人工合成基因重組肽rLj-RGD4對小鼠黑色素瘤B16細胞的抑制效應與機制探究一、引言1.1研究背景與意義黑色素瘤是一種起源于神經(jīng)外胚葉、產生于黑色素細胞或其母細胞的惡性腫瘤，在皮膚腫瘤中惡性程度極高，嚴重威脅人類健康。近年來，全球黑色素瘤的發(fā)病率呈顯著上升趨勢。據(jù)相關數(shù)據(jù)顯示，在過去的30年中，黑色素瘤的發(fā)病率不斷攀升，僅在2015年，美國就有73870個新病例被診斷出來，其中9940人死于黑色素瘤。黑色素瘤具有高度的侵襲性和轉移性，患者往往面臨高轉移率和高復發(fā)率的困境。對于大多數(shù)早期黑色素瘤患者而言，手術切除是主要的治療手段，但一旦腫瘤發(fā)生轉移，患者的5年生存率急劇下降，僅為16%。這使得黑色素瘤的治療成為醫(yī)學領域的一大挑戰(zhàn)，尋求更有效的治療方法迫在眉睫。腫瘤細胞的侵襲和轉移是導致黑色素瘤患者預后不良的關鍵因素。而腫瘤細胞與其細胞外基質的黏附，是引起腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵環(huán)節(jié)。在這個過程中，整合蛋白作為細胞黏附分子家族的重要成員，與細胞外基質蛋白質配體間相互作用的識別位點是精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）模體。RGD模體在腫瘤細胞與細胞外基質以及腫瘤細胞之間的黏附中發(fā)揮著至關重要的作用，成為腫瘤治療的一個重要靶點。RGD廣泛存在于生物體內，細胞外基質和血液中的黏附蛋白是人體中最常見的含RGD序列的蛋白質。它是一種動物毒素蛋白，通過毒腺或唾液腺分泌，具有抗血栓和抗腫瘤兩大典型生物活性。前期研究發(fā)現(xiàn)，重組日本七鰓鰻RGD3毒素蛋白（rLj-RGD3）能抑制體外培養(yǎng)的Hela細胞和人肝癌HepG2細胞增殖，并誘導細胞發(fā)生凋亡。然而，rLj-RGD3分子量稍大，在生物制藥應用中可能存在免疫原性的潛在風險。為了克服這一問題，本課題組以rLj-RGD3野生型缺失突變體小肽為對象，設計并人工合成了含有4個RGD序列、分子量僅為6.27kDa的基因重組肽rLj-RGD4。人工合成基因重組肽rLj-RGD4的出現(xiàn)，為黑色素瘤的治療帶來了新的希望。研究rLj-RGD4對小鼠黑色素瘤B16細胞的抑制作用，有助于深入了解其抗腫瘤機制，為黑色素瘤的治療提供新的策略和潛在的藥物靶點。通過探究rLj-RGD4對B16細胞增殖、遷移、浸潤與凋亡等生物學行為的影響，可以進一步明確其在黑色素瘤治療中的價值，為后續(xù)的臨床研究和藥物開發(fā)奠定堅實的基礎。這不僅有助于提高黑色素瘤患者的生存率和生活質量，也將為腫瘤治療領域的發(fā)展做出積極貢獻。1.2國內外研究現(xiàn)狀在黑色素瘤的研究領域，小鼠黑色素瘤B16細胞系因其高度的侵襲性和轉移性，成為了研究黑色素瘤發(fā)病機制、侵襲轉移機制以及評估抗癌藥物效果的常用細胞模型。國內外眾多學者對B16細胞進行了深入研究，旨在揭示黑色素瘤的生物學特性，為開發(fā)有效的治療策略提供理論依據(jù)。在細胞增殖方面，研究發(fā)現(xiàn)B16細胞的增殖受到多種信號通路的調控，如MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路等，這些通路的異常激活與B16細胞的快速增殖密切相關。在細胞遷移和浸潤方面，B16細胞能夠通過分泌多種蛋白酶，降解細胞外基質，從而促進其遷移和浸潤，其中基質金屬蛋白酶（MMPs）在這一過程中發(fā)揮了關鍵作用。針對黑色素瘤的治療，目前臨床上主要采用手術切除、化療、放療、免疫治療和靶向治療等方法。手術切除是早期黑色素瘤的主要治療手段，但對于晚期黑色素瘤患者，由于腫瘤的轉移和復發(fā)，手術治療的效果往往不理想?；熕幬锶邕_卡巴嗪（DTIC）等，雖然在一定程度上能夠抑制腫瘤細胞的生長，但也存在嚴重的副作用，且易產生耐藥性。放療則主要用于緩解黑色素瘤患者的局部癥狀，但對遠處轉移的腫瘤細胞效果不佳。近年來，免疫治療和靶向治療取得了顯著進展，為黑色素瘤患者帶來了新的希望。免疫治療藥物如免疫檢查點抑制劑，能夠激活機體的免疫系統(tǒng)，增強對腫瘤細胞的殺傷作用；靶向治療藥物如BRAF抑制劑和MEK抑制劑等，能夠特異性地抑制腫瘤細胞中的關鍵分子，從而阻斷腫瘤細胞的生長和增殖。然而，這些治療方法仍存在一定的局限性，如免疫治療可能導致免疫相關的不良反應，靶向治療可能出現(xiàn)耐藥性等問題。在RGD肽的研究方面，國內外的研究成果表明，RGD肽在腫瘤治療中具有廣闊的應用前景。RGD肽能夠特異性地與腫瘤細胞表面的整合素結合，從而阻斷腫瘤細胞與細胞外基質的黏附，抑制腫瘤細胞的遷移、浸潤和轉移。此外，RGD肽還能夠誘導腫瘤細胞凋亡，通過激活細胞內的凋亡信號通路，促使腫瘤細胞發(fā)生程序性死亡。在腫瘤靶向治療中，RGD肽作為一種理想的靶向載體，能夠將藥物、放射性核素等特異性地輸送到腫瘤組織，提高治療效果，減少對正常組織的損傷。人工合成基因重組肽rLj-RGD4作為一種新型的RGD肽，其研究主要集中在抗腫瘤活性及作用機制方面。前期研究已證實，rLj-RGD4能夠抑制小鼠黑色素瘤B16細胞的增殖、遷移和浸潤，并誘導細胞凋亡。在細胞增殖抑制方面，rLj-RGD4能夠通過阻斷細胞周期進程，抑制B16細胞的增殖；在細胞遷移和浸潤抑制方面，rLj-RGD4能夠破壞B16細胞的細胞骨架，降低細胞的運動能力，從而抑制其遷移和浸潤；在誘導細胞凋亡方面，rLj-RGD4能夠激活caspase-8和caspase-3等凋亡相關蛋白，促進細胞凋亡。然而，目前對于rLj-RGD4在體內的抗腫瘤效果、藥代動力學特性以及與其他治療方法聯(lián)合應用的研究還相對較少。此外，rLj-RGD4與腫瘤細胞表面整合素的結合機制以及對腫瘤微環(huán)境的影響等方面，也有待進一步深入探究。1.3研究目標與內容本研究旨在深入探究人工合成基因重組肽rLj-RGD4對小鼠黑色素瘤B16細胞的抑制作用及其潛在機制，為黑色素瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。具體研究內容如下：rLj-RGD4對B16細胞增殖的影響：采用MTT法，檢測不同濃度rLj-RGD4作用于B16細胞后的增殖情況，繪制細胞生長曲線，計算半數(shù)抑制濃度（IC50），以明確rLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制效果及量效關系。rLj-RGD4對B16細胞遷移和浸潤的影響：運用細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗，觀察rLj-RGD4處理后B16細胞的遷移能力和浸潤能力的變化，從細胞運動和侵襲角度揭示rLj-RGD4對B16細胞惡性行為的抑制作用。rLj-RGD4對B16細胞凋亡的誘導作用：通過Hoechst33258染色、TUNEL法以及流式細胞術等方法，檢測rLj-RGD4對B16細胞凋亡率的影響，觀察凋亡細胞的形態(tài)學變化，明確rLj-RGD4是否能夠誘導B16細胞發(fā)生凋亡。rLj-RGD4對B16細胞骨架的破壞作用：利用鬼筆環(huán)肽染色，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察rLj-RGD4處理后B16細胞骨架的形態(tài)變化，分析rLj-RGD4對細胞骨架結構的影響，探討其與細胞遷移和浸潤抑制之間的關聯(lián)。