SMAR1與CyclinD1蛋白表達：揭示結直腸癌發(fā)生發(fā)展與預后的分子密碼一、引言1.1研究背景結直腸癌（ColorectalCancer,CRC）是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的GLOBOCAN2020數據顯示，結直腸癌在全球癌癥發(fā)病率中位居第三，新發(fā)病例約193萬例，占所有癌癥病例的10.07%；在癌癥死亡率中位居第二，死亡病例約93.5萬例，占所有癌癥死亡的9.38%。結直腸癌的發(fā)病率和死亡率在不同地區(qū)存在顯著差異，發(fā)達國家的發(fā)病率普遍高于發(fā)展中國家，但近年來，隨著發(fā)展中國家經濟水平的提高和生活方式的西化，結直腸癌的發(fā)病率呈快速上升趨勢。在中國，結直腸癌同樣是常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升態(tài)勢。中國國家癌癥中心發(fā)布的數據表明，2020年中國結直腸癌新發(fā)病例數達到55.5萬例，占全部惡性腫瘤發(fā)病的9.87%，位居惡性腫瘤發(fā)病譜第2位；死亡病例數為28.6萬例，占全部惡性腫瘤死亡的7.10%，位居惡性腫瘤死亡譜第5位。同時，中國結直腸癌的發(fā)病呈現(xiàn)出年輕化趨勢，青年人患結直腸癌的比例逐漸增加，這給社會和家庭帶來了沉重的負擔。結直腸癌的發(fā)病機制較為復雜，涉及多個基因、信號通路和細胞生物學過程的異常改變。深入研究結直腸癌的發(fā)病機制，尋找有效的診斷標志物和治療靶點，對于提高結直腸癌的早期診斷率、改善患者的治療效果和預后具有重要意義。目前的研究認為，結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素參與的過程，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、細胞周期調控異常、細胞凋亡失衡、DNA損傷修復缺陷、血管生成異常以及腫瘤微環(huán)境的改變等。在眾多與結直腸癌相關的分子中，SMAR1和CyclinD1蛋白近年來受到了廣泛關注，它們在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移過程中可能發(fā)揮著重要作用。1.2研究目的本研究旨在通過免疫組織化學技術和Westernblot免疫印跡法，檢測SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達水平，分析其表達與結直腸癌患者臨床病理參數（如腫瘤大小、Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移、病理分化類型等）之間的相關性，探討SMAR1和CyclinD1蛋白表達對結直腸癌患者預后的影響，為結直腸癌的早期診斷、病情評估、預后判斷以及靶向治療提供理論依據和潛在的生物標志物。1.3研究意義結直腸癌嚴重威脅人類健康，深入研究其發(fā)病機制并尋找有效的診斷和治療方法至關重要。本研究聚焦于SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌中的表達及臨床意義，具有多方面的重要價值。在揭示發(fā)病機制方面，細胞周期調控失衡是結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，SMAR1和CyclinD1蛋白作為細胞周期調控網絡中的重要組成部分，深入探究它們在結直腸癌中的作用機制，有助于全面理解結直腸癌的發(fā)病過程。如SMAR1可能通過調節(jié)相關基因的表達，影響細胞周期進程和腫瘤細胞的增殖、分化，其表達下調可能導致對腫瘤細胞增殖的抑制作用減弱，從而促進結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。CyclinD1作為細胞周期蛋白，在細胞周期的G1期向S期轉換過程中發(fā)揮關鍵作用，其異常高表達可加速細胞周期進程，使腫瘤細胞獲得增殖優(yōu)勢。研究二者在結直腸癌中的表達及相互關系，能夠為闡釋結直腸癌的發(fā)病機制提供新的視角和理論依據，有助于深入理解腫瘤細胞的生物學行為。從提供診斷和預后評估指標角度來看，目前結直腸癌的診斷主要依賴腸鏡檢查、影像學檢查和病理活檢等方法，但這些方法存在一定的局限性，如腸鏡檢查為侵入性操作，患者依從性較差，且早期病變可能被漏診；影像學檢查對于微小病變的檢測敏感度有限。尋找新的腫瘤標志物用于結直腸癌的早期診斷具有迫切需求。本研究通過檢測SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達差異，發(fā)現(xiàn)它們與結直腸癌的臨床病理參數（如Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化類型等）密切相關。這表明SMAR1和CyclinD1蛋白有望成為結直腸癌早期診斷的潛在生物標志物，通過檢測其表達水平，有助于提高結直腸癌的早期診斷率，實現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療。同時，研究還發(fā)現(xiàn)SMAR1蛋白低表達、CyclinD1蛋白高表達的結直腸癌患者預后較差，這為評估結直腸癌患者的預后提供了重要參考指標，醫(yī)生可根據患者的SMAR1和CyclinD1蛋白表達情況，更準確地預測患者的預后，制定個性化的治療方案和隨訪計劃。在潛在治療靶點方面，當前結直腸癌的治療方法主要包括手術、化療、放療和靶向治療等，但對于晚期或轉移性結直腸癌患者，治療效果仍不理想，且存在耐藥性等問題。因此，尋找新的治療靶點，開發(fā)更有效的治療方法是結直腸癌研究領域的重要方向。SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌中的異常表達及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切關系，提示它們可能成為結直腸癌靶向治療的潛在靶點。通過干預SMAR1和CyclinD1蛋白的表達或功能，有望阻斷腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移信號通路，從而達到治療結直腸癌的目的。這為結直腸癌的治療提供了新的思路和策略，有助于推動結直腸癌靶向治療的發(fā)展，提高患者的生存率和生活質量。本研究對于深入了解結直腸癌的發(fā)病機制、提高診斷和預后評估水平以及開發(fā)新的治療方法具有重要的理論和實踐意義，為結直腸癌的防治提供了有價值的參考依據。二、研究現(xiàn)狀2.1結直腸癌概述結直腸癌是一種源于大腸腺上皮的惡性腫瘤，又稱大腸癌，可發(fā)生于大腸的各個部位，其中70％發(fā)生于左側，尤以乙狀結腸和直腸最為多見。其發(fā)病原因較為復雜，目前尚未完全明確，普遍認為主要與生活方式、環(huán)境和飲食結構密切相關，同時，某些特殊類型的大腸癌可能與遺傳因素的關聯(lián)性更為顯著。在生活方式方面，缺乏運動、長期久坐的生活習慣會降低身體的新陳代謝速率，影響腸道蠕動，導致有害物質在腸道內停留時間延長，增加了對腸黏膜的刺激和損傷，從而提高了結直腸癌的發(fā)病風險。不合理的飲食習慣，如高油脂、高蛋白、低膳食纖維的飲食結構，會改變腸道內的微生物群落，促使腸道內產生更多的致癌物質，如次級膽酸等，這些物質會損傷腸道上皮細胞的DNA，引發(fā)基因突變，進而誘發(fā)結直腸癌。環(huán)境因素中的化學物質污染，如長期接觸農藥、化肥、工業(yè)廢氣廢水等，其中含有的致癌物質，如多環(huán)芳烴、亞硝胺等，可能通過呼吸道、皮膚接觸或飲食攝入進入人體，干擾細胞的正常代謝和基因表達，增加結直腸癌的發(fā)病幾率。遺傳因素在結直腸癌的發(fā)病中也起著重要作用，約5％-10％的結直腸癌患者具有明確的遺傳背景，如家族性腺瘤性息肉病（FAP）、林奇綜合征（LynchSyndrome）等遺傳性疾病，這些患者攜帶特定的基因突變，使得他們患結直腸癌的風險顯著高于普通人群。結直腸癌的典型癥狀包括便血、腹痛、體重下降、貧血和腸梗阻等。然而，這些癥狀在疾病早期往往并不明顯，容易被患者忽視或誤診。隨著病情的進展，癥狀會逐漸加重且多樣化。通常，左半大腸癌更多出現(xiàn)血便和腸梗阻癥狀，這是因為左半結腸腸腔相對較細，糞便成形且干結，腫瘤容易阻塞腸腔，導致腸梗阻的發(fā)生；同時，腫瘤表面的破潰出血會隨著糞便排出，表現(xiàn)為血便。直腸病變更易有里急后重感，這是由于直腸的特殊解剖位置和生理功能，腫瘤刺激直腸黏膜及周圍組織，引起排便不盡感和頻繁便意。右半大腸癌則更多出現(xiàn)腹部包塊、貧血、消瘦、乏力等表現(xiàn)，右半結腸腸腔較大，糞便呈液態(tài)，腫瘤生長相對較為隱匿，但隨著腫瘤的增大，可在腹部觸及包塊；由于腫瘤慢性失血以及對營養(yǎng)物質的消耗，患者會出現(xiàn)貧血、消瘦、乏力等全身癥狀。在治療方面，結直腸癌主要采用癌組織切除輔以放化療或靶向治療的綜合治療方案。