組織工程的研究與進展

(ResearchandDevelopmentofTissueEngineering)

隨著移植醫(yī)學與替代醫(yī)療的發(fā)展，人體病損器官、器件和組織的替代物的臨床需求量迅

速增加。

據(jù)美國國家健康統(tǒng)計中心（ＮＣＨＳ）調(diào)查，１９９３年不涉及齒科材料，植入一件以上植入物的患者，在美國已達１１００萬人，占其總?cè)丝诘模矗?，全球預計超出３０００萬人。

齒科植入物，據(jù)日本齒科學會預計，廿一世紀初對牙種植體的需求量將達成其總?cè)丝诘模担埃ァ?/p>

１９９７年美國ＦＡＤ預測將來十年生物醫(yī)學工程產(chǎn)業(yè)３９項新產(chǎn)品中涉及人體器官、器件和組織替代物的幾乎占５０％。

由于源于人體的同種移植物來源有限，在美國僅局限性２０％的患者能得到及時治療，耗資４００億美元。

許多人工合成與制造的替代物，但在一定程度上能滿足臨床的規(guī)定，特別是在植入人體較長時間后，并發(fā)癥較多。因此，研制開發(fā)植入人體后能形成與人體構(gòu)造組織相似、參加人體代謝、能夠修復和改善病損器官、器件和組織功效的植入物，是各國科學家孜孜以求的目的。

組織工程（TissueEngineering)就是在這樣某些需求背景和人工器官技術(shù)、生物技術(shù)、生物材料技術(shù)等當代科學進展的基礎上發(fā)展起來的一項綜合性的高新技術(shù)，是跨世紀生物醫(yī)學工程前沿領(lǐng)域之一。

１９８７年美國科學基金會在華盛頓舉辦的生物工程小組會上提出組織工程這個名詞，１９８８年被定義為：“它應用工程科學與生命科學的原理與辦法，在可控、可重復條件下，通過哺乳動物、人類（涉及患者自己）的特定細胞在網(wǎng)絡構(gòu)架的體外培養(yǎng)、體內(nèi)植入增殖，形成含有特定功效組織和生物替代物?！?/p>

第一種組織工程產(chǎn)品——人工皮膚于１９８８年２月經(jīng)ＦＤＡ同意其上市銷售，進入臨床實用階段。正在研究開發(fā)的骨骼、軟骨、血管以及神經(jīng)組織等項目也已進入進行體內(nèi)實驗的階段。

一、組織工程的基本原理

許多文獻都將組織工程技術(shù)歸納為三個要素：種子細胞、基質(zhì)材料與細胞生長因子。事實上除了上述三個要素以外，培養(yǎng)的生物環(huán)境也是重要的要素。

１．種子細胞

種子細胞指培養(yǎng)、存活、增殖最后形成組織的原始細胞。

種子細胞可分為三類：異種、同種異體和自體細胞。

性能穩(wěn)定、可重復提供的種子細胞來源是組織工程產(chǎn)品商業(yè)化的首要前提。

動物細胞是存量充足的可靠細胞來源之一，但動物細胞在人體內(nèi)會引發(fā)免疫排斥反映造成安全性的問題。

采用轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)可使動物攜有人類的基因以減少甚至避免免疫排斥反映。但更嚴峻的問題是動物體內(nèi)的某些病毒會造成人類的某些新的疾患的產(chǎn)生。

有某些國家政府就明令嚴禁實施異種植入人體。事實上，對科學家來說重要的是要解決避免動物病毒傳染人類的問題，一旦異種細胞植入的安全性問題獲得解決，相信這些國家政府的禁令亦會逐步取消。但現(xiàn)在尚有較大的難度。

現(xiàn)在在組織工程研究中人類本身的細胞仍然是種子細胞的重要來源。人類本身的細胞也存在不少問題。培養(yǎng)的人體組織細胞增生能力普通有限，同時在體外培養(yǎng)條件下隨著細胞的增殖會產(chǎn)生去分化現(xiàn)象，細胞喪失應有的功效。

人類本身的原代細胞作為種子細胞的商業(yè)前景暗淡。但是，應強調(diào)在體內(nèi)的條件下，有許多個成體細胞含有較強的“再生”能力。

這同傳統(tǒng)的組織工程的研究思路不同，反而同傳統(tǒng)的人工器官的研究思路較靠近。這就是近年發(fā)展的再生醫(yī)學發(fā)展的內(nèi)容