rLj-RGD4對B16細胞凋亡相關蛋白表達的影響：采用Westernblot技術，檢測rLj-RGD4作用于B16細胞后，凋亡相關蛋白如caspase-3、caspase-8、Bcl-2等的表達水平變化，從分子層面深入探究rLj-RGD4誘導B16細胞凋亡的作用機制。1.4研究方法與技術路線細胞培養(yǎng)：將小鼠黑色素瘤B16細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液傳代。MTT法檢測細胞增殖：取對數(shù)生長期的B16細胞，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度（0、2.4、4.8、9.6、14.4、19.2μmol/L）的rLj-RGD4，每個濃度設置5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h后，吸出培養(yǎng)液，加入150μLDMSO，振蕩10min，使結晶充分溶解，用酶標儀在492nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)公式計算細胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以rLj-RGD4濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制細胞生長曲線，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。細胞劃痕實驗檢測細胞遷移：將B16細胞以每孔5×10?個細胞的密度接種于6孔板中，待細胞長滿至80%-90%融合時，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，用PBS沖洗3次，去除劃下的細胞。加入含不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L）的無血清培養(yǎng)基，分別在0h、24h、48h在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率：遷移率（%）=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤：遷移實驗中，在上室中加入含不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L）的B16細胞懸液（200μL，5×10?個細胞/mL），下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（600μL）作為趨化劑，培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽擦去上室未遷移的細胞，甲醇固定15min，結晶紫染色10min，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)。浸潤實驗中，預先將Matrigel基質膠鋪于Transwell小室的聚碳酸酯膜上，4℃放置過夜使其凝固，后續(xù)步驟同遷移實驗，培養(yǎng)48h后計數(shù)浸潤到下室的細胞數(shù)。Hoechst33258染色檢測細胞凋亡：將B16細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次，加入Hoechst33258染色液（10μg/mL），室溫避光染色10min，PBS沖洗3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算凋亡率：凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。TUNEL法檢測細胞凋亡：按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。將B16細胞接種于24孔板中，處理方法同Hoechst33258染色實驗，固定細胞后，加入TdT酶和生物素標記的dUTP，37℃孵育60min，PBS洗滌3次，加入HRP標記的鏈霉親和素，37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，在顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算凋亡率。流式細胞術檢測細胞凋亡：收集經(jīng)不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L）處理24h后的B16細胞，用PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細胞，調整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，室溫避光孵育15min，再加入400μLBindingBuffer，在1h內用流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率。鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架：將B16細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出蓋玻片，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次，0.1%TritonX-100通透10min，PBS洗滌3次，加入鬼筆環(huán)肽（1:200稀釋），室溫避光染色30min，PBS洗滌3次，DAPI染核5min，PBS洗滌3次，封片后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析細胞骨架形態(tài)變化。Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達：收集經(jīng)不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6、14.4μmol/L）處理24h后的B16細胞，用含PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白進行12%SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（caspase-3、caspase-8、Bcl-2等，1:1000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10min，加入二抗（1:5000稀釋），室溫孵育2h，TBST洗滌3次，每次10min，ECL化學發(fā)光法顯色，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。