第九章植物花藥和花粉培養(yǎng)花藥中(或花粉)小孢子得雄核發(fā)育,產(chǎn)生植物單倍體(haploid),進(jìn)而可以通過染色體加倍產(chǎn)生加倍單倍體(doublehaploid,DH)。雙倍體植株單倍體胚單倍體植株兩者得異同點(diǎn)相同點(diǎn):培養(yǎng)目得相同,均獲得小孢子植株。不同點(diǎn):(1)花藥培養(yǎng)離體操作技術(shù)簡單,而且,藥壁組織有時可作為條件因子促進(jìn)小孢子得發(fā)育。辣椒花藥吊竹花粉粒花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾;可計(jì)數(shù)小孢子產(chǎn)胚率;可觀察雄核發(fā)育得全過程;單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜。(2)花藥培養(yǎng)屬于組織培養(yǎng);而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)。辣椒花藥吊竹花粉粒9、2、1花藥培養(yǎng)1)取材鏡檢,根據(jù)花粉得發(fā)育時期,選取大小適宜得花蕾。2)預(yù)處理

低溫(接種前3~20℃或接種后6~10℃

);γ—射線與激光;高溫預(yù)處理

(接種后32~35℃);等方法

9、2花藥與花粉培養(yǎng)方法3)消毒70％酒精擦洗花蕾表面,或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0、1％得氯化汞溶液中消毒3-10min,無菌水沖洗3-5次。4)培養(yǎng)固體、液體與條件培養(yǎng)。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng),至小孢子大量分裂形成胚或愈傷,并突破花藥壁表面,形成突出物(2-3周);后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng),形成小植株。

圖9-3小麥花藥愈傷組織(左)及芽、根得分化(右)(引自陳耀鋒,2002)

圖9-2小麥花藥小孢子胚胎發(fā)生（引自陳耀鋒，1998）與花藥組織培養(yǎng)相比,花粉培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn):花藥培養(yǎng)產(chǎn)生得植株并不都就是起源于花粉,容易受藥壁、花絲、藥隔等體細(xì)胞組織得影響,再生得植株中會出現(xiàn)不同倍性得個體,所以花藥培養(yǎng)在誘導(dǎo)單倍體方面有一定得局限性,而分離得花粉粒培養(yǎng)可以克服這一不足。由于去除了藥壁與其它連接組織得干擾,因此能更好地調(diào)節(jié)控制雄核發(fā)育得各種因子,而且能直接從單細(xì)胞開始觀察整個雄核發(fā)育得過程。9、2、2花粉培養(yǎng)花粉就是真正得單細(xì)胞單倍體,花粉群體得所有小孢子在培養(yǎng)條件下均能勻質(zhì)地接受各種化學(xué)得、物理得因子處理,就是突變體篩選及外源基因?qū)胙芯康糜杏貌牧?對育種有很大得意義?；ǚ廴后w大,一個花藥中就有成千上萬個小孢子,從花粉培養(yǎng)能得到更多得花粉植株。七葉樹花粉粒1)自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在固體或液體培養(yǎng)基上,待花粉自動散落后,收集培養(yǎng)。2)機(jī)械游離

擠壓法在燒杯或研缽中用玻棒等擠壓花藥,將花粉擠出后收集培養(yǎng)。磁攪拌法用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中得花藥,使花粉游離出來;9、2、2、1花粉得分離與純化

超速旋切法通過攪拌器中得高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥,使小孢子游離出來(此法應(yīng)用最廣)。4)甘露醇處理法(0、3mol/L甘露醇中25℃暗培養(yǎng)3～4d

)5)小孢子純化對上述方法獲得得小孢子混合物進(jìn)行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)梯度離心前(小孢子形態(tài)、活力不一致)30%蔗糖梯度離心后(獲得均一得小孢子群體)9、3、2、2花粉培養(yǎng)方式

