Met和P-Akt表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)關(guān)聯(lián)研究：機(jī)制、臨床意義與治療啟示一、引言1.1研究背景胃癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。在全球范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率和死亡率均居于前列，其高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率更是給患者的生命帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。盡管目前在胃癌的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等多種手段的綜合應(yīng)用，但總體治療效果仍不盡人意，患者的5年生存率仍有待提高。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，具有重要的臨床意義。血管生成擬態(tài)（vasculogenicmimicry，VM）是一種近年來(lái)備受關(guān)注的腫瘤微循環(huán)模式。與傳統(tǒng)的由血管內(nèi)皮細(xì)胞形成的血管不同，VM是由腫瘤細(xì)胞自身變形并重塑細(xì)胞外基質(zhì)而形成的類血管通道，能夠?yàn)槟[瘤提供血供。這一概念的提出，打破了以往認(rèn)為腫瘤血管僅由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的傳統(tǒng)觀念，為腫瘤血管生成機(jī)制的研究開辟了新的方向。研究表明，VM在多種高度侵襲性腫瘤中存在，如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等，并且與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。在胃癌中，VM的存在也逐漸被證實(shí)，但其具體的形成機(jī)制以及在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍有待進(jìn)一步深入研究。Met基因編碼的蛋白是一種跨膜酪氨酸激酶受體，即肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（HGFR）。在正常生理情況下，Met參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等過(guò)程。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Met基因常常發(fā)生異常激活，其激活方式包括基因擴(kuò)增、突變、蛋白過(guò)表達(dá)以及與配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）的異常結(jié)合等。激活后的Met通過(guò)一系列復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-Akt通路等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移、侵襲以及血管生成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt），又稱PKB，是PI3K-Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白。在正常細(xì)胞中，Akt處于非活化狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，PI3K被激活，使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，招募Akt至細(xì)胞膜，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt的蘇氨酸殘基Thr308和絲氨酸殘基Ser473發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)kt，即P-Akt。激活后的P-Akt通過(guò)調(diào)節(jié)下游一系列靶蛋白的活性，如Bad、caspase-9、FOXO家族、mTOR等，參與細(xì)胞的增殖、存活、凋亡、代謝、遷移和侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K-Akt信號(hào)通路常常異常激活，導(dǎo)致P-Akt高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥性的產(chǎn)生。目前，關(guān)于Met、P-Akt與胃癌血管生成擬態(tài)之間的關(guān)系研究尚處于起步階段。已有研究表明，在某些腫瘤中，Met和P-Akt的激活與VM的形成存在一定關(guān)聯(lián)，但在胃癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。深入探討Met和P-Akt在胃癌中的表達(dá)情況，以及它們與胃癌血管生成擬態(tài)的關(guān)系，不僅有助于進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為胃癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和思路，具有重要的理論和臨床價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)檢測(cè)Met和P-Akt在胃癌組織中的表達(dá)水平，分析它們與胃癌血管生成擬態(tài)之間的相關(guān)性，探討三者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。具體而言，研究目的包括：明確Met和P-Akt在胃癌組織中的表達(dá)情況，并與正常胃黏膜組織進(jìn)行對(duì)比，以揭示其在胃癌中的異常表達(dá)規(guī)律；通過(guò)免疫組化、熒光染色等技術(shù)，觀察Met、P-Akt的表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)形成之間的關(guān)系，確定它們是否參與VM的調(diào)控；進(jìn)一步深入研究Met和P-Akt影響胃癌血管生成擬態(tài)的潛在分子機(jī)制，為后續(xù)的靶向治療提供理論基礎(chǔ)；評(píng)估Met、P-Akt及VM作為胃癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的臨床價(jià)值，為胃癌的精準(zhǔn)診療提供新的思路和方法。本研究具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。在理論方面，深入探討Met和P-Akt與胃癌血管生成擬態(tài)的關(guān)系，有助于進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，完善腫瘤血管生成理論體系，為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究提供新的視角和方向。在臨床實(shí)踐中，若能明確三者之間的關(guān)系，將為胃癌的早期診斷提供更為精準(zhǔn)的生物標(biāo)志物，提高胃癌的早期診斷率，為患者爭(zhēng)取更多的治療時(shí)機(jī)；為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)，基于這些靶點(diǎn)開發(fā)針對(duì)性的靶向治療藥物，有望提高治療效果，減少不良反應(yīng)，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量；對(duì)于評(píng)估胃癌患者的預(yù)后也具有重要意義，通過(guò)檢測(cè)Met、P-Akt及VM的表達(dá)情況，能夠更準(zhǔn)確地判斷患者的病情進(jìn)展和預(yù)后情況，為制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，關(guān)于腫瘤血管生成擬態(tài)的研究起步較早。1999年，Maniotis等首次在侵襲性葡萄膜黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)現(xiàn)象，打破了傳統(tǒng)觀念中腫瘤血管僅由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的認(rèn)知，此后，VM成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。眾多研究表明，VM在多種惡性腫瘤中存在，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等。在胃癌研究方面，國(guó)外學(xué)者通過(guò)免疫組化、熒光染色等技術(shù)，證實(shí)了胃癌組織中VM的存在，并發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。例如，有研究對(duì)不同分期的胃癌組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VM陽(yáng)性的胃癌患者，其腫瘤侵襲深度更深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，5年生存率明顯低于VM陰性患者。在Met基因與腫瘤的研究領(lǐng)域，國(guó)外開展了大量深入的基礎(chǔ)和臨床研究。明確了Met基因在多種腫瘤中存在異常激活，包括擴(kuò)增、突變和過(guò)表達(dá)等形式，并且其激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。針對(duì)Met基因的靶向治療研究也取得了顯著進(jìn)展，多種Met抑制劑如克唑替尼、卡博替尼等已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，并在部分?jǐn)y帶Met基因異常的腫瘤患者中顯示出良好的療效。然而，在胃癌中，Met基因異常激活的具體機(jī)制及其與VM的關(guān)系研究仍相對(duì)較少。對(duì)于PI3K-Akt信號(hào)通路，國(guó)外研究已經(jīng)全面而深入地揭示了其在細(xì)胞增殖、存活、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控作用，以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要角色。在胃癌中，也有研究報(bào)道PI3K-Akt信號(hào)通路的異常激活與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。但關(guān)于P-Akt在胃癌VM形成中的具體作用及機(jī)制，尚未有系統(tǒng)的研究報(bào)道。國(guó)內(nèi)對(duì)胃癌血管生成擬態(tài)、Met和P-Akt的研究也在逐步開展。在VM方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物模型和臨床標(biāo)本檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)了胃癌VM的存在，并對(duì)其形成的相關(guān)因素進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)VM的形成與腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑密切相關(guān)。在Met基因和P-Akt的研究中，國(guó)內(nèi)也有研究表明，Met在胃癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與胃癌的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)；P-Akt在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常胃黏膜組織，并且與胃癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于三者之間相互關(guān)系的研究仍處于起步階段，缺乏深入系統(tǒng)的研究。綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于胃癌血管生成擬態(tài)、Met和P-Akt各自的研究已取得一定成果，但關(guān)于Met和P-Akt與胃癌血管生成擬態(tài)之間關(guān)系的研究尚存在不足。