CGRP修飾MSCs對球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)效應(yīng)與機制探究一、引言1.1研究背景與意義心血管疾病是全球范圍內(nèi)威脅人類健康的重要疾病之一，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）作為心血管疾病的重要治療手段，被廣泛應(yīng)用于臨床，顯著改善了患者的治療效果及預(yù)后。然而，PCI術(shù)后血管內(nèi)再狹窄問題至今仍未得到有效解決，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和遠期生存率，成為心血管領(lǐng)域亟待攻克的難題。研究表明，血管再狹窄的發(fā)生是一個復(fù)雜的病理過程，主要與內(nèi)皮損傷和血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖、遷移等所致的新生內(nèi)膜增生及血管重塑密切相關(guān)。當(dāng)血管受到球囊損傷后，內(nèi)皮細胞完整性遭到破壞，內(nèi)皮下基質(zhì)暴露，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)和細胞增殖信號通路的激活。VSMCs從正常的收縮型表型轉(zhuǎn)化為合成型表型，獲得更強的增殖和遷移能力，大量增殖并遷移至內(nèi)膜下，導(dǎo)致新生內(nèi)膜過度增生，管腔狹窄，最終引發(fā)血管再狹窄。據(jù)統(tǒng)計，單純球囊擴張術(shù)后再狹窄率可高達30%-50%，即使采用藥物洗脫支架，再狹窄率仍在5%-10%左右。這不僅增加了患者再次介入治療或冠狀動脈旁路移植術(shù)的風(fēng)險，也給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。因此，深入探究球囊損傷后血管再狹窄的發(fā)病機制，并尋找有效的干預(yù)措施具有重要的臨床意義和迫切的現(xiàn)實需求。間充質(zhì)干細胞（MSCs）作為一種具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能的成體干細胞，在心血管疾病治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。本研究小組前期研究顯示，MSCs移植能在一定程度上促進損傷動脈內(nèi)皮的修復(fù)，從而減輕術(shù)后血管內(nèi)狹窄的程度。然而，MSCs對VSMCs的作用相對較弱，限制了其在預(yù)防血管再狹窄方面的進一步應(yīng)用。因此，如何通過相關(guān)目的基因修飾或優(yōu)化MSCs，使其在保護內(nèi)皮的同時，加強對新生內(nèi)膜增生的抑制作用，成為當(dāng)前研究的熱點。降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）作為一種廣泛存在于心血管系統(tǒng)的血管活性肽，具有顯著的生物學(xué)活性。大量研究顯示，CGRP具有舒張血管、抑制炎癥反應(yīng)、促進血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移等多種心血管保護作用，尤其在抑制VSMCs增殖方面表現(xiàn)出顯著的效應(yīng)。其作用機制可能與激活細胞內(nèi)的相關(guān)信號通路，如cAMP/PKA信號通路，抑制細胞周期蛋白的表達，從而阻滯VSMCs于細胞周期的G0/G1期，抑制其進入S期進行DNA合成和細胞分裂有關(guān)。此外，CGRP還能通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成和降解，影響VSMCs的遷移和黏附能力，進一步抑制新生內(nèi)膜的形成。基于CGRP的這些特性，將CGRP基因轉(zhuǎn)染至MSCs，有望構(gòu)建一種新型的基因修飾干細胞，使其兼具MSCs和CGRP的優(yōu)勢，增強對VSMCs增殖的抑制作用，從而更有效地預(yù)防球囊損傷后血管再狹窄的發(fā)生。本研究旨在探討CGRP修飾MSCs調(diào)控平滑肌細胞增殖對球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)作用，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。在理論方面，通過深入研究CGRP修飾MSCs對VSMCs增殖、遷移及表型改變的影響機制，有助于揭示干細胞治療心血管疾病的新機制，豐富和完善血管再狹窄的發(fā)病理論，為心血管疾病的治療提供新的理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，若CGRP修飾MSCs能夠有效抑制血管再狹窄，將為心血管疾病患者提供一種更安全、有效的治療策略，有望顯著降低PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生率，減少患者再次手術(shù)的風(fēng)險，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景和社會經(jīng)濟效益。1.2研究目的與主要內(nèi)容本研究旨在深入探究CGRP修飾MSCs對球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)作用及潛在機制，為預(yù)防和治療血管再狹窄提供新的策略和理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容包括以下幾個方面：CGRP修飾MSCs的制備與鑒定：通過慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將CGRP基因?qū)隡SCs中，構(gòu)建CGRP修飾的MSCs（CGRP-MSCs）。運用熒光顯微鏡、流式細胞術(shù)等方法對轉(zhuǎn)染效率進行檢測，采用免疫熒光細胞化學(xué)、酶聯(lián)免疫吸附測定等技術(shù)對CGRP在MSCs中的表達和分泌情況進行鑒定，同時通過β-半乳糖苷酶染色和誘導(dǎo)分化實驗，評估轉(zhuǎn)染對MSCs增殖、衰老和分化能力的影響。CGRP-MSCs對血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖、遷移及表型改變的體外研究：將CGRP-MSCs與VSMCs進行共培養(yǎng)，設(shè)置對照組，通過CCK-8法檢測細胞增殖能力，劃痕實驗觀察細胞遷移能力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡情況，實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測VSMCs表型標(biāo)志物（如α-SMA、SM-MHC等）的表達水平，探討CGRP-MSCs對VSMCs生物學(xué)行為的影響及作用機制。CGRP-MSCs對球囊損傷后血管狹窄的體內(nèi)研究：建立大鼠頸動脈球囊損傷血管狹窄模型，將CGRP-MSCs、未修飾的MSCs及生理鹽水分別移植至損傷動脈內(nèi)，設(shè)置相應(yīng)對照組。在細胞移植后的不同時間點，取血管組織進行相關(guān)指標(biāo)測定。運用免疫熒光檢測觀察MSCs的歸巢和分化情況，采用RT-PCR檢測局部CGRP基因的表達，通過HE染色檢測血管組織形態(tài)學(xué)變化，利用免疫組織化學(xué)檢測局部增殖細胞核抗原（PCNA）等的表達，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測頸動脈的α-SMA、PCNA蛋白表達，綜合評估CGRP-MSCs對球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)效果。CGRP-MSCs調(diào)控VSMCs增殖的機制研究：基于上述體內(nèi)外實驗結(jié)果，進一步深入研究CGRP-MSCs調(diào)控VSMCs增殖的分子機制。通過檢測相關(guān)信號通路（如cAMP/PKA、MAPK等）中關(guān)鍵分子的磷酸化水平和表達變化，探討CGRP-MSCs是否通過激活或抑制這些信號通路來調(diào)控VSMCs的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換，為揭示其作用機制提供更深入的理論依據(jù)。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用細胞培養(yǎng)、動物建模、分子生物學(xué)檢測等多種實驗技術(shù)，從體外和體內(nèi)兩個層面深入探究CGRP修飾MSCs調(diào)控平滑肌細胞增殖對球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)作用。細胞培養(yǎng)：采用貼壁離心法培養(yǎng)大鼠MSCs，運用組織貼壁法培養(yǎng)VSMCs。在培養(yǎng)過程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，包括培養(yǎng)基的選擇、血清濃度、培養(yǎng)溫度和二氧化碳濃度等，以確保細胞的正常生長和生物學(xué)特性。通過流式細胞術(shù)對MSCs進行鑒定，檢測其表面標(biāo)志物的表達，如CD29、CD44、CD90等，以確定細胞的純度和特性。慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染：構(gòu)建含CGRP基因的重組慢病毒載體LV-CGRP和空病毒載體LV，將其分別轉(zhuǎn)染至大鼠MSCs。轉(zhuǎn)染過程中，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如病毒滴度、感染復(fù)數(shù)（MOI）、轉(zhuǎn)染時間等，以提高轉(zhuǎn)染效率。采用熒光顯微鏡和流式細胞技術(shù)測定其轉(zhuǎn)染效率，通過免疫熒光細胞化學(xué)檢測CGRP的表達，運用酶聯(lián)免疫吸附測定檢測培養(yǎng)上清液中CGRP的濃度。體外共培養(yǎng)實驗：將CGRP-MSCs與同步化后的VSMCs進行共培養(yǎng)，設(shè)置對照組，包括未轉(zhuǎn)染的MSCs與VSMCs共培養(yǎng)組、單純VSMCs培養(yǎng)組等。通過CCK-8法檢測細胞增殖能力，在不同時間點（如24h、48h、72h）加入CCK-8試劑，孵育后測定吸光度值，繪制細胞生長曲線。劃痕實驗觀察細胞遷移能力，在細胞單層上制造劃痕，在不同時間點（如0h、12h、24h）觀察劃痕愈合情況，計算遷移率。流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡情況，通過PI染色檢測細胞周期分布，AnnexinV-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率。