１９９８年末，美國有兩個研究機構(gòu)先后成功地培養(yǎng)出人胚胎干細胞。與成體細胞不同，這類細胞含有持續(xù)生長，分化的能力，即從理論上講這類細胞在一定的條件下能夠分化成人體的任何成體細胞，并含有成體細胞的功效。

這類細胞是頗為抱負的種子細胞來源。近年人胚胎干細胞的研究發(fā)展迅猛。隨著人胚胎干細胞研究的進一步進行，也碰到了相稱多的實踐問題，涉及法律的與道德的問題。就技術(shù)而言仍有某些困難問題需要克服。

人胚胎干細胞移植人體內(nèi)后的致癌性問題、抗原性問題、如何調(diào)控人胚胎干細胞定向分化構(gòu)建組織的目的細胞的問題等。

現(xiàn)在比較靠近于實際應用的種子細胞來源是從組織中分離出來的所謂“前驅(qū)細胞”，亦有稱之為組織干細胞。

由于這類細胞在向特定分化方向轉(zhuǎn)化上已得到了部分調(diào)控，但它們尚未完全分化，因而尚存有足夠的靈活性以發(fā)育成幾個不同的類型的細胞。

來源于中胚層細胞的間充質(zhì)干細胞，它們存在于成人的骨髓中，在適宜的誘導條件下含有多向分化為肌腱、骨、軟骨、脂肪、基質(zhì)組織細胞的潛能，進而增殖哺育成對應的組織。現(xiàn)在研究較多的這類細胞涉及：造血干細胞系、神經(jīng)干細胞系以及間充質(zhì)干細胞系等。

２．基質(zhì)材料

基質(zhì)材料類似于人體細胞外基質(zhì)、作為種子細胞以及細胞生長因子的載體，使種子細胞賴以定向分化增殖發(fā)育成對應的組織?；|(zhì)材料亦有稱為細胞支架。抱負的基質(zhì)材料起碼應含有下列某些性能：

a.生物相容性

除了含有普通生物材料的生物相容性規(guī)定，還規(guī)定它利于種子細胞的粘附、分化與增殖。

b.生物降解性

作為種子細胞的支架，一旦種細胞哺育成組織，規(guī)定基質(zhì)材料降解并為人體所代謝，即基質(zhì)材料的降解速率與細胞生長的速率相適應，降解速率應可根據(jù)組織的生長特性加以調(diào)控。

c.含有三維多孔立體網(wǎng)架構(gòu)造

這種構(gòu)造含有較高的比表面積和孔隙率，以利于種子細胞增殖、細胞外基質(zhì)沉積進而形成組織。其中較高的空隙率，利于營養(yǎng)、氧氣的進入和代謝廢物的排出，有助于血管與神經(jīng)的長入。

d.材料—細胞界面

基質(zhì)材料應提供優(yōu)秀的材料——細胞界面，利于細胞的粘附、生長，更重要的是應能激活細胞特異基因的體現(xiàn)和維持正常細胞的表型體現(xiàn)。

e.加工性能和機械強度

由于病損和缺失的組織、器件、器官，形狀尺寸變化較大，有的基質(zhì)材料甚至在手術(shù)植入時還需進一步加工，

有的基質(zhì)材料植入體內(nèi)需為新生組織維持一段時間的力學支撐，直至新生組織含有足夠的力學特性為止。

f.滅菌性能

基質(zhì)材料使用時均需滅菌。因此，規(guī)定滅菌過程對基質(zhì)材料的基本性能不產(chǎn)生明顯的影響

和不帶來新的生物學危害作用。

現(xiàn)在在組織工程中應用的基質(zhì)材料重要有三大類別：天然材料及其復合物；合成高分子可降解材料及其復合物；無機材料及其復合物。

a.天然材料

現(xiàn)在應用較多的有膠原（以Ｉ型膠原為主）、明膠、甲殼素、殼聚糖、海藻酸鹽、透明

質(zhì)酸鈉等。

這類材料制成的細胞支架生物相容性普通較好。其界面利于種子細胞的粘附、分化、增殖。問題是這類材料濕態(tài)強度差，較易為體液的多個酶所降解，降解速率過快。

現(xiàn)在，大都采用交聯(lián)的辦法來提高強度與減緩降解速率。也有采用天然材料之間的復合，

b.合成可降解高分子材料

現(xiàn)在應用較多的品種是聚乙交酯（ＰＧＡ）、聚丙交酯即聚乳酸（ＰＬＡ）、聚己內(nèi)酯（ＰＣＬ）以及它們之間的多個共聚物。通過材料的組份、構(gòu)成比、分子量、分子量分布等因素的調(diào)控來制備體內(nèi)降解速率（半降解期）能夠從幾周到幾年、其它性能也不盡相似、各有特長的基質(zhì)材料。