大多數(shù)研究?jī)H停留在對(duì)三者表達(dá)情況的檢測(cè)以及兩兩之間相關(guān)性的初步分析，對(duì)于它們之間具體的調(diào)控機(jī)制，特別是Met和P-Akt如何協(xié)同作用影響胃癌血管生成擬態(tài)的形成，以及這種關(guān)系在胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用尚未明確。本研究將在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，深入探討Met和P-Akt在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌血管生成擬態(tài)的關(guān)系，進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的臨床診療提供新的靶點(diǎn)和思路。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌概述胃癌是指源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，在胃部惡性腫瘤中占比超過(guò)95%，其中絕大多數(shù)為腺癌。胃癌的發(fā)病是一個(gè)多步驟、多因素的復(fù)雜過(guò)程，涉及遺傳、環(huán)境、飲食以及幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染等多種因素。遺傳因素在胃癌發(fā)病中具有重要作用，某些家族中存在遺傳易感性，攜帶特定基因突變的個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。環(huán)境因素如長(zhǎng)期暴露于化學(xué)致癌物、高鹽飲食、吸煙等，也會(huì)增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。其中，Hp感染被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，1994年世界衛(wèi)生組織（WHO）的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將Hp感染定為人類Ⅰ類致癌原。在Hp感染、不良環(huán)境與不健康飲食等多種因素的共同作用下，胃黏膜細(xì)胞的增殖和凋亡之間的正常動(dòng)態(tài)平衡被打破，胃黏膜可經(jīng)歷“慢性炎癥——萎縮性胃炎——萎縮性胃炎伴腸上皮化生——異型增生”的過(guò)程，逐漸向胃癌演變。按照病情發(fā)展時(shí)期，胃癌可分為早期胃癌和進(jìn)展期胃癌。早期胃癌大多無(wú)明顯癥狀體征，或僅表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如消化不良、上腹隱痛等，這使得早期診斷較為困難。隨著病情進(jìn)展到進(jìn)展期胃癌，最常見的癥狀是體重減輕和上腹疼痛，還可能出現(xiàn)類似胃炎、胃潰瘍的癥狀，如上腹飽脹不適、食欲減退、黑便等。從病理類型來(lái)看，WHO在2000年將胃癌分為腺癌（腸型和彌漫型）、乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌、腺鱗癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、未分化癌及其他類型，其中腺癌最為常見，占胃癌總數(shù)的90%以上。在全球范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率和死亡率均較高。根據(jù)Globalcancerstatistics2022年的數(shù)據(jù)，胃癌是全球發(fā)病率和死亡率第五的常見惡性腫瘤，每年發(fā)病約97萬(wàn)例、死亡約66萬(wàn)例。胃癌的發(fā)病具有明顯的地域差異，高發(fā)于亞洲，亞洲地區(qū)的發(fā)病病例數(shù)占全球的71.4%，死亡病例數(shù)占全球的70.1%。在中國(guó)，胃癌同樣是常見的惡性腫瘤，新發(fā)病例數(shù)占全球總數(shù)的37%，死亡病例數(shù)占全球總數(shù)的39%，發(fā)病率排名第五，死亡率排名第三。由于中國(guó)人口基數(shù)龐大，且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，我國(guó)胃癌疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)峻。目前，胃癌的治療總體策略是以手術(shù)為主的綜合治療。對(duì)于早期胃癌且無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的患者，可采取內(nèi)鏡治療，如內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)（EMR）或內(nèi)鏡下黏膜下剝離術(shù)（ESD），這些內(nèi)鏡治療方法具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，能夠保留胃的正常結(jié)構(gòu)和功能，提高患者的生活質(zhì)量。進(jìn)展期胃癌在無(wú)全身轉(zhuǎn)移時(shí)，可行手術(shù)治療，手術(shù)方式包括胃大部切除術(shù)、全胃切除術(shù)、胃周淋巴結(jié)清掃術(shù)等，手術(shù)的目的是盡可能切除腫瘤組織，清掃淋巴結(jié)，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。然而，手術(shù)治療存在一定局限性，如對(duì)于一些晚期胃癌患者，腫瘤可能已經(jīng)侵犯周圍重要臟器或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無(wú)法進(jìn)行根治性手術(shù)切除；手術(shù)本身也會(huì)對(duì)患者的身體造成較大創(chuàng)傷，術(shù)后可能出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如吻合口瘺、出血、腸梗阻等，影響患者的康復(fù)和預(yù)后?；熓俏赴┚C合治療的重要組成部分，通常用于進(jìn)展期胃癌患者，可在手術(shù)前、手術(shù)后或無(wú)法手術(shù)的患者中應(yīng)用?；煼桨傅闹贫ㄐ韪鶕?jù)胃癌的分期、病理類型、患者的身體狀況和耐受性等因素進(jìn)行個(gè)體化選擇，常用的化療藥物包括氟尿嘧啶類、鉑類、紫杉醇類等，可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用?；熗ㄟ^(guò)使用細(xì)胞毒性藥物來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，這些不良反應(yīng)會(huì)降低患者的生活質(zhì)量，影響化療的順利進(jìn)行，甚至導(dǎo)致部分患者因無(wú)法耐受而中斷治療。放療主要用于局部晚期的胃癌患者，旨在縮小腫瘤、減輕癥狀、提高手術(shù)切除率等；對(duì)于無(wú)法手術(shù)的晚期胃癌患者，放療也可作為姑息性治療手段，緩解患者的疼痛等癥狀。隨著放療技術(shù)的不斷發(fā)展，三維適形放療、調(diào)強(qiáng)放療等精確放療技術(shù)已廣泛應(yīng)用于胃癌的治療，這些技術(shù)能夠更準(zhǔn)確地定位腫瘤，減少對(duì)周圍正常組織的損傷，提高治療效果。但放療同樣存在副作用，如放射性胃炎、放射性腸炎等，會(huì)對(duì)患者的胃腸道功能造成損害。近年來(lái)，靶向治療和免疫治療等新興治療手段為胃癌患者帶來(lái)了新的希望。靶向治療藥物如曲妥珠單抗，針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）陽(yáng)性的胃癌患者，能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)，精準(zhǔn)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，與傳統(tǒng)化療藥物相比，具有療效好、副作用相對(duì)較小的優(yōu)勢(shì)。然而，并非所有胃癌患者都適用靶向治療，僅部分患者存在特定的靶點(diǎn)突變或過(guò)表達(dá)，且長(zhǎng)期使用靶向藥物可能會(huì)出現(xiàn)耐藥問(wèn)題，限制了其療效的持續(xù)發(fā)揮。免疫治療通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)來(lái)識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，在部分胃癌患者中顯示出較好的療效。但免疫治療也存在一定的局限性，如免疫相關(guān)不良反應(yīng)，包括皮膚毒性、內(nèi)分泌毒性、胃腸道毒性等，以及部分患者對(duì)免疫治療無(wú)響應(yīng)或響應(yīng)率較低等問(wèn)題。綜上所述，胃癌作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療手段多樣但均存在一定局限性。深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和更有效的治療策略，對(duì)于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。2.2血管生成擬態(tài)（VM）2.2.1VM的概念與發(fā)現(xiàn)歷程血管生成擬態(tài)（vasculogenicmimicry，VM）這一概念由Maniotis等在1999年首次提出。當(dāng)時(shí)，他們?cè)趯?duì)侵襲性葡萄膜黑色素瘤進(jìn)行研究時(shí)，通過(guò)特殊的染色技術(shù)和顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在一種不同于傳統(tǒng)血管的微循環(huán)模式。這種模式下，腫瘤細(xì)胞自身發(fā)生變形，相互連接并重塑細(xì)胞外基質(zhì)，形成了類似血管的通道結(jié)構(gòu)，這些通道能夠?yàn)槟[瘤組織提供血液供應(yīng)，保障腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)攝取和代謝廢物排出，他們將這種現(xiàn)象命名為血管生成擬態(tài)。在傳統(tǒng)觀念中，腫瘤血管主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)增殖、遷移等過(guò)程形成血管網(wǎng)絡(luò)，為腫瘤生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。VM的發(fā)現(xiàn)打破了這一傳統(tǒng)認(rèn)知，揭示了腫瘤血管生成的多樣性和復(fù)雜性。此后，VM現(xiàn)象在多種高度侵襲性腫瘤中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌等，逐漸成為腫瘤研究領(lǐng)域的重要熱點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，人們對(duì)VM的認(rèn)識(shí)也在逐步深化。研究者們通過(guò)多種技術(shù)手段，包括免疫組化、熒光顯微鏡、電子顯微鏡以及分子生物學(xué)技術(shù)等，進(jìn)一步明確了VM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和形成機(jī)制。這些研究不僅豐富了我們對(duì)腫瘤血管生成機(jī)制的理解，也為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的視角和思路。2.2.2VM的形成機(jī)制與生物學(xué)意義VM的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為以及細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，其機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程在VM形成中起著關(guān)鍵作用。在某些信號(hào)通路的激活下，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，上皮細(xì)胞特征逐漸喪失，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，如細(xì)胞極性消失、E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)、波形蛋白表達(dá)上調(diào)等。