.60±0.05，與1μmol/L濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Notch2基因相對表達量下降至0.63±0.06，與1μmol/L濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Hes1基因相對表達量下降至0.58±0.05，與1μmol/L濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。10μmol/L濃度組的Notch1基因相對表達量最低，為0.40±0.03，與5μmol/L濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Notch2基因相對表達量為0.43±0.04，與5μmol/L濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Hes1基因相對表達量為0.35±0.03，與5μmol/L濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。上述結果表明，從基因水平上，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠顯著抑制Notch信號通路相關基因的表達，且抑制作用同樣呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。這與Westernblot檢測蛋白表達水平的結果一致，進一步證實了Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑可能通過抑制Notch信號通路相關基因的表達，進而抑制Notch信號通路的激活，最終影響U251細胞的生物學行為，包括增殖和凋亡等過程。[此處插入圖6：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用48h后U251細胞Notch信號通路相關基因表達的real-timePCR結果][此處插入表5：不同濃度Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑作用48h后U251細胞Notch信號通路相關基因相對表達量]五、討論5.1Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株增殖和凋亡影響的討論5.1.1與已有研究結果的對比分析本研究結果顯示，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠顯著抑制惡性膠質瘤細胞株U251的增殖，并誘導其凋亡，且抑制作用和誘導凋亡作用均呈現(xiàn)明顯的劑量-時間依賴性。在細胞增殖實驗中，MTT法和克隆形成實驗結果表明，隨著Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑濃度的增加和作用時間的延長，U251細胞的增殖能力明顯受到抑制，細胞生長曲線變平緩，克隆形成率顯著降低。在細胞凋亡實驗中，細胞凋亡檢測試劑盒和AnnexinV-FITC/PI雙染實驗結果顯示，Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑能夠誘導U251細胞凋亡，且隨著抑制劑濃度的升高，細胞凋亡率顯著增加，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的比例均明顯上升。與已有研究結果相比，部分研究結論具有一致性。例如，有研究使用不同類型的γ-分泌酶抑制劑處理惡性膠質瘤細胞株，同樣發(fā)現(xiàn)其能夠抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡。這些研究中，γ-分泌酶抑制劑通過抑制γ-分泌酶的活性，阻斷Notch信號通路的激活，進而影響細胞的增殖和凋亡相關蛋白的表達，最終導致細胞增殖受到抑制和凋亡增加，與本研究中Ⅰ型γ-分泌酶抑制劑的作用機制相似。然而，也有部分研究結果存在差異。一些研究中，γ-分泌酶抑制劑對惡性膠質瘤細胞株的抑制效果可能相對較弱，或者在誘導凋亡方面的作用不如本研究明顯。這可能與多種因素有關，首先，不同研究中使用的細胞株存在差異。除了U251細胞株外，其他研究可能采用了U87等不同的惡性膠質瘤細胞株。這些細胞株雖然都屬于惡性膠質瘤細胞，但在基因表達、信號通路的活性以及對藥物的敏感性等方面可能存在差異。例如，U87細胞株可能在某些關鍵基因的表達水平上與U251細胞株不同，導致其對γ-分泌酶抑制劑的反應有