本研究的技術路線圖如下所示：@startumlstart:獲取小鼠黑色素瘤B16細胞，進行細胞培養(yǎng);:設置不同濃度rLj-RGD4處理組和對照組;fork:MTT法檢測細胞增殖，計算IC50，繪制細胞生長曲線;:細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，計算遷移率;:Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤，計數(shù)遷移和浸潤細胞數(shù);:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@endumlstart:獲取小鼠黑色素瘤B16細胞，進行細胞培養(yǎng);:設置不同濃度rLj-RGD4處理組和對照組;fork:MTT法檢測細胞增殖，計算IC50，繪制細胞生長曲線;:細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，計算遷移率;:Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤，計數(shù)遷移和浸潤細胞數(shù);:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:獲取小鼠黑色素瘤B16細胞，進行細胞培養(yǎng);:設置不同濃度rLj-RGD4處理組和對照組;fork:MTT法檢測細胞增殖，計算IC50，繪制細胞生長曲線;:細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，計算遷移率;:Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤，計數(shù)遷移和浸潤細胞數(shù);:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:設置不同濃度rLj-RGD4處理組和對照組;fork:MTT法檢測細胞增殖，計算IC50，繪制細胞生長曲線;:細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，計算遷移率;:Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤，計數(shù)遷移和浸潤細胞數(shù);:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@endumlfork:MTT法檢測細胞增殖，計算IC50，繪制細胞生長曲線;:細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，計算遷移率;:Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤，計數(shù)遷移和浸潤細胞數(shù);:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:MTT法檢測細胞增殖，計算IC50，繪制細胞生長曲線;:細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，計算遷移率;:Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤，計數(shù)遷移和浸潤細胞數(shù);:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:細胞劃痕實驗檢測細胞遷移，計算遷移率;:Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤，計數(shù)遷移和浸潤細胞數(shù);:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:Transwell小室實驗檢測細胞遷移和浸潤，計數(shù)遷移和浸潤細胞數(shù);:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:TUNEL法檢測細胞凋亡，計算凋亡率;:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:流式細胞術檢測細胞凋亡，分析凋亡率;:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞骨架形態(tài)變化;:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達，分析蛋白相對表達量;forkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@endumlforkend:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@enduml:綜合分析實驗結果，探討rLj-RGD4對B16細胞的抑制作用及機制;end@endumlend@enduml@enduml通過以上研究方法和技術路線，本研究將系統(tǒng)地探究人工合成基因重組肽rLj-RGD4對小鼠黑色素瘤B16細胞的抑制作用，從細胞增殖、遷移、浸潤、凋亡以及細胞骨架和凋亡相關蛋白表達等多個層面深入分析其作用機制，為黑色素瘤的治療提供有價值的理論依據(jù)和潛在的治療策略。二、相關理論基礎2.1人工合成基因重組肽rLj-RGD42.1.1rLj-RGD4的結構與特點人工合成基因重組肽rLj-RGD4是本課題組以rLj-RGD3基因為原型，通過精心設計改造而獲得的。它由58個氨基酸殘基組成，分子量僅為6.27kDa。其氨基酸序列經(jīng)過巧妙設計，具有獨特的結構特征。rLj-RGD4最為顯著的特點是含有4個RGD模體，RGD模體即精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列，在腫瘤細胞與細胞外基質以及腫瘤細胞之間的黏附中發(fā)揮著核心作用。這4個RGD模體的存在，使得rLj-RGD4在與整合素結合時具有更高的親和力和特異性，能夠更有效地阻斷腫瘤細胞與細胞外基質的黏附過程。與rLj-RGD3相比，rLj-RGD4在結構上進行了優(yōu)化，分子量的減小使其在生物制藥應用中更具優(yōu)勢。較小的分子量不僅有利于其在體內的運輸和擴散，還降低了免疫原性的潛在風險，提高了藥物的安全性和有效性。此外，rLj-RGD4自身帶有5個組氨酸殘基，這一結構特點為其純化提供了便利。利用鎳柱進行親和層析純化，能夠高效地獲得高純度的rLj-RGD4，為后續(xù)的研究和應用奠定了堅實的基礎。rLj-RGD4的空間結構也對其功能產生重要影響。通過生物信息學分析和相關實驗技術預測，其氨基酸殘基之間形成了特定的相互作用，使得分子呈現(xiàn)出穩(wěn)定的三維構象。這種構象不僅保證了RGD模體的暴露和活性，還影響了rLj-RGD4與其他分子的相互作用方式。例如，其空間結構可能影響與整合素結合時的位點特異性和結合強度，進而影響其對腫瘤細胞生物學行為的調控效果。2.1.2rLj-RGD4的作用機制概述rLj-RGD4的作用機制主要圍繞其與整合素的特異性結合展開。整合素是一類廣泛存在于細胞表面的跨膜糖蛋白，在腫瘤細胞的生長、遷移、浸潤和血管新生等過程中扮演著關鍵角色。rLj-RGD4憑借其含有的4個RGD模體，能夠與腫瘤細胞和新生血管內皮細胞表面高表達的某些整合素亞型，如αvβ3和αvβ5整合素，發(fā)生特異性結合。當rLj-RGD4與整合素結合后，會阻斷整合素與細胞外基質蛋白質配體之間的相互作用，從而封閉整合素介導的信號轉導通路。這一過程產生了多方面的影響：在血管新生方面，抑制了新生血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，切斷了腫瘤生長所需的營養(yǎng)供應和氧氣輸送，從根源上限制了腫瘤的發(fā)展；在腫瘤細胞行為方面，抑制了腫瘤細胞的黏附、遷移和浸潤能力，使其難以突破基底膜向周圍組織擴散，有效遏制了腫瘤的轉移。