這使得腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠脫離原發(fā)灶，遷移到周圍組織中，并通過(guò)相互連接形成管腔樣結(jié)構(gòu)，為VM的形成奠定基礎(chǔ)。例如，在黑色素瘤中，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)通路的激活可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)VM的形成。腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑是VM形成的重要環(huán)節(jié)。腫瘤細(xì)胞分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）等，這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等。細(xì)胞外基質(zhì)的降解為腫瘤細(xì)胞的遷移提供了空間，同時(shí)也釋放出一些生物活性分子，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和分化。腫瘤細(xì)胞在降解細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，還會(huì)合成和分泌一些新的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如纖連蛋白、玻連蛋白等，這些成分參與VM管腔樣結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，使其更加穩(wěn)定和成熟。例如，MMP-2和MMP-9能夠降解基底膜中的膠原蛋白Ⅳ，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和VM的形成。某些基因和蛋白的表達(dá)異常也與VM的形成密切相關(guān)。例如，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）在VM形成中發(fā)揮重要作用。eNOS催化產(chǎn)生的一氧化氮（NO）能夠調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮，同時(shí)還參與細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，eNOS的高表達(dá)可促進(jìn)VM的形成，其機(jī)制可能與NO調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力有關(guān)。EphA2受體及其配體EphrinA1在VM形成中也具有重要作用。EphA2與EphrinA1結(jié)合后，可激活下游的信號(hào)通路，如PI3K-Akt、Ras-Raf-MEK-ERK等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而促進(jìn)VM的形成。VM的存在對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為具有重要意義。在腫瘤生長(zhǎng)方面，VM為腫瘤組織提供了額外的血液供應(yīng)途徑，補(bǔ)充了傳統(tǒng)血管生成方式的不足，能夠更有效地滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧氣的需求，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和體積增大。研究表明，在VM陽(yáng)性的腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞的增殖活性明顯高于VM陰性的腫瘤組織，腫瘤的生長(zhǎng)速度更快。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，VM為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供了便捷通道。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)VM直接進(jìn)入血管腔，然后隨血流播散到遠(yuǎn)處器官，增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，VM陽(yáng)性的腫瘤患者，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率明顯高于VM陰性的患者，預(yù)后更差。VM還可能通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干細(xì)胞特性的獲得，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。2.2.3VM在胃癌中的研究現(xiàn)狀近年來(lái)，VM在胃癌中的研究逐漸受到關(guān)注。在檢測(cè)方法上，目前常用的是CD34/PAS雙重染色法。通過(guò)該方法，VM表現(xiàn)為PAS陽(yáng)性物質(zhì)襯附于腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的管腔樣結(jié)構(gòu)，且管腔內(nèi)未見CD34染色陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，以此可與傳統(tǒng)的內(nèi)皮依賴性血管相區(qū)分。免疫熒光染色技術(shù)也可用于檢測(cè)VM相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，如EphA2、VE-cadherin等，進(jìn)一步明確VM的存在和分布情況。眾多研究表明，VM與胃癌的多項(xiàng)臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。戴佳文等研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中VM生成與腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤侵襲深度、TNM分期、胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管中有無(wú)癌栓均相關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，腫瘤越大、分化程度越低、侵襲深度越深、TNM分期越晚、存在胃周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓的胃癌組織中，VM的陽(yáng)性率越高。這表明VM的形成與胃癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，可能參與了胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程。在預(yù)后方面，VM對(duì)胃癌患者的預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值。Kaplan-Meier生存分析顯示，VM陽(yáng)性的胃癌患者，其5年總體生存率及無(wú)復(fù)發(fā)生存率明顯低于VM陰性患者。COX模型多因素回歸分析結(jié)果表明，胃癌TNM分期、腫瘤分化、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓及VM生成狀態(tài)是影響患者總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。這提示VM可作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，為臨床制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。目前關(guān)于VM在胃癌中的研究仍存在一些問(wèn)題和挑戰(zhàn)。雖然已經(jīng)明確VM在胃癌中存在且與臨床病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)，但其具體的形成機(jī)制尚未完全闡明，尤其是在分子調(diào)控層面，仍有許多未知之處。針對(duì)VM的靶向治療研究尚處于起步階段，如何開發(fā)有效的靶向VM的治療藥物，提高胃癌的治療效果，是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向。2.3Met信號(hào)通路2.3.1Met基因與蛋白結(jié)構(gòu)Met基因位于人類染色體7q31區(qū)域，其編碼的蛋白產(chǎn)物是一種跨膜酪氨酸激酶受體，即肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（HGFR）。Met蛋白由1472個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為190kD，由α和β兩個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵連接而成。其中，α亞基為50kD的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，主要負(fù)責(zé)與配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）的特異性結(jié)合；β亞基為145kD的跨膜蛋白，包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中，存在多個(gè)酪氨酸殘基位點(diǎn)，如Tyr1234、Tyr1235和Tyr1349、Tyr1356等，這些位點(diǎn)在Met信號(hào)通路的激活和傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)HGF與Met的α亞基結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)Met蛋白發(fā)生二聚化，使β亞基的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，進(jìn)而使β亞基上的酪氨酸殘基位點(diǎn)發(fā)生自身磷酸化。這些磷酸化的酪氨酸殘基位點(diǎn)可以作為多種下游信號(hào)分子的結(jié)合位點(diǎn)，招募并激活一系列下游信號(hào)通路，從而將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。在正常細(xì)胞生理過(guò)程中，Met信號(hào)通路參與多種重要的生物學(xué)功能。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Met信號(hào)通路對(duì)于器官的形成和組織的構(gòu)建起著關(guān)鍵作用。例如，在肝臟發(fā)育過(guò)程中，HGF/Met信號(hào)通路能夠促進(jìn)肝臟細(xì)胞的增殖、遷移和分化，確保肝臟正常的形態(tài)和功能發(fā)育。在腎臟發(fā)育中，該信號(hào)通路也參與了腎小管的形成和腎臟間質(zhì)細(xì)胞的分化。在組織修復(fù)和再生過(guò)程中，Met信號(hào)通路同樣發(fā)揮重要作用。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，受損部位的細(xì)胞會(huì)分泌HGF，激活周圍細(xì)胞的Met受體，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，加速組織的修復(fù)和再生。如在皮膚傷口愈合過(guò)程中，角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞通過(guò)激活Met信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖，合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)傷口的愈合。2.3.2Met信號(hào)通路的激活與調(diào)控Met信號(hào)通路的激活主要是通過(guò)其配體HGF與Met受體的特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。HGF是一種由間質(zhì)細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)N端發(fā)夾結(jié)構(gòu)域、4個(gè)kringle結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端絲氨酸蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域。