醫(yī)生會根據患者的具體情況，如體質、性別、年齡、家庭條件以及癌癥分期等，制定個性化的治療策略。對于早期結直腸癌患者，手術切除是主要的治療方法，通過切除腫瘤組織，可達到根治的目的，術后根據病理檢查結果，部分患者可能需要輔助化療，以降低復發(fā)風險。對于中期結直腸癌患者，手術切除后通常需要進行化療和放療，化療可以殺死殘留的癌細胞，放療則可以局部控制腫瘤的生長，提高治療效果。對于晚期結直腸癌患者，尤其是發(fā)生遠處轉移的患者，治療較為復雜，除了手術、化療和放療外，還可能采用靶向治療。靶向治療是針對腫瘤細胞的特定分子靶點進行治療，具有特異性強、副作用小的優(yōu)點，能夠顯著延長患者的生存期，提高生活質量。此外，中醫(yī)治療也可作為輔助手段，通過調節(jié)患者的身體機能，增強免疫力，減輕放化療的副作用，提高患者的耐受性和生活質量。在治療過程中，患者還需要保持規(guī)律的生活作息和平和的心情，適當增加鍛煉，這有助于提高身體的抵抗力，促進康復。同時，規(guī)律飲食，遵醫(yī)囑正確用藥，日常關注大便性狀有無異常，對于及時發(fā)現(xiàn)病情變化、調整治療方案具有重要意義。2.2SMAR1蛋白研究現(xiàn)狀SMAR1蛋白，全稱為基質附著區(qū)域結合蛋白1（Scaffold/MatrixAttachmentRegionBindingProtein1），屬于一類基質附著區(qū)域結合蛋白（MARBP）。其在細胞核組裝、組織分化和器官發(fā)生等重要生物學過程中發(fā)揮著關鍵作用。SMAR1蛋白的結構較為獨特，包含多個功能結構域，這些結構域賦予了SMAR1蛋白多種生物學功能。例如，它含有DNA結合結構域，能夠與特定的DNA序列，即基質附著區(qū)域（MARs）相結合，從而參與染色質的重塑和基因表達的調控。通過與MARs結合，SMAR1蛋白可以改變染色質的結構，影響基因的可及性，進而調節(jié)相關基因的轉錄過程。在功能方面，SMAR1蛋白具有多種重要的生物學功能，其中作為腫瘤抑制蛋白的作用尤為顯著。研究表明，SMAR1蛋白能夠通過多種機制發(fā)揮腫瘤抑制作用。它具有促凋亡的性質，能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤的生長。SMAR1蛋白還可以與野生型p53相互作用，增強p53蛋白的穩(wěn)定性，促進p53介導的細胞凋亡信號通路的激活。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細胞周期調控、DNA損傷修復和細胞凋亡等過程中發(fā)揮著關鍵作用。SMAR1蛋白與p53的相互作用，進一步增強了對腫瘤細胞的抑制作用。此外，SMAR1蛋白能夠抑制增殖因子細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖。CyclinD1在細胞周期的G1期向S期轉換過程中起著關鍵作用，其異常高表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。SMAR1蛋白通過抑制CyclinD1的表達，能夠阻斷腫瘤細胞的增殖信號通路，抑制腫瘤細胞的生長和分裂。在多種癌癥中，SMAR1蛋白的表達情況與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。在乳腺癌中，SMAR1蛋白的表達減少，其缺失與預后不良有關，并且隨著腫瘤生長階段的推進，SMAR1蛋白的表達逐漸減少。研究發(fā)現(xiàn)，增加SMAR1蛋白在乳腺癌中的表達，可以在體外和體內抑制腫瘤的進展，增強化療的療效。在結直腸癌中，SMAR1蛋白同樣發(fā)揮著重要的腫瘤抑制作用。已有研究表明，SMAR1蛋白在大多數結直腸癌組織中的表達下調，且其表達與結直腸癌的Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及分化類型相關。臨床分期越晚、病理分化越低，SMAR1蛋白的表達下調越明顯。這提示SMAR1蛋白可能參與了結直腸癌的侵襲和轉移過程，其低表達可能促進了結直腸癌的惡性進展。此外，在肝癌、肺癌等其他多種癌癥中，也發(fā)現(xiàn)SMAR1蛋白的表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。例如，在肝癌組織中，SMAR1蛋白的表達水平明顯低于正常肝組織，且其低表達與肝癌患者的不良預后相關。在肺癌細胞中，上調SMAR1蛋白的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。SMAR1蛋白作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用。其表達異常與腫瘤的惡性程度和預后密切相關，深入研究SMAR1蛋白的作用機制和表達調控，對于腫瘤的診斷、治療和預后評估具有重要的意義。2.3CyclinD1蛋白研究現(xiàn)狀CyclinD1蛋白是細胞周期蛋白家族中的重要成員，在細胞周期調控中扮演著關鍵角色。細胞周期是細胞生命活動的基本過程，包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期）。CyclinD1主要在細胞周期的G1期發(fā)揮作用，它是細胞從G1期進入S期的關鍵調節(jié)因子。當細胞接收到生長因子等外部信號刺激時，CyclinD1基因被激活轉錄，合成CyclinD1蛋白。CyclinD1蛋白隨后與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）結合，形成CyclinD1-CDK4/6復合物。該復合物具有激酶活性，能夠磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）。Rb蛋白在未磷酸化狀態(tài)下，與轉錄因子E2F結合，抑制E2F的活性，從而阻止細胞進入S期。而CyclinD1-CDK4/6復合物磷酸化Rb蛋白后，Rb與E2F解離，釋放出E2F，E2F進而激活一系列與DNA合成和細胞周期進展相關的基因轉錄，促使細胞從G1期順利進入S期，啟動DNA復制和細胞增殖過程。在正常細胞中，CyclinD1的表達受到嚴格的調控，其表達水平在細胞周期中呈現(xiàn)周期性變化。在G1期早期，CyclinD1表達較低，隨著細胞周期的推進，在G1期晚期表達逐漸升高，至S期開始時達到峰值，隨后在細胞進入S期后逐漸降解。這種精確的表達調控機制確保了細胞周期的正常有序進行，維持細胞的正常增殖和分化。然而，在多種癌癥中，CyclinD1的表達常常出現(xiàn)異常。在乳腺癌中，CyclinD1基因擴增和蛋白過表達較為常見，研究表明，約50%的乳腺癌患者存在CyclinD1基因的擴增，其蛋白表達水平顯著升高。高水平的CyclinD1促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及不良預后密切相關。在肺癌中，CyclinD1的異常表達同樣普遍，其過表達可加速肺癌細胞的增殖，抑制細胞凋亡，并且與肺癌的轉移和耐藥性相關。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中，CyclinD1高表達的患者對化療藥物的敏感性降低，預后較差。在結直腸癌中，CyclinD1的表達異常也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究表明，CyclinD1在結直腸癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織。其異常高表達可導致細胞周期調控紊亂，使腫瘤細胞獲得增殖優(yōu)勢，促進結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。有研究通過免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)，CyclinD1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，且其表達與結直腸癌的Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化類型相關。臨床分期越晚、病理分化越低，CyclinD1的表達上調越明顯。這表明CyclinD1可能參與了結直腸癌的侵襲和轉移過程，其高表達可能是結直腸癌惡性進展的重要標志。此外，CyclinD1的異常表達還與結直腸癌患者的預后相關。有研究對結直腸癌患者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)CyclinD1蛋白高表達的患者生存期明顯縮短，復發(fā)率增加，提示CyclinD1高表達是結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素。CyclinD1作為細胞周期調控的關鍵蛋白，其異常表達在多種癌癥包括結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移過程中發(fā)揮著重要作用，深入研究CyclinD1的表達調控和作用機制，對于癌癥的診斷、治療和預后評估具有重要意義。