第3節(jié)

動物細(xì)胞工程（第2課時）動物細(xì)胞融合技術(shù)和單克隆抗體【本節(jié)聚焦】1、什么是動物細(xì)胞融合技術(shù)？2、單克隆抗體是如何制備的？在臨床上有哪些應(yīng)用？第2章細(xì)胞工程學(xué)習(xí)目標(biāo)、重難點核心素養(yǎng)1.說出什么是動物細(xì)胞融合技術(shù)。2.簡述單克隆抗體的制備過程以及在臨床上有哪些應(yīng)用。1.生命觀念：闡明動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件和過程；商述干細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)工程中有廣泛的應(yīng)用價值。2.科學(xué)思維：闡明利用動物體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆動物的過程和該技術(shù)的應(yīng)用前景.3.社會責(zé)任：闡明利用動物細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體的過程，認(rèn)同單克隆抗體在臨床上有重要的應(yīng)用價值.1.教學(xué)重點：（1）動物細(xì)胞融合技術(shù)的原理、方法及其應(yīng)用。（2）單克隆抗體的制備過程及其在臨床上的應(yīng)用。2.教學(xué)難點：（1）單克隆抗體制備過程中的兩次篩選及其目的。（2）單克隆抗體在疾病診斷和治療中的應(yīng)用優(yōu)勢。情境導(dǎo)入問題：為什么要號召新冠感染痊愈者捐獻自己的血漿？這樣的血漿對新冠重癥感染患者有什么作用呢？

血漿中有新冠病毒的抗體,可以用于治療新冠感染患者。

但一個捐獻者的200-300毫升的血漿，如果合格，一般也只能治療2-3個患者。思考：抗體為什么不人工制備呢？傳統(tǒng)抗體如何制備？

抗體是在抗原物質(zhì)的刺激下，由漿細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）產(chǎn)生的，可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。情境導(dǎo)入傳統(tǒng)抗體制備方法及缺陷抗原傳統(tǒng)血清免疫（所有抗體混合）（2）缺陷：產(chǎn)量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。（1）方法：抗原從血清中分離抗體漿細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞動物體內(nèi)刺激增值分化？病原體表面多個抗原決定簇，被免疫系統(tǒng)視為不同獨立的激活信號，形成不同B淋巴細(xì)胞每一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體?？乖患兛贵w不純有什么方法解決這個問題？思考：有什么方法解決傳統(tǒng)抗體制備存在產(chǎn)量低、純度低、特異性差的問題？1個B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞群大量單一抗體克隆產(chǎn)生在體外培養(yǎng)條件下，一個B淋巴細(xì)胞是不可能無限增殖的！米爾斯坦【英國】科勒【德國】解決1975年，英國科學(xué)家米爾斯坦和德國科學(xué)家科勒設(shè)計了一個極富創(chuàng)造性的試驗方案：抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞(單克隆抗體)情境導(dǎo)入骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖既能無限增殖，又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體：由單一雜交瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生的特異性抗體。如何將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞呢？思考與討論單克隆抗體分析概念中“單”和“克隆”的含義?？偨Y(jié)單克隆抗體的概念？注：B淋巴細(xì)胞指的是活化的B淋巴細(xì)胞（指從成熟的B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化的時期），其融合的效率最高，若直接用漿細(xì)胞，融合效率很低。自主閱讀教材P48，思考下列問題1.動物細(xì)胞融合技術(shù)的概念、原理、結(jié)果分別是什么？2.動物細(xì)胞融合技術(shù)常用的誘導(dǎo)方法有哪些？4.動物細(xì)胞融合技術(shù)有何意義？在現(xiàn)實生活中的應(yīng)用有哪些？3.什么是滅活？滅活病毒誘導(dǎo)融合的原理？融合實質(zhì)及完成的標(biāo)志？