rLj-RGD4還能夠誘導腫瘤細胞凋亡。它可能通過激活細胞內的凋亡信號通路，促使腫瘤細胞發(fā)生程序性死亡。例如，研究發(fā)現(xiàn)rLj-RGD4能夠上調凋亡相關蛋白caspase-3和caspase-8的表達水平，同時下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而打破細胞內的凋亡平衡，誘導腫瘤細胞凋亡。rLj-RGD4對細胞骨架的結構和功能也產生影響。通過破壞細胞骨架的完整性，改變細胞的形態(tài)和運動能力，進一步抑制腫瘤細胞的遷移和浸潤。綜上所述，rLj-RGD4通過多種途徑協(xié)同作用，發(fā)揮對腫瘤細胞的抑制作用，展現(xiàn)出在腫瘤治療領域的巨大潛力。2.2小鼠黑色素瘤B16細胞2.2.1B16細胞的來源與特性小鼠黑色素瘤B16細胞系于1954年成功建系，其源于C57BL/6J小鼠，這些小鼠在緬因州杰克遜實驗室中，皮膚自發(fā)形成腫瘤，B16細胞正是從這些腫瘤組織中分離培養(yǎng)而來。B16細胞具有獨特的生物學特性，在生長方面，它呈現(xiàn)出貼壁生長的特性，且生長速度迅速，倍增時間約為24小時左右。在形態(tài)上，B16細胞以單層形式生長，兼具上皮樣和紡錘形細胞形態(tài)，細胞大小約為15.4μm。值得一提的是，B16細胞具有產生黑色素的能力，其黑色素的產生與細胞的生長狀態(tài)和培養(yǎng)條件密切相關。當使用RPMI-1640培養(yǎng)基時，B16細胞能夠快速增殖；而使用DMEM培養(yǎng)基時，則可誘導細胞分化成熟并合成黑色素。B16細胞還具有較強的轉移能力，能夠在小鼠體內轉移至脾臟、肝臟和肺部等多個器官，這使得它成為研究腫瘤轉移機制的理想模型。B16細胞存在不同的克隆亞系，如B16GMCSF、B164A5、B16FLT3和B16F10等，這些亞系在形態(tài)、細胞大小和轉移能力等方面存在差異。其中，B16F10具有較高的肺轉移能力，而B16A3則是最具侵襲性的皮膚癌細胞系之一。這些亞系的存在，為研究腫瘤細胞的異質性和不同轉移特性提供了豐富的研究材料。2.2.2B16細胞在腫瘤研究中的應用B16細胞在腫瘤研究領域應用廣泛，為深入探究腫瘤生物學、開發(fā)新型抗癌藥物以及評估治療效果提供了重要的研究工具。在腫瘤生物學研究方面，B16細胞系被大量用于探索腫瘤細胞生長、增殖和轉移背后的細胞機制。長鏈非編碼RNALncRNAMEG3在黑色素瘤形成、生長和轉移中的作用研究，就是借助B16細胞展開的。研究發(fā)現(xiàn)，該非編碼RNA通過調節(jié)miRNA-21/E-鈣粘蛋白軸，對這些細胞事件產生刺激作用，從而揭示了黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵分子調控機制。B16細胞也用于研究Notch1信號在腫瘤誘導的免疫抑制中的潛在作用，有助于進一步了解腫瘤免疫逃逸的機制，為腫瘤免疫治療提供新的靶點和思路。在藥物篩選方面，B16細胞在體外培養(yǎng)中，可用于篩選和評估抗黑色素瘤藥物的療效。通過將藥物添加到培養(yǎng)基中，研究藥物對B16細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移等生物學行為的影響，從而評估其抗腫瘤活性。新藤黃酸（一種天然化合物）的抗腫瘤作用研究，就是以B16細胞系為模型。研究結果表明，新藤黃酸能夠調節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路，導致癌癥細胞死亡，為開發(fā)新型抗黑色素瘤藥物提供了理論依據(jù)。人參皂苷Rg3的抗黑色素瘤作用研究也借助了B16細胞系，發(fā)現(xiàn)該天然化合物通過下調ERK和Akt途徑，引起抗腫瘤活性，為黑色素瘤的治療提供了新的潛在藥物選擇。B16細胞還可作為免疫治療研究的模型。將免疫刺激劑或免疫檢查點抑制劑添加到培養(yǎng)基中，研究它們對細胞免疫應答和腫瘤生長的影響，以評估其在黑色素瘤治療中的潛力。在黑色素瘤轉移研究中，通過將B16細胞注射到小鼠的血液循環(huán)或特定的器官中，研究黑色素瘤細胞的遷移和轉移機制，以及針對轉移的治療策略。B16細胞也用于研究細胞信號傳導通路在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，通過轉染或抑制特定的信號分子或途徑，研究其對細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學行為的影響。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞與試劑細胞：小鼠黑色素瘤B16細胞，由本實驗室保存。其來源于C57BL/6J小鼠皮膚自發(fā)形成的腫瘤組織，具有貼壁生長、生長速度快、可產生黑色素以及高轉移能力等特性，在腫瘤研究領域應用廣泛。試劑：人工合成基因重組肽rLj-RGD4，由本課題組設計并人工合成，其基因構建于pET23b質粒載體，通過對表達菌BL21進行IPTG誘導表達，并經(jīng)鎳柱親和層析純化獲得。細胞培養(yǎng)試劑：RPMI1640培養(yǎng)基（購自Gibco公司），為B16細胞提供生長所需的營養(yǎng)成分；胎牛血清（FBS，購自Gibco公司），含有多種生長因子和營養(yǎng)物質，能促進細胞生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，購自Solarbio公司），用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（購自Solarbio公司），用于消化貼壁的B16細胞，以便進行傳代培養(yǎng)。檢測試劑：四甲基偶氮唑藍（MTT，購自Sigma公司），用于檢測細胞增殖；二甲基亞砜（DMSO，購自Sigma公司），用于溶解MTT形成的甲瓚結晶；細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒（購自碧云天生物技術有限公司），通過Hoechst33258染色觀察細胞核形態(tài)變化，檢測細胞凋亡；TUNEL細胞凋亡試劑盒（購自碧云天生物技術有限公司），基于分子生物學與形態(tài)學相結合的方法，通過檢測斷裂DNA片段的著色情況來判斷細胞凋亡；鬼筆環(huán)肽（購自Sigma公司），用于標記細胞骨架中的肌動蛋白，觀察細胞骨架形態(tài)變化；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（購自BD公司），利用AnnexinV能特異性結合磷脂酰絲氨酸以及PI能染色壞死細胞和晚期凋亡細胞的特性，通過流式細胞術區(qū)分不同凋亡時期的細胞；RIPA裂解液（含PMSF，購自Solarbio公司），用于裂解細胞，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（購自Solarbio公司），用于測定提取的蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（購自Beyotime公司），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進行蛋白質電泳；PVDF膜（購自Millipore公司），用于蛋白質轉膜；脫脂奶粉（購自BD公司），用于封閉PVDF膜，減少非特異性結合；一抗caspase-3、caspase-8、Bcl-2（購自CellSignalingTechnology公司，1:1000稀釋），用于特異性識別凋亡相關蛋白；二抗（購自CellSignalingTechnology公司，1:5000稀釋），與一抗結合，通過化學發(fā)光法檢測目的蛋白表達。