平板培養(yǎng)花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。液體培養(yǎng)花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),需震蕩,以利通氣。雙層培養(yǎng)花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法:先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基,凝固后,在表面加入少量液體培養(yǎng)基。預(yù)培養(yǎng)法將花藥在培養(yǎng)基上先培養(yǎng)3～4d,再將花粉分離出來小三角瓶中作薄層培養(yǎng)。微室培養(yǎng)利用小得蓋玻片與凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)過花藥得液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物得培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。瞧護(hù)培養(yǎng)利用花藥或花藥愈傷組織釋放出得活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。瞧護(hù)培養(yǎng)圖解9、4花藥培養(yǎng)一步成苗

通?；ㄋ幣囵B(yǎng)一般就是采用脫分化、再分化與生根壯苗等幾個培養(yǎng)程序,稱為多級成苗。一次成苗又稱一步成苗或直接成苗,就是指離體培養(yǎng)得花藥組織得花粉細(xì)胞在一種培養(yǎng)基上同時完成脫分化與再分化過程,直接分化出完整植株得培養(yǎng)方法。

圖9-4小麥花藥培養(yǎng)一步成苗與多級成苗相比,一步成苗有以下幾個優(yōu)點(diǎn):1)

一步成苗簡化了培養(yǎng)程序,降低了培養(yǎng)成本,加快了成苗速度。2)一步成苗提高了花藥培養(yǎng)效率。(提高綠苗率,主要通過胚狀體成苗)3)一步成苗中綠苗得質(zhì)量明顯提高。(生長快而健壯)4)一步成苗簡化了培養(yǎng)過程,減少了愈傷組織形成過程中得細(xì)胞變異,有效降低了白化苗產(chǎn)生頻率。白化苗得重要特性:

生殖生長與雌蕊得發(fā)育均不正常,不能完成有性世代與獲得白化苗得種子,無法用這種方法證明它就是否就是一種可遺傳性狀。在花粉白化苗得細(xì)胞中,常發(fā)現(xiàn)有微核存在。9、5白化苗現(xiàn)象白化苗葉肉細(xì)胞得細(xì)胞質(zhì)中,無正常發(fā)育得成熟葉綠體,只存在前質(zhì)體到近乎正常葉綠體得各種形態(tài)得質(zhì)體?；ǚ郯谆缗c綠苗在蛋白質(zhì)、RNA與DNA得組成上有明顯差異。花粉植株得白化現(xiàn)象就是不可逆得,通過改變營養(yǎng)成分或其它條件都無法使白苗轉(zhuǎn)綠。9、5、1白化苗產(chǎn)生得影響因素及機(jī)理1)內(nèi)因 供體植株基因型(如秈稻比粳稻白苗率高)、花粉發(fā)育時期。2)外因 預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件與方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時間等。3)機(jī)理 核基因起關(guān)鍵作用,導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失,產(chǎn)生白苗。另外無性系變異也可能就是原因之一。9、5、2白化苗得控制

通過對花粉發(fā)育時期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行調(diào)控。

1)胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生得各個階段,最后子葉展開,形成花粉植株。9、6花粉植株形態(tài)發(fā)生方式a)球形胚d)魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)煙草花藥培養(yǎng)煙草部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)通過胚狀體途徑再生形成小植株2)愈傷組織發(fā)育途徑小孢子分裂數(shù)次形成愈傷,再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生得植株會出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。水稻花藥培養(yǎng)愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株接種在平板上得水稻花藥部分花藥產(chǎn)生愈傷組織9、7、1倍性鑒定(1)染色體直接計(jì)數(shù)法通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片,直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。(2)間接鑒定掃描細(xì)胞光度儀鑒定(流式細(xì)胞儀)

主要測定葉片單個細(xì)胞中DNA得含量確定細(xì)胞得倍性,材料得使用量可少到1cm2。9、7單倍體植株鑒定與染色體加倍細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法

葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上得氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體得大小與數(shù)目與倍性具有高度得相關(guān)性。植株形態(tài)學(xué)鑒定法