ＰＬＡ、ＰＧＡ及其共聚物在組織工程中采用的重要構(gòu)造形式有纖維支架、多孔泡沫以及管狀構(gòu)造等。

纖維支架是由ＰＧＡ通過擠壓制成１０～１５μｍ的纖維，再通過編織加工技術(shù)形成編織加工技術(shù)形成編織狀或無紡狀構(gòu)造，孔隙率可高達９７％，面積體積比高達０.０５μｍ-1

１.這樣形成的支架普通不能承當壓力。

高度多孔的泡沫狀支架是一種較好的構(gòu)造形式?？捎枚鄠€方式獲得多孔泡沫構(gòu)造，如：溶劑澆鑄、微粒溶出、氣體發(fā)泡、相分離等辦法。其中氣體發(fā)泡法效果最佳。

ＰＬＡ和ＰＧＡ及其共聚物還可制成管狀構(gòu)造用于尿道，小腸等管狀器官的基質(zhì)材料。

脂肪族聚酯類可降解高分子材料，作為基質(zhì)材料尚有某些局限性的辦法，有待改善：

（１）親水性差，細胞粘附、生長增殖受阻。如：ＰＬＡ包埋的ＰＧＡ無紡纖維支架由于親水性差，細胞吸附力弱，滿足不了組織工程研究的規(guī)定。

（２）引發(fā)無菌性炎癥。ＰＬＡ與ＰＧＡ在臨床應用中發(fā)現(xiàn)約有８％左右患者出現(xiàn)非特異性無菌性炎癥。平均分子量低于２萬時發(fā)病率增加，使用高分子量的ＰＬＡ只能緩慢而不能消除此種并發(fā)癥的發(fā)生。

（３）抗壓強度差。大多數(shù)ＰＬＡ與ＰＧＡ無紡布支架都有抗壓強度差的問題。除了上述介紹的脂肪族聚酯可降解高分子材料及其復合物外，文獻中還報道采用聚偶磷氮（Polyphosphazenes）、聚原酸酯（Polyorthoesters,POE)、聚氨基酸（PolyaminoAcid)|bctisgxjrnpvsgxj(Polyesterurethane)等。

與天然材料相比，合成的材料最大缺點是缺少細胞識別信號，不利于細胞特異性粘附及特異基因的激活，許多學者致力于將某些識別信號片斷，引入合成基質(zhì)材料表面與整體，以增進種子細胞的粘附、生長、增殖。

c.生物陶瓷

生物陶瓷指由金屬離子及非金屬離子以離子鍵結(jié)合的晶體材料。根據(jù)其在生理環(huán)境中的化學活性可分為四類：惰性生物陶瓷，表面活性生物陶瓷，可吸取性生物陶瓷與復合生物陶瓷。

作為基質(zhì)材料普通采用可生物降解的可吸取性生物陶恣。重要有下列某些品種：

（１）磷酸鈣陶瓷支架：磷酸

鈣陶瓷按其Ｃa/P比值分別為１.５、１.６７和２而分為磷酸三鈣、羥基磷灰石和磷酸四鈣，另外尚有Ｃa/P比介于它們之間的物質(zhì)，如：氟代及氧代的羥基磷灰石。其中以羥基磷灰石（ＨＡ）與β磷酸三鈣（β-ΤCΡ）研究最多。

７０年代的研究認為骨骼中的無機成分重要是ＨＡ，因此認為ＨＡ植入人體內(nèi)有助于骨組織的再生。

近年的研究表明骨組織中的礦物質(zhì)是Ｃa/P＜１．５的碳酸鹽磷灰石，除鈣、磷外尚含有鎂、鈉、鉀及某些微量元素。

許多學者研究以β-ＴＣＰ為主的支架及其在組織工程中的應用獲得一定的進展。由于磷酸鈣陶瓷表面的ξ電位效應、濕潤性及游離的磷酸根離子不利于細胞的粘附、增殖，這方面改善的研究尚待進一步。