3.1.2儀器設備細胞培養(yǎng)設備：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司），提供37℃、5%CO?的培養(yǎng)環(huán)境，滿足B16細胞的生長需求；超凈工作臺（ThermoScientific公司），為細胞培養(yǎng)操作提供無菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Nikon公司），用于觀察細胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。檢測分析儀器：酶標儀（ThermoScientific公司），用于測定MTT實驗中各孔的吸光值，分析細胞增殖情況；流式細胞儀（BD公司），進行AnnexinV-FITC/PI雙染后，檢測細胞凋亡率；共聚焦熒光顯微鏡（CarlZeiss公司），用于觀察Hoechst33258染色、TUNEL染色以及鬼筆環(huán)肽染色后的細胞，分析細胞凋亡和細胞骨架形態(tài)變化；蛋白電泳儀（Bio-Rad公司）和轉膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質的SDS-PAGE電泳和轉膜操作；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（FluorChemQ成像儀，ProteinSimple公司），用于檢測Westernblot中的化學發(fā)光信號，分析凋亡相關蛋白的表達水平。其他儀器：高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞和蛋白樣品的離心分離；移液器（Eppendorf公司），準確移取各種試劑和樣品；96孔板、24孔板、6孔板、細胞培養(yǎng)瓶（Corning公司），用于細胞培養(yǎng)和實驗操作。3.2實驗方法3.2.1rLj-RGD4的制備與純化以rLj-RGD3為原型，在保留原有3個RGD模體的基礎上，通過精心的基因缺失突變和突變后序列連接，設計出能形成第4個RGD堿基序列的rLj-RGD4基因。對設計后的基因序列進行全序列基因合成，獲得rLj-RGD4基因。在人工合成的rLj-RGD4基因基礎上，運用引物設計軟件設計引物，在序列5′端引入NdeI酶切位點，在序列3′端引入終止密碼子和HindIII酶切位點。通過PCR擴增目的基因片段，將擴增產物和pET23b載體分別用NdeI和HindIII進行雙酶切，酶切反應體系包含10×Buffer、限制性內切酶、DNA模板等，37℃水浴反應2-3小時。酶切產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的基因片段與線性化的pET23b載體在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接反應體系包括T4DNA連接酶、10×Buffer、目的基因片段、載體片段等，16℃連接過夜。連接產物轉化入E.coliDH5α克隆菌感受態(tài)細胞中，將轉化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑選單菌落進行菌落PCR鑒定和測序驗證，篩選出陽性重組子pET23bRGD4(Tag-)。將陽性重組子pET23bRGD4(Tag-)轉化入E.coliBL21表達菌感受態(tài)細胞中。挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1:100的比例轉接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值達到0.6-0.8。加入終濃度為1mmol/L的IPTG進行誘導表達，30℃、180rpm振蕩培養(yǎng)12h。誘導結束后，4℃、8000rpm離心10min收集菌體，用PBS重懸菌體，超聲破碎儀進行超聲破碎，功率300W，工作3s，間隔5s，共30min。4℃、12000rpm離心30min，收集上清，即為含有rLj-RGD4的粗提液。利用鎳柱親和層析對rLj-RGD4進行純化。將鎳柱用平衡緩沖液（20mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH7.4）平衡3-5個柱體積，然后將粗提液緩慢上樣，使rLj-RGD4與鎳柱上的鎳離子特異性結合。用洗滌緩沖液（20mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，50mmol/L咪唑，pH7.4）洗滌鎳柱，去除雜蛋白，直至流出液的OD280值接近基線。最后用洗脫緩沖液（20mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH7.4）洗脫rLj-RGD4，收集洗脫峰。洗脫得到的rLj-RGD4經(jīng)Tricine-SDSPAGE電泳鑒定純度，考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白濃度。將純化后的rLj-RGD4用透析袋透析去除咪唑等雜質，透析液為PBS，4℃透析過夜，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?.2.2B16細胞的培養(yǎng)與處理從液氮罐中取出凍存的小鼠黑色素瘤B16細胞，迅速放入37℃水浴中，不斷搖晃，使其快速解凍。在超凈工作臺內，將解凍后的細胞懸液轉移至含有5mL完全培養(yǎng)基（RPMI1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清。用5mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液轉移至T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞匯合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次，每次3-5min，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。加入1mL0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，37℃消化2-3min，在倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓、間隙增大、開始脫落時，加入2mL完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全脫落并分散成單細胞懸液，按1:3-1:4的比例將細胞接種到新的細胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在進行實驗時，將對數(shù)生長期的B16細胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸并調整細胞濃度。根據(jù)不同實驗需求，將細胞接種到相應的培養(yǎng)板中。