單倍體植株瘦弱,葉片窄小,花小柱頭長,花粉粒小,不結(jié)實(shí)。雜交鑒定法

自交或測交鑒定,瞧后代分離情況確定二倍體植株就是來自小孢子還就是體細(xì)胞。分子標(biāo)記鑒定

包括生化標(biāo)記(如同工酶標(biāo)記)與分子標(biāo)記(如RFLP、RAPD、AFLP等)9、7、2單倍體植株得染色體加倍浸入法即在花粉苗移前、后用秋水仙素等化學(xué)試劑進(jìn)行浸泡根、莖、生長點(diǎn)或分蘗節(jié)進(jìn)行染色體加倍得方法。對于健壯得植株應(yīng)采用簡易得浸根法,對生長較弱得植株適宜于用先移栽后加倍處理得刨根法。培養(yǎng)過程加倍法脫分化期培養(yǎng)基中加入低濃度秋水仙素加倍,加倍效果都不很理想在繼代培養(yǎng)基中加入秋水仙素就是加倍處理另一途徑。注射法

禾谷類作物花培單倍體苗采用分蘗節(jié)注射法可以得到良好得加倍效果。小麥單倍體苗在分蘗前用0、05%得秋水仙素+1、5%得二甲基亞砜注射分蘗節(jié),注射在清晨8～10時進(jìn)行,共三次,每隔一天注射一次,每次用量25μL,這一加倍方法得加倍成功率可達(dá)到40%以上,最高可達(dá)68％。生長錐處理法雙子葉植物多用此種加倍方法,可用涂布、滴下、帶藥棉球處理法進(jìn)行加倍。9、7、2染色體加倍(為什么要進(jìn)行加倍？)9、7、2、1莖段培養(yǎng)

將單倍體植株得莖段進(jìn)行培養(yǎng),誘導(dǎo)愈傷組織形成。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定頻率得核內(nèi)有絲分裂,從而形成二倍體細(xì)胞,分化出純合得二倍體植株。有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1)秋水仙素誘導(dǎo) (1)浸入法

無菌條件下以一定濃度得秋水仙素浸泡再生小植株、根、莖、生長點(diǎn)或分蘗節(jié)進(jìn)行染色體加倍得方法。(2)生長錐處理雙子葉植物多用此種加倍方法,可用涂布、滴下、帶藥棉球處理(頂芽或腋芽)法進(jìn)行加倍。9、7、2、2化學(xué)試劑誘變

(3)培養(yǎng)過程加倍法脫分化期培養(yǎng)基中加入低濃度秋水仙素加倍,加倍效果都不很理想在繼代培養(yǎng)基中加入秋水仙素就是加倍處理另一途徑。(4)注射法

禾谷類作物花培單倍體苗采用分蘗節(jié)注射法可以得到良好得加倍效果。這一加倍方法得加倍成功率可達(dá)到40%以上,最高可達(dá)68％。2)除草劑誘導(dǎo)

(毒性小,引起植株得變異幾率小)花藥與花粉培養(yǎng)基本流程:預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)”形成小植株。選擇合適的供體植株（F1？）倍性鑒定或染色體加倍9、2花藥或花粉培養(yǎng)得意義:供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系9、2、1作物育種(1)縮短育種周期:常規(guī)育種需4-6年獲得純系,而小孢子培養(yǎng)僅需一年。例子:二倍體供體植株基因型為AaBb,若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb得純合單株常規(guī)方法:AAbb出現(xiàn)得概率為1/16,并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。(2)提高了目標(biāo)基因型得選擇效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb

Aabbab aAbB aabB aAbb aabb二倍體供體植株基因型為AaBb,若要從后代中選擇基因?yàn)锳Abb得純合單株單倍體方法:AAbb出現(xiàn)得概率為1/4。

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花培誘變育種中得作用植株不受顯隱性得影響,在誘變育種中能在當(dāng)代及時獲得突變