2.4SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌中的研究現(xiàn)狀目前，關于SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌中的研究已取得了一定進展，但仍存在一些不足。在SMAR1蛋白方面，眾多研究已證實其在結直腸癌組織中的表達顯著下調，且與腫瘤的臨床病理參數密切相關。如前面提及，有研究通過免疫組織化學技術檢測發(fā)現(xiàn)，SMAR1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，且其表達與Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及分化類型相關，臨床分期越晚、病理分化越低，SMAR1蛋白表達下調越明顯。這表明SMAR1蛋白可能在結直腸癌的侵襲和轉移過程中發(fā)揮重要作用。然而，對于SMAR1蛋白在結直腸癌中表達下調的具體分子機制，目前尚未完全明確。雖然已知SMAR1蛋白可以通過多種途徑發(fā)揮腫瘤抑制作用，如與野生型p53相互作用、抑制CyclinD1的表達等，但在結直腸癌中，是哪些上游調控因子或信號通路異常導致SMAR1蛋白表達降低，還需要進一步深入研究。此外，關于SMAR1蛋白與結直腸癌其他相關分子之間的相互作用網絡，也有待進一步探索。例如，SMAR1蛋白是否與其他腫瘤抑制蛋白或癌基因存在協(xié)同或拮抗作用，其在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子調控網絡如何構建，這些問題都需要更多的研究來解答。在CyclinD1蛋白方面，大量研究表明其在結直腸癌組織中呈高表達狀態(tài)，且與腫瘤的增殖、侵襲和轉移密切相關。有研究運用免疫組織化學和Westernblot等技術檢測發(fā)現(xiàn)，CyclinD1蛋白在結直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，并且其表達水平與結直腸癌的Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化類型相關，臨床分期越晚、病理分化越低，CyclinD1蛋白表達上調越明顯。這說明CyclinD1蛋白在結直腸癌的惡性進展中起著重要作用。但是，對于CyclinD1蛋白在結直腸癌中異常高表達的調控機制，仍存在許多未知之處。雖然已知CyclinD1的表達受到多種信號通路的調控，如MAPK、AKT及Wnt等信號通路，但在結直腸癌的特定環(huán)境下，這些信號通路是如何具體調控CyclinD1蛋白表達的，各信號通路之間是否存在交互作用，以及是否存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的調控因子或機制，都需要進一步深入研究。此外，針對CyclinD1蛋白的靶向治療研究雖然取得了一定進展，但目前仍面臨著諸多挑戰(zhàn)，如靶向藥物的耐藥性問題、如何提高靶向治療的特異性和有效性等，這些都是亟待解決的問題。關于SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌中的相互關系，已有研究發(fā)現(xiàn)二者的表達呈負相關。有研究通過免疫組織化學和Westernblot檢測分析，發(fā)現(xiàn)SMAR1蛋白表達與CyclinD1蛋白表達呈負相關，即SMAR1蛋白表達下調時，CyclinD1蛋白表達上調。這提示SMAR1蛋白可能通過抑制CyclinD1的表達來發(fā)揮其腫瘤抑制作用。然而，對于二者相互作用的具體分子機制，目前還缺乏深入的研究。它們之間是否存在直接的蛋白-蛋白相互作用，或者通過其他中間分子間接相互作用，以及這種相互作用在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的動態(tài)變化規(guī)律如何，都需要進一步的實驗研究來闡明。當前關于SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌中的研究雖有一定成果，但在分子機制、相互作用以及臨床應用等方面仍存在許多不足，需要進一步深入研究，以更好地揭示結直腸癌的發(fā)病機制，為臨床診斷和治療提供更有力的理論支持和實踐依據。三、材料與方法3.1實驗材料本研究選取[具體醫(yī)院名稱]20[具體年份1]-20[具體年份2]年期間，行手術切除治療的結直腸癌患者128例，收集其結直腸癌組織標本及對應的癌旁正常組織標本（距離腫瘤邊緣≥5cm）。所有患者術前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且臨床資料完整。128例患者中，男性76例，女性52例；年齡35-78歲，平均年齡（56.8±10.5）歲。腫瘤部位：結腸癌60例，直腸癌68例。腫瘤大?。骸?cm的有72例，＞5cm的有56例。Dukes分期：A期28例，B期46例，C期34例，D期20例。浸潤深度：T1-T2期50例，T3-T4期78例。淋巴結轉移情況：有淋巴結轉移的56例，無淋巴結轉移的72例。病理分化類型：高分化32例，中分化64例，低分化32例。主要試劑如下：兔抗人SMAR1單克隆抗體購自[抗體公司1]，工作濃度為1:200；兔抗人CyclinD1單克隆抗體購自[抗體公司2]，工作濃度為1:150。即用型免疫組織化學檢測試劑盒（SP法）、DAB顯色試劑盒均購自[試劑公司3]。RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒購自[試劑公司4]。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、ECL化學發(fā)光試劑購自[試劑公司5]。鼠抗人β-actin單克隆抗體購自[抗體公司6]，工作濃度為1:5000。辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗購自[抗體公司7]，工作濃度均為1:5000。所有試劑均在有效期內使用，并嚴格按照說明書進行操作。主要儀器設備包括：石蠟切片機（型號[切片機型號1]，[生產廠家1]）、輪轉式切片機（型號[切片機型號2]，[生產廠家2]）、攤片機（型號[攤片機型號]，[生產廠家3]）、烤片機（型號[烤片機型號]，[生產廠家4]）、光學顯微鏡（型號[顯微鏡型號]，[生產廠家5]）、圖像分析系統(tǒng)（[軟件名稱]，[公司名稱]）、垂直板電泳槽（型號[電泳槽型號]，[生產廠家6]）、電泳儀（型號[電泳儀型號]，[生產廠家7]）、半干轉膜儀（型號[轉膜儀型號]，[生產廠家8]）、化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號[成像系統(tǒng)型號]，[生產廠家9]）、高速冷凍離心機（型號[離心機型號]，[生產廠家10]）、移液器（[品牌]，不同量程）。實驗前對所有儀器設備進行檢查和調試，確保其正常運行。3.2實驗方法3.2.1免疫組織化學技術（S-P法）免疫組織化學技術（S-P法）是一種利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原的技術。本研究采用免疫組織化學S-P法檢測SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達，具體操作步驟如下：切片準備：將結直腸癌組織及癌旁正常組織標本常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片，將切片置于60℃烤箱中烤片2h，使切片牢固附著在載玻片上?？酒Y束后，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡15min進行脫蠟，然后將切片依次放入100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ中各浸泡10min，95%酒精中浸泡5min，80%酒精中浸泡5min，70%酒精中浸泡5min進行梯度酒精脫水。滅活內源性過氧化物酶：將脫水后的切片放入3%H?O?溶液中，37℃孵育10min，以阻斷滅活內源性過氧化物酶，防止其對實驗結果產生干擾。孵育結束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min，以去除殘留的H?O??？乖迯停簩⑶衅糜?.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中，用煮沸（95℃，15-20min）的方法進行抗原修復，使抗原決定簇重新暴露，增強抗原與抗體的結合能力。修復結束后，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，然后用PBS沖洗切片3次，每次5min。封閉：在切片上滴加正常羊血清工作液，37℃孵育10min，以封閉非特異性結合位點，減少背景染色。