如在MTT實驗中，將細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板，每孔加入100μL細胞懸液；在細胞劃痕實驗中，將細胞以每孔5×10?個的密度接種于6孔板，每孔加入2mL細胞懸液；在Transwell實驗中，將細胞以每孔5×10?個的密度接種于Transwell小室的上室，上室加入200μL細胞懸液。細胞接種后，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。貼壁后，吸去原培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質。然后加入不同濃度的rLj-RGD4溶液，每個濃度設置3-5個復孔。rLj-RGD4溶液用無血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，對照組加入等體積的無血清培養(yǎng)基。處理后的細胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相應時間，用于后續(xù)實驗檢測。3.2.3細胞活性檢測方法MTT法：MTT法是一種廣泛應用于檢測細胞增殖活性的方法，其原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將黃色的MTT（四甲基偶氮唑藍）還原為不溶性的藍紫色甲瓚結晶，而死細胞則無此功能。甲瓚結晶的生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過檢測其在特定波長下的吸光值，可間接反映細胞的增殖活性。在本實驗中，將接種有B16細胞的96孔板培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的rLj-RGD4作用24h。然后每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4h，此時活細胞中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚結晶。小心吸出培養(yǎng)液，避免吸走甲瓚結晶，加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚結晶充分溶解。用酶標儀在492nm波長處測定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)公式計算細胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以rLj-RGD4濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制細胞生長曲線，通過曲線擬合計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。CCK-8法：CCK-8法是一種基于WST-8（水溶性四唑鹽）的細胞增殖和細胞毒性檢測方法，具有操作簡便、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點。其原理是WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，被細胞內的脫氫酶還原為高度水溶性的橙黃色甲瓚產物，甲瓚的生成量與活細胞數(shù)量成正比。在本實驗中，將B16細胞接種于96孔板，每孔100μL，細胞密度為每孔5×103個，培養(yǎng)24h。設置空白組（只含培養(yǎng)基和CCK-8試劑，不含細胞）、對照組（含細胞和培養(yǎng)基，不含rLj-RGD4）和實驗組（含細胞、培養(yǎng)基和不同濃度rLj-RGD4），每組設置5個復孔。向實驗組加入不同濃度的rLj-RGD4，使其終濃度分別為0、2.4、4.8、9.6、14.4、19.2μmol/L，對照組加入等體積的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束前1-4h，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產生氣泡，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育，直至顏色變化明顯（肉眼可見橙黃色）。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的OD值，參比波長設為600-650nm。根據(jù)公式計算細胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以rLj-RGD4濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制細胞生長曲線，計算IC50。3.2.4細胞遷移與浸潤實驗劃痕實驗：劃痕實驗是一種簡單直觀的檢測細胞遷移能力的方法，通過觀察細胞在劃痕區(qū)域的遷移情況，評估細胞的運動能力。在本實驗中，將B16細胞以每孔5×10?個的密度接種于6孔板中，加入2mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長滿至80%-90%融合時，進行劃痕操作。在超凈工作臺內，用200μL移液器槍頭垂直于孔中心，在細胞單層上均勻劃出約500μm寬的“傷痕”，劃痕時盡量保持力度和角度一致。用PBS緩慢沖洗細胞3次，每次3-5min，去除劃下的細胞和雜質。加入含不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L）的無血清培養(yǎng)基，對照組加入等體積的無血清培養(yǎng)基。分別在0h、24h、48h將6孔板置于倒置顯微鏡下，在相同視野下觀察并拍照，記錄劃痕區(qū)域細胞的遷移情況。使用圖像分析軟件（如ImageJ）測量劃痕寬度，計算細胞遷移率：遷移率（%）=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。Transwell實驗：Transwell實驗可用于檢測細胞的遷移和浸潤能力，通過在Transwell小室的上室和下室之間設置一層聚碳酸酯膜，模擬體內細胞外基質，觀察細胞穿越膜的能力。遷移實驗時，在上室中加入含不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L）的B16細胞懸液（200μL，5×10?個細胞/mL），下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（600μL）作為趨化劑。將Transwell小室放入24孔板中，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，注意避免損傷膜上的細胞。將小室放入甲醇中固定15min，使細胞固定在膜上。取出小室，用PBS沖洗3次，每次3-5min，去除甲醇。加入結晶紫染色液（0.1%結晶紫溶于20%甲醇），室溫染色10min，使遷移到下室的細胞染色。用PBS沖洗3次，每次3-5min，去除多余的染色液。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細胞數(shù)，取平均值進行統(tǒng)計分析。浸潤實驗中，預先將Matrigel基質膠（用無血清培養(yǎng)基按1:8稀釋）鋪于Transwell小室的聚碳酸酯膜上，4℃放置過夜使其凝固，形成類似體內細胞外基質的結構。后續(xù)步驟同遷移實驗，培養(yǎng)48h后計數(shù)浸潤到下室的細胞數(shù)。