當(dāng)HGF與Met的α亞基結(jié)合后，會(huì)引起Met受體的構(gòu)象改變，促使兩個(gè)Met受體分子發(fā)生二聚化。二聚化后的Met受體，其β亞基的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，發(fā)生自身磷酸化，使β亞基上的酪氨酸殘基位點(diǎn)（如Tyr1234、Tyr1235、Tyr1349、Tyr1356等）磷酸化。這些磷酸化的酪氨酸殘基位點(diǎn)能夠招募并結(jié)合多種含有SH2結(jié)構(gòu)域或PTB結(jié)構(gòu)域的下游信號(hào)分子，如Grb2、Shc、Gab1等，從而激活一系列下游信號(hào)通路。Ras-Raf-MEK-ERK通路是Met信號(hào)通路的重要下游通路之一。當(dāng)Met受體激活后，磷酸化的Tyr1349和Tyr1356位點(diǎn)會(huì)招募并結(jié)合Gab1蛋白。Gab1被磷酸化后，又會(huì)招募Grb2和SOS蛋白。SOS蛋白作為一種鳥苷酸交換因子，能夠促進(jìn)Ras蛋白上的GDP與GTP交換，使Ras蛋白激活。激活后的Ras蛋白進(jìn)一步招募并激活Raf蛋白，Raf蛋白通過(guò)磷酸化激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化激活ERK蛋白。激活后的ERK蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，Ras-Raf-MEK-ERK通路的持續(xù)激活可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。PI3K-Akt通路也是Met信號(hào)通路的關(guān)鍵下游通路。Met受體激活后，磷酸化的Gab1蛋白可以招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募Akt蛋白到細(xì)胞膜上，并在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt蛋白的蘇氨酸殘基Thr308和絲氨酸殘基Ser473發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)kt，即P-Akt。激活后的P-Akt可以調(diào)節(jié)多種下游靶蛋白的活性，如Bad、caspase-9、FOXO家族、mTOR等，參與細(xì)胞的增殖、存活、凋亡、代謝、遷移和侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K-Akt通路的異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的抵抗能力。除了上述兩條主要的下游通路外，Met信號(hào)通路還可以激活其他信號(hào)通路，如STAT3通路、PLCγ通路等。這些信號(hào)通路相互交織，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，STAT3通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抗凋亡作用，同時(shí)還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸；PLCγ通路的激活則可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和蛋白激酶C（PKC）的活性，影響細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過(guò)程。Met信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，除了通過(guò)配體-受體結(jié)合進(jìn)行激活調(diào)控外，還存在多種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。一些內(nèi)源性的負(fù)調(diào)控因子可以抑制Met信號(hào)通路的活性，如Sprouty蛋白、SHIP蛋白等。Sprouty蛋白可以通過(guò)與Grb2蛋白相互作用，抑制Ras-Raf-MEK-ERK通路的激活；SHIP蛋白則可以通過(guò)水解PIP3，減少PIP3的生成，從而抑制PI3K-Akt通路的激活。泛素化降解也是調(diào)節(jié)Met信號(hào)通路的重要機(jī)制。Cbl蛋白是一種E3泛素連接酶，它可以識(shí)別并結(jié)合激活后的Met受體，將泛素分子連接到Met受體上，使Met受體被蛋白酶體降解，從而終止Met信號(hào)通路的傳導(dǎo)。2.3.3Met在胃癌中的表達(dá)及臨床意義大量研究表明，Met在胃癌組織中常常呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。鮑敏等通過(guò)免疫組織化學(xué)間接法對(duì)78例經(jīng)病理證實(shí)的胃癌組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)C-met蛋白陽(yáng)性率與腫瘤的大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤越大、分化程度越低、浸潤(rùn)深度越深、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，C-met蛋白陽(yáng)性率越高。這提示Met的高表達(dá)與胃癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程。另有研究對(duì)不同分期的胃癌組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著胃癌分期的進(jìn)展，Met的表達(dá)水平逐漸升高。在早期胃癌中，Met的陽(yáng)性表達(dá)率相對(duì)較低；而在晚期胃癌中，Met的陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加。這進(jìn)一步表明Met的表達(dá)與胃癌的病情進(jìn)展密切相關(guān)，其高表達(dá)可能是胃癌惡化的重要標(biāo)志之一。Met的表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后也存在密切關(guān)聯(lián)。眾多臨床研究結(jié)果顯示，Met高表達(dá)的胃癌患者，其總體生存率和無(wú)病生存率明顯低于Met低表達(dá)的患者。一項(xiàng)對(duì)胃癌患者的長(zhǎng)期隨訪研究表明，Met陽(yáng)性表達(dá)患者的5年生存率顯著低于Met陰性表達(dá)患者，且Met表達(dá)水平越高，患者的生存時(shí)間越短。這說(shuō)明Met高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，檢測(cè)Met的表達(dá)水平對(duì)于評(píng)估胃癌患者的預(yù)后具有重要價(jià)值。在胃癌的治療方面，Met的異常表達(dá)為靶向治療提供了潛在靶點(diǎn)。由于Met在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，針對(duì)Met的靶向治療藥物成為研究熱點(diǎn)。目前，多種Met抑制劑正在研發(fā)和臨床試驗(yàn)中，如克唑替尼、卡博替尼等。這些藥物通過(guò)抑制Met的酪氨酸激酶活性，阻斷Met信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。臨床前研究和部分臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，Met抑制劑在部分Met高表達(dá)的胃癌患者中顯示出一定的療效，能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率。然而，由于胃癌的異質(zhì)性和耐藥性等問(wèn)題，Met抑制劑的臨床應(yīng)用仍面臨一些挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步深入研究和探索。2.4P-Akt信號(hào)通路2.4.1PI3K/Akt信號(hào)通路概述PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞的多種生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該通路主要由磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt，又稱PKB）以及下游一系列靶蛋白組成。PI3K是一種脂質(zhì)激酶，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型，其中Ⅰ型PI3K在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中最為重要，它由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基（p85）和一個(gè)催化亞基（p110）組成。調(diào)節(jié)亞基p85含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如SH2結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域等，這些結(jié)構(gòu)域能夠與多種上游信號(hào)分子相互作用，調(diào)節(jié)PI3K的活性。催化亞基p110則具有催化活性，能夠催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的PI3K處于相對(duì)低活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到多種刺激，如生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子EGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF等）、細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素IL-6等）、整合素與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用等，細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTKs）或G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）被激活。激活后的受體通過(guò)自身磷酸化或招募接頭蛋白，與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85結(jié)合，從而使PI3K的催化亞基p110被激活。激活后的PI3K催化PIP2生成PIP3，PIP3作為第二信使，招募含有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白到細(xì)胞膜上，其中包括Akt和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）。在細(xì)胞膜上，PDK1磷酸化Akt的蘇氨酸殘基Thr308，使其部分活化。隨后，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）磷酸化Akt的絲氨酸殘基Ser473，使Akt完全活化，即P-Akt。激活后的P-Akt通過(guò)磷酸化多種下游靶蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。在細(xì)胞增殖方面，P-Akt可以激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。P-Akt還可以抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的活性，使細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)增加，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞存活方面，P-Akt可以磷酸化促凋亡蛋白Bad，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而抑制Bad的促凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞存活。