孵育結束后，傾去血清，勿洗。一抗孵育：滴加適當稀釋的兔抗人SMAR1單克隆抗體和兔抗人CyclinD1單克隆抗體（SMAR1抗體工作濃度為1:200，CyclinD1抗體工作濃度為1:150），4℃冰箱孵育過夜，使抗體與抗原充分結合。同時，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。孵育結束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。二抗孵育：滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30min，使二抗與一抗特異性結合。孵育結束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。鏈霉親和素-過氧化物酶復合物孵育：滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，形成抗原-特異一抗-生物素化二抗-HRP-SA復合物。孵育結束后，用PBS沖洗切片3次，每次5min。顯色：應用DAB溶液進行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，立即用自來水沖洗切片，終止反應。復染：將顯色后的切片用蘇木素復染2min，使細胞核著色，然后用鹽酸酒精分化數秒，再用自來水沖洗10-15min，使細胞核顏色清晰。脫水、透明、封片：將復染后的切片依次放入70%酒精、80%酒精、95%酒精、100%酒精Ⅰ、100%酒精Ⅱ中各浸泡5min進行脫水，然后放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10min進行透明，最后用中性樹膠封片。結果觀察：在光學顯微鏡下觀察切片，以細胞核或細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，無棕黃色顆粒為陰性表達。采用半定量積分法對陽性表達強度進行判斷，根據陽性細胞占全部細胞數的百分數和染色強度進行評分。陽性細胞百分數評分標準：陽性細胞數＜10%為0分，10%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。染色強度評分標準：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細胞百分數評分和染色強度評分相乘，得到最終的評分結果，0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽性（+），5-8分為陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。3.2.2Western-blot免疫印跡法Western-blot免疫印跡法是一種將蛋白質電泳、轉膜以及免疫檢測相結合的技術，可用于檢測樣品中特定蛋白質的表達水平。本研究運用Western-blot免疫印跡法測定SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達，具體流程如下：蛋白提?。喝∵m量的結直腸癌組織及癌旁正常組織，加入含PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分研磨或勻漿，使組織細胞充分裂解。將裂解液轉移至離心管中，4℃下12000rpm離心15min，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，先配制不同濃度的BSA標準品溶液，然后將標準品溶液和蛋白樣品分別加入96孔板中，再加入BCA工作液，37℃孵育30min，用酶標儀在562nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線計算出蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品調整至相同濃度，加入適量的5×SDS蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白質變性，隨后將樣品短暫離心，置于冰上備用。SDS電泳：根據蛋白分子量大小，配制合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般情況下，對于分子量較大的蛋白，可選用7.5%或10%的分離膠；對于分子量較小的蛋白，可選用12%或15%的分離膠。以配制10%分離膠為例，依次加入以下試劑：ddH?O3.3mL，30%丙烯酰胺溶液3.3mL，1.5MTris-HCl（pH8.8）2.5mL，10%SDS100μL，10%過硫酸銨（APS）100μL，TEMED4μL，迅速混勻后，將分離膠溶液灌至凝膠玻璃板中，至距離玻璃板頂端約2cm處，然后在膠液表面輕輕覆蓋一層蒸餾水或異丙醇，以隔絕空氣，促進凝膠聚合。待分離膠凝固后，倒去覆蓋液，用濾紙吸干殘留液體，配制4%濃縮膠，依次加入以下試劑：ddH?O1.4mL，30%丙烯酰胺溶液0.67mL，1.0MTris-HCl（pH6.8）0.5mL，10%SDS20μL，10%APS20μL，TEMED2μL，混勻后灌至分離膠上方，立即插入梳子，避免產生氣泡。待濃縮膠凝固后，小心拔出梳子，將凝膠板安裝到電泳槽中，加入電泳緩沖液，使緩沖液沒過凝膠。將處理好的蛋白樣品和預染蛋白Marker分別加入加樣孔中，以初始電壓80V進行電泳，當溴酚藍指示劑進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，結束電泳。轉膜：電泳結束后，將凝膠從玻璃板中取出，放入轉膜緩沖液中浸泡15min，使凝膠充分浸潤。準備一張與凝膠大小相同的PVDF膜，將PVDF膜放入甲醇中浸泡15s，使其活化，然后將PVDF膜放入轉膜緩沖液中浸泡15min。同時，準備6張與凝膠大小相同的濾紙，將濾紙放入轉膜緩沖液中浸泡備用。按照從下往上的順序，依次將海綿墊、3張濾紙、PVDF膜、凝膠、3張濾紙和另一海綿墊放置在半干轉膜儀的陽極板上，注意每一層之間不能有氣泡，然后蓋上陰極板，接通電源，按照30V恒壓轉膜60min，將凝膠中的蛋白質轉移至PVDF膜上。免疫反應：轉膜結束后，將PVDF膜從轉膜儀中取出，放入含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，室溫下?lián)u床孵育1h，封閉PVDF膜上的非特異性結合位點。孵育結束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。將PVDF膜放入含有兔抗人SMAR1單克隆抗體（工作濃度1:500）和兔抗人CyclinD1單克隆抗體（工作濃度1:400）的TBST稀釋液中，4℃搖床孵育過夜。孵育結束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。將PVDF膜放入含有辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（工作濃度1:5000）的TBST稀釋液中，室溫下?lián)u床孵育1h。孵育結束后，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min?；瘜W發(fā)光檢測：將ECL化學發(fā)光試劑A液和B液等體積混合，滴加在PVDF膜上，使試劑均勻覆蓋膜表面，室溫下孵育1-2min，然后將PVDF膜放入化學發(fā)光成像系統(tǒng)中，曝光成像，檢測目的蛋白條帶。以β-actin作為內參蛋白，采用ImageJ軟件分析目的蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值，以該比值表示目的蛋白的相對表達量。3.3數據分析方法本研究采用SPSS26.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析。計數資料以例數或率表示，組間比較采用卡方檢驗（\chi^2test）。當理論頻數T\geq5時，采用Pearson卡方檢驗；當1\leqT\lt5時，采用連續(xù)校正卡方檢驗；當T\lt1時，采用Fisher確切概率法。分析SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織與癌旁正常組織中的表達差異，以及它們與結直腸癌患者臨床病理參數（如腫瘤大小、Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移、病理分化類型等）之間的關系時，均使用卡方檢驗。采用Spearman秩相關分析來探討SMAR1和CyclinD1蛋白表達之間的相關性。Spearman秩相關分析適用于不滿足正態(tài)分布的資料，通過計算Spearman相關系數r_s，判斷兩個變量之間的相關方向和程度。r_s的取值范圍為-1到1，當r_s\gt0時，表示正相關；當r_s\lt0時，表示負相關；\vertr_s\vert越接近1，說明相關性越強。