PCR檢驗技術培訓測驗試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共30分）1.PCR技術中，引物的作用是（）A.提供模板B.打開DNA雙鏈C.催化DNA合成D.使DNA聚合酶能夠從其3'端開始合成新的DNA鏈答案：D解析：引物是一小段單鏈DNA或RNA，它能與模板DNA特定區(qū)域互補配對，為DNA聚合酶提供起始點，使DNA聚合酶能夠從其3'端開始合成新的DNA鏈。模板是DNA本身，打開DNA雙鏈是通過高溫變性實現(xiàn)，催化DNA合成的是DNA聚合酶，所以A、B、C選項錯誤。2.以下哪種物質不是PCR反應體系的必需成分（）A.模板DNAB.dNTPC.RNA聚合酶D.引物答案：C解析：PCR反應體系的必需成分包括模板DNA提供復制的模板，dNTP是合成DNA的原料，引物引導DNA合成。而PCR中使用的是DNA聚合酶，不是RNA聚合酶，所以答案選C。3.PCR反應的變性溫度一般為（）A.55℃左右B.72℃左右C.94℃左右D.37℃左右答案：C解析：在PCR反應中，變性步驟是將雙鏈DNA解開成單鏈，需要較高的溫度，一般為94℃左右，所以選C。55℃左右通常是退火溫度，72℃左右是延伸溫度，37℃不是PCR反應的特征溫度。4.PCR反應的延伸時間主要取決于（）A.引物的長度B.模板的長度C.DNA聚合酶的活性D.dNTP的濃度答案：B解析：延伸時間主要與擴增片段（即模板）的長度有關，一般DNA聚合酶每分鐘大約可以合成1000-2000個堿基對，所以根據(jù)模板長度來確定延伸時間。引物長度主要影響退火溫度等，DNA聚合酶活性影響反應速度但不是決定延伸時間的主要因素，dNTP濃度主要影響反應的效率等，所以答案是B。5.TaqDNA聚合酶的特點是（）A.具有3'→5'外切酶活性B.不耐熱C.具有逆轉錄活性D.具有5'→3'聚合酶活性答案：D解析：TaqDNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性，能夠以dNTP為原料，從引物的3'端開始合成DNA鏈。它沒有3'→5'外切酶活性，所以沒有校對功能；它是耐熱的DNA聚合酶，可在高溫下保持活性；它不具有逆轉錄活性，逆轉錄是逆轉錄酶的功能，所以答案選D。6.在PCR反應中，循環(huán)次數(shù)一般設置為（）A.5-10次B.10-15次C.25-35次D.40-50次答案：C解析：循環(huán)次數(shù)太少，擴增產物量不足；循環(huán)次數(shù)太多，容易產生非特異性擴增。一般PCR反應的循環(huán)次數(shù)設置為25-35次，所以選C。7.以下關于熒光定量PCR技術的描述，錯誤的是（）A.可以對核酸進行定量分析B.分為探針法和染料法C.不需要引物D.實時監(jiān)測PCR過程答案：C解析：熒光定量PCR技術可以對核酸進行定量分析，根據(jù)使用的熒光標記物不同分為探針法和染料法，它能夠實時監(jiān)測PCR過程。而PCR反應都需要引物來引導DNA合成，所以C選項錯誤。8.PCR產物的檢測方法不包括（）A.瓊脂糖凝膠電泳B.聚丙烯酰胺凝膠電泳C.質譜分析D.免疫熒光法答案：D解析：PCR產物的檢測方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，可根據(jù)條帶的大小和亮度來初步判斷產物的情況；質譜分析可以對PCR產物進行精確的分子量測定等。免疫熒光法主要用于檢測抗原-抗體反應，一般不用于PCR產物的檢測，所以答案是D。9.在PCR反應中，退火溫度過高會導致（）A.引物與模板結合不充分B.非特異性擴增增加C.DNA聚合酶活性降低D.模板DNA降解答案：A解析：退火溫度過高，引物與模板之間的氫鍵難以形成，會導致引物與模板結合不充分。非特異性擴增增加一般是退火溫度過低導致的；DNA聚合酶活性主要受溫度范圍和酶本身特性影響，退火溫度過高一般不會直接導致其活性降低；模板DNA降解通常與高溫長時間處理等因素有關，不是退火溫度過高的主要后果，所以選A。10.以下哪種情況可能導致PCR反應無擴增產物（）A.引物濃度過高B.模板DNA量過多C.緩沖液pH不合適D.dNTP濃度過高答案：C解析：緩沖液pH不合適會影響DNA聚合酶的活性，從而可能導致PCR反應無擴增產物。引物濃度過高可能會增加非特異性擴增；模板DNA量過多一般不會導致無擴增產物，只是可能會增加反應體系的復雜性；dNTP濃度過高可能會影響反應的平衡，但通常不會導致完全無擴增產物，所以選C。