ICS13.020.01

CCSZ06

!7,



DB32/T4677—2024

周叢生物綜合調(diào)查與分析

測試技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofpracticeforsurvey，analysisanddetermination

ofperiphyton

2024-02-05發(fā)布2024-03-05實(shí)施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

中國標(biāo)準(zhǔn)出版社出版

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目次

前言……………………………Ⅲ

1范圍…………………………1

2規(guī)范性引用文件……………1

3術(shù)語和定義…………………1

4采樣點(diǎn)位布設(shè)………………2

4.1布點(diǎn)原則………………2

4.2布點(diǎn)前期準(zhǔn)備…………………………2

4.3布點(diǎn)要求………………3

5樣品采集與保存……………4

5.1材料和器具……………4

5.2樣品采集………………4

5.3樣品的處理與儲存……………………5

6物理指標(biāo)分析測試…………………………5

6.1覆蓋度測定……………5

6.2厚度測定………………6

6.3二維形態(tài)表征…………………………7

6.4三維結(jié)構(gòu)表征…………………………7

7化學(xué)指標(biāo)分析測試…………………………8

7.1總有機(jī)碳、總無機(jī)碳和總碳含量………………………8

7.2總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量…………………9

7.3磷含量…………………9

7.4鉀含量…………………10

7.5鈉含量…………………10

7.6鈣、鎂含量……………11

7.7硫含量…………………11

7.8鐵含量…………………11

7.9錳含量…………………12

7.10銅含量………………12

7.11鋅含量………………13

7.12鉬含量………………13

7.13硅含量………………13

7.14氯含量………………14

Ⅰ

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7.15硼含量………………14

8生物指標(biāo)分析測試…………………………15

8.1微生物組成和多樣性…………………15

8.2磷脂脂肪酸群落結(jié)構(gòu)…………………15

8.3胞外聚合物……………17

8.4生物量…………………18

8.5葉綠素含量……………18

附錄A（資料性）周叢生物采樣點(diǎn)位信息記錄表…………19

附錄B（資料性）周叢生物原位采樣器……………………20

附錄C（資料性）周叢生物野外采樣記錄…………………21

Ⅱ

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由全國土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會提出并歸口。

本文件起草單位：中國科學(xué)院南京土壤研究所、中國環(huán)境科學(xué)研究院、中國科學(xué)院水生生物研究所、

河海大學(xué)、南京林業(yè)大學(xué)、中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本文件主要起草人：吳永紅、孫朋飛、徐瀅、周蕾、劉俊琢、陸海鷹、李丹、王思楚、陳志浩、王凱、

周晴晴、陶靜、李庭芳、劉凌佳、韓燕云、吳麗蓉、金澤凡、相棣、李志福、羅華溢、劉蘇賢、孫宇婷、盧少勇、

吳辰熙、李九玉、夏永秋、佘冬立、沈健林、張松賀、馮彥房。

Ⅲ

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周叢生物綜合調(diào)查與分析

測試技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了周叢生物調(diào)查點(diǎn)位布設(shè)、樣品采集與保存以及物理、化學(xué)和生物指標(biāo)分析測試的要求。

本文件適用于稻田、溝渠、河流、水庫、湖泊等濕地或淺水水體中周叢生物采樣點(diǎn)的布設(shè)、采集、保存

以及物理、化學(xué)和生物性質(zhì)的定量表征或測試分析。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T30988多酚類植物基因組DNA提取純化及測試方法

GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程

GB/T33834微束分析掃描電子顯微術(shù)生物試樣掃描電子顯微鏡分析方法

GB/T35871糧油檢驗(yàn)谷物及其制品中鈣、鉀、鎂、鈉、鐵、磷、鋅、銅、錳、硼、鋇、鉬、鈷、鉻、鋰、鍶、

鎳、硫、釩、硒、銣含量的測定電感耦合等離子體發(fā)射光譜法

DZ/T0279.27區(qū)域地球化學(xué)樣品分析方法第27部分：有機(jī)碳量測定重鉻酸鉀容量法

HJ634土壤氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的測定氯化鉀溶液提取?分光光度法

HJ897水質(zhì)葉綠素a的測定分光光度法

HJ/T345水質(zhì)鐵的測定鄰菲啰啉分光光度法

JY/T0586激光掃描共聚焦顯微鏡分析方法通則

LY/T1246森林土壤交換性鉀和鈉的測定

LY/T1250森林土壤碳酸鈣的測定

LY/T1270森林植物與森林枯枝落葉層全硅、鐵、鋁、鈣、鎂、鉀、鈉、磷、硫、錳、銅、鋅的測定

NY/T88土壤全磷測定法

NY/T149土壤有效硼測定方法

NY/T1378土壤氯離子含量的測定

NY/T2017植物中氮、磷、鉀的測定

NY/T3030棉花中水溶性總糖含量的測定蒽酮比色法

SN/T3926出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測定考馬斯亮藍(lán)法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

周叢生物periphyton

淹水環(huán)境下附著生長于固體基質(zhì)表面的藻類、細(xì)菌、原生動物和后生動物等微生物及其代謝產(chǎn)物和

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有機(jī)碎屑交織在一起形成的聚合體。

3.2

周叢生物覆蓋度periphytoncoverage

單位面積內(nèi)附著生長在基質(zhì)表面的周叢生物面積占總面積之比。

注：一般用百分?jǐn)?shù)表示。

3.3

周叢生物粗糙度periphytonroughness

周叢生物表面孔隙和空隙占整個體積的比例。

3.4

周叢生物多樣性biodiversityofperiphyton

周叢生物內(nèi)顯著不同的種群之間以及同一種群內(nèi)的遺傳變異，涉及周叢生物中多種多樣活的有機(jī)體

（藻類、細(xì)菌、原生動物和后生動物）的種類、數(shù)量及其在周叢生物中的分布信息。

3.5

周叢生物胞外聚合物extracellularpolymericsubstances（EPS)ofperiphyton

在一定環(huán)境條件下由周叢生物內(nèi)細(xì)菌、微藻等微生物分泌于細(xì)胞外的主要由多糖、蛋白質(zhì)和核酸等

組成的大分子聚合物。

3.6

周叢生物生物量biomassofperiphyton

某一時(shí)間段內(nèi)單位面積或單位體積內(nèi)周叢生物實(shí)存生活的有機(jī)物質(zhì)（干重）總量。

注：通常用g/cm2或g/cm3表示。

4采樣點(diǎn)位布設(shè)

4.1布點(diǎn)原則

4.1.1科學(xué)性原則

采樣點(diǎn)位應(yīng)具有典型性和代表性，能充分滿足調(diào)查評估工作的目標(biāo)要求，能真實(shí)反映水域生態(tài)系統(tǒng)

中周叢生物真實(shí)分布情況。

4.1.2系統(tǒng)性原則

布設(shè)點(diǎn)位宜涵蓋調(diào)查區(qū)域范圍內(nèi)周叢生物可能分布的類型，采樣點(diǎn)數(shù)量宜滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

4.1.3重點(diǎn)性原則

宜把調(diào)查區(qū)域內(nèi)水域生態(tài)系統(tǒng)及稻田作為調(diào)查重點(diǎn)區(qū)域。周叢生物生物量、性質(zhì)、水動力和生境差

異較大時(shí)，宜提高點(diǎn)位布設(shè)密度。

4.1.4持續(xù)性原則

布設(shè)點(diǎn)位確定后宜長期保持固定。

4.2布點(diǎn)前期準(zhǔn)備

4.2.1背景調(diào)查

了解調(diào)查區(qū)域稻田、溝渠、池塘、河流和水庫等水系分布信息及土壤、地形、灌溉、施肥、水文、氣候等

2

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背景信息，采樣點(diǎn)位信息表詳見附錄A。

4.2.2人員組織

組織具有相關(guān)專業(yè)背景的人員，明確任務(wù)分工，對人員做好觀測方法和野外操作規(guī)范的工作培訓(xùn)。

加強(qiáng)野外調(diào)查安全培訓(xùn)工作，提高相關(guān)人員安全意識。

4.3布點(diǎn)要求

4.3.1農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)布點(diǎn)