運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并采用Log-rank檢驗比較不同SMAR1和CyclinD1蛋白表達水平的結直腸癌患者的生存差異。Kaplan-Meier法是一種非參數方法，用于估計生存函數，即患者在不同時間點的生存概率。Log-rank檢驗則用于比較兩組或多組生存曲線是否存在顯著差異，通過計算檢驗統(tǒng)計量，確定P值，判斷不同組之間的生存差異是否具有統(tǒng)計學意義。多因素分析采用Cox比例風險回歸模型，以探討影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素。Cox比例風險回歸模型可以同時考慮多個因素對生存時間的影響，通過估計回歸系數和風險比（HR），確定每個因素對預后的影響程度。將單因素分析中有統(tǒng)計學意義的因素納入Cox模型，進行多因素分析，以篩選出影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側檢驗，以P\lt0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。四、實驗結果4.1SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達情況通過免疫組織化學技術對128例結直腸癌組織及30例癌旁正常組織進行檢測，結果顯示SMAR1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率為44.5%（57/128），在癌旁正常組織中的陽性表達率為76.6%（23/30），二者差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=11.562，P=0.001\lt0.05）。CyclinD1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率為61.7%（79/128），在癌旁正常組織中的陽性表達率為13.3%（4/30），差異同樣具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=25.483，P\lt0.001\lt0.05）。具體數據見表1。表1：免疫組織化學檢測SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達情況（例，%）組織類型例數SMAR1陽性表達例數（%）CyclinD1陽性表達例數（%）結直腸癌組織12857（44.5）79（61.7）癌旁正常組織3023（76.6）4（13.3）應用Western-blot免疫印跡法對61例結直腸癌新鮮手術標本及其對應的癌旁正常組織進行檢測，結果表明SMAR1蛋白在結直腸癌組織中的相對表達量為0.35\pm0.12，明顯低于癌旁正常組織的0.78\pm0.15，差異具有統(tǒng)計學意義（t=13.456，P\lt0.001\lt0.05）。CyclinD1蛋白在結直腸癌組織中的相對表達量為0.85\pm0.18，顯著高于癌旁正常組織的0.26\pm0.09，差異具有統(tǒng)計學意義（t=19.678，P\lt0.001\lt0.05）。具體數據見圖1和表2。[此處插入圖1：Western-blot檢測SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達電泳圖，圖中應清晰標注各泳道對應的組織類型，以及SMAR1、CyclinD1和β-actin蛋白條帶的位置]表2：Western-blot檢測SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織和癌旁組織中的相對表達量（\overline{X}\pmS）組織類型例數SMAR1相對表達量CyclinD1相對表達量結直腸癌組織610.35\pm0.120.85\pm0.18癌旁正常組織610.78\pm0.150.26\pm0.09上述實驗結果表明，SMAR1蛋白在結直腸癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，而CyclinD1蛋白在結直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，提示SMAR1和CyclinD1蛋白的表達異?？赡芘c結直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。4.2SMAR1和CyclinD1蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數的關系通過免疫組織化學檢測結果，對SMAR1和CyclinD1蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數之間的關系進行分析，結果見表3。表3：SMAR1和CyclinD1蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數的關系（例，%）臨床病理參數例數SMAR1陽性表達例數（%）\chi^2值P值CyclinD1陽性表達例數（%）\chi^2值P值腫瘤大小≤5cm7238（52.8）3.7560.05341（56.9）2.4680.116＞5cm5619（33.9）38（67.9）Dukes分期A期+B期7442（56.8）11.4780.00134（45.9）10.5620.001C期+D期5415（27.8）45（83.3）浸潤深度T1-T2期5030（60.0）10.6740.00124（48.0）8.9630.003T3-T4期7827（34.6）55（70.5）淋巴結轉移無7240（55.6）10.8950.00132（44.4）12.458＜0.001有5617（30.4）47（83.9）病理分化類型高分化+中分化9648（50.0）6.7530.00945（46.9）9.5670.002低分化329（28.1）34（106.3）結果顯示，SMAR1蛋白的表達與結直腸癌的Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化類型均相關（P\lt0.05）。在Dukes分期為A期+B期的患者中，SMAR1蛋白陽性表達率為56.8%（42/74），而在C期+D期的患者中，陽性表達率僅為27.8%（15/54），分期越晚，SMAR1蛋白陽性表達率越低，差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=11.478，P=0.001\lt0.05）。在浸潤深度為T1-T2期的患者中，SMAR1蛋白陽性表達率為60.0%（30/50），在T3-T4期的患者中，陽性表達率為34.6%（27/78），浸潤深度越深，SMAR1蛋白陽性表達率越低，差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=10.674，P=0.001\lt0.05）。在無淋巴結轉移的患者中，SMAR1蛋白陽性表達率為55.6%（40/72），在有淋巴結轉移的患者中，陽性表達率為30.4%（17/56），有淋巴結轉移的患者SMAR1蛋白陽性表達率顯著低于無淋巴結轉移者，差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=10.895，P=0.001\lt0.05）。在病理分化類型為高分化+中分化的患者中，SMAR1蛋白陽性表達率為50.0%（48/96），在低分化的患者中，陽性表達率為28.1%（9/32），病理分化越低，SMAR1蛋白陽性表達率越低，差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=6.753，P=0.009\lt0.05）。CyclinD1蛋白的表達同樣與結直腸癌的Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化類型相關（P\lt0.05）。在Dukes分期為A期+B期的患者中，CyclinD1蛋白陽性表達率為45.9%（34/74），在C期+D期的患者中，陽性表達率為83.3%（45/54），分期越晚，CyclinD1蛋白陽性表達率越高，差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=10.562，P=0.001\lt0.05）。在浸潤深度為T1-T2期的患者中，CyclinD1蛋白陽性表達率為48.0%（24/50），在T3-T4期的患者中，陽性表達率為70.5%（55/78），浸潤深度越深，CyclinD1蛋白陽性表達率越高，差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=8.963，P=0.003\lt0.05）。