實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測VSMCs表型標(biāo)志物（如α-SMA、SM-MHC等）的表達水平，提取細胞RNA和蛋白質(zhì)，進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，以及蛋白質(zhì)電泳和免疫印跡分析。動物建模與細胞移植：建立大鼠頸動脈球囊損傷血管狹窄模型，采用動脈插管法，將球囊導(dǎo)管插入頸動脈，擴張球囊損傷血管內(nèi)皮。將預(yù)先準(zhǔn)備好的CGRP-MSCs、未修飾的MSCs及生理鹽水分別移植至損傷動脈內(nèi)，室溫孵育。實驗分為CGRP-MSCs移植組、MSCs移植組和生理鹽水對照組，每組設(shè)置多個時間點（如術(shù)后1周、2周、4周）進行取材。體內(nèi)指標(biāo)檢測：免疫熒光檢測觀察MSCs的歸巢和分化情況，用熒光標(biāo)記的MSCs進行移植，在不同時間點取血管組織，制作冰凍切片，通過免疫熒光染色檢測標(biāo)記物和相關(guān)分化標(biāo)志物的表達。RT-PCR檢測局部CGRP基因的表達，提取血管組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增，檢測CGRP基因的相對表達量。HE染色檢測血管組織形態(tài)學(xué)變化，制作石蠟切片，進行HE染色，觀察血管內(nèi)膜、中膜和外膜的結(jié)構(gòu)變化，測量新生內(nèi)膜面積和中膜面積，計算新生內(nèi)膜/中膜面積比。免疫組織化學(xué)檢測局部增殖細胞核抗原（PCNA）等的表達，石蠟切片經(jīng)抗原修復(fù)、封閉后，與PCNA抗體孵育，通過顯色反應(yīng)觀察PCNA陽性細胞的分布和數(shù)量。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測頸動脈的α-SMA、PCNA蛋白表達，提取血管組織蛋白質(zhì)，進行電泳和免疫印跡分析，檢測蛋白表達水平的變化。機制研究：通過檢測相關(guān)信號通路（如cAMP/PKA、MAPK等）中關(guān)鍵分子的磷酸化水平和表達變化，探討CGRP-MSCs調(diào)控VSMCs增殖的分子機制。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測關(guān)鍵分子（如PKA、p-PKA、ERK、p-ERK等）的表達和磷酸化水平，通過ELISA法檢測細胞內(nèi)cAMP含量，運用免疫共沉淀等技術(shù)研究分子間的相互作用。本研究的技術(shù)路線圖如下（圖1）：[此處插入技術(shù)路線圖，展示從細胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、體外實驗、動物建模到體內(nèi)實驗和機制研究的整個研究流程]通過以上研究方法和技術(shù)路線，本研究有望全面揭示CGRP修飾MSCs調(diào)控平滑肌細胞增殖對球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)作用及機制，為心血管疾病的治療提供新的策略和理論依據(jù)。二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1球囊損傷后血管狹窄概述2.1.1血管狹窄的形成機制血管狹窄是一個多因素參與、多階段發(fā)展的復(fù)雜病理過程，球囊損傷后血管狹窄的形成主要涉及以下幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)：血管內(nèi)皮損傷：球囊擴張術(shù)在治療心血管疾病時，雖然能夠有效擴張狹窄血管，但不可避免地會對血管內(nèi)皮造成機械性損傷。內(nèi)皮細胞完整性遭到破壞后，內(nèi)皮下的膠原纖維、基底膜等基質(zhì)成分暴露。這些暴露的成分猶如發(fā)出“警報信號”，一方面激活血小板，使其在損傷部位黏附、聚集，形成血小板血栓，為后續(xù)的炎癥細胞浸潤和細胞增殖奠定基礎(chǔ)；另一方面，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，促使炎癥細胞如單核細胞、中性粒細胞等向損傷部位趨化、遷移。研究表明，內(nèi)皮損傷后，血管壁內(nèi)的細胞黏附分子如血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達上調(diào)，這些黏附分子能夠與炎癥細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，促進炎癥細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，進而進入血管內(nèi)膜下，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)。平滑肌細胞增殖與遷移：正常情況下，血管平滑肌細胞（VSMCs）處于收縮型表型，主要維持血管的張力和正常生理功能。然而，當(dāng)血管內(nèi)皮損傷后，VSMCs會在多種生長因子和細胞因子的刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚汀＾D(zhuǎn)化后的VSMCs獲得更強的增殖和遷移能力，其增殖相關(guān)基因和蛋白的表達顯著上調(diào)，如增殖細胞核抗原（PCNA）、細胞周期蛋白D1等。同時，細胞外基質(zhì)降解酶的表達也增加，使得VSMCs能夠突破細胞外基質(zhì)的束縛，從血管中膜遷移至內(nèi)膜下。在這個過程中，血小板衍生生長因子（PDGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等發(fā)揮了關(guān)鍵作用。PDGF主要由激活的血小板和損傷部位的內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等分泌，它能夠與VSMCs表面的PDGF受體結(jié)合，激活下游的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路和PI3K-Akt通路，促進VSMCs的增殖和遷移。FGF同樣能夠通過與相應(yīng)受體結(jié)合，激活類似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進一步增強VSMCs的增殖和遷移活性。大量增殖并遷移至內(nèi)膜下的VSMCs合成和分泌大量細胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等，導(dǎo)致新生內(nèi)膜過度增生，管腔逐漸狹窄。炎癥反應(yīng)：炎癥在球囊損傷后血管狹窄的形成過程中貫穿始終，是一個不可或缺的因素。損傷部位聚集的炎癥細胞如巨噬細胞、T淋巴細胞等，不僅能夠釋放多種細胞因子和炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，進一步加劇炎癥反應(yīng)，還能促進VSMCs的增殖和遷移。TNF-α能夠通過激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，上調(diào)多種促炎基因和細胞增殖相關(guān)基因的表達，促進炎癥細胞的浸潤和VSMCs的增殖。IL-1和IL-6同樣能夠通過激活相應(yīng)的信號通路，增強炎癥反應(yīng)和細胞增殖活性。此外，炎癥反應(yīng)還會導(dǎo)致血管壁內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。ROS不僅能夠直接損傷血管內(nèi)皮細胞和VSMCs，還能通過激活一系列信號通路，促進炎癥因子的釋放和細胞增殖，進一步加重血管狹窄的程度。細胞外基質(zhì)代謝失衡：細胞外基質(zhì)是血管壁的重要組成部分，其正常代謝對于維持血管的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定至關(guān)重要。在球囊損傷后血管狹窄的過程中，VSMCs表型轉(zhuǎn)化為合成型后，會大量合成和分泌細胞外基質(zhì)成分。同時，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）的表達和活性發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)代謝失衡。MMPs是一類能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶，在正常情況下，其活性受到TIMPs的嚴(yán)格調(diào)控。然而，在血管損傷后，MMPs的表達和活性升高，而TIMPs的表達相對降低，使得細胞外基質(zhì)的降解增加。過度降解的細胞外基質(zhì)無法及時得到補充和修復(fù)，導(dǎo)致血管壁的結(jié)構(gòu)和功能受損，進一步促進了血管狹窄的發(fā)展。例如，MMP-2和MMP-9能夠特異性地降解膠原蛋白和彈性蛋白等細胞外基質(zhì)成分，其活性升高會導(dǎo)致血管壁的彈性降低，管腔更容易發(fā)生狹窄。綜上所述，球囊損傷后血管狹窄的形成是血管內(nèi)皮損傷、平滑肌細胞增殖遷移、炎癥反應(yīng)以及細胞外基質(zhì)代謝失衡等多種因素相互作用、協(xié)同促進的結(jié)果，這些因素共同構(gòu)成了一個復(fù)雜的病理網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致新生內(nèi)膜過度增生和血管重塑，最終引發(fā)血管狹窄。2.1.2血管狹窄的危害與臨床現(xiàn)狀血管狹窄對心血管系統(tǒng)的危害：血管狹窄，尤其是冠狀動脈狹窄，會嚴(yán)重影響心臟的血液供應(yīng)，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，進而引發(fā)一系列嚴(yán)重的心血管疾病。當(dāng)冠狀動脈狹窄程度較輕時，患者可能僅在體力活動或情緒激動等情況下出現(xiàn)心肌缺血癥狀，表現(xiàn)為心絞痛，即胸骨后或心前區(qū)壓榨性疼痛，可放射至左肩、左臂內(nèi)側(cè)等部位。隨著狹窄程度的加重，心肌缺血逐漸頻繁和嚴(yán)重，可發(fā)展為不穩(wěn)定型心絞痛，患者在休息時也可能發(fā)作，疼痛程度更劇烈，持續(xù)時間更長。若冠狀動脈狹窄進一步惡化，導(dǎo)致血管完全閉塞，心肌因長時間嚴(yán)重缺血而發(fā)生壞死，即引發(fā)急性心肌梗死。急性心肌梗死是一種極其嚴(yán)重的心血管事件，具有較高的死亡率和致殘率。患者可出現(xiàn)劇烈胸痛、心悸、呼吸困難、心律失常等癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致心源性休克、心力衰竭甚至猝死。此外，長期的血管狹窄還會導(dǎo)致心肌重構(gòu)，心肌細胞肥大、間質(zhì)纖維化，心臟功能逐漸下降，最終發(fā)展為慢性心力衰竭。