4.3.1.1稻田布點(diǎn)

對于同一調(diào)查區(qū)域的稻田點(diǎn)位布設(shè)，應(yīng)包含集約農(nóng)業(yè)區(qū)、傳統(tǒng)自耕區(qū)、重要水體上下游及附近的稻

田，每類稻田至少布設(shè)3個采樣點(diǎn)。若調(diào)查區(qū)域的稻田不存在差異化分布，布設(shè)點(diǎn)位的稻田應(yīng)涵蓋調(diào)查

區(qū)域的流域范圍，東南西北主要方位均有設(shè)點(diǎn)。盡量選擇具有一定規(guī)模的連片稻田，避免將點(diǎn)位布設(shè)在

6667m（210畝）以下孤立的小塊稻田。稻田面積小于66667m（2100畝）的設(shè)3~5個點(diǎn)位，66667m2~

666667m（2100畝~1000畝）的設(shè)4~6個點(diǎn)位，666667m（21000畝）以上的設(shè)6~10個點(diǎn)位。稻田點(diǎn)位

避免距離田壟較近的受人為擾動頻繁的區(qū)域，盡量靠近稻田中心位置等相對穩(wěn)定的地段。對于多個點(diǎn)位

同時(shí)布設(shè)在同一稻田的情況，主要依據(jù)均勻隨機(jī)布點(diǎn)的原則，根據(jù)周叢生物生長情況等進(jìn)行實(shí)地調(diào)整，點(diǎn)

位相互間距離應(yīng)大于5m。

4.3.1.2溝渠布點(diǎn)

溝渠點(diǎn)位應(yīng)與稻田點(diǎn)位相對應(yīng)，在每條溝渠中段布設(shè)1~2個點(diǎn)位，或布設(shè)不超過對應(yīng)稻田樣點(diǎn)數(shù)的

點(diǎn)位。

4.3.2淺水生態(tài)系統(tǒng)布點(diǎn)

4.3.2.1河流布點(diǎn)

在河流上、中、下游，干、支流，以及干支流匯合點(diǎn)處均應(yīng)設(shè)置點(diǎn)位。同一干/支流上任意兩個相鄰點(diǎn)

位間的地理距離應(yīng)大于5km，若河流較短，則采樣點(diǎn)位應(yīng)至少設(shè)置3個，覆蓋河流的上、中、下游，宜包括

不同生境（如淺灘、深潭、激流區(qū)、湍流區(qū)、緩流區(qū)、回水區(qū)、過渡區(qū)等）。

4.3.2.2池塘布點(diǎn)

將點(diǎn)位布設(shè)在池塘的水陸交錯帶附近，水域面積小于6667m（210畝）設(shè)1~2個點(diǎn)位，6667m2~

20000m（210畝~30畝）設(shè)2~3個點(diǎn)位，大于20000m（230畝）設(shè)3~6個點(diǎn)位。點(diǎn)位可圍繞池塘均勻布

設(shè)，但應(yīng)覆蓋進(jìn)水區(qū)、出水區(qū)和池塘灣區(qū)。

4.3.2.3水庫布點(diǎn)

將點(diǎn)位布設(shè)在水庫的水陸交錯帶附近，水域面積小于10km2設(shè)3~5個點(diǎn)位，10km2~50km2設(shè)4~6

個點(diǎn)位，大于50km2設(shè)5~8個點(diǎn)位，超過100km2設(shè)10~20個點(diǎn)位。點(diǎn)位可圍繞水庫均勻布設(shè)，但應(yīng)覆

蓋進(jìn)水區(qū)、出水區(qū)和水庫中段。

4.3.2.4湖泊布點(diǎn)

根據(jù)湖泊水體形態(tài)特點(diǎn)、水文狀況和周叢生物的分布特征以及水體受干擾狀況等因素，將湖泊區(qū)域

劃分成相對均質(zhì)的敞水區(qū)、湖濱帶，污染區(qū)或相對清潔區(qū)等，每個小區(qū)內(nèi)設(shè)置1~3個有代表性的點(diǎn)位，主