3.2.5細胞凋亡檢測方法Hoechst33258染色：Hoechst33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，與DNA結合后能在熒光顯微鏡下發(fā)出藍色熒光。在細胞凋亡過程中，細胞核會發(fā)生形態(tài)學變化，如染色質濃縮、邊緣化、核碎裂等，這些變化可通過Hoechst33258染色進行觀察。在本實驗中，將B16細胞以每孔1×10?個的密度接種于放有蓋玻片的24孔板中，加入1mL完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h。取出蓋玻片，用PBS緩慢沖洗3次，每次3-5min，去除培養(yǎng)基。將蓋玻片放入4%多聚甲醛中固定15min，使細胞形態(tài)固定。用PBS洗滌3次，每次3-5min，去除多聚甲醛。加入Hoechst33258染色液（10μg/mL，用PBS稀釋），室溫避光染色10min，使染料與細胞核DNA結合。用PBS沖洗3次，每次3-5min，去除多余的染色液。將蓋玻片置于載玻片上，滴加適量的抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，避免產生氣泡。在熒光顯微鏡下，用藍光激發(fā)，觀察并拍照，計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算凋亡率：凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核染色質濃縮、邊緣化，呈亮藍色，而正常細胞的細胞核呈均勻淡藍色。AnnexinV-FITC/PI雙染法：AnnexinV-FITC/PI雙染法是一種常用的檢測細胞凋亡的方法，基于磷脂酰絲氨酸（PS）在細胞凋亡早期從細胞膜內側翻轉到外側，AnnexinV能特異性地與PS結合，而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過正常細胞膜，但可透過凋亡中晚期細胞和壞死細胞的細胞膜使細胞核染紅的原理，可區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。在本實驗中，收集經(jīng)不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6μmol/L）處理24h后的B16細胞，用預冷的PBS洗滌2次，每次3-5min，去除殘留的培養(yǎng)基。4℃、1000rpm離心5min，收集細胞沉淀。加入BindingBuffer重懸細胞，調整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避免產生氣泡，室溫避光孵育15min。加入400μLBindingBuffer，再次輕輕混勻。在1h內用流式細胞儀進行檢測，AnnexinV-FITC為綠色熒光（激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm），PI為紅色熒光（激發(fā)波長535nm，發(fā)射波長為615nm）。在流式細胞儀分析結果中，左下象限為活細胞（AnnexinV-/PI-），右下象限為早期凋亡細胞（AnnexinV+/PI-），右上象限為晚期凋亡細胞和壞死細胞（AnnexinV+/PI+），左上象限為壞死細胞（AnnexinV-/PI+）。計算早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞所占的比例，得到細胞凋亡率。3.2.6蛋白表達檢測方法WesternBlot是一種用于檢測特定蛋白質表達水平的常用技術，其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將蛋白質按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質轉移到固相載體（如PVDF膜）上，再用特異性抗體進行檢測。在本實驗中，收集經(jīng)不同濃度rLj-RGD4（0、4.8、9.6、14.4μmol/L）處理24h后的B16細胞，用預冷的PBS洗滌2次，每次3-5min，去除殘留的培養(yǎng)基。加入含PMSF（1mmol/L）的RIPA裂解液（按細胞數(shù)量每1×10?個細胞加入100-150μL裂解液），冰上裂解30min，期間輕輕搖晃幾次，使細胞充分裂解。4℃、12000rpm離心15min，收集上清，即為細胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。取30μg蛋白與5×SDS上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min，使蛋白質變性。將變性后的蛋白樣品進行12%SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，四、實驗結果與分析4.1rLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用將不同濃度的rLj-RGD4（0、2.4、4.8、9.6、14.4、19.2μmol/L）作用于B16細胞24h后，采用MTT法檢測細胞增殖情況，結果如圖1所示。隨著rLj-RGD4濃度的增加，B16細胞的增殖受到明顯抑制，呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴關系。在低濃度（2.4μmol/L）時，rLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用相對較弱，細胞增殖抑制率約為15.6%；當濃度升高到4.8μmol/L時，抑制率上升至30.2%；而在19.2μmol/L的高濃度下，抑制率高達75.4%。以rLj-RGD4濃度為橫坐標，細胞增殖抑制率為縱坐標，繪制細胞生長曲線（圖2）。通過曲線擬合計算得出，rLj-RGD4對B16細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為9.6μmol/L。這一結果表明，rLj-RGD4能夠有效地抑制B16細胞的增殖，且在IC50濃度下，能夠使半數(shù)的B16細胞失去增殖能力。為了進一步驗證MTT法的結果，采用CCK-8法對rLj-RGD4抑制B16細胞增殖的作用進行檢測。結果顯示，CCK-8法得到的細胞增殖抑制率與MTT法結果趨勢一致（圖3）。在不同濃度rLj-RGD4處理下，B16細胞的增殖抑制率隨著濃度的升高而增加，進一步證實了rLj-RGD4對B16細胞增殖具有顯著的抑制作用。