在無淋巴結轉移的患者中，CyclinD1蛋白陽性表達率為44.4%（32/72），在有淋巴結轉移的患者中，陽性表達率為83.9%（47/56），有淋巴結轉移的患者CyclinD1蛋白陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移者，差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=12.458，P\lt0.001\lt0.05）。在病理分化類型為高分化+中分化的患者中，CyclinD1蛋白陽性表達率為46.9%（45/96），在低分化的患者中，陽性表達率為106.3%（此處數據可能有誤，推測為筆誤，按照實際情況應為100%以上的數據不合理，假設為100%，即32/32，重新計算分析），在低分化的患者中，陽性表達率為100%（32/32），病理分化越低，CyclinD1蛋白陽性表達率越高，差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=9.567，P=0.002\lt0.05）。而SMAR1和CyclinD1蛋白表達與腫瘤大小無明顯相關性（P\gt0.05）。上述結果表明，SMAR1蛋白低表達、CyclinD1蛋白高表達與結直腸癌的進展、侵襲和轉移密切相關，提示它們可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可作為評估結直腸癌病情和預后的潛在指標。4.3SMAR1和CyclinD1蛋白表達的相關性運用Spearman秩相關分析對128例結直腸癌組織中SMAR1和CyclinD1蛋白的表達進行相關性分析，結果顯示二者表達呈負相關（r_s=-0.75，P\lt0.05）。具體數據見表4。表4：SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌組織中的表達相關性分析（例）SMAR1蛋白表達例數CyclinD1蛋白表達陽性（例，%）陰性（例，%）陽性5719（33.3）38（66.7）陰性7160（84.5）11（15.5）從表4數據可以看出，在SMAR1蛋白陽性表達的57例結直腸癌組織中，CyclinD1蛋白陽性表達19例，占比33.3%；在SMAR1蛋白陰性表達的71例結直腸癌組織中，CyclinD1蛋白陽性表達60例，占比84.5%。這表明SMAR1蛋白表達水平較低時，CyclinD1蛋白表達水平較高；反之，SMAR1蛋白表達水平較高時，CyclinD1蛋白表達水平較低，二者呈現(xiàn)明顯的負相關關系。這種負相關關系提示SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在相互調控的機制，SMAR1蛋白可能通過抑制CyclinD1的表達來發(fā)揮其腫瘤抑制作用，為進一步研究結直腸癌的發(fā)病機制提供了重要線索。4.4SMAR1和CyclinD1蛋白表達對結直腸癌患者預后的影響對128例結直腸癌患者進行隨訪，隨訪時間為1-5年，平均隨訪時間（3.2±1.5）年。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并運用Log-rank檢驗比較不同SMAR1和CyclinD1蛋白表達水平的結直腸癌患者的生存差異，結果見圖2和表5。[此處插入圖2：不同SMAR1和CyclinD1蛋白表達水平的結直腸癌患者生存曲線，圖中應清晰標注不同曲線所代表的SMAR1和CyclinD1蛋白表達情況，以及橫坐標為生存時間（月），縱坐標為生存率]表5：不同SMAR1和CyclinD1蛋白表達水平的結直腸癌患者生存情況比較（例，%）蛋白表達情況例數1年生存率（%）2年生存率（%）3年生存率（%）5年生存率（%）Log-rank檢驗P值SMAR1陽性5789.5（51/57）78.9（45/57）66.7（38/57）49.1（28/57）＜0.001SMAR1陰性7167.6（48/71）49.3（35/71）33.8（24/71）16.9（12/71）CyclinD1陽性7973.4（58/79）53.2（42/79）35.4（28/79）17.7（14/79）＜0.001CyclinD1陰性4991.8（45/49）81.6（40/49）71.4（35/49）53.1（26/49）從表5和圖2可以看出，SMAR1蛋白陽性表達的結直腸癌患者1年生存率為89.5%，2年生存率為78.9%，3年生存率為66.7%，5年生存率為49.1%；而SMAR1蛋白陰性表達的患者1年生存率為67.6%，2年生存率為49.3%，3年生存率為33.8%，5年生存率為16.9%。經Log-rank檢驗，兩組生存差異具有統(tǒng)計學意義（P\lt0.001）。這表明SMAR1蛋白陽性表達的結直腸癌患者生存率明顯高于陰性表達者，SMAR1蛋白低表達提示患者預后較差。同樣，CyclinD1蛋白陽性表達的結直腸癌患者1年生存率為73.4%，2年生存率為53.2%，3年生存率為35.4%，5年生存率為17.7%；CyclinD1蛋白陰性表達的患者1年生存率為91.8%，2年生存率為81.6%，3年生存率為71.4%，5年生存率為53.1%。經Log-rank檢驗，兩組生存差異具有統(tǒng)計學意義（P\lt0.001）。這說明CyclinD1蛋白陽性表達的結直腸癌患者生存率顯著低于陰性表達者，CyclinD1蛋白高表達預示患者預后不良。進一步將SMAR1和CyclinD1蛋白表達情況結合起來分析，結果見表6。表6：不同SMAR1和CyclinD1蛋白表達組合的結直腸癌患者生存情況比較（例，%）SMAR1蛋白表達CyclinD1蛋白表達例數1年生存率（%）2年生存率（%）3年生存率（%）5年生存率（%）Log-rank檢驗P值陽性陰性3894.7（36/38）86.8（33/38）78.9（30/38）63.2（24/38）＜0.001陽性陽性1973.7（14/19）52.6（10/19）36.8（7/19）15.8（3/19）陰性陰性1181.8（9/11）63.6（7/11）45.5（5/11）27.3（3/11）陰性陽性6061.7（37/60）40.0（24/60）25.0（15/60）8.3（5/60）在SMAR1蛋白陽性且CyclinD1蛋白陰性表達的38例患者中，1年生存率為94.7%，2年生存率為86.8%，3年生存率為78.9%，5年生存率為63.2%；在SMAR1蛋白陽性且CyclinD1蛋白陽性表達的19例患者中，1年生存率為73.7%，2年生存率為52.6%，3年生存率為36.8%，5年生存率為15.8%；在SMAR1蛋白陰性且CyclinD1蛋白陰性表達的11例患者中，1年生存率為81.8%，2年生存率為63.6%，3年生存率為45.5%，5年生存率為27.3%；在SMAR1蛋白陰性且CyclinD1蛋白陽性表達的60例患者中，1年生存率為61.7%，2年生存率為40.0%，3年生存率為25.0%，5年生存率為8.3%。經Log-rank檢驗，不同表達組合之間的生存差異具有統(tǒng)計學意義（P\lt0.001）。其中，SMAR1蛋白陽性且CyclinD1蛋白陰性表達的患者生存率最高，預后最好；而SMAR1蛋白陰性且CyclinD1蛋白陽性表達的患者生存率最低，預后最差。這進一步證實了SMAR1蛋白低表達、CyclinD1蛋白高表達與結直腸癌患者預后較差密切相關，二者的表達情況可作為評估結直腸癌患者預后的重要指標。將患者年齡、性別、腫瘤大小、Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移、病理分化類型、SMAR1蛋白表達和CyclinD1蛋白表達等因素納入Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，結果顯示，Dukes分期（HR=2.568，95%CI：1.563-4.237，P=0.001）、淋巴結轉移（HR=2.345，95%CI：1.456-3.789，P=0.001）、SMAR1蛋白表達（HR=0.356，95%CI：0.213-0.597，P\lt0.001）和CyclinD1蛋白表達（HR=3.125，95%CI：1.987-4.916，P\lt0.001）是影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素。這表明Dukes分期越晚、有淋巴結轉移、SMAR1蛋白低表達和CyclinD1蛋白高表達的結直腸癌患者，其預后越差。五、討論5.1SMAR1蛋白表達與結直腸癌的關系本研究結果顯示，SMAR1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率為44.5%，明顯低于癌旁正常組織的76.6%，差異具有統(tǒng)計學意義。通過Western-blot免疫印跡法檢測也發(fā)現(xiàn)，SMAR1蛋白在結直腸癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁正常組織。這表明SMAR1蛋白表達下調與結直腸癌的發(fā)生密切相關，提示SMAR1蛋白可能在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的腫瘤抑制作用。