（教材P48的相關(guān)信息）一、動物細(xì)胞融合技術(shù)回顧-必修一：細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)回顧-選必三：植物體細(xì)胞自交1、概念：指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。融合后形成的雜交細(xì)胞具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞。3、誘導(dǎo)方式：物理法：離心法、電融合法化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)融合法生物法：滅活病毒誘導(dǎo)法（不能，動物細(xì)胞的全能性受限）注意：誘導(dǎo)融合之前，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散。思考：通過動物細(xì)胞融合技術(shù)能否形成完整個體？2、原理：細(xì)胞膜的流動性一、動物細(xì)胞融合技術(shù)（動物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)方法）P49肺結(jié)核病人病理切片滅活病毒誘導(dǎo)法用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。拓展：一、動物細(xì)胞融合技術(shù)不滅活的病毒的不可以用作細(xì)胞融合誘導(dǎo)劑，會感染動物細(xì)胞。不滅活可以嗎？病毒：表面含有糖蛋白和酶細(xì)胞膜融合細(xì)胞核融合細(xì)胞質(zhì)融合細(xì)胞融合的實質(zhì)4、動物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志：兩個或多個細(xì)胞核融合為一個細(xì)胞核一、動物細(xì)胞融合技術(shù)4、結(jié)果：形成具有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息的雜交細(xì)胞5、意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。6、應(yīng)用：正在融合的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(1)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。(2)用于制造單克隆抗體。生產(chǎn)單克隆抗體植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜流動性、植物細(xì)胞全能性細(xì)胞膜的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法離心法、電融合法、PEG融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能小結(jié)：動物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較一、動物細(xì)胞融合技術(shù)1.下列有關(guān)動物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交比較的敘述，錯誤的是（

）

A.它們的原理都涉及細(xì)胞膜的流動性

B.都可以用電融合法或PEG融合法誘導(dǎo)融合

C.融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細(xì)胞

D.前者主要是為了獲得細(xì)胞產(chǎn)品，后者主要是為了獲得雜種植株C趁熱打鐵1.制備單克隆抗體的思路骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖能產(chǎn)生抗體B淋巴細(xì)胞二、單克隆抗體的制備過程2.建構(gòu)模型①請大家結(jié)合教材P48—49相關(guān)內(nèi)容，以小組為單位，討論單克隆抗體制備過程(2min)②在學(xué)案上構(gòu)建單克隆抗體制備流程圖（用文字+箭頭的形式）動物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞，能無限增殖）一個B淋巴細(xì)胞（只分泌一種特異性抗體不能無限增殖）雜交瘤細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體。流程圖問題引導(dǎo)：①用特定抗原對小鼠進行免疫的原因？②骨髓瘤細(xì)胞、免疫的B淋巴細(xì)胞各有何特點？③免疫的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后，得到的細(xì)胞是否都是雜交瘤細(xì)胞？雜交瘤細(xì)胞有何特點？④

雜交瘤細(xì)胞是如何篩選出來的？⑤

是否所有的雜交瘤細(xì)胞都能產(chǎn)生所需的抗體？⑥如何擴大培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？二、單克隆抗體的制備過程1、請大家結(jié)合教材P48—49相關(guān)內(nèi)容，以小組為單位，討論單克隆抗體制備過程(2min)2、在學(xué)案上構(gòu)建單克隆抗體制備流程圖（用文字+箭頭的形式）

注射特定抗原

從脾臟中獲取B淋巴細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞目的是獲得產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合誘導(dǎo)融合多種雜交細(xì)胞從患骨髓瘤的小鼠體內(nèi)取骨髓瘤細(xì)胞進行培養(yǎng)3、單克隆抗體的制備過程B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞：BB、B-瘤、瘤-瘤選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)（HAT培養(yǎng)基）目的？種類？①產(chǎn)生其他抗體的B淋巴細(xì)胞

②產(chǎn)生針對注射抗原的抗體的B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中共出現(xiàn)幾種細(xì)胞？其中融合的細(xì)胞有幾種？(只考慮兩兩融合)思考：雜交瘤細(xì)胞是如何篩選出來的？？第一次篩選目的：篩選雜交瘤細(xì)胞（多種）二、單克隆抗體的制備過程①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。②B淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。篩選出雜交瘤細(xì)胞方法？培養(yǎng)基中加入氨基嘌呤（HAT選擇培養(yǎng)基）B，B-B：不能無限增殖，死亡瘤，瘤-瘤：不能無限增殖，死亡雜交瘤細(xì)胞：（B-瘤）能無限增殖，生長D途徑、S途徑D途徑D途徑、S途徑拓展：DNA復(fù)制途經(jīng)二、單克隆抗體的制備過程