P-Akt還可以通過(guò)抑制半胱天冬酶-9（caspase-9）的活性，阻斷細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，維持細(xì)胞的存活。在細(xì)胞代謝方面，P-Akt在胰島素信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，它可以磷酸化并激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4），促進(jìn)葡萄糖攝取，調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝。P-Akt還參與脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞的正常代謝功能。2.4.2P-Akt的激活機(jī)制與生物學(xué)功能P-Akt的激活是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，主要依賴于PI3K的激活以及PIP3的生成。如前文所述，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，PI3K被激活，催化PIP2生成PIP3。PIP3在細(xì)胞膜上富集，通過(guò)與Akt的PH結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，將Akt招募到細(xì)胞膜上。在細(xì)胞膜上，PDK1首先磷酸化Akt的Thr308位點(diǎn)，使Akt發(fā)生部分活化。然而，僅有Thr308位點(diǎn)的磷酸化還不足以使Akt完全發(fā)揮其生物學(xué)功能，還需要mTORC2對(duì)Akt的Ser473位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化。mTORC2是一種由mTOR、Rictor、mLST8等蛋白組成的復(fù)合物，它能夠識(shí)別并結(jié)合Akt，催化Ser473位點(diǎn)的磷酸化。只有當(dāng)Akt的Thr308和Ser473位點(diǎn)同時(shí)被磷酸化后，Akt才被完全激活，即形成P-Akt。P-Akt在細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，P-Akt通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期進(jìn)程。mTOR可以調(diào)節(jié)S6K和4E-BP1的活性，S6K被激活后，能夠磷酸化核糖體蛋白S6，促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成；4E-BP1被磷酸化后，解除對(duì)真核起始因子4E（eIF4E）的抑制，使eIF4E能夠與mRNA的5'端帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程。P-Akt還可以通過(guò)抑制GSK3β的活性，穩(wěn)定CyclinD1的表達(dá)。GSK3β能夠磷酸化CyclinD1，使其被泛素化降解。當(dāng)P-Akt磷酸化GSK3β后，GSK3β的活性受到抑制，CyclinD1的降解減少，表達(dá)增加，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，推動(dòng)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，P-Akt具有明顯的抗凋亡作用。Bad是一種促凋亡蛋白，它能夠與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合，形成異二聚體，從而解除Bcl-2或Bcl-XL的抗凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。P-Akt可以磷酸化Bad的Ser136位點(diǎn)，使Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)法與Bcl-2或Bcl-XL相互作用，從而抑制Bad的促凋亡作用，促進(jìn)細(xì)胞存活。P-Akt還可以通過(guò)抑制caspase-9的活性來(lái)阻斷細(xì)胞凋亡的線粒體途徑。caspase-9是細(xì)胞凋亡線粒體途徑中的關(guān)鍵蛋白酶，它被激活后，能夠激活下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。P-Akt可以直接磷酸化caspase-9，使其活性受到抑制，從而阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)方面，P-Akt在胰島素信號(hào)通路中起著核心作用。胰島素與細(xì)胞膜上的胰島素受體結(jié)合后，激活受體的酪氨酸激酶活性，使受體底物（如IRS-1、IRS-2等）發(fā)生磷酸化。磷酸化的IRS招募并激活PI3K，進(jìn)而激活P-Akt。P-Akt可以磷酸化并激活GLUT4，促進(jìn)GLUT4從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖代謝。P-Akt還參與脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。在脂質(zhì)代謝中，P-Akt可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等關(guān)鍵酶的活性，影響脂肪酸的合成和代謝。在蛋白質(zhì)代謝中，P-Akt通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，同時(shí)抑制蛋白質(zhì)降解，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的平衡。2.4.3P-Akt在胃癌中的表達(dá)及臨床意義眾多研究表明，P-Akt在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織。張立功等應(yīng)用免疫組織化學(xué)EliVision法檢測(cè)68例胃癌及其癌旁組織中P-AKT蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)P-AKT蛋白在胃癌組織中表達(dá)高于癌旁組織。薛鵬等收集229例隨訪超過(guò)5年的胃癌患者腫瘤組織標(biāo)本，制作成組織芯片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中p-AKT蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為55.9％，高于相應(yīng)癌旁組織。這些研究結(jié)果表明，P-Akt在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。P-Akt的表達(dá)與胃癌的多項(xiàng)臨床病理特征密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，P-Akt的表達(dá)與胃癌的分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在分化程度方面，低分化胃癌組織中P-Akt的表達(dá)水平明顯高于高分化胃癌組織，提示P-Akt的高表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞的低分化狀態(tài)有關(guān)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。在臨床分期上，隨著胃癌臨床分期的進(jìn)展，P-Akt的表達(dá)水平逐漸升高，表明P-Akt的激活可能參與了胃癌的病情進(jìn)展過(guò)程。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中P-Akt的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織，說(shuō)明P-Akt的高表達(dá)可能促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。P-Akt的表達(dá)對(duì)胃癌患者的預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值。薛鵬等研究顯示，p-AKT蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的生存率低于陰性表達(dá)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明P-Akt高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后的不良因素，檢測(cè)P-Akt的表達(dá)水平可以作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。高表達(dá)的P-Akt可能通過(guò)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，從而降低患者的生存率。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1研究對(duì)象本研究選取[具體醫(yī)院名稱]在[具體時(shí)間段]內(nèi)收治的胃癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)手術(shù)切除并由病理確診為胃癌；患者術(shù)前未接受過(guò)放療、化療、靶向治療或免疫治療等抗腫瘤治療；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：合并其他惡性腫瘤；存在嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙；患有精神疾病或認(rèn)知障礙，無(wú)法配合研究。共收集到符合標(biāo)準(zhǔn)的胃癌患者[X]例，同時(shí)選取同期在該醫(yī)院進(jìn)行胃鏡檢查且病理證實(shí)為正常胃黏膜的患者[X]例作為正常對(duì)照。詳細(xì)收集胃癌患者的臨床病理資料，包括患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期等。年齡精確記錄，性別分為男性和女性；腫瘤部位分為賁門、胃底、胃體、胃竇等；腫瘤大小通過(guò)手術(shù)記錄或影像學(xué)檢查測(cè)量并記錄；組織學(xué)類型依據(jù)WHO胃癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定；分化程度分為高分化、中分化、低分化和未分化；浸潤(rùn)深度根據(jù)腫瘤侵犯胃壁的層次分為T1、T2、T3、T4；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況記錄轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)目和部位；TNM分期依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）制定的第[具體版本號(hào)]版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確定。這些臨床病理資料將為后續(xù)分析Met、P-Akt表達(dá)及VM與胃癌臨床病理特征的關(guān)系提供重要依據(jù)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用SP法，具體步驟如下：首先對(duì)胃癌組織和正常胃黏膜組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，厚度為4μm。將切片置于60℃烤箱中烘烤2小時(shí)，使切片與載玻片緊密黏附。隨后進(jìn)行脫蠟和水化處理，依次將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘，然后分別在100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中浸泡5分鐘，接著依次在95%、85%、75%乙醇中各浸泡3分鐘，最后用蒸餾水沖洗3次，每次3分鐘。為了暴露抗原決定簇，進(jìn)行抗原修復(fù)。將切片放入盛有0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）的容器中，放入微波爐中高火加熱至沸騰，然后轉(zhuǎn)中火加熱10分鐘。加熱結(jié)束后，取出容器，待其自然冷卻至室溫，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。