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要分布在湖濱帶。對于均質(zhì)化程度較高的湖泊，可按照水庫布點(diǎn)方法均勻設(shè)置點(diǎn)位。

4.3.2.5濕地布點(diǎn)

對于非均一地面的濕地，每類設(shè)置1~3個點(diǎn)位。對于均一地面的濕地，點(diǎn)位布設(shè)應(yīng)在區(qū)域內(nèi)進(jìn)行簡

單隨機(jī)抽樣代替整體分布，面積小于1km2設(shè)3~5個點(diǎn)位，面積1km2~10km2設(shè)5~8個點(diǎn)位，面積大于

10km2可按照水庫布點(diǎn)方法均勻設(shè)置點(diǎn)位。

5樣品采集與保存

5.1材料和器具

5.1.1主要材料

蒸餾水或同等純度的水、冰袋和液氮等。

5.1.2主要器具

金屬刮刀、鑷子、短尺、樣品袋或樣品瓶、聚乙烯樣品袋或螺紋蓋玻璃瓶、一次性無菌手套、GPS定位

儀、溫度計(jì)和便攜pH計(jì)等。

5.2樣品采集

5.2.1采樣計(jì)劃制定要點(diǎn)

5.2.1.1確定采樣基質(zhì)

根據(jù)生境類型或溝渠、河流底質(zhì)，確定周叢生物附著的基質(zhì)。池塘、水庫、湖泊以近水岸的無機(jī)基質(zhì)

（如石頭等）和有機(jī)基質(zhì)（如水生植物等）作為周叢生物附著基質(zhì)，稻田以表層土壤作為周叢生物附著基

質(zhì)。不同基質(zhì)上的樣品分開收集保存。

5.2.1.2確定樣品數(shù)