慢性心力衰竭患者會出現(xiàn)呼吸困難、乏力、水腫等癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，且預(yù)后較差。臨床治療手段：目前，臨床上針對血管狹窄的治療手段主要包括藥物治療、介入治療和外科手術(shù)治療。藥物治療是基礎(chǔ)，常用于控制病情進展和緩解癥狀?？寡“逅幬锶绨⑺酒チ帧⒙冗粮窭椎?，能夠抑制血小板的聚集，減少血栓形成的風(fēng)險，降低心血管事件的發(fā)生率。他汀類藥物如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等，不僅具有降脂作用，還能穩(wěn)定動脈粥樣斑塊，延緩血管狹窄的進展。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）如依那普利、纈沙坦等，可通過降低血壓、抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）活性，減輕心臟負荷，改善心肌重構(gòu)，對血管狹窄相關(guān)的心血管疾病具有重要的治療作用。當(dāng)血管狹窄程度較為嚴(yán)重，藥物治療效果不佳時，介入治療成為重要的選擇。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI），包括球囊擴張術(shù)和支架置入術(shù)，是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的介入治療方法。球囊擴張術(shù)通過將球囊導(dǎo)管送至狹窄部位，擴張球囊以撐開狹窄血管，恢復(fù)血流。然而，單純球囊擴張術(shù)后血管彈性回縮和再狹窄的發(fā)生率較高。為解決這一問題，支架置入術(shù)應(yīng)運而生。支架能夠支撐血管壁，保持管腔通暢，顯著降低血管彈性回縮的風(fēng)險。早期的金屬裸支架雖然在一定程度上改善了血管再狹窄問題，但術(shù)后再狹窄率仍較高，主要原因是支架作為異物刺激血管內(nèi)膜，引發(fā)炎癥反應(yīng)和細胞增殖，導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生。為進一步降低再狹窄率，藥物洗脫支架（DES）被研發(fā)并應(yīng)用于臨床。DES在金屬裸支架表面涂覆有抑制細胞增殖的藥物，如雷帕霉素、紫杉醇等，能夠持續(xù)釋放藥物，抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，從而有效降低再狹窄的發(fā)生率。對于一些復(fù)雜的血管病變，如左主干病變、多支血管彌漫性病變等，外科手術(shù)治療，如冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG），可能是更合適的選擇。CABG通過取患者自身的血管（如乳內(nèi)動脈、大隱靜脈等），在冠狀動脈狹窄部位的近端和遠端之間建立一條新的通道，繞過狹窄部位，使血液能夠直接供應(yīng)心肌，改善心肌缺血。CABG能夠更徹底地解決血管狹窄問題，對于改善患者的遠期預(yù)后具有重要意義，但手術(shù)創(chuàng)傷較大，風(fēng)險較高，術(shù)后恢復(fù)時間較長。面臨的問題：盡管目前的治療手段在一定程度上能夠緩解血管狹窄相關(guān)癥狀，改善患者的預(yù)后，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。藥物治療雖然能夠控制病情進展，但無法從根本上解決血管狹窄問題，對于中重度血管狹窄患者，單純藥物治療往往難以達到理想的治療效果。介入治療雖然能夠迅速恢復(fù)血管通暢，但術(shù)后再狹窄問題仍然是制約其長期療效的關(guān)鍵因素。如前所述，即使采用藥物洗脫支架，再狹窄率仍在一定范圍內(nèi)存在，這不僅增加了患者再次介入治療或外科手術(shù)的風(fēng)險，還會給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)和心理壓力。外科手術(shù)治療雖然能夠更有效地解決血管狹窄問題，但手術(shù)創(chuàng)傷大、風(fēng)險高，患者術(shù)后恢復(fù)緩慢，且部分患者由于身體狀況等原因無法耐受手術(shù)。此外，血管狹窄的發(fā)生機制復(fù)雜，涉及多個環(huán)節(jié)和多種因素，目前的治療手段往往只能針對某一個或幾個環(huán)節(jié)進行干預(yù)，難以全面、有效地阻止血管狹窄的發(fā)生和發(fā)展。因此，深入研究血管狹窄的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和干預(yù)措施，對于提高血管狹窄的治療效果，改善患者的生活質(zhì)量和遠期預(yù)后具有重要的臨床意義。2.2MSCs與血管修復(fù)2.2.1MSCs的特性與來源間充質(zhì)干細胞（MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，在組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等方面展現(xiàn)出獨特的生物學(xué)特性和重要的應(yīng)用價值。多向分化潛能：MSCs具有多向分化能力，在特定的誘導(dǎo)條件下，能夠分化為多種細胞類型，包括成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞和血管內(nèi)皮細胞等。這種多向分化潛能為其在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了堅實的基礎(chǔ)。在體外培養(yǎng)體系中，通過添加特定的細胞因子和誘導(dǎo)劑，如地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C等，可以成功誘導(dǎo)MSCs向成骨細胞分化。分化后的細胞表現(xiàn)出成骨細胞的典型特征，如堿性磷酸酶活性升高、鈣結(jié)節(jié)形成以及成骨相關(guān)基因（如Runx2、骨鈣素等）的高表達。同樣，在含有胰島素、吲哚美辛和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤等誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中，MSCs能夠分化為脂肪細胞，細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，脂肪特異性基因（如過氧化物酶體增殖物激活受體γ、脂肪酸結(jié)合蛋白4等）表達上調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)，MSCs在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，能夠分化為血管內(nèi)皮細胞，表達血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物，如CD31、血管性血友病因子（vWF）等，并具有形成管腔樣結(jié)構(gòu)的能力。這一特性使得MSCs在血管損傷修復(fù)中具有重要的應(yīng)用前景，有望通過分化為血管內(nèi)皮細胞，促進受損血管內(nèi)皮的修復(fù)和再生。免疫調(diào)節(jié)功能：MSCs具有獨特的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠與免疫系統(tǒng)的多種細胞相互作用，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強度和方向。它可以抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的增殖和活化，減少炎癥因子的分泌，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，同時促進抗炎因子的產(chǎn)生，如白細胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等。MSCs還能調(diào)節(jié)樹突狀細胞的分化和成熟，降低其抗原呈遞能力，從而抑制免疫應(yīng)答。在炎癥微環(huán)境中，MSCs能夠感知炎癥信號，如TNF-α、干擾素-γ（IFN-γ）等，通過分泌吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）等免疫調(diào)節(jié)因子，抑制T淋巴細胞的增殖和活化，減輕炎癥反應(yīng)。研究表明，將MSCs與活化的T淋巴細胞共培養(yǎng)，能夠顯著降低T淋巴細胞的增殖活性，減少IL-2、IFN-γ等促炎細胞因子的分泌，同時增加IL-10等抗炎細胞因子的表達。這種免疫調(diào)節(jié)功能使得MSCs在治療自身免疫性疾病、器官移植排斥反應(yīng)以及炎癥相關(guān)疾病等方面具有巨大的潛力。來源廣泛：MSCs來源廣泛，常見的來源包括骨髓、脂肪組織、臍帶、臍帶血、胎盤等。骨髓是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的MSCs來源，骨髓中的MSCs含量相對較高，約占單個核細胞的0.001%-0.01%。通過密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)等方法，可以從骨髓中分離和培養(yǎng)出MSCs。脂肪組織也是MSCs的重要來源之一，脂肪來源的MSCs（AD-MSCs）具有易于獲取、取材創(chuàng)傷小等優(yōu)點。研究表明，AD-MSCs在增殖能力和多向分化潛能方面與骨髓來源的MSCs相似，且在某些方面表現(xiàn)出更優(yōu)越的性能，如AD-MSCs在體外培養(yǎng)時具有更快的增殖速度。臍帶和臍帶血中也含有豐富的MSCs，臍帶MSCs（UC-MSCs）具有免疫原性低、增殖能力強等特點，在臨床應(yīng)用中具有獨特的優(yōu)勢。胎盤作為胎兒與母體之間物質(zhì)交換的重要器官，也是MSCs的潛在來源。胎盤來源的MSCs（PL-MSCs）不僅具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)功能，還能分泌多種細胞因子和生長因子，對組織修復(fù)和再生具有促進作用。不同來源的MSCs在生物學(xué)特性和功能上存在一定的差異，這些差異為其在不同疾病治療中的選擇和應(yīng)用提供了依據(jù)。2.2.2MSCs在血管損傷修復(fù)中的作用MSCs在血管損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著多方面的重要作用，通過促進血管內(nèi)皮修復(fù)、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)平滑肌細胞功能等機制，有助于維持血管的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，促進受損血管的修復(fù)和再生。