為了減少非特異性染色，將切片用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。之后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。在切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘。甩去封閉液，不洗，直接滴加適量稀釋好的一抗（兔抗人Met多克隆抗體、兔抗人P-Akt多克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體，抗體稀釋度根據(jù)說(shuō)明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），將切片放入濕盒中，4℃孵育過(guò)夜。次日，將切片從冰箱中取出，室溫復(fù)溫30分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片5次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS緩沖液沖洗切片5次，每次5分鐘。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片5次，每次5分鐘。采用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。將DAB顯色劑A、B、C液按1:1:1的比例混合均勻，滴加在切片上，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗切片終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3分鐘，然后用自來(lái)水沖洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來(lái)水沖洗返藍(lán)。依次將切片放入75%、85%、95%、100%乙醇中各浸泡3分鐘進(jìn)行脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡5分鐘進(jìn)行透明，最后用中性樹膠封片。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：Met和P-Akt陽(yáng)性產(chǎn)物均定位于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。采用半定量積分法進(jìn)行結(jié)果判定，先根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；再根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)得分與染色強(qiáng)度得分相乘，總分0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽(yáng)性（+），5-8分為陽(yáng)性（++），9-12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。VM的判斷標(biāo)準(zhǔn)：采用CD34/PAS雙重染色法，VM表現(xiàn)為PAS陽(yáng)性物質(zhì)襯附于腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的管腔樣結(jié)構(gòu)，且管腔內(nèi)未見CD34染色陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞。在高倍鏡下（×400）觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)VM的數(shù)量，計(jì)算平均值。為保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照采用已知陽(yáng)性的胃癌組織切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟相同。同時(shí)，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行技術(shù)培訓(xùn)，確保操作的一致性和準(zhǔn)確性；對(duì)實(shí)驗(yàn)所用的試劑進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保試劑的有效性和穩(wěn)定性。3.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)采用TRIzol法提取胃癌組織和正常胃黏膜組織中的總RNA。具體操作如下：將組織標(biāo)本剪碎后，加入1mlTRIzol試劑，充分勻漿。室溫靜置5分鐘，使組織細(xì)胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃，12000rpm離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，RNA溶解在水相中。小心吸取上層水相至新的RNase-free離心管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘，離心后管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄上清。加入1ml75%乙醇，用手輕輕顛倒離心管，洗滌RNA沉淀。4℃，7500rpm離心5分鐘，去上清。超凈工作臺(tái)上吹干樣品5-10分鐘，加入適量DEPC水溶解RNA。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質(zhì)量。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。將RNA在65℃條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管中依次加入5×RTBuffer、RTEnzymeMix、PrimerMix、RNA和RNase-freeWater，總體積為10μl。反應(yīng)條件為37℃，15分鐘；98℃，5分鐘；4℃，hold。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中Met、P-Akt和內(nèi)參基因GAPDH的mRNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由[引物合成公司名稱]合成。引物序列如下：Met上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；P-Akt上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；GAPDH上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μl，包括10μl2×SYBRGreenMasterMix、0.25μl上游引物（20μM）、0.25μl下游引物（20μM）、0.04μl50×ROXReferenceDye、5μl模板cDNA和4.46μl滅菌蒸餾水。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2分鐘；95℃變性10秒，60℃退火34秒（采集熒光信號(hào)），共45個(gè)循環(huán)；72℃延伸30秒。循環(huán)結(jié)束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置無(wú)模板對(duì)照（NTC）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，計(jì)算公式為：F=2-[(待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基因平均Ct值)-(對(duì)照組目的基因平均Ct值-對(duì)照組管家基因平均Ct值)]，其中F為相對(duì)表達(dá)量，對(duì)照組中的目的基因表達(dá)量設(shè)定為1。通過(guò)比較胃癌組織和正常胃黏膜組織中Met、P-Akt基因的相對(duì)表達(dá)量，分析其表達(dá)差異。3.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)將胃癌組織和正常胃黏膜組織剪碎后，加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿。4℃，12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入96孔板中，每孔加入適量BCA工作液，37℃孵育30分鐘。用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使終濃度為1×，混勻。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，使蛋白充分變性。冷卻后，13000rpm離心5分鐘，取上清用于電泳。配制10%分離膠和4%濃縮膠，按照常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳。先80V電壓電泳，當(dāng)示蹤劑進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓增至120V。當(dāng)示蹤劑移至距下端1cm處時(shí)，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜前，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化。在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和活化后的PVDF膜。將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面墊一張海綿墊，用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。在墊子上墊三層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。將凝膠小心地從玻璃板上剝離下來(lái)，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中15分鐘，然后將凝膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將PVDF膜蓋于凝膠上，要蓋滿整個(gè)凝膠并除去氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷地?fù){去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降溫。一般用200mA（約70V）轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用1×麗春紅染液染5分鐘，于脫色搖床上搖，然后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液，觀察膜上的蛋白條帶，以確定轉(zhuǎn)膜是否成功。用5%脫脂奶粉（或3%BSA的TBS）室溫封閉PVDF膜2小時(shí)或者4℃平緩搖動(dòng)過(guò)夜。用1×TBST室溫洗膜5分鐘，洗三次。加入稀釋好的一抗（兔抗人Met多克隆抗體、兔抗人P-Akt多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體，抗體稀釋度根據(jù)說(shuō)明書及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），室溫孵育2小時(shí)或者4℃平緩搖動(dòng)過(guò)夜?；厥找豢?，按5μl/ml一抗液加入疊氮鈉（可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)），4℃保存（不常用的抗體可-20℃長(zhǎng)期保存），可重復(fù)使用。用1×TBST洗膜3次，每次5分鐘。加入二抗（一般為1:2000稀釋），室溫平緩搖動(dòng)1小時(shí)。用1×TBST洗膜3次，每次5分鐘。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。將ECL發(fā)光試劑A液和B液按1:1的比例混合均勻，滴加在PVDF膜上，室溫孵育1-2分鐘。用保鮮膜將膜包裹好，放入暗盒中，在X光膠片上曝光，根據(jù)曝光情況調(diào)整曝光時(shí)間。曝光結(jié)束后，將X光膠片顯影、定影，觀察蛋白條帶。