（２）碳酸鈣陶瓷支架：天然珊瑚（重要成分為碳酸鈣）制成的細胞支架在９０年代初即被用于作為人類骨髓細胞、成纖維細胞、牙齦纖維細胞及胎鼠骨細胞的體外培養(yǎng)。實驗發(fā)現(xiàn)盡管培養(yǎng)早期人類細胞的貼壁率較低，但２０天后細胞數(shù)量和培養(yǎng)板一致，細胞的生理活性正常，分泌的骨唾蛋白，Ｉ型、ＩＩＩ型膠原、骨橋素均顯示陽性。細胞在支架上增殖持續(xù)時間長，碳酸鈣又是在體內(nèi)可降解的材料。

（３）生物活性玻璃細胞支架：含磷和鈣的硅玻璃（SiO-ＣａＯ-ＨＰＯ４）能夠部分降解，其中一類特殊構(gòu)造的稱為生物活性玻璃。其表面水解形成的水合層利于羥基磷灰石形成沉積，同時這類新生態(tài)的羥基磷灰石可選擇性吸附膠原、纖維粘連蛋白，從而使玻璃表面與骨及軟組織之間形成較好的生物相容界面，利于新骨形成。

３.細胞生長因子

生長因子（GrowthFactor,GF)是含有定向誘導和激活組織分化、增殖，維持細胞生物活性等生物效應的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。它對于增進細胞增殖，以及組織的修復、再生含有重要的增進作用。

生長因子的生理功效含有特異性和專一性，即每種生長因子只對某些細胞或某些細胞的某個分化階段發(fā)揮其生理功效。

細胞生長因子并不能調(diào)控細胞分化的全過程。特別是運用生長因子來調(diào)控加緊干細胞定向分化成目的細胞，運用一種生長因素，時常很難奏效。往往是若干種生長因子間協(xié)同作用方能調(diào)控向目的細胞的分化與增殖。

生長因子的作用往往與細胞表面對應受體的活躍程度有關(guān)。如運用ＩＧＦ-Ｉ對肌腱細胞生長增殖的增進作用，其必要條件是ＩＧＦ-１受體系統(tǒng)的活躍。

運用細胞因子來增進種子細胞的分化與增殖，雖是很有效的技術(shù)手段，但要成功地運用自如尚有相稱多的問題需要研究加以解決。

４.培養(yǎng)的生物環(huán)境

現(xiàn)在許多研究者強調(diào)組織工程中細胞培養(yǎng)與擴增，應當是三維，因此推崇采用微重力效應下，細胞與組織三維培養(yǎng)技術(shù)。

我們應當看到人體的細胞的種類是非常多的，不同組織與器官所在的生理環(huán)境（涉及力學環(huán)境）千差萬別。因此，在某些特定環(huán)境中應用的組織只有在特定的環(huán)境條件下培養(yǎng)才干符合臨床應用的規(guī)定。

因此，研究組織工程中細胞培養(yǎng)與擴增條件時，應當重視在與人體生理環(huán)境類似條件下的培養(yǎng)。特別是人體的許多組織的再生能力很強：如人的膀胱，研究在人體環(huán)境下膀胱的再生無疑是非常有科學價值的研究方向。

二、組織工程某些活躍的研究領(lǐng)域

組織工程的目的旨在研制、開發(fā)能夠修復損傷或缺失組織功效的體內(nèi)植入物。因此，組織工程的某些活躍的研究多集中在能夠較快地在臨床應用、可形成商品化、應用前景較明確的某些領(lǐng)域。

１.骨組織工程

將基質(zhì)材料與生長因子（重要是骨形成蛋白rhBMP-２和人轉(zhuǎn)移生長因子βｒｈＴＧＦ-β。在體外組裝后植入體內(nèi)，通過生長因子分子誘導成骨細胞分化、增殖進而長成新骨。這對于社區(qū)域骨缺損的修復有較好的療效。

另一種思路，運用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)增殖獲得足夠數(shù)量的成骨細胞，然后與基質(zhì)材料在體外組裝后植入缺損部位。現(xiàn)在，正在運用后一種思路研究長骨的體內(nèi)生物植入物。

ＢＭＰ在人體內(nèi)發(fā)揮作用的時間受到限制，有的學者提出將控制ＢＭＰ合成的ＤＮＡ質(zhì)粒復合于基質(zhì)材料中植入人體，這樣能夠在骨組織形成過程中不停合成ＢＭＰ，增進成骨細胞生長。

２．皮膚組織工程

最早的皮膚生物替代物是源于患者本人的角質(zhì)細胞在高鈣條件下的復層模片，爾后將其用酶從培養(yǎng)瓶中消化下來，移植至斷層或全層皮膚創(chuàng)面。