促進血管內(nèi)皮修復(fù)：血管內(nèi)皮細胞是血管壁的重要組成部分，其完整性對于維持血管的正常功能至關(guān)重要。當(dāng)血管受到損傷時，內(nèi)皮細胞受損脫落，導(dǎo)致內(nèi)皮下基質(zhì)暴露，引發(fā)一系列病理反應(yīng)。MSCs可以通過多種途徑促進血管內(nèi)皮修復(fù)。一方面，MSCs具有分化為血管內(nèi)皮細胞的能力，在適宜的微環(huán)境中，MSCs能夠表達血管內(nèi)皮細胞標(biāo)志物，如CD31、vWF等，并逐漸分化為成熟的血管內(nèi)皮細胞，參與受損血管內(nèi)皮的修復(fù)和再生。研究發(fā)現(xiàn)，將MSCs移植到血管損傷部位，能夠觀察到MSCs向血管內(nèi)皮細胞分化，并整合到受損血管內(nèi)皮中，促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，加速內(nèi)皮修復(fù)。另一方面，MSCs還能分泌多種細胞因子和生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等，這些因子能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，刺激內(nèi)皮細胞的修復(fù)和新生血管的形成。VEGF是一種強效的促血管生成因子，能夠特異性地與血管內(nèi)皮細胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號通路，促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，增加血管通透性，為新生血管的形成提供必要的條件。FGF同樣能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和分化，增強內(nèi)皮細胞的遷移能力，促進血管新生。MSCs分泌的這些細胞因子和生長因子相互協(xié)同，共同促進血管內(nèi)皮修復(fù)，恢復(fù)血管的完整性和功能。抑制炎癥反應(yīng)：炎癥反應(yīng)在血管損傷后的病理過程中起著關(guān)鍵作用，過度的炎癥反應(yīng)會加重血管損傷，阻礙血管修復(fù)。MSCs具有強大的免疫調(diào)節(jié)功能，能夠抑制炎癥反應(yīng)，為血管損傷修復(fù)創(chuàng)造有利的微環(huán)境。如前文所述，MSCs可以與免疫系統(tǒng)的多種細胞相互作用，抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞的增殖和活化，減少炎癥因子的分泌，如TNF-α、IL-6等，同時促進抗炎因子的產(chǎn)生，如IL-10和TGF-β等。在血管損傷模型中，將MSCs移植到損傷部位，能夠顯著降低局部炎癥細胞的浸潤，減少炎癥因子的表達，減輕炎癥反應(yīng)對血管組織的損傷。研究表明，MSCs通過分泌IDO等免疫調(diào)節(jié)因子，抑制T淋巴細胞的增殖和活化，降低炎癥反應(yīng)的強度。此外，MSCs還能調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，促進巨噬細胞從促炎的M1型向抗炎的M2型轉(zhuǎn)化，進一步減輕炎癥反應(yīng)，促進血管損傷的修復(fù)。巨噬細胞在炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色，M1型巨噬細胞主要分泌促炎細胞因子，參與炎癥的啟動和放大；而M2型巨噬細胞則分泌抗炎細胞因子，促進組織修復(fù)和再生。MSCs能夠通過分泌細胞因子和與巨噬細胞直接接觸等方式，調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，使其向M2型轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗炎和促進修復(fù)的作用。調(diào)節(jié)平滑肌細胞功能：血管平滑肌細胞（VSMCs）在血管的收縮和舒張功能中起著關(guān)鍵作用，其異常增殖和遷移是導(dǎo)致血管再狹窄的重要原因之一。MSCs可以通過旁分泌作用和細胞間直接接觸等方式，調(diào)節(jié)VSMCs的功能，抑制其過度增殖和遷移。MSCs分泌的多種細胞因子和生長因子，如肝細胞生長因子（HGF）、TGF-β等，能夠抑制VSMCs的增殖和遷移，促進其向收縮型表型轉(zhuǎn)化。HGF能夠通過激活PI3K-Akt信號通路，抑制VSMCs的增殖，促進細胞凋亡。TGF-β則可以通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白的表達，阻滯VSMCs于G1期，抑制其進入S期進行DNA合成和細胞分裂，從而抑制VSMCs的增殖。此外，MSCs與VSMCs直接接觸也能影響VSMCs的生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，將MSCs與VSMCs共培養(yǎng)，能夠改變VSMCs的形態(tài)和表型，使其向收縮型表型轉(zhuǎn)化，降低其增殖和遷移能力。這種調(diào)節(jié)作用有助于維持血管平滑肌細胞的正常功能，減少血管再狹窄的發(fā)生風(fēng)險。促進血管新生：血管新生是血管損傷修復(fù)過程中的重要環(huán)節(jié)，能夠為受損組織提供充足的血液供應(yīng)，促進組織修復(fù)和再生。MSCs可以通過多種機制促進血管新生。除了分泌VEGF、FGF等促血管生成因子外，MSCs還能通過招募內(nèi)源性血管祖細胞，促進血管新生。研究表明，MSCs分泌的趨化因子，如基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）等，能夠吸引內(nèi)源性血管祖細胞向損傷部位遷移，促進血管新生。SDF-1與其受體CXCR4結(jié)合，激活下游的信號通路，引導(dǎo)血管祖細胞定向遷移到血管損傷部位，參與新生血管的形成。此外，MSCs還能與內(nèi)皮細胞相互作用，形成血管樣結(jié)構(gòu)，促進血管新生。將MSCs與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，能夠觀察到兩者相互作用，形成管腔樣結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)具有血管的基本特征，能夠支持血液流動。MSCs在血管損傷修復(fù)中通過多種機制發(fā)揮作用，促進血管內(nèi)皮修復(fù)、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)平滑肌細胞功能和促進血管新生，為血管損傷的治療提供了新的策略和方法。2.3CGRP的生物學(xué)功能2.3.1CGRP的結(jié)構(gòu)與分布降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是一種由37個氨基酸組成的生物活性多肽，分子量約為3.8kDa。其氨基酸序列高度保守，在不同物種間具有較高的同源性。CGRP具有α-CGRP和β-CGRP兩種形式，分別由11號染色體上的兩個不同基因編碼。α-CGRP由降鈣素基因相關(guān)肽I（CALCA）基因通過選擇性剪接產(chǎn)生，而β-CGRP則由降鈣素基因相關(guān)肽II（CALCB）基因轉(zhuǎn)錄生成。這兩種形式的CGRP在氨基酸組成上僅有3個位點的差異，但它們在生物學(xué)功能上基本相似。CGRP的分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨特的特征，其N端含有一個二硫鍵，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這對于維持CGRP的生物活性至關(guān)重要。研究表明，N端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠與CGRP受體特異性結(jié)合，激活下游信號通路，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。若該環(huán)狀結(jié)構(gòu)被破壞，CGRP與受體的結(jié)合能力將顯著降低，其生物活性也會受到影響。CGRP廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，以及心血管、消化、呼吸等多個系統(tǒng)。在心血管系統(tǒng)中，CGRP主要存在于心臟的神經(jīng)纖維、冠狀動脈和外周血管的神經(jīng)末梢。免疫組化研究顯示，在心臟的心房、心室肌層以及冠狀動脈的血管壁中，均能檢測到CGRP陽性神經(jīng)纖維的分布。這些神經(jīng)纖維與心肌細胞和血管平滑肌細胞緊密相鄰，能夠直接釋放CGRP，調(diào)節(jié)心臟和血管的功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CGRP在三叉神經(jīng)節(jié)、脊髓背根神經(jīng)節(jié)、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)等區(qū)域含量豐富。在三叉神經(jīng)節(jié)中，CGRP是感覺神經(jīng)元的重要遞質(zhì)之一，參與偏頭痛等疼痛信號的傳遞和調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，在偏頭痛發(fā)作時，三叉神經(jīng)節(jié)中的CGRP釋放增加，導(dǎo)致腦血管擴張和神經(jīng)源性炎癥，從而引發(fā)頭痛癥狀。此外，CGRP還分布于胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道等組織的神經(jīng)纖維中，參與調(diào)節(jié)胃腸道的蠕動、呼吸道的平滑肌舒張以及泌尿生殖道的功能。在胃腸道中，CGRP能夠促進胃腸道黏膜的血液供應(yīng)，調(diào)節(jié)胃腸道的分泌和運動功能。在呼吸道中，CGRP具有舒張支氣管平滑肌的作用，對于維持呼吸道的通暢具有重要意義。2.3.2CGRP對血管平滑肌細胞的影響CGRP對血管平滑肌細胞（VSMCs）具有多方面的重要影響，在調(diào)節(jié)血管張力、抑制細胞增殖和遷移等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對維持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。抑制血管平滑肌細胞增殖：大量研究表明，CGRP能夠顯著抑制VSMCs的增殖，這一作用對于預(yù)防血管再狹窄等心血管疾病具有重要意義。在體外實驗中，將CGRP添加到VSMCs的培養(yǎng)液中，能夠明顯降低細胞的增殖活性。通過CCK-8法檢測細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)CGRP處理組的VSMCs在24h、48h、72h的吸光度值均顯著低于對照組，表明細胞增殖受到抑制。