注射特定抗原

從脾臟中獲取B淋巴細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞目的是獲得產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合誘導(dǎo)融合多種雜交細(xì)胞從患骨髓瘤的小鼠體內(nèi)取骨髓瘤細(xì)胞進行培養(yǎng)3、單克隆抗體的制備過程B淋巴細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞：BB、B-瘤、瘤-瘤選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)（HAT培養(yǎng)基）目的？種類？①產(chǎn)生其他抗體的B淋巴細(xì)胞

②產(chǎn)生針對注射抗原的抗體的B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中共出現(xiàn)幾種細(xì)胞？其中融合的細(xì)胞有幾種？(只考慮兩兩融合)思考：雜交瘤細(xì)胞是如何篩選出來的？？第一次篩選目的：篩選雜交瘤細(xì)胞（多種）二、單克隆抗體的制備過程篩選的所有雜交瘤細(xì)胞都能產(chǎn)生所需的抗體？？不一定，雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞篩選？克隆化培養(yǎng)和抗體檢測用培養(yǎng)液稀釋

雜交瘤細(xì)胞(多種)方法：抗原—抗體雜交原理：抗原—抗體特異性結(jié)合拓展：克隆化培養(yǎng)和抗體檢測★有限稀釋法每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞側(cè)面模擬圖克隆化培養(yǎng)一段時間取上清液進行抗體檢測克隆化培養(yǎng)細(xì)胞增殖抗體檢測陽性細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）顯色測定熒光測定多次篩選，可獲得足量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞二、單克隆抗體的制備過程原理？⑤如何擴大培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體？單克隆抗體從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提?。w內(nèi)培養(yǎng)）（能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞）特異性強靈敏度高可大量制備特點優(yōu)點：易于控制培養(yǎng)條件，操作簡單，成本較低。缺點：規(guī)模小，產(chǎn)量少優(yōu)點：可大規(guī)模培養(yǎng)，產(chǎn)量大。缺點：需要認(rèn)為控制培養(yǎng)條件，成本高二、單克隆抗體的制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用單克隆抗體第二次篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)培養(yǎng)第一次篩選骨髓瘤細(xì)胞

誘導(dǎo)融合分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞群提取已免疫的B淋巴細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小結(jié)：既能大量繁殖又能產(chǎn)生抗體優(yōu)點：特異性強、靈敏度高、可大量制備注射抗原單克隆抗體制備的過程中，應(yīng)用到的技術(shù)手段單克隆抗體制備過程的原理細(xì)胞膜的流動性和細(xì)胞增殖二、單克隆抗體的制備過程單克隆抗體制備過程相關(guān)知識點檢測（1）該過程中應(yīng)用到的技術(shù)_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）誘導(dǎo)融合的方法______________________________________動物細(xì)胞特有的誘導(dǎo)融合方法為_______________________（5）第一次篩選的目的______________________

第一次如何篩選___________________________

篩選原理____________________________________________________（6）雜交瘤細(xì)胞的特點__________________________________動物細(xì)胞融合、動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞膜具有一定的流動性、細(xì)胞增殖用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法滅活病毒誘導(dǎo)法篩選獲得雜交瘤細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選在選擇培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體二、單克隆抗體的制備過程（7）第二次篩選的目的________________________________________________如何篩選___________________________________________________選擇抗體檢測呈___性的雜交瘤細(xì)胞，即_____________

_____________（8）抗體檢測原理_______________________________________（9）如何獲取大量所需雜交瘤細(xì)胞__________________________________________（10）如何獲取單克隆抗體①體外培養(yǎng)___________________________②小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)_________________________（11）單克隆抗體的優(yōu)點_____________________________獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測（進行多次篩選）分泌的抗體能與特定的抗原結(jié)合抗原和抗體能夠特異性結(jié)合(分子水平的鑒定）在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)（接種于培養(yǎng)液中）或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從細(xì)胞培養(yǎng)液中獲取從小鼠腹水中獲取能準(zhǔn)確地識別抗原的細(xì)微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備陽單克隆抗體制備過程相關(guān)知識點檢測二、單克隆抗體的制備過程項目第一次篩選第二次篩選篩選原因目的篩選出？

