目錄TOC\o"1-3"\h\u188541 1110132 172993 122445 1179064 1286144.1 1226744.2 1242674.3PCR 1286634.6 2245405 2146225.1 2145875.2 2171925.3 2167065.4 28386 245266.1 232716.2 232124 218065ITS 25669 229088 2 8巴貝蟲檢測WS/T 巴貝Babesia(Babesiamicroti)、分歧巴貝蟲（Bdivergens）、鄧肯巴貝蟲（Bduncani）和獵戶巴貝蟲（B.venatorum）等（參見附錄A）。200r/min～3000r/minPCR4℃～990.11055V～5000V1mA～500mA鏡頭分辨率(HV)13601024UV18S核糖體RNA（18SrRNA）基因和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因的特異性引物（見附錄peabodymjrDNA。參見附錄18SrRNAITS取第二輪PCR5μL1μL6×1.0％瓊脂糖凝膠中，在1×TAE緩沖液中，5V/cm電泳約40min，當溴酚藍到達底部時停止電泳，用凝膠成像系統(tǒng)或PCR擴增巴貝蟲18SrRNA基因，出現(xiàn)大小為400bp左右特異性的擴增片段，空白對照和陰性對照未出現(xiàn)條帶，PCRPCR18SrRNA400bp左右特異性的擴增片段，空白對照和陰性對照未出現(xiàn)條帶，PCR結(jié)果陰性。PCRITS700bp～2100bp的特異性的擴增片段，空白對照和陰性對照未出現(xiàn)條帶，PCR結(jié)果陽性。PCRITS基因，未出現(xiàn)特異性的擴增片段，空白對照和陰性對照未出現(xiàn)條帶，PCR結(jié)果陰性。附錄巴貝蟲（Babesiaspp.）屬于頂復(fù)門（Apicomplexa）、孢子蟲綱（Sporozoa）、梨形蟲亞綱往已知可以感染人的巴貝蟲種類主要有：田鼠巴貝蟲(Bmicroti)、分歧巴貝蟲（Bdivergens）、鄧肯巴貝蟲（Bduncani，也稱為WA1）和獵戶巴貝蟲（Bvenatorum，也被稱為EU1）等。不同巴貝蟲蟲種引A.1附錄Tris-乙酸電泳緩沖液（Tris-aceticacidbuffersolution，TAE）8.0100mL1000mL41×TAE50TAE20mL1000mL瓊脂糖1.0g加1×TAE定容至100mL，微波爐加熱完全融化后，溶液冷卻至60℃，加10mg/mL溴化乙錠替代物5μL（終濃度0.5μg/mL)，輕輕混勻后，制備凝膠。0.25g40g100mL4附錄C.1引物序列片段大小18SBab400bpBab18SBabBaba18SrRNAPCRWS/T564釋成20μmol/L的工作液備用。18S 18SrRNAPCR以引物Bab5和Bab850μLTaq酶（5 0.2510×PCR緩沖液(含15mmol/L 525mmol/L 420μmol/LBab 1.520μmol/LBab 1.5 2 35.75 50PCRPCR955min；9545s，5545s，721min，共35個循環(huán)；727min；4∞18SrRNAPCR取第一輪PCR產(chǎn)物2μL為模板，以引物Bab6和Bab750μLTaq酶（50.2510×PCR緩沖液（15mmol/L525mmol/L420μmol/L1.520μmol/L1.5235.7550PCR955min；9445s，5545s，721min，共35個循環(huán)；727min；4∞ITSPCRITSPCRTaq酶（5 0.2510×PCR緩沖液(含15mmol/L 525mmol/L 420μmol/LITS- 1.520μmol/LITS- 1.5 2 35.75 50PCR955min；9430s，5030s，722min，共35個循環(huán)；7210min；4∞ITSPCR取第一輪PCR2μL為模板，以引物ITS-F4和ITS-R450μLTaq酶（5 0.2510×PCR緩沖液(含15mmol/L 525mmol/L 420μmol/LITS- 1.520μmol/LITS- 1.5 2 35.75 50PCR955min；9430s，6030s，722min，共35個循環(huán)；7210min；4∞。注：PCR實驗符合WS/T230的規(guī)定。\ha）18SrRNA基因序列與GenBank中巴貝蟲18SrRNA序列相似度96ITS基因序列與18SrRNA基因序列與田鼠巴貝蟲18SrRNA序列相似度99ITS基因序列與田鼠巴貝蟲ITS序列相似度98％以上，判定為田鼠巴貝蟲；8SrRNA基因序列與分歧巴貝蟲18SrRNA序列相似度99ITS基因序列與分歧巴貝蟲ITS序列相似度98％以上，判定為分歧巴貝蟲；8SrRNA基因序列與鄧肯巴貝蟲18SrRNA序列相似度99％以上，判定為鄧肯巴貝蟲；e）18SrRNA基因序列與獵戶巴貝蟲18SrRNA序列相似度99％以上，判定為獵戶巴貝蟲。18SrRNA田鼠巴貝蟲18SrRNA基因參考序列（參考序列GenBank序列號為KU204794，其在該基因GAGTAATGGTTAATAGGAGCAGTTGGG(407bp)分歧巴貝蟲18SrRNA基因參考序列（參考序列GenBankKP745627，其在該基因中(379bp)鄧肯巴貝蟲18SrRNA基因參考序列（參考序列GenBank序列號為HQ289870，其在該基因AATAGGAACAGTTGGG(398bp)獵戶巴貝蟲18SrRNA基因參考序列（參考序列GenBankKF724377，其在該基因中(379bp)分歧巴貝蟲ITS標準參考序列（參考序列GenBank序列號為EU185801，其在該基因中起始CCGCT