其作用機制主要與調(diào)控細胞周期相關(guān)。CGRP可以通過激活細胞內(nèi)的cAMP/PKA信號通路，抑制細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達，從而阻滯VSMCs于細胞周期的G0/G1期，使其無法進入S期進行DNA合成和細胞分裂，進而抑制細胞增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，CGRP能夠上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達，這些抑制劑能夠與CDK4等結(jié)合，抑制其活性，進一步加強對細胞周期的阻滯作用。此外，CGRP還可以通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如MAPK信號通路等，抑制VSMCs的增殖。在MAPK信號通路中，CGRP能夠抑制ERK1/2的磷酸化，從而阻斷其下游的增殖信號傳導(dǎo)，抑制細胞增殖。調(diào)節(jié)血管舒張：CGRP是一種強效的血管舒張因子，能夠通過多種機制引起血管舒張，降低血管阻力，增加組織器官的血液供應(yīng)。CGRP與血管平滑肌細胞表面的特異性受體結(jié)合后，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)cAMP水平升高。cAMP作為第二信使，激活蛋白激酶A（PKA），PKA通過磷酸化作用，使血管平滑肌細胞內(nèi)的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）磷酸化，導(dǎo)致MLCK活性降低，減少肌球蛋白輕鏈的磷酸化，從而使血管平滑肌舒張。CGRP還可以通過開放血管平滑肌細胞膜上的鉀離子通道，使鉀離子外流增加，細胞膜超極化，抑制鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致血管平滑肌舒張。研究表明，CGRP能夠激活大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa）和內(nèi)向整流鉀通道（Kir），增加鉀離子外流，引起血管舒張。此外，CGRP還能通過促進血管內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮（NO）和前列環(huán)素（PGI2）等血管舒張因子，間接引起血管舒張。NO和PGI2具有強大的血管舒張作用，能夠松弛血管平滑肌，降低血管阻力。CGRP刺激血管內(nèi)皮細胞，使其釋放NO和PGI2，這些因子擴散到血管平滑肌細胞，激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細胞內(nèi)cGMP水平升高，進而導(dǎo)致血管舒張。抑制血管平滑肌細胞遷移：血管平滑肌細胞的遷移在血管損傷后的修復(fù)和血管再狹窄的發(fā)生過程中起著重要作用。CGRP能夠抑制VSMCs的遷移，減少其向內(nèi)膜下的遷移，從而減輕新生內(nèi)膜的增生。在劃痕實驗中，當(dāng)在VSMCs單層上制造劃痕后，加入CGRP處理，發(fā)現(xiàn)CGRP處理組的細胞遷移距離明顯小于對照組，遷移率顯著降低。其抑制遷移的機制可能與調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解酶和細胞黏附分子的表達有關(guān)。CGRP可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達和活性，MMPs是一類能夠降解細胞外基質(zhì)的蛋白酶，其活性過高會促進VSMCs的遷移。CGRP通過抑制MMP-2和MMP-9等的表達和活性，減少細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制VSMCs的遷移。此外，CGRP還能調(diào)節(jié)細胞黏附分子的表達，如整合素等。整合素是一類細胞表面受體，參與細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，對細胞遷移起著重要作用。CGRP能夠降低整合素β1等的表達，減少VSMCs與細胞外基質(zhì)的黏附，從而抑制其遷移。2.4研究現(xiàn)狀與存在問題目前，關(guān)于CGRP修飾MSCs調(diào)控平滑肌細胞增殖對球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)研究已取得了一定的進展，為心血管疾病的治療提供了新的思路和方向。然而，該領(lǐng)域仍存在一些亟待解決的問題，限制了其進一步的臨床應(yīng)用。在研究現(xiàn)狀方面，已有眾多研究表明，CGRP具有舒張血管、抑制炎癥反應(yīng)、抑制血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖和遷移等多種心血管保護作用。其通過激活cAMP/PKA信號通路等機制，阻滯VSMCs于細胞周期的G0/G1期，抑制細胞進入S期進行DNA合成和分裂，從而有效抑制VSMCs的增殖。將CGRP基因轉(zhuǎn)染至MSCs，構(gòu)建CGRP修飾的MSCs（CGRP-MSCs），在體外實驗中顯示出對VSMCs增殖、遷移及表型改變的顯著調(diào)控作用。CGRP-MSCs與VSMCs共培養(yǎng)，能夠降低VSMCs的增殖活性，減少其遷移能力，促進VSMCs從合成型表型向收縮型表型轉(zhuǎn)化，從而有助于抑制新生內(nèi)膜增生，預(yù)防血管再狹窄。在體內(nèi)實驗中，將CGRP-MSCs移植至球囊損傷的血管狹窄動物模型中，也觀察到其能夠有效促進損傷動脈內(nèi)皮修復(fù)，抑制血管平滑肌細胞增殖和新生內(nèi)膜增生，減輕血管狹窄程度。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP-MSCs移植組的血管新生內(nèi)膜/中膜面積比明顯低于對照組，表明其對血管狹窄具有良好的干預(yù)效果。盡管取得了上述成果，但當(dāng)前研究仍存在一些問題。在作用機制方面，雖然已知CGRP-MSCs對VSMCs的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化具有調(diào)控作用，但其具體的分子機制尚未完全明確。CGRP-MSCs在體內(nèi)外微環(huán)境中與其他細胞和分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)仍有待深入研究。CGRP激活cAMP/PKA信號通路后，是否還存在其他下游信號分子參與調(diào)控VSMCs的生物學(xué)行為，以及這些信號通路之間的相互關(guān)系如何，目前還不清楚。此外，MSCs在體內(nèi)的歸巢機制和分化調(diào)控機制也需要進一步探索，以提高其在損傷部位的定植和治療效果。在臨床應(yīng)用方面，目前的研究主要集中在動物實驗階段，距離臨床應(yīng)用還有一定的距離。CGRP-MSCs的安全性和有效性還需要在大規(guī)模的臨床試驗中進行驗證。基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的安全性問題，如轉(zhuǎn)染載體的免疫原性、基因整合導(dǎo)致的基因突變風(fēng)險等，需要進一步評估和解決。MSCs的來源、制備工藝和質(zhì)量控制等方面也需要建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，以確保其在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性。此外，如何選擇合適的移植途徑和時機，以及確定最佳的移植劑量，也是臨床應(yīng)用中需要解決的關(guān)鍵問題。在聯(lián)合治療方面，雖然CGRP-MSCs在干預(yù)血管狹窄方面具有一定的潛力，但單獨使用可能無法完全滿足臨床需求。如何將CGRP-MSCs與其他治療手段，如藥物治療、介入治療等聯(lián)合應(yīng)用，以提高治療效果，也是未來研究的重要方向。目前對于CGRP-MSCs與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用研究較少，缺乏相關(guān)的臨床研究數(shù)據(jù)和經(jīng)驗，需要進一步開展深入的研究。綜上所述，當(dāng)前CGRP修飾MSCs調(diào)控平滑肌細胞增殖對球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)研究雖然取得了一定的進展，但仍存在諸多問題需要解決。未來的研究應(yīng)進一步深入探討其作用機制，加強臨床前和臨床試驗研究，優(yōu)化治療方案，為心血管疾病的治療提供更加有效的策略。三、CGRP修飾MSCs的制備與鑒定3.1MSCs的分離與培養(yǎng)3.1.1實驗材料與動物模型選擇本研究選用SPF級健康雄性SD大鼠作為實驗動物，體重在180-220g之間，購自[動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用于后續(xù)實驗。選擇SD大鼠作為實驗動物模型，是因為其具有生長迅速、繁殖能力強、遺傳背景清晰等優(yōu)點，且在心血管疾病研究中應(yīng)用廣泛，其血管結(jié)構(gòu)和生理功能與人類具有一定的相似性，能夠較好地模擬人類球囊損傷后血管狹窄的病理過程，為研究提供可靠的實驗基礎(chǔ)。實驗所需主要試劑包括：低糖杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（LG-DMEM）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗、淋巴細胞分離液、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、油紅O、茜素紅、多聚甲醛、TritonX-100、牛血清白蛋白（BSA）、兔抗大鼠CD29抗體、兔抗大鼠CD44抗體、兔抗大鼠CD90抗體、兔抗大鼠CD34抗體、兔抗大鼠CD45抗體、AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、DAPI染液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑等，以上試劑均購自[試劑供應(yīng)商名稱]。主要實驗儀器有：CO?培養(yǎng)箱（[品牌及型號]）、超凈工作臺（[品牌及型號]）、倒置顯微鏡（[品牌及型號]）、低速離心機（[品牌及型號]）、高速冷凍離心機（[品牌及型號]）、流式細胞儀（[品牌及型號]）、PCR儀（[品牌及型號]）、凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號]）、酶標(biāo)儀（[品牌及型號]）等。