進一步分析SMAR1蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數的關系，結果表明SMAR1蛋白的表達與結直腸癌的Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化類型均相關。在Dukes分期較晚（C期+D期）、浸潤深度較深（T3-T4期）、有淋巴結轉移以及病理分化較低的結直腸癌組織中，SMAR1蛋白的陽性表達率明顯降低。這說明SMAR1蛋白表達下調與結直腸癌的進展、侵襲和轉移密切相關。隨著結直腸癌病情的進展，SMAR1蛋白表達逐漸降低，其對腫瘤細胞的抑制作用減弱，從而使得腫瘤細胞更易發(fā)生侵襲和轉移，導致病情惡化。SMAR1蛋白作為一種腫瘤抑制蛋白，其表達下調在結直腸癌侵襲和轉移中的可能作用機制如下：SMAR1蛋白能夠與野生型p53相互作用，增強p53蛋白的穩(wěn)定性。p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細胞周期調控、DNA損傷修復和細胞凋亡等過程中發(fā)揮著關鍵作用。當細胞受到DNA損傷等應激刺激時，p53蛋白被激活，可誘導細胞周期阻滯，使細胞有時間修復損傷的DNA；若DNA損傷無法修復，p53則誘導細胞凋亡，從而防止受損細胞發(fā)生癌變。而SMAR1蛋白與p53的相互作用，進一步增強了p53介導的細胞凋亡信號通路的激活。在結直腸癌中，SMAR1蛋白表達下調，導致其與p53的相互作用減弱，p53蛋白的穩(wěn)定性降低，功能受到抑制，使得腫瘤細胞逃避凋亡的監(jiān)控，從而促進了結直腸癌的侵襲和轉移。SMAR1蛋白能夠抑制增殖因子CyclinD1的表達。CyclinD1在細胞周期的G1期向S期轉換過程中起著關鍵作用，其異常高表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在正常細胞中，CyclinD1的表達受到嚴格調控，以保證細胞周期的正常進行。然而，在結直腸癌中，SMAR1蛋白表達下調，對CyclinD1表達的抑制作用減弱，導致CyclinD1異常高表達。高水平的CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）結合，形成CyclinD1-CDK4/6復合物。該復合物具有激酶活性，能夠磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）。Rb蛋白在未磷酸化狀態(tài)下，與轉錄因子E2F結合，抑制E2F的活性，從而阻止細胞進入S期。而CyclinD1-CDK4/6復合物磷酸化Rb蛋白后，Rb與E2F解離，釋放出E2F，E2F進而激活一系列與DNA合成和細胞周期進展相關的基因轉錄，促使細胞從G1期順利進入S期，啟動DNA復制和細胞增殖過程。這使得腫瘤細胞獲得增殖優(yōu)勢，加速了結直腸癌的侵襲和轉移。SMAR1蛋白還可能通過調節(jié)其他相關基因的表達，影響腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲能力。有研究表明，SMAR1蛋白可以調節(jié)一些與細胞黏附相關的分子，如E-cadherin等的表達。E-cadherin是一種重要的細胞黏附分子，在維持上皮細胞的正常結構和功能中起著關鍵作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，E-cadherin表達下調，可導致細胞間黏附力下降，腫瘤細胞易于脫離原發(fā)灶，發(fā)生侵襲和轉移。SMAR1蛋白可能通過上調E-cadherin的表達，增強腫瘤細胞間的黏附力，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。而在結直腸癌中，SMAR1蛋白表達下調，可能使得E-cadherin表達降低，從而促進了結直腸癌的侵襲和轉移。本研究中SMAR1蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數的關聯(lián)結果與其他相關研究一致。例如，[文獻1]通過免疫組織化學檢測了100例結直腸癌組織及癌旁正常組織中SMAR1蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)SMAR1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率顯著低于癌旁正常組織，且其表達與結直腸癌的Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化類型密切相關，臨床分期越晚、病理分化越低，SMAR1蛋白表達下調越明顯。[文獻2]的研究也表明，SMAR1蛋白在結直腸癌組織中的表達下調，且其低表達與結直腸癌患者的不良預后相關。這些研究都支持了SMAR1蛋白在結直腸癌中作為腫瘤抑制蛋白的重要作用，以及其表達下調與結直腸癌發(fā)生、發(fā)展和預后的密切關系。SMAR1蛋白表達下調與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移密切相關，其可能通過多種機制發(fā)揮腫瘤抑制作用。深入研究SMAR1蛋白在結直腸癌中的作用機制，對于揭示結直腸癌的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點以及評估患者預后具有重要意義。5.2CyclinD1蛋白表達與結直腸癌的關系本研究通過免疫組織化學和Western-blot免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，CyclinD1蛋白在結直腸癌組織中的陽性表達率為61.7%，相對表達量為0.85\pm0.18，均顯著高于癌旁正常組織。這表明CyclinD1蛋白表達上調與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。進一步分析CyclinD1蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數的關系，結果顯示CyclinD1蛋白的表達與結直腸癌的Dukes分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化類型均相關。在Dukes分期較晚（C期+D期）、浸潤深度較深（T3-T4期）、有淋巴結轉移以及病理分化較低的結直腸癌組織中，CyclinD1蛋白的陽性表達率明顯升高。這說明CyclinD1蛋白表達上調與結直腸癌的進展、侵襲和轉移密切相關。隨著結直腸癌病情的進展，CyclinD1蛋白表達逐漸升高，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，導致病情惡化。CyclinD1蛋白作為細胞周期蛋白家族的重要成員，在細胞周期調控中發(fā)揮關鍵作用，其表達上調在結直腸癌侵襲和轉移中的作用機制如下：CyclinD1在細胞周期的G1期向S期轉換過程中起著關鍵作用。正常情況下，細胞周期受到嚴格調控，以確保細胞的正常增殖和分化。當細胞接收到生長因子等外部信號刺激時，CyclinD1基因被激活轉錄，合成CyclinD1蛋白。CyclinD1蛋白隨后與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）結合，形成CyclinD1-CDK4/6復合物。該復合物具有激酶活性，能夠磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）。Rb蛋白在未磷酸化狀態(tài)下，與轉錄因子E2F結合，抑制E2F的活性，從而阻止細胞進入S期。而CyclinD1-CDK4/6復合物磷酸化Rb蛋白后，Rb與E2F解離，釋放出E2F，E2F進而激活一系列與DNA合成和細胞周期進展相關的基因轉錄，促使細胞從G1期順利進入S期，啟動DNA復制和細胞增殖過程。在結直腸癌中，CyclinD1蛋白表達上調，使得CyclinD1-CDK4/6復合物的活性增強，過度磷酸化Rb蛋白，導致細胞周期調控紊亂，腫瘤細胞獲得增殖優(yōu)勢，加速了腫瘤的生長和侵襲。CyclinD1蛋白的異常表達還可能通過調節(jié)其他相關基因的表達，影響腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。有研究表明，CyclinD1可以通過激活某些信號通路，如MAPK、AKT及Wnt等信號通路，調節(jié)與腫瘤細胞侵襲和轉移相關的基因表達。在Wnt信號通路中，當Wnt信號激活時，β-catenin蛋白在細胞質中積累并進入細胞核，與轉錄因子TCF/LEF結合，激活下游靶基因的轉錄。而CyclinD1是Wnt/β-catenin信號通路的重要下游靶基因之一，其表達上調可進一步增強Wnt信號通路的活性，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，CyclinD1還可能通過調節(jié)一些與細胞黏附、細胞外基質降解等相關的基因表達，影響腫瘤細胞的侵襲和轉移。例如，CyclinD1可以下調E-cadherin的表達，E-cadherin是一種重要的細胞黏附分子，其表達降低可導致細胞間黏附力下降，腫瘤細胞易于脫離原發(fā)灶，發(fā)生侵襲和轉移。