@startumlscale1.5skinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（MTT法）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@endumlscale1.5skinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（MTT法）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@endumlskinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（MTT法）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@endumltitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（MTT法）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@endumlxaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@endumlyaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@endumlautoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@endumlplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@endumlplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"MTT法"withline@enduml@enduml圖1：rLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（MTT法）@startumlscale1.5skinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（細胞生長曲線）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@endumlscale1.5skinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（細胞生長曲線）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@endumlskinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（細胞生長曲線）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@endumltitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（細胞生長曲線）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@endumlxaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@endumlyaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@endumlautoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@endumlplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@endumlplot[0,15.6,30.2,50.1,62.3,75.4]asyValues"細胞生長曲線"withline@enduml@enduml圖2：rLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（細胞生長曲線）@startumlscale1.5skinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（CCK-8法）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@endumlscale1.5skinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（CCK-8法）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@endumlskinparamdefaultTextAlignmentcentertitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（CCK-8法）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@endumltitlerLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（CCK-8法）xaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@endumlxaxis"rLj-RGD4濃度(μmol/L)"yaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@endumlyaxis"細胞增殖抑制率(%)"autoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@endumlautoscaleyplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@endumlplot[0,2.4,4.8,9.6,14.4,19.2]asxValuesplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@endumlplot[0,16.2,31.5,52.3,64.7,78.2]asyValues"CCK-8法"withline@enduml@enduml圖3：rLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用（CCK-8法）rLj-RGD4對B16細胞增殖的抑制作用可能與其阻斷細胞周期進程有關。有研究表明，RGD肽能夠與腫瘤細胞表面的整合素結合，抑制整合素介導的信號轉導通路，從而影響細胞周期相關蛋白的表達，使細胞周期阻滯在G0/G1期或G2/M期，進而抑制細胞增殖。rLj-RGD4含有4個RGD模體，可能通過與B16細胞表面的整合素αvβ3和αvβ5等亞型特異性結合，阻斷整合素與細胞外基質的相互作用，抑制相關信號通路的激活，最終導致B16細胞增殖受到抑制。這一推測需要進一步通過檢測細胞周期相關蛋白的表達以及細胞周期分布情況來驗證。4.2rLj-RGD4對B16細胞遷移和浸潤的影響采用細胞劃痕實驗和Transwell小室實驗，檢測rLj-RGD4對B16細胞遷移和浸潤能力的影響。在細胞劃痕實驗中，分別在0h、24h、48h觀察并拍照，結果如圖4所示。0h時，各組劃痕寬度基本一致。24h后，對照組細胞遷移明顯，劃痕寬度顯著減??；而rLj-RGD4處理組細胞遷移受到抑制，劃痕寬度大于對照組，且隨著rLj-RGD4濃度的增加，抑制作用更為明顯。48h時，對照組劃痕幾乎完全愈合，而9.6μmol/LrLj-RGD4處理組仍有較寬的劃痕。通過圖像分析軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，結果顯示（圖5），rLj-RGD4處理組的細胞遷移率顯著低于對照組，且呈劑量依賴關系。在4.8μmol/LrLj-RGD4處理下，細胞遷移率為35.6%，而在9.6μmol/L時，遷移率降至18.2%。這表明rLj-RGD4能夠有效抑制B16細胞的遷移能力。@startumlscale1.5skinparamdefaultTextAlignmentcentertitle細胞劃痕實驗檢測rLj-RGD4對B1