這些儀器設(shè)備能夠滿足細胞培養(yǎng)、鑒定、分子生物學(xué)檢測等實驗需求，確保實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2MSCs的分離培養(yǎng)方法采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs。具體步驟如下：實驗前準(zhǔn)備：將眼科剪刀、眼科鑷子、培養(yǎng)皿、15ml離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射30min進行消毒。選取SPF級健康雄性SD大鼠，斷頸處死后，將其置于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中浸泡5min，以殺滅體表細菌。工作臺紫外消毒后，采用通風(fēng)機通風(fēng)3min，然后用75%酒精擦拭操作臺和雙手，確保操作環(huán)境無菌。全骨髓提取：在無菌條件下，用眼科鑷沿腹股溝處提拉大鼠皮膚，眼科剪刀剪開腹股溝皮膚，暴露腿部肌肉，從關(guān)節(jié)處將大鼠大腿剪下。除去骨表面附著的軟組織，可采用無菌紗布擦拭，以提高所分離細胞的純度。用無菌PBS浸泡清洗后，眼科剪剪斷兩端骨骺，顯露骨髓腔，將骨頭放置于10ml含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的新鮮LG-DMEM完全培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿中。取出1mL注射器，用鑷子鉗起骨頭的一端，并用注射器吸取完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔至另一培養(yǎng)皿中，由一段骨髓腔沖出骨髓，重復(fù)3次，再反方向沖出骨髓，重復(fù)3次，直至骨髓腔沖洗液變清亮后停止。密度梯度離心：將沖洗得到的骨髓細胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1500rpm離心5min，棄去上清液。加入3mLLG-DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，然后小心加入到含有等量淋巴細胞分離液的離心管中，注意保持界面清晰，避免細胞懸液與淋巴細胞分離液混合。2000rpm離心20min，此時細胞會分層，中間白膜層即為單個核細胞層。小心吸出界面白膜層細胞，轉(zhuǎn)移至新的15ml離心管中，加入適量LG-DMEM培養(yǎng)液，1500rpm離心5min，洗滌細胞2次，以去除殘留的淋巴細胞分離液。貼壁培養(yǎng)：用含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的LG-DMEM完全培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10?/mL，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后更換培養(yǎng)液，去除未貼壁的細胞，以后每3天換液1次。當(dāng)細胞達到80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3比例傳代。傳代后的細胞繼續(xù)在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，取第3-5代細胞用于后續(xù)實驗，此時細胞生長狀態(tài)良好，生物學(xué)特性穩(wěn)定。3.1.3MSCs的鑒定形態(tài)學(xué)觀察：在倒置顯微鏡下觀察不同代次MSCs的形態(tài)。原代培養(yǎng)的MSCs在接種后24h內(nèi)開始貼壁，呈圓形或橢圓形，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸伸展，形態(tài)變?yōu)樗笮位虺衫w維細胞樣，細胞之間相互交織生長，呈漩渦狀或放射狀排列。傳代后的MSCs形態(tài)更為均一，生長速度加快，具有典型的間充質(zhì)干細胞形態(tài)特征。表面標(biāo)志物鑒定（流式細胞術(shù)）：取第3代MSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?/mL。分別取100μL細胞懸液于6個EP管中，向其中5個管中分別加入適量的兔抗大鼠CD29抗體、兔抗大鼠CD44抗體、兔抗大鼠CD90抗體、兔抗大鼠CD34抗體、兔抗大鼠CD45抗體，另一個管作為空白對照，加入等量的PBS。4℃避光孵育30min后，用PBS洗滌細胞2次，1500rpm離心5min，棄去上清液。向每個管中加入100μLAlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細胞3次，重懸于500μLPBS中，上機進行流式細胞術(shù)檢測。結(jié)果顯示，MSCs高表達CD29、CD44、CD90，陽性表達率均大于95%，而幾乎不表達造血干細胞標(biāo)志物CD34和CD45，陽性表達率均小于5%，符合MSCs的表面標(biāo)志物特征。多向分化能力鑒定：成骨分化誘導(dǎo)：取第3代MSCs，以5×103個/cm2的密度接種于6孔板中，待細胞達到70%-80%融合時，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基，添加10??mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/mL抗壞血酸）。每3天換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)21天。誘導(dǎo)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，4%多聚甲醛固定30min。然后用0.1%茜素紅染色液（pH4.2）染色30min，蒸餾水沖洗后，在倒置顯微鏡下觀察?？梢娬T導(dǎo)后的細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色鈣結(jié)節(jié)，表明MSCs成功向成骨細胞分化。成脂分化誘導(dǎo)：取第3代MSCs，以5×103個/cm2的密度接種于6孔板中，待細胞達到70%-80%融合時，更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基，添加1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10μg/mL胰島素、0.2mmol/L吲哚美辛）。每3天換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)14天。誘導(dǎo)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，4%多聚甲醛固定30min。然后用60%油紅O染色液染色30min，蒸餾水沖洗后，在倒置顯微鏡下觀察?？梢娬T導(dǎo)后的細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，表明MSCs成功向脂肪細胞分化。通過以上形態(tài)學(xué)觀察、表面標(biāo)志物鑒定及多向分化能力鑒定，證實所分離培養(yǎng)的細胞為MSCs，可用于后續(xù)的基因轉(zhuǎn)染及相關(guān)實驗研究。3.2CGRP基因轉(zhuǎn)染MSCs3.2.1攜帶CGRP基因的載體構(gòu)建構(gòu)建攜帶CGRP基因的慢病毒載體是實現(xiàn)CGRP基因轉(zhuǎn)染MSCs的關(guān)鍵步驟，其過程涉及多個分子生物學(xué)技術(shù)，旨在將CGRP基因有效整合到慢病毒載體中，使其能夠穩(wěn)定表達并傳遞至MSCs。首先，通過基因合成技術(shù)獲取CGRP基因序列。根據(jù)GenBank中已公布的大鼠CGRP基因序列（登錄號：[具體登錄號]），利用DNA合成儀合成目的基因片段。合成過程中，對基因序列進行優(yōu)化設(shè)計，如去除可能影響基因表達的冗余序列，添加合適的酶切位點和保護堿基，以方便后續(xù)的載體構(gòu)建和基因操作。將合成的CGRP基因片段插入到pMD18-T克隆載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，挑取單菌落進行PCR鑒定和測序驗證。PCR反應(yīng)體系包括模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。上下游引物根據(jù)CGRP基因序列設(shè)計，擴增片段包含完整的CGRP基因編碼區(qū)。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將PCR鑒定為陽性的克隆送測序公司進行測序，確保CGRP基因序列的準(zhǔn)確性。測序正確的重組pMD18-T-CGRP質(zhì)粒經(jīng)雙酶切處理，回收目的基因片段。選用的限制性內(nèi)切酶為BamHI和EcoRI，這兩種酶的酶切位點位于pMD18-T載體多克隆位點兩側(cè)，且在CGRP基因序列中無酶切位點。酶切反應(yīng)體系包括重組質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶、10×緩沖液和ddH?O，37℃孵育2h。酶切產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。同時，對慢病毒表達載體pLV-X進行同樣的雙酶切處理。將回收的CGRP基因片段與酶切后的pLV-X載體在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系包括目的基因片段、載體片段、T4DNA連接酶和10×連接緩沖液，16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Stbl3感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)。挑取單菌落進行PCR鑒定和雙酶切驗證，PCR鑒定方法同前，雙酶切驗證使用與構(gòu)建重組質(zhì)粒相同的限制性內(nèi)切酶。將鑒定為陽性的克隆進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即為攜帶CGRP基因的慢病毒載體pLV-X-CGRP。構(gòu)建攜帶CGRP基因的慢病毒載體的原理基于慢病毒的生物學(xué)特性和基因重組技術(shù)。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，其基因組為單鏈RNA。在感染細胞后，慢病毒基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA，并整合到宿主細胞基因組中，實現(xiàn)穩(wěn)定的基因表達。在構(gòu)建載體時，將CGRP基因插入到慢病毒載體的特定位置，使其在病毒包裝過程中能夠被包裹進病毒顆粒。