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算Met、P-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量，即目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。通過(guò)比較胃癌組織和正常胃黏膜組織中Met、P-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量，分析其表達(dá)差異。3.3數(shù)據(jù)分析方法將所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel表格進(jìn)行整理，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性。使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較胃癌組織與正常胃黏膜組織中Met、P-Akt的表達(dá)水平差異；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)（如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）。多組間比較時(shí)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差不齊則采用Welch校正或非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。進(jìn)一步的兩兩比較，根據(jù)方差齊性情況，選擇LSD法、DunnettT3法等合適的方法。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析Met、P-Akt表達(dá)及VM與胃癌臨床病理特征（如年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等）之間的關(guān)系。當(dāng)理論頻數(shù)小于5時(shí)，采用連續(xù)校正的χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。采用Spearman秩相關(guān)分析探討Met與P-Akt表達(dá)之間的相關(guān)性，以及Met、P-Akt表達(dá)與VM的相關(guān)性。計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)r，根據(jù)r的絕對(duì)值大小判斷相關(guān)性強(qiáng)弱，|r|≥0.7為強(qiáng)相關(guān)，0.4≤|r|＜0.7為中等相關(guān)，|r|＜0.4為弱相關(guān)。應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析Met、P-Akt表達(dá)及VM對(duì)胃癌患者預(yù)后的影響，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其95%置信區(qū)間（CI）。將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素分析，篩選出影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果均以相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)圖表進(jìn)行直觀展示，如柱狀圖、折線圖、散點(diǎn)圖、列聯(lián)表等，使結(jié)果更加清晰明了。四、研究結(jié)果4.1Met和P-Akt在胃癌組織中的表達(dá)情況通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）三種方法，對(duì)胃癌組織和正常胃黏膜組織中Met和P-Akt的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Met陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。在胃癌組織中，Met陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），其中弱陽(yáng)性（+）[X]例，陽(yáng)性（++）[X]例，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[X]例；而在正常胃黏膜組織中，Met陽(yáng)性表達(dá)率僅為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），且多為弱陽(yáng)性（+）表達(dá)，兩組陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1A。P-Akt陽(yáng)性產(chǎn)物同樣定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，胃癌組織中P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），其中弱陽(yáng)性（+）[X]例，陽(yáng)性（++）[X]例，強(qiáng)陽(yáng)性（+++）[X]例；正常胃黏膜組織中P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%（[陽(yáng)性例數(shù)]/[總例數(shù)]），主要為弱陽(yáng)性（+），兩組陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1B。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，胃癌組織中MetmRNA的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[X]，顯著高于正常胃黏膜組織的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P-AktmRNA在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[X]，明顯高于正常胃黏膜組織的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，以β-actin作為內(nèi)參，胃癌組織中Met蛋白的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[X]，高于正常胃黏膜組織的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P-Akt蛋白在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[X]±[X]，顯著高于正常胃黏膜組織的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3。綜合以上三種檢測(cè)方法的結(jié)果，明確Met和P-Akt在胃癌組織中的表達(dá)水平均顯著高于正常胃黏膜組織。進(jìn)一步分析Met和P-Akt表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果見表1。Met表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)（P<0.05）。在分化程度方面，低分化胃癌組織中Met的陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，明顯高于中分化的[X]%和高分化的[X]%；隨著浸潤(rùn)深度的增加，T3-T4期胃癌組織中Met陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，顯著高于T1-T2期的[X]%；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中Met陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，遠(yuǎn)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的[X]%；TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的胃癌組織中Met陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，明顯高于Ⅰ-Ⅱ期的[X]%。然而，Met表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。P-Akt表達(dá)也與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P<0.05）。低分化胃癌組織中P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，高于中分化的[X]%和高分化的[X]%；T3-T4期胃癌組織中P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，顯著高于T1-T2期的[X]%；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的[X]%；TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的胃癌組織中P-Akt陽(yáng)性表達(dá)率為[X]%，高于Ⅰ-Ⅱ期的[X]%。同樣，P-Akt表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。[此處插入圖1：胃癌組織和正常胃黏膜組織中Met和P-Akt的免疫組化染色結(jié)果圖，A為Met，B為P-Akt，標(biāo)尺=50μm][此處插入圖2：胃癌組織和正常胃黏膜組織中Met和P-AktmRNA相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖，*P<0.05][此處插入圖3：胃癌組織和正常胃黏膜組織中Met和P-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量的Westernblot條帶圖及柱狀圖，*P<0.05][此處插入表1：Met和P-Akt表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系]4.2胃癌組織中血管生成擬態(tài)的檢測(cè)結(jié)果采用CD34/PAS雙重染色法對(duì)胃癌組織和正常胃黏膜組織進(jìn)行檢測(cè)，以觀察血管生成擬態(tài)（VM）的存在情況。結(jié)果顯示，在正常胃黏膜組織中未檢測(cè)到VM結(jié)構(gòu)；而在胃癌組織中，VM表現(xiàn)為PAS陽(yáng)性物質(zhì)襯附于腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的管腔樣結(jié)構(gòu)，且管腔內(nèi)未見CD34染色陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞。在納入研究的[X]例胃癌患者中，有[X]例檢測(cè)到VM，陽(yáng)性率為[X]%。進(jìn)一步分析VM與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果見表2。VM與胃癌的腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)（P<0.05）。在腫瘤大小方面，腫瘤直徑≥5cm的胃癌組織中VM陽(yáng)性率為[X]%，顯著高于腫瘤直徑<5cm的[X]%；低分化胃癌組織中VM陽(yáng)性率為[X]%，明顯高于中分化的[X]%和高分化的[X]%；隨著浸潤(rùn)深度的增加，T3-T4期胃癌組織中VM陽(yáng)性率為[X]%，顯著高于T1-T2期的[X]%；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中VM陽(yáng)性率為[X]%，遠(yuǎn)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的[X]%；TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的胃癌組織中VM陽(yáng)性率為[X]%，明顯高于Ⅰ-Ⅱ期的[X]%。然而，VM與患者的年齡、性別及腫瘤部位無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。[此處插入表2：VM與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系]4.3Met、P-Akt表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析探討Met、P-Akt表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)（VM）的相關(guān)性，結(jié)果見表3。