之后，較成功的實驗是將新生兒包皮中成纖維細胞與牛Ｉ型膠原制成真皮替代物。表面由自體表皮細胞覆蓋，成功地用于人體創(chuàng)面復蓋。

近年，由膠原與硫酸軟骨素復

合的模擬真皮；ＰＧＡ和ＰＬＡ作支架移植新生兒包皮成纖維細胞增殖后制成的人工真皮；去除包含有郎罕氏細胞的表皮成分，通過一段時間冷藏的無細胞異體真皮等產(chǎn)品均在燒傷創(chuàng)面應用獲得成功。

人工皮膚是最早被ＦＤＡ同意上市的組織工程產(chǎn)品。

皮膚生物工程產(chǎn)品的設計已趨成熟，即此種皮膚替代物應用表皮、真皮兩層，表皮中的細胞應含有分化、增殖的能力，表皮與真皮之間的緊密粘附，通過兩層細胞間的互相作用實現(xiàn)人工組織植入物的功效。

３．肌腱、軟骨組織工程

結(jié)締組織的替代是重建外科的熱點，其中尤以肌腱與軟骨修復受到關(guān)注。

ＰＧＡ與間充質(zhì)細胞構(gòu)成的人工組織植入裸鼠皮下、兔子的關(guān)節(jié)缺損進行了廣泛的研究，證明能夠形成軟骨，肌腱和新生骨。還能夠進行血管化再生組織的培養(yǎng)。

軟骨的體外培養(yǎng)已獲成功，核心是要得到足夠的厚度與對應的強度。體外培養(yǎng)中新生軟骨超出一定的厚度，中心區(qū)域的軟骨細胞由于距離邊沿遠而無法得到充足的營養(yǎng)和氧氣，無法對多個生長因子的刺激作出響應，也不能排除代謝廢物。國外采用一種旋轉(zhuǎn)式生物反映器，在此反映器的細胞支架上進行培養(yǎng)，確保細胞營養(yǎng)與氧氣充足供應與代謝廢物的排除，同時對環(huán)境施以一定的應力場作用，造成組織工程化軟骨，富含膠原及其它某些蛋白質(zhì)。

肌腱組織工程的種子細胞現(xiàn)在大多采用胚胎肌腱組織分離、純化獲得的肌腱細胞。采用以膠原為主原料制成的天然細胞支架，也有采用ＰＬＡ與ＰＧＡ細胞支架的，后者親水性較差而影響細胞粘附。

肌腱組織工程中尚有一種極其重要的研究方向就是運用支架植入誘導自體肌腱組織的再生。文獻中已有成功的報道。

４．含有分泌功效器官的組織工程

實驗中的研究目的現(xiàn)在集中在人工肝、人工胰及人工腎。以人工肝為例，事實上現(xiàn)在還沒有達成形成肝組織的水平，只是分化增殖肝細胞的聚集體。另一片現(xiàn)在有二類研究方向。一類是體內(nèi)型，重要是運用海藻酸／聚賴氨酸包埋肝細胞形成生物微膠囊用作組織細胞移植治療的免疫隔離工具，組織在囊內(nèi)分化、增殖，營養(yǎng)和氧份由組織液提供，細胞的分泌物與代謝由囊內(nèi)向囊外輸運再轉(zhuǎn)運全身，起到肝組織的分泌代謝功效。

另一類是體外型。重要是運用空心纖維型生物反映器在體外大量培養(yǎng)肝細胞，該反映器附有供營養(yǎng)液、充氣和排泄裝置，使細胞維持在良好的微環(huán)境中生長。運用血液凈化的原理經(jīng)肝細胞作用后的血液回輸體內(nèi)。這類裝置事實上只是肝臟的短期支持系統(tǒng)。

生物活性的人工胰，也是運用微膠囊技術(shù)包埋胰島細胞制成。植入腹腔后胰島細胞分泌的胰島素通過微囊半透膜輸運到腹腔，爾后通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運到全身。

三、組織工程研究的若干問題

１．人體組織與器官的替代需要“綜合”各學科的成就各個學科總是從本學科已有的技術(shù)優(yōu)勢出發(fā)來解決臨床碰到的某些科學“難題”。從某種意義上講，這種優(yōu)勢又是一種片面。

只有不受狹小學科的思維束縛，在多領(lǐng)域的技術(shù)成就的基礎上，集成各方面的技術(shù)優(yōu)勢，才有可能解決人體器官的替代、修復、再生、復制與置換這樣一種極其復雜的問題。

２．免疫問題

由于人的