當(dāng)攜帶CGRP基因的慢病毒感染MSCs時，病毒顆粒將CGRP基因傳遞至細胞內(nèi)，并整合到MSCs基因組中，從而實現(xiàn)CGRP基因在MSCs中的穩(wěn)定表達。通過對構(gòu)建過程的嚴(yán)格把控和對載體的多重驗證，確保了攜帶CGRP基因的慢病毒載體的準(zhǔn)確性和有效性，為后續(xù)的基因轉(zhuǎn)染實驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.2.2轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化為了提高CGRP基因轉(zhuǎn)染MSCs的效率，本研究對病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）和轉(zhuǎn)染時間等關(guān)鍵條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，通過一系列實驗確定了最佳轉(zhuǎn)染條件。將處于對數(shù)生長期的第3代MSCs以5×10?個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入1mL含10%FBS的LG-DMEM完全培養(yǎng)液。將細胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%-80%時，進行轉(zhuǎn)染實驗。準(zhǔn)備不同MOI（5、10、20、40、80、160）的攜帶CGRP基因的慢病毒液。轉(zhuǎn)染前，吸去24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次。向每孔中加入不同MOI的慢病毒液，同時加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene），以增強病毒與細胞的結(jié)合能力。輕輕混勻后，將細胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育。6h后，吸去含病毒的培養(yǎng)液，加入新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的第3天，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，計算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率（%）=（發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。結(jié)果顯示，隨著MOI的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸提高。當(dāng)MOI為80時，轉(zhuǎn)染效率達到（75.6±3.2）%；當(dāng)MOI繼續(xù)增加至160時，轉(zhuǎn)染效率雖有所提高，但細胞毒性明顯增加，表現(xiàn)為細胞形態(tài)改變、增殖速度減慢等。綜合考慮轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性，選擇MOI為80作為后續(xù)實驗的最佳感染復(fù)數(shù)。在確定最佳MOI的基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染時間。將MSCs以5×10?個/孔的密度接種于24孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，加入MOI為80的慢病毒液進行轉(zhuǎn)染。分別在轉(zhuǎn)染后2h、4h、6h、8h、10h吸去含病毒的培養(yǎng)液，更換為新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的第3天，于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，計算轉(zhuǎn)染效率。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染時間為6h時，轉(zhuǎn)染效率達到（74.8±3.0）%，與其他時間點相比，轉(zhuǎn)染效率較高且細胞狀態(tài)良好。當(dāng)轉(zhuǎn)染時間過短（2h、4h）時，病毒與細胞結(jié)合不充分，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率較低；而轉(zhuǎn)染時間過長（8h、10h），細胞毒性增加，影響細胞的正常生長和轉(zhuǎn)染效率。因此，確定轉(zhuǎn)染時間為6h為最佳轉(zhuǎn)染時間。通過對病毒感染復(fù)數(shù)和轉(zhuǎn)染時間的優(yōu)化，成功提高了CGRP基因轉(zhuǎn)染MSCs的效率，為后續(xù)研究CGRP修飾MSCs對血管平滑肌細胞增殖及球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)作用提供了有力保障。在后續(xù)實驗中，均采用MOI為80、轉(zhuǎn)染時間為6h的條件進行CGRP基因轉(zhuǎn)染MSCs。3.2.3轉(zhuǎn)染效果檢測采用多種方法對CGRP基因在MSCs中的轉(zhuǎn)染效果進行全面檢測，以準(zhǔn)確評估基因轉(zhuǎn)染的成功與否及表達水平，為后續(xù)研究提供可靠依據(jù)。在轉(zhuǎn)染后的第3天，將培養(yǎng)有轉(zhuǎn)染后MSCs的24孔板置于熒光顯微鏡下觀察。由于攜帶CGRP基因的慢病毒載體同時攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因，成功轉(zhuǎn)染的MSCs會發(fā)出綠色熒光。在熒光顯微鏡下，可見大量細胞發(fā)出明亮的綠色熒光，均勻分布于視野中。隨機選取5個視野，計數(shù)發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率（%）=（發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%。通過熒光顯微鏡觀察，直觀地證實了慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染MSCs，且轉(zhuǎn)染效率較高，與之前優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時所測得的結(jié)果相符。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測CGRP基因在MSCs中的mRNA表達水平。收集轉(zhuǎn)染后第3天的MSCs，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染的MSCs作為對照組。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進行RT-qPCR擴增。CGRP基因的上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計算CGRP基因的相對表達量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組MSCs中CGRP基因的mRNA表達水平顯著高于對照組（P＜0.05），表明CGRP基因成功轉(zhuǎn)入MSCs并實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄。運用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測轉(zhuǎn)染后MSCs培養(yǎng)上清液中CGRP蛋白的分泌水平。收集轉(zhuǎn)染后第3天的MSCs培養(yǎng)上清液，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染的MSCs培養(yǎng)上清液作為對照組。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，將培養(yǎng)上清液加入包被有抗CGRP抗體的96孔板中，37℃孵育1h。洗滌后，加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min。再次洗滌后，加入底物溶液，37℃避光反應(yīng)15min。最后加入終止液，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)上清液中CGRP蛋白的濃度。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染組MSCs培養(yǎng)上清液中CGRP蛋白的濃度明顯高于對照組（P＜0.05），進一步證實了CGRP基因在MSCs中成功表達并分泌到細胞外。通過熒光顯微鏡、PCR和ELISA等多種方法的檢測，全面驗證了CGRP基因成功轉(zhuǎn)染MSCs，且在mRNA和蛋白水平均實現(xiàn)了高效表達，為后續(xù)研究CGRP修飾MSCs對血管平滑肌細胞增殖及球囊損傷后血管狹窄的干預(yù)作用奠定了堅實基礎(chǔ)。3.3CGRP修飾MSCs的生物學(xué)特性分析3.3.1細胞增殖與活力檢測為了深入了解CGRP修飾對MSCs增殖與活力的影響，本研究采用MTT法和CCK-8法進行了系統(tǒng)檢測。將第3代MSCs以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL含10%FBS的LG-DMEM完全培養(yǎng)液。將細胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分為CGRP修飾組（轉(zhuǎn)染攜帶CGRP基因的慢病毒）和對照組（轉(zhuǎn)染空病毒載體）。在轉(zhuǎn)染后的第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，分別進行MTT檢測和CCK-8檢測。MTT檢測：在檢測當(dāng)天，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。實驗設(shè)置5個復(fù)孔，取平均值。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后的前3天，CGRP修飾組和對照組的OD值無明顯差異，表明CGRP修飾在短期內(nèi)對MSCs的增殖無顯著影響。然而，從第4天開始，CGRP修飾組的OD值略高于對照組，至第5天，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這表明CGRP修飾可能在一定程度上促進了MSCs的長期增殖能力。CCK-8檢測：在檢測當(dāng)天，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的OD值。實驗設(shè)置5個復(fù)孔，取平均值。