Met表達(dá)與VM呈顯著正相關(guān)（r=[X]，P<0.05），即隨著Met表達(dá)水平的升高，VM的陽(yáng)性率和數(shù)量也相應(yīng)增加。P-Akt表達(dá)與VM同樣呈顯著正相關(guān)（r=[X]，P<0.05），表明P-Akt表達(dá)水平的上調(diào)與VM的形成密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Met表達(dá)與P-Akt表達(dá)之間也存在顯著正相關(guān)（r=[X]，P<0.05），提示在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Met和P-Akt可能通過(guò)相互協(xié)同作用，共同促進(jìn)VM的形成。從分子機(jī)制角度來(lái)看，Met信號(hào)通路的激活可通過(guò)多種途徑促進(jìn)VM的形成。當(dāng)Met被其配體HGF激活后，可通過(guò)Ras-Raf-MEK-ERK通路，調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力，從而有利于腫瘤細(xì)胞相互連接形成VM管腔樣結(jié)構(gòu)。Met激活還可通過(guò)PI3K-Akt通路，激活下游的mTOR等靶點(diǎn)，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞存活，為VM的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)和生存保障。同時(shí)，PI3K-Akt通路的激活可上調(diào)一些與細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，為VM的形成創(chuàng)造有利條件。P-Akt作為PI3K-Akt通路的關(guān)鍵激活蛋白，其高表達(dá)可增強(qiáng)該通路的活性，進(jìn)一步促進(jìn)VM的形成。綜上所述，Met和P-Akt表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)密切相關(guān)，且二者可能通過(guò)相互協(xié)同，共同參與VM的形成過(guò)程，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。[此處插入表3：Met、P-Akt表達(dá)與VM的相關(guān)性分析]五、討論5.1Met表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)的關(guān)系探討本研究結(jié)果顯示，Met在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜組織，且Met表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，這與以往的研究結(jié)果一致。更重要的是，本研究通過(guò)Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Met表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)（VM）呈顯著正相關(guān)，即Met表達(dá)水平越高，VM的陽(yáng)性率和數(shù)量也越高。從分子機(jī)制角度來(lái)看，Met信號(hào)通路的激活可通過(guò)多種途徑促進(jìn)VM的形成。當(dāng)Met被其配體HGF激活后，可通過(guò)Ras-Raf-MEK-ERK通路，調(diào)節(jié)下游與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的上皮標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物如波形蛋白、N-鈣黏蛋白表達(dá)上調(diào)。這使得腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，細(xì)胞極性消失，細(xì)胞間連接減弱，從而具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這些具有高遷移和侵襲能力的腫瘤細(xì)胞能夠脫離原發(fā)灶，遷移到周圍組織中，并通過(guò)相互連接形成VM管腔樣結(jié)構(gòu)。例如，在黑色素瘤細(xì)胞中，激活Met信號(hào)通路可上調(diào)Snail、Twist等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程和VM的形成。Met激活還可通過(guò)PI3K-Akt通路，激活下游的mTOR等靶點(diǎn)，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞存活，為VM的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)和生存保障。PI3K被激活后，催化PIP2生成PIP3，PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上并使其磷酸化激活。激活后的P-Akt可以磷酸化激活mTOR，mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。充足的蛋白質(zhì)合成能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的增殖、遷移和VM管腔樣結(jié)構(gòu)的構(gòu)建提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。P-Akt還可以通過(guò)磷酸化多種抗凋亡蛋白，如Bad、caspase-9等，抑制細(xì)胞凋亡，保障腫瘤細(xì)胞在構(gòu)建VM過(guò)程中的存活。在乳腺癌細(xì)胞中，抑制Met信號(hào)通路可降低PI3K-Akt-mTOR通路的活性，減少蛋白質(zhì)合成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和VM的形成。Met激活還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)VM的形成。細(xì)胞外基質(zhì)的重塑是VM形成的重要環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞需要降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)，以形成穩(wěn)定的VM管腔樣結(jié)構(gòu)。Met信號(hào)通路激活后，可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和VM管腔樣結(jié)構(gòu)的形成開辟空間。MMP-2和MMP-9能夠降解基底膜中的膠原蛋白Ⅳ，使腫瘤細(xì)胞更容易穿透基底膜，遷移到周圍組織中形成VM。Met信號(hào)通路還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)，如纖連蛋白、玻連蛋白等，參與VM管腔樣結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，使其更加穩(wěn)定和成熟。在臨床意義方面，Met表達(dá)與VM的正相關(guān)關(guān)系提示，Met可能作為評(píng)估胃癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。高表達(dá)Met的胃癌患者，其VM形成的可能性更高，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，預(yù)后往往更差。檢測(cè)Met的表達(dá)水平，結(jié)合VM的檢測(cè)結(jié)果，能夠更準(zhǔn)確地判斷胃癌患者的病情進(jìn)展和預(yù)后情況，為臨床制定個(gè)性化的治療方案提供重要依據(jù)。針對(duì)Met信號(hào)通路的靶向治療，有可能通過(guò)抑制VM的形成，阻斷腫瘤的血供，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前已有多種Met抑制劑處于研發(fā)和臨床試驗(yàn)階段，未來(lái)有望為胃癌患者提供新的治療選擇。5.2P-Akt表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)的關(guān)系探討本研究通過(guò)多種檢測(cè)方法證實(shí)，P-Akt在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于正常胃黏膜組織，且其表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)，這與既往相關(guān)研究結(jié)果一致。更為關(guān)鍵的是，Spearman秩相關(guān)分析顯示，P-Akt表達(dá)與胃癌血管生成擬態(tài)（VM）呈顯著正相關(guān)，即P-Akt表達(dá)水平越高，VM的陽(yáng)性率和數(shù)量越多。從分子機(jī)制角度來(lái)看，P-Akt作為PI3K-Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵激活蛋白，其激活對(duì)VM的形成具有多方面的促進(jìn)作用。PI3K被激活后，催化PIP2生成PIP3，PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上并使其磷酸化激活，形成P-Akt。激活后的P-Akt可通過(guò)多種途徑促進(jìn)VM的形成。P-Akt可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活相關(guān)蛋白的活性，為VM的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)和細(xì)胞保障。P-Akt可以磷酸化激活mTOR，mTOR通過(guò)調(diào)節(jié)S6K和4E-BP1的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，滿足腫瘤細(xì)胞在增殖和構(gòu)建VM過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)的需求。P-Akt還可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad的活性，使Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，無(wú)法發(fā)揮促凋亡作用。P-Akt還能抑制caspase-9的活性，阻斷細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，從而保障腫瘤細(xì)胞在構(gòu)建VM過(guò)程中的存活。在肝癌細(xì)胞中，抑制PI3K-Akt通路可降低mTOR的活性，減少蛋白質(zhì)合成，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制VM的形成。P-Akt可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)重塑相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)VM的形成。細(xì)胞外基質(zhì)的重塑是VM形成的重要環(huán)節(jié)，P-Akt激活后，可上調(diào)MMPs等蛋白的表達(dá)。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和VM管腔樣結(jié)構(gòu)的形成開辟空間。P-Akt還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)，如纖連蛋白、玻連蛋白等，參與VM管腔樣結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，使其更加穩(wěn)定和成熟。在乳腺癌細(xì)胞中，激活PI3K-Akt通路可上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而促進(jìn)VM的形成。P-Akt還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，促進(jìn)VM的形成。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