11.PCR技術可應用于（）A.基因克隆B.疾病診斷C.親子鑒定D.以上都是答案：D解析：PCR技術在基因克隆中可用于擴增目的基因；在疾病診斷中，可用于檢測病原體的核酸等；在親子鑒定中，通過擴增特定的基因位點進行分析。所以答案是D。12.進行PCR反應時，首先要進行的步驟是（）A.變性B.退火C.延伸D.加樣答案：D解析：進行PCR反應，首先要將各種反應成分如模板DNA、引物、dNTP、DNA聚合酶、緩沖液等加入到反應管中，即加樣。然后才依次進行變性、退火、延伸等步驟，所以選D。13.熒光定量PCR中，Ct值的含義是（）A.達到熒光閾值所經歷的循環(huán)數(shù)B.熒光信號的強度C.擴增產物的濃度D.反應的時間答案：A解析：在熒光定量PCR中，Ct值是指每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)，它與起始模板的拷貝數(shù)成反比，可用于定量分析，所以選A。14.以下關于巢式PCR的描述，正確的是（）A.只需要一對引物B.靈敏度和特異性較低C.可以降低非特異性擴增D.不需要模板DNA答案：C解析：巢式PCR使用兩對引物，先使用外側引物進行第一輪PCR擴增，然后以第一輪的擴增產物為模板，使用內側引物進行第二輪擴增。這樣可以降低非特異性擴增，提高靈敏度和特異性。它需要模板DNA，所以A、B、D選項錯誤，答案選C。15.PCR反應中，dNTP的作用是（）A.提供能量B.作為DNA合成的原料C.調節(jié)緩沖液的pHD.激活DNA聚合酶答案：B解析：dNTP（脫氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料，在DNA聚合酶的作用下，dNTP中的脫氧核苷酸逐個連接到引物的3'端，形成新的DNA鏈。它不能提供能量，也不調節(jié)緩沖液的pH，更不是激活DNA聚合酶的物質，所以選B。二、多項選擇題（每題3分，共30分）1.PCR反應體系的基本成分包括（）A.模板DNAB.引物C.dNTPD.DNA聚合酶E.緩沖液答案：ABCDE解析：PCR反應體系的基本成分有模板DNA提供復制的模板；引物引導DNA合成；dNTP是合成DNA的原料；DNA聚合酶催化DNA鏈的合成；緩沖液為反應提供合適的pH和離子環(huán)境，所以答案是ABCDE。2.影響PCR反應特異性的因素有（）A.引物的設計B.退火溫度C.模板的純度D.DNA聚合酶的種類E.循環(huán)次數(shù)答案：ABCDE解析：引物設計不合理，如引物特異性差，會導致非特異性擴增；退火溫度不合適，過高或過低都會影響引物與模板的結合特異性；模板純度低，含有雜質等可能會影響反應的特異性；不同種類的DNA聚合酶其特性不同，也可能影響特異性；循環(huán)次數(shù)過多可能會增加非特異性擴增的概率，所以答案是ABCDE。3.熒光定量PCR技術的優(yōu)點有（）A.靈敏度高B.特異性強C.可進行定量分析D.操作簡單快速E.無需對照答案：ABCD解析：熒光定量PCR技術靈敏度高，能夠檢測到低拷貝數(shù)的核酸；特異性強，可通過引物和探針的設計實現(xiàn)；可以對核酸進行定量分析；操作相對簡單快速。但它需要設置對照，如內參對照等，以保證實驗結果的準確性，所以E選項錯誤，答案是ABCD。4.PCR技術在醫(yī)學領域的應用有（）A.傳染病的診斷B.腫瘤的早期診斷C.遺傳病的診斷D.藥物療效的監(jiān)測E.器官移植的配型答案：ABCDE解析：在醫(yī)學領域，PCR技術可用于傳染病的診斷，檢測病原體的核酸；用于腫瘤的早期診斷，檢測腫瘤相關基因的突變等；用于遺傳病的診斷，檢測致病基因；還可用于藥物療效的監(jiān)測，通過檢測相關基因的表達變化等；在器官移植配型中，可對HLA等基因進行分析，所以答案是ABCDE。5.以下關于PCR產物純化的方法有（）A.凝膠回收法B.柱純化法C.酒精沉淀法D.離子交換法E.超濾法答案：ABCDE解析：凝膠回收法是從瓊脂糖凝膠中回收目的PCR產物；柱純化法利用柱子對PCR產物進行吸附和洗脫；酒精沉淀法通過酒精沉淀使PCR產物從溶液中析出；離子交換法根據(jù)離子交換原理分離PCR產物；超濾法利用超濾膜對不同大小的分子進行分離，從而純化PCR產物，所以答案是ABCDE。6.導致PCR反應出現(xiàn)非特異性擴增的原因可能有（）A.