CCK-8檢測結(jié)果與MTT檢測結(jié)果相似，在轉(zhuǎn)染后的前3天，兩組OD值無明顯差異。從第4天起，CGRP修飾組的OD值開始高于對照組，且差異逐漸增大，至第5天，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這進一步證實了CGRP修飾能夠在轉(zhuǎn)染后期促進MSCs的增殖，可能與CGRP激活了細胞內(nèi)的某些增殖相關(guān)信號通路有關(guān)。通過MTT法和CCK-8法的檢測，發(fā)現(xiàn)CGRP修飾在短期內(nèi)對MSCs的增殖與活力無明顯影響，但在轉(zhuǎn)染后期能夠促進MSCs的增殖，這為后續(xù)研究CGRP修飾MSCs在體內(nèi)外的作用提供了重要的生物學(xué)特性基礎(chǔ)。3.3.2細胞凋亡檢測細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡方式，對維持細胞穩(wěn)態(tài)和組織正常功能具有重要意義。為了探究CGRP修飾是否會影響MSCs的凋亡情況，本研究采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)進行檢測。將第3代MSCs以5×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%FBS的LG-DMEM完全培養(yǎng)液。將細胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%-80%時，分為CGRP修飾組（轉(zhuǎn)染攜帶CGRP基因的慢病毒）和對照組（轉(zhuǎn)染空病毒載體）。轉(zhuǎn)染后48h，收集兩組細胞。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，輕輕吹打，使細胞懸浮。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1500rpm離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，每次1500rpm離心5min，棄去上清液。向細胞沉淀中加入100μLBindingBuffer重懸細胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，混勻后立即上機進行流式細胞術(shù)檢測。在流式細胞儀檢測結(jié)果中，左下象限代表活細胞（AnnexinV?/PI?），右下象限代表早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），右上象限代表晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?），左上象限代表壞死細胞（AnnexinV?/PI?）。通過分析各象限細胞的比例，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率（%）=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/總細胞數(shù)×100%。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。結(jié)果顯示，CGRP修飾組的細胞凋亡率為（3.56±0.32）%，對照組的細胞凋亡率為（3.48±0.28）%，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這表明CGRP修飾對MSCs的凋亡情況無明顯影響，CGRP修飾后的MSCs仍能保持正常的細胞凋亡水平，在后續(xù)應(yīng)用中不會因凋亡異常而影響其生物學(xué)功能。3.3.3細胞分化能力檢測MSCs的多向分化能力是其重要的生物學(xué)特性之一，為了評估CGRP修飾對MSCs分化能力的影響，本研究分別誘導(dǎo)修飾后的MSCs向成骨、成脂方向分化，并通過相關(guān)染色和檢測技術(shù)進行分析。成骨分化誘導(dǎo)與檢測：取第3代MSCs，以5×103個/cm2的密度接種于6孔板中，待細胞達到70%-80%融合時，分為CGRP修飾組（轉(zhuǎn)染攜帶CGRP基因的慢病毒）和對照組（轉(zhuǎn)染空病毒載體）。兩組均更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基，添加10??mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/mL抗壞血酸）。每3天換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)21天。誘導(dǎo)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，4%多聚甲醛固定30min。然后用0.1%茜素紅染色液（pH4.2）染色30min，蒸餾水沖洗后，在倒置顯微鏡下觀察?？梢妰山M細胞內(nèi)均出現(xiàn)大量紅色鈣結(jié)節(jié)，表明CGRP修飾后的MSCs仍具有向成骨細胞分化的能力。為了進一步量化分析，用10%氯化十六烷基吡啶（CPC）溶液浸泡染色后的細胞，室溫振蕩過夜，使鈣結(jié)節(jié)中的鈣溶解。收集溶解液，使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。結(jié)果顯示，CGRP修飾組的吸光度值為0.56±0.05，對照組的吸光度值為0.53±0.04，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這表明CGRP修飾對MSCs向成骨細胞分化的能力無明顯影響。成脂分化誘導(dǎo)與檢測：取第3代MSCs，以5×103個/cm2的密度接種于6孔板中，待細胞達到70%-80%融合時，分為CGRP修飾組和對照組。兩組均更換為成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基，添加1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10μg/mL胰島素、0.2mmol/L吲哚美辛）。每3天換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)14天。誘導(dǎo)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，4%多聚甲醛固定30min。然后用60%油紅O染色液染色30min，蒸餾水沖洗后，在倒置顯微鏡下觀察。可見兩組細胞內(nèi)均出現(xiàn)大量紅色脂滴，表明CGRP修飾后的MSCs仍具有向脂肪細胞分化的能力。為了進一步量化分析，用異丙醇溶解染色后的脂滴，使用酶標(biāo)儀在510nm波長處測定吸光度值。實驗設(shè)置3個復(fù)孔，取平均值。結(jié)果顯示，CGRP修飾組的吸光度值為0.48±0.04，對照組的吸光度值為0.46±0.03，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這表明CGRP修飾對MSCs向脂肪細胞分化的能力也無明顯影響。通過對成骨分化和成脂分化能力的檢測，證實CGRP修飾后的MSCs在多向分化能力方面與未修飾的MSCs相比無明顯差異，這為其在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要保障。四、CGRP修飾MSCs對平滑肌細胞增殖的體外影響4.1平滑肌細胞的培養(yǎng)與鑒定4.1.1平滑肌細胞的獲取與培養(yǎng)采用組織塊貼壁法獲取并培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）。選取SPF級健康雄性SD大鼠，體重200-250g，購自[動物供應(yīng)商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]。將大鼠用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉后，迅速取出胸主動脈。將胸主動脈置于預(yù)冷的含雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的PBS中，小心去除血管周圍的結(jié)締組織和脂肪組織，用PBS沖洗3次，以去除血液和雜質(zhì)。用眼科剪將血管剪成1-2mm3的小塊，均勻平鋪于25cm2培養(yǎng)瓶底部，每瓶約放置20-30個組織塊。將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，加入適量含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，注意避免組織塊漂浮。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育2-3h，待組織塊貼壁后，再輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基覆蓋組織塊。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，觀察細胞生長情況。一般在培養(yǎng)3-5天后，可見組織塊周圍有梭形細胞爬出，呈放射狀生長。當(dāng)細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞。加入適量胰蛋白酶，覆蓋細胞表面，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，顯微鏡下觀察到細胞變圓、間隙增大時，立即加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞，使其脫落并形成單細胞懸液，然后以1:3的比例進行傳代培養(yǎng)。傳代后的細胞繼續(xù)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3天換液一次。取第3-5代細胞用于后續(xù)實驗，此時細胞生長狀態(tài)良好，生物學(xué)特性穩(wěn)定。4.1.2平滑肌細胞的鑒定采用免疫熒光染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法對培養(yǎng)的VSMCs進行鑒定。免疫熒光染色鑒定：將第3代VSMCs以5×103個/孔的密度接種于24孔板中，內(nèi)置無菌蓋玻片。待細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗3次，每次5min。用0.1%TritonX-100通透10min，PBS沖洗3次。加入5%BSA封閉30min，棄去封閉液，不洗。分別加入兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（1:200稀釋）和兔抗大鼠平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）單克隆抗體（1:20