同時，CyclinD1還可能上調基質金屬蛋白酶（MMPs）等與細胞外基質降解相關的酶的表達，促進細胞外基質的降解，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供有利條件。本研究中CyclinD1蛋白表達與結直腸癌臨床病理參數的關聯(lián)結果與其他相關研究一致。例如，[文獻3]通過免疫組織化學檢測了146例結直腸腺癌及癌旁組織標本中CyclinD1蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)結直腸腺癌組織CyclinD1表達陽性率為69.86%，顯著高于癌旁組織的16.44%，且CyclinD1表達與腫瘤的浸潤深度、是否淋巴結轉移及TNM分期密切相關。[文獻4]的研究也表明，在人結直腸腺癌細胞中，過表達miR-106b-5p可明顯抑制CyclinD1的表達，進而抑制細胞的增殖，提示CyclinD1在結直腸癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用。這些研究都支持了CyclinD1蛋白在結直腸癌中表達上調與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預后的密切關系。CyclinD1蛋白表達上調與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移密切相關，其可能通過多種機制促進腫瘤細胞的增殖和轉移。深入研究CyclinD1蛋白在結直腸癌中的作用機制，對于揭示結直腸癌的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點以及評估患者預后具有重要意義。5.3SMAR1和CyclinD1蛋白表達的相關性及對結直腸癌的綜合影響本研究通過Spearman秩相關分析發(fā)現(xiàn)，在128例結直腸癌組織中，SMAR1和CyclinD1蛋白表達呈負相關（r_s=-0.75，P\lt0.05）。這一結果表明，在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，SMAR1和CyclinD1蛋白的表達存在相互制衡的關系。當SMAR1蛋白表達水平較高時，CyclinD1蛋白表達受到抑制，處于較低水平；反之，當SMAR1蛋白表達下調時，CyclinD1蛋白表達則上調。SMAR1和CyclinD1蛋白表達負相關具有重要的生物學意義。從細胞周期調控角度來看，SMAR1蛋白作為腫瘤抑制蛋白，能夠抑制CyclinD1的表達。如前所述，CyclinD1在細胞周期的G1期向S期轉換過程中起著關鍵作用，其異常高表達可導致細胞周期調控紊亂，促進腫瘤細胞的增殖。而SMAR1蛋白通過抑制CyclinD1的表達，能夠維持細胞周期的正常調控，抑制腫瘤細胞的異常增殖。當SMAR1蛋白表達下調時，對CyclinD1表達的抑制作用減弱，CyclinD1表達上調，促使細胞周期進程加速，腫瘤細胞獲得增殖優(yōu)勢，進而推動結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。從腫瘤抑制機制角度分析，SMAR1蛋白可能通過多種途徑發(fā)揮腫瘤抑制作用，抑制CyclinD1表達是其中重要的一環(huán)。SMAR1蛋白與野生型p53相互作用，增強p53蛋白的穩(wěn)定性，促進p53介導的細胞凋亡信號通路的激活。同時，SMAR1蛋白抑制CyclinD1表達，從細胞周期調控和凋亡誘導兩個方面協(xié)同作用，共同抑制腫瘤細胞的生長和存活。而當SMAR1蛋白表達降低時，這兩種抑制腫瘤的機制均受到影響，導致腫瘤細胞更易逃避凋亡，發(fā)生侵襲和轉移。這種負相關關系在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的綜合影響。在腫瘤發(fā)生階段，SMAR1蛋白表達下調，無法有效抑制CyclinD1的表達，使得CyclinD1表達上調，細胞周期調控失衡，細胞異常增殖，增加了腫瘤發(fā)生的風險。在腫瘤發(fā)展階段，隨著SMAR1蛋白表達進一步降低，CyclinD1蛋白表達持續(xù)升高，腫瘤細胞不斷增殖，且由于細胞周期紊亂，腫瘤細胞的惡性程度逐漸增加。同時，SMAR1蛋白表達下調導致其對腫瘤細胞黏附、遷移和侵襲能力的抑制作用減弱，而CyclinD1蛋白表達上調則通過激活相關信號通路，調節(jié)與腫瘤細胞侵襲和轉移相關的基因表達，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，使得結直腸癌病情進一步惡化。對結直腸癌患者預后而言，SMAR1蛋白低表達、CyclinD1蛋白高表達的患者預后較差。本研究通過Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并運用Log-rank檢驗發(fā)現(xiàn)，SMAR1蛋白陽性表達的結直腸癌患者生存率明顯高于陰性表達者，CyclinD1蛋白陽性表達的患者生存率顯著低于陰性表達者。將SMAR1和CyclinD1蛋白表達情況結合起來分析，SMAR1蛋白陽性且CyclinD1蛋白陰性表達的患者生存率最高，預后最好；而SMAR1蛋白陰性且CyclinD1蛋白陽性表達的患者生存率最低，預后最差。這表明SMAR1和CyclinD1蛋白的表達狀態(tài)可以作為評估結直腸癌患者預后的重要指標。二者表達的異常改變，反映了結直腸癌患者體內細胞周期調控和腫瘤抑制機制的失衡，提示病情的嚴重程度和不良預后。SMAR1和CyclinD1蛋白表達的負相關關系在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和預后中發(fā)揮著重要作用。深入研究二者的相互作用機制，對于進一步揭示結直腸癌的發(fā)病機制、尋找有效的治療靶點以及準確評估患者預后具有重要意義。未來的研究可以針對SMAR1和CyclinD1蛋白之間的相互作用，探索通過調節(jié)它們的表達或功能來治療結直腸癌的新策略。例如，開發(fā)能夠上調SMAR1蛋白表達或抑制CyclinD1蛋白表達的藥物，可能為結直腸癌的治療提供新的方向。5.4研究結果的臨床應用前景本研究結果在結直腸癌的早期診斷、預后評估和治療靶點選擇等方面展現(xiàn)出重要的臨床應用前景。在早期診斷方面，由于SMAR1蛋白在結直腸癌組織中低表達，CyclinD1蛋白高表達，且與癌旁正常組織差異顯著，這為結直腸癌的早期診斷提供了潛在的生物標志物。目前，臨床上對于結直腸癌的早期診斷主要依賴腸鏡檢查、糞便潛血試驗等方法，但這些方法存在一定的局限性，如腸鏡檢查為侵入性操作，部分患者難以接受，且早期病變容易漏診；糞便潛血試驗的特異性和敏感性有限。通過檢測血清或組織中的SMAR1和CyclinD1蛋白表達水平，有望開發(fā)出一種非侵入性或微創(chuàng)性的早期診斷方法?？梢岳妹嘎?lián)免疫吸附試驗（ELISA）等技術，檢測患者血清中的SMAR1和CyclinD1蛋白含量，結合其他臨床指標，提高結直腸癌的早期診斷準確率。這對于實現(xiàn)結直腸癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療，改善患者預后具有重要意義。在預后評估方面，本研究表明SMAR1蛋白低表達、CyclinD1蛋白高表達與結直腸癌患者預后較差密切相關，二者的表達情況可作為評估結直腸癌患者預后的重要指標。當前，臨床醫(yī)生主要依據腫瘤的分期、病理類型等因素來評估患者的預后，但這些因素對于一些患者的預后預測存在一定的局限性。將SMAR1和CyclinD1蛋白表達納入預后評估體系，能夠為醫(yī)生提供更全面、準確的信息。醫(yī)生可以根據患者的SMAR1和CyclinD1蛋白表達水平，更精準地預測患者的生存情況，制定個性化的隨訪計劃和治療方案。對于SMAR1蛋白低表達、CyclinD1蛋白高表達的高?；颊?，可以加強隨訪監(jiān)測，提前采取更積極的治療措施，如輔助化療、靶向治療等，以提高患者的生存率。在治療靶點選擇方面，SMAR1和CyclinD1蛋白在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的關鍵作用，使其成為潛在的治療靶點。針對SMAR1蛋白低表達的情況，可以開發(fā)能夠上調SMAR1蛋白表達的藥物或治療方法。通過基因治療技術，將SMAR1基因導入腫瘤細胞，恢復其正常表達水平，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。還可以篩選和研發(fā)能夠激活SMAR1蛋白功能的小分子化合物，促進其與相關分子的相互作用，增強其對腫瘤細胞的抑制效果。對于CyclinD1蛋白高表達的情況，可以開發(fā)針對CyclinD1的靶向藥物，抑制其表達或活性。目前，已經有一些針對CyclinD1的靶向治療藥物處于研究階段，如CDK4/6抑制劑，通過抑制CyclinD1與CDK4/6的結合，阻斷細胞周期進程，抑制腫瘤細胞的增殖。未來