引物設計不合理B.退火溫度過低C.模板濃度過高D.DNA聚合酶量過多E.循環(huán)次數(shù)過多答案：ABCDE解析：引物設計不合理，如引物與非目的序列有互補區(qū)域，會導致非特異性擴增；退火溫度過低，引物容易與非特異性位點結合；模板濃度過高可能會增加非特異性結合的機會；DNA聚合酶量過多可能會使反應過于活躍，增加非特異性擴增；循環(huán)次數(shù)過多也會使非特異性產物不斷積累，所以答案是ABCDE。7.實時熒光定量PCR常用的熒光標記方法有（）A.SYBRGreenI染料法B.TaqMan探針法C.MolecularBeacon探針法D.Scorpions引物法E.FRET探針法答案：ABCDE解析：實時熒光定量PCR常用的熒光標記方法有SYBRGreenI染料法，它能與雙鏈DNA結合發(fā)出熒光；TaqMan探針法利用探針的熒光信號變化進行定量；MolecularBeacon探針法通過探針的構象變化產生熒光信號；Scorpions引物法將引物和探針結合在一起；FRET探針法利用熒光共振能量轉移原理，所以答案是ABCDE。8.PCR反應中，模板DNA的來源可以是（）A.血液B.組織C.細胞培養(yǎng)物D.唾液E.毛發(fā)答案：ABCDE解析：模板DNA可以從多種生物樣本中提取，血液中含有白細胞等細胞，可提取DNA；組織經過處理也能獲得DNA；細胞培養(yǎng)物是常見的DNA來源；唾液中含有口腔上皮細胞等，可提取DNA；毛發(fā)的毛囊部分含有DNA，也可作為模板DNA的來源，所以答案是ABCDE。9.以下關于PCR技術的描述，正確的有（）A.可以在體外快速擴增特定的DNA片段B.是一種酶促反應C.反應過程需要高溫、低溫和適溫循環(huán)D.擴增產物的特異性取決于引物E.可以對RNA進行直接擴增答案：ABCD解析：PCR技術可以在體外快速擴增特定的DNA片段，它是一種酶促反應，由DNA聚合酶催化。反應過程包括高溫變性、低溫退火和適溫延伸的循環(huán)。擴增產物的特異性主要取決于引物的設計。但PCR不能直接對RNA進行擴增，需要先將RNA逆轉錄為cDNA再進行PCR擴增，所以E選項錯誤，答案是ABCD。10.在PCR實驗中，為了防止污染，可采取的措施有（）A.設立專門的PCR實驗室B.分區(qū)操作C.使用一次性耗材D.定期對實驗室進行清潔和消毒E.戴口罩、手套等防護用品答案：ABCDE解析：設立專門的PCR實驗室可以減少外界污染的機會；分區(qū)操作，如將樣本制備區(qū)、試劑準備區(qū)、擴增區(qū)和產物分析區(qū)分開，可防止交叉污染；使用一次性耗材，避免重復使用帶來的污染；定期對實驗室進行清潔和消毒，可去除可能存在的核酸污染；戴口罩、手套等防護用品，防止操作人員的污染，所以答案是ABCDE。三、判斷題（每題1分，共10分）1.PCR技術只能擴增雙鏈DNA模板。（）答案：錯誤解析：PCR技術可以以雙鏈DNA為模板，也可以先將單鏈DNA或RNA經過處理（如RNA需先逆轉錄為cDNA）后作為模板進行擴增。2.熒光定量PCR中，Ct值越大，說明起始模板的拷貝數(shù)越多。（）答案：錯誤解析：在熒光定量PCR中，Ct值與起始模板的拷貝數(shù)成反比，Ct值越大，說明起始模板的拷貝數(shù)越少。3.PCR反應中，引物的濃度越高，擴增效果越好。（）答案：錯誤解析：引物濃度過高可能會增加非特異性擴增，而不是擴增效果越好，合適的引物濃度需要根據(jù)實驗進行優(yōu)化。4.TaqDNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性，因此具有校對功能。（）答案：錯誤解析：TaqDNA聚合酶沒有3'→5'外切酶活性，所以不具有校對功能，容易出現(xiàn)堿基錯配。5.巢式PCR可以提高PCR反應的靈敏度和特異性。（）答案：正確解析：巢式PCR通過兩輪擴增，先使用外側引物，再使用內側引物，能夠降低非特異性擴增，提高靈敏度和特異性。6.PCR產物的大小可以通過瓊脂糖凝膠電泳來確定。（）答案：正確解析：瓊脂糖凝膠電泳根據(jù)DNA片段在電場中的遷移速度不同，可將不同大小的DNA片段分開，通過與DNA分子量標準對比，能確定PCR產物的大小。7.熒光定量PCR不需要進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。