篩選出

的雜交瘤細(xì)胞方法用特定選擇培養(yǎng)基篩選：未融合的親本細(xì)胞和融合的有同種核的細(xì)胞都會

，只有融合雜交瘤細(xì)胞才能

。

用96孔板培養(yǎng)，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞的情況下進行克隆化培養(yǎng)和

，經(jīng)多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體死亡抗體檢測生長誘導(dǎo)融合后得到多種融合細(xì)胞，還有未融合的細(xì)胞等由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞

比較兩次篩選的原因、方法和目的二、單克隆抗體的制備過程2.科學(xué)家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關(guān)敘述正確的是（

）A.利用該單克隆抗體可以診斷是否感染SARS病毒B.體外培養(yǎng)單個B淋巴細(xì)胞可以獲得針對SARS病毒的單克隆抗體C.將等量B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合，經(jīng)誘導(dǎo)后融合的細(xì)胞即為雜交瘤細(xì)胞D.將純化的核衣殼蛋白反復(fù)注射到小鼠體內(nèi)，從小鼠血清中分離出的抗體為單克隆抗體A趁熱打鐵

新型冠狀病毒抗原檢測1、作為診斷試劑

乙肝測定試劑單克隆抗體+同位素（熒光標(biāo)記）在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病?？谷私q毛促性腺激素單克隆抗體艾滋病檢測試劑優(yōu)點：準(zhǔn)確、高效、簡易、快速。三、單克隆抗體的應(yīng)用（2）抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）通過將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。作用機制如下圖：優(yōu)點：位置準(zhǔn)確、特異性強、靈敏度高，毒副作用小。三、單克隆抗體的應(yīng)用

“生物導(dǎo)彈”發(fā)揮靶向運輸作用，特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面抗原，將藥物輸送到靶細(xì)胞發(fā)揮治療效應(yīng)思考：除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進行靶向放療；②一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進行治療。（3）用于治療疾?。簡慰寺】贵w藥物已被廣泛用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療，如利妥昔單抗被用于治療復(fù)發(fā)難治的低分化B細(xì)胞淋巴瘤；曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。優(yōu)點：位置準(zhǔn)確、療效高、毒副作用小。三、單克隆抗體的應(yīng)用3.抗體—藥物偶聯(lián)物(ADC)通過將細(xì)胞毒素與單克隆抗體結(jié)合，實現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，過程如圖所示。下列敘述不正確的是（

）A.抗體進入細(xì)胞后激活溶酶體酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡B.ADC可通過胞吞方式進入腫瘤細(xì)胞C.單克隆抗體攜帶細(xì)胞毒素與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合D.腫瘤細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動死亡的過程，會產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)趁熱打鐵A課堂小結(jié)1.關(guān)于動物細(xì)胞融合的說法錯誤的是()A.動物細(xì)胞融合后形成的具有原來兩個或多個動物細(xì)胞遺傳信息的多核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞B.動物細(xì)胞融合己成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段C.常用于誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合手段有聚乙二醇、滅活的病毒、電激等D.細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交方法局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能A課后訓(xùn)練2.如圖2-2-6為單克隆抗體的制備流程示意圖。下列敘述正確的是()圖2-2-6A.甲是從已免疫的小鼠脾臟中獲得的T淋巴細(xì)胞B.①表示將骨髓瘤細(xì)胞去核后進行細(xì)胞融合C.乙為融合細(xì)胞，同時具有細(xì)胞甲和骨髓瘤細(xì)胞的特性D.②表示篩選能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞練習(xí)D課后訓(xùn)練3.如圖所示為雜交瘤細(xì)胞的制備示意圖。骨髓瘤細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT-),在HAT選擇培養(yǎng)液中不能正常合成DNA，無法生長。下列敘述錯誤的是()A.可用滅活的病毒誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