（）答案：錯誤解析：雖然熒光定量PCR可以實時監(jiān)測擴增過程并進行定量分析，但為了驗證擴增產物的特異性等，有時也需要進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。8.在PCR反應中，延伸時間越長，擴增效果越好。（）答案：錯誤解析：延伸時間應根據(jù)擴增片段的長度合理設置，過長的延伸時間可能會導致非特異性擴增增加等問題，而不是擴增效果越好。9.PCR技術可以用于物種的鑒定。（）答案：正確解析：不同物種的DNA序列存在差異，通過設計特異性引物對特定基因進行PCR擴增和分析，可以用于物種的鑒定。10.為了提高PCR反應的效率，反應體系中dNTP的濃度越高越好。（）答案：錯誤解析：dNTP濃度過高可能會影響反應的平衡，如抑制DNA聚合酶的活性等，合適的dNTP濃度需要根據(jù)實驗優(yōu)化。四、簡答題（每題10分，共20分）1.簡述PCR技術的基本原理和反應步驟。答：基本原理：PCR技術是一種體外酶促擴增特定DNA片段的方法，其原理類似于DNA的天然復制過程。它以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'端和3'端互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。通過不斷重復高溫變性、低溫退火和適溫延伸的循環(huán)過程，使目的DNA片段得到指數(shù)級擴增。反應步驟：（1）變性：將反應體系加熱至94℃左右，使雙鏈DNA模板解開成單鏈，為引物與模板的結合和DNA聚合酶的作用提供單鏈模板。（2）退火：將溫度降至引物的退火溫度（一般55℃左右），引物與單鏈模板的互補序列特異性結合。（3）延伸：將溫度升至72℃左右，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的3'端開始，按照堿基互補配對原則，合成新的DNA鏈。這三個步驟構成一個循環(huán)，每經過一個循環(huán)，目的DNA片段的數(shù)量就增加一倍。通常經過25-35個循環(huán)，可使目的DNA片段得到大量擴增。2.請比較熒光定量PCR中SYBRGreenI染料法和TaqMan探針法的優(yōu)缺點。答：SYBRGreenI染料法：優(yōu)點：（1）成本較低：SYBRGreenI染料價格相對便宜，不需要設計和合成特異性的探針，降低了實驗成本。（2）操作簡單：只需要將染料加入到PCR反應體系中即可，無需復雜的探針設計和合成過程，實驗操作簡便。（3）通用性強：可以用于各種DNA模板的擴增檢測，只要能設計出合適的引物，就可以使用該方法進行定量分析。缺點：（1）特異性較差：SYBRGreenI染料能與所有雙鏈DNA結合，包括非特異性擴增產物和引物二聚體，可能導致熒光信號的誤判，影響定量的準確性。（2）不能進行多重檢測：由于無法區(qū)分不同的擴增產物，難以在同一反應體系中同時檢測多個靶基因。TaqMan探針法：優(yōu)點：（1）特異性強：TaqMan探針是一段與靶DNA序列特異性結合的寡核苷酸，只有當探針與靶序列特異性結合并被DNA聚合酶切割后才會產生熒光信號，能夠有效避免非特異性擴增的干擾，提高定量的準確性。（2）可進行多重檢測：可以設計不同熒光標記的探針，在同一反應體系中同時檢測多個靶基因，提高檢測效率。缺點：（1）成本較高：探針的設計和合成需要較高的費用，增加了實驗成本。（2）實驗設計復雜：需要根據(jù)靶基因序列設計特異性的探針，對實驗技術要求較高。五、論述題（10分）論述PCR技術在基因診斷中的應用及優(yōu)勢。答：PCR技術在基因診斷中具有廣泛的應用和顯著的優(yōu)勢，以下分別進行闡述。應用1.傳染病診斷：PCR技術可用于檢測各種病原體的核酸，如病毒（如乙肝病毒、艾滋病病毒、新冠病毒等）、細菌（如結核桿菌等）和寄生蟲等。通過設計針對病原體特異性基因的引物，對患者樣本進行PCR擴增和檢測，能夠快速、準確地判斷患者是否感染病原體。例如，在新冠疫情期間，熒光定量PCR技術成為診斷新冠病毒感染的重要手段，通過檢測患者呼吸道樣本中新冠病毒的核酸，為疫情防控提供了關鍵的診斷依據(jù)。2.遺傳病診斷：許多遺傳病是由特定基因的突變引起的。PCR技術可以擴增患者的相關基因片段，然后通過測序等方法分析基因序列，確定是否存在突變。例如，對于地中海貧血等單基因遺傳病，可通過PCR技術擴增珠蛋白基因，檢測其突變情況，實現(xiàn)早期診斷和遺傳咨詢。