每份樣品保證取至少3個平行樣品。

5.2.2采樣時(shí)間和采樣頻率

5.2.2.1農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)采樣時(shí)間和頻率

水稻移栽后每月采集樣品一次，移栽后第一個月可半月采集一次。農(nóng)田溝渠周叢生物采樣時(shí)間和頻

率與稻田采樣相對應(yīng)。

5.2.2.2淺水生態(tài)系統(tǒng)采樣時(shí)間和頻率

河流、池塘、湖泊、水庫、濕地等生境的周叢生物宜按季節(jié)或豐、平、枯水期開展采樣。采樣時(shí)間間隔

宜相同，選擇一天中的同一時(shí)段。

5.2.3樣品采集方法

5.2.3.1確定采樣容積

每個樣點(diǎn)采集的周叢生物容積應(yīng)保持一致?；旌喜蓸討?yīng)根據(jù)混合點(diǎn)數(shù)量確定每點(diǎn)采集量。

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5.2.3.2采樣順序

需采集周叢生物上覆水或下層土壤樣品時(shí)，應(yīng)先采集水樣后再采集周叢生物和土壤樣品。

5.2.3.3樣品刮取

使用鑷子或刮刀等工具從水下浸沒的介質(zhì)，包括稻田土壤、水生植物、石塊表面剝離周叢生物，并移

至聚乙烯采樣袋內(nèi)。

5.2.3.4原位厚度檢測

利用原位采樣器對周叢生物進(jìn)行原位厚度檢測和固定，原位采樣器可參考附錄B。

5.2.3.5器具清洗

應(yīng)及時(shí)清洗所有接觸過樣品的采樣器具，使用前使用0.1mol/L鹽酸溶液消毒。

5.2.4樣品標(biāo)識和記錄

5.2.4.1樣品標(biāo)識

在樣品袋或樣品瓶外側(cè)標(biāo)注樣品編號、采樣日期、水體名稱、采樣點(diǎn)位、采樣人姓名。

5.2.4.2樣品記錄

采樣現(xiàn)場應(yīng)記錄樣品經(jīng)緯度、生境情況等信息，記錄表格可參考附錄C。

5.3樣品的處理與儲存

5.3.1樣品儲存容器

5.3.1.1常規(guī)樣品保存

周叢生物一般常用聚乙烯袋存儲。

5.3.1.2特殊樣品保存

有機(jī)物污染的周叢生物宜采用帶有螺紋蓋的玻璃瓶。

5.3.2樣品運(yùn)輸和儲存

5.3.2.1從田間采樣到進(jìn)行分析之前宜儲存在0℃~4℃的保溫箱中。

5.3.2.2運(yùn)輸中應(yīng)仔細(xì)存放樣品，以確保樣品無破損、樣品之間無污染。避免強(qiáng)光照射及強(qiáng)烈震動。

5.3.2.3周叢生物樣品運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，分析物理指標(biāo)的樣品應(yīng)風(fēng)干或儲存于4℃，分析化學(xué)指標(biāo)的樣品

應(yīng)進(jìn)行液氮處理并儲存于-20℃，分析生物指標(biāo)的樣品應(yīng)進(jìn)行液氮處理并儲存于-80℃。

6物理指標(biāo)分析測試

6.1覆蓋度測定

6.1.1被測點(diǎn)選定

在擬開展調(diào)查的生境內(nèi)，隨機(jī)選定觀測點(diǎn)，點(diǎn)與點(diǎn)之間間距為15m~30m。觀測點(diǎn)數(shù)參照第4章

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執(zhí)行。

6.1.2針刺法測定覆蓋度

覆蓋度應(yīng)在采樣現(xiàn)場測定。將1m2的被測點(diǎn)方框以間隔網(wǎng)格線方式劃分為10cm×10cm，15cm×

15cm，20cm×20cm三種不同格網(wǎng)密度，并重復(fù)該過程5次~10次，取均值作為該被測點(diǎn)的最終結(jié)果。

6.1.3覆蓋度計(jì)算

測量每個隨機(jī)被測點(diǎn)的覆蓋面積，求取平均值，然后乘以總的稻田面積得到所測稻田的周叢生物面

積。覆蓋度為周叢生物面積占稻田總面積之比，一般用百分?jǐn)?shù)表示。覆蓋度（PBC）計(jì)算見公式（1）：

S×S

PBC=AveragecoverageTotalarea×100…………（1）

STotalarea

式中：

——1m2m2

SAveragecoverage被測點(diǎn)（）內(nèi)覆蓋面積的平均值，單位為平方米（）；

——m2

STotalarea所研究稻田區(qū)域的總面積，單位為平方米（）。

6.2厚度測定

6.2.1材料與設(shè)備

6.2.1.1主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、二甲基亞砜溶液、綠色熒光核酸染料、0.9%氯化鈉溶液（生

理鹽水）和抗熒光淬滅封片劑等。

6.2.1.2主要材料：載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、吸水紙、離心管和錫箔紙等。

6.2.1.3主要設(shè)備：激光掃描共聚焦顯微鏡等。

6.2.2測定步驟

6.2.2.1樣品制備

6.2.2.1.1用鑷子取小塊新鮮的周叢生物于潔凈載玻片，并放置于潔凈的培養(yǎng)皿中，用0.9%氯化鈉溶液

（生理鹽水）輕柔洗去表面殘余培養(yǎng)液和雜質(zhì)。

6.2.2.1.2染料的配制：取潔凈離心管，用錫箔紙包緊，向其中加1mL二甲基亞砜溶液，取1.5μL綠色熒

光核酸染料加入二甲基亞砜溶液中，振蕩混勻，待用。

6.2.2.1.3加200μL染料于載玻片上，確保整個片子被染料液覆蓋，用錫箔紙包起放有載玻片的培養(yǎng)皿，

染色20min~30min后，取出載玻片，并將其邊緣液體吸干，加10μL抗熒光淬滅封片劑到潔凈的蓋玻片

上，將蓋玻片放置于周叢生物上壓緊，并排除氣泡，確保視野清晰不流動。將制備好的片子用錫箔紙包

好，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

6.2.2.2激光掃描共聚焦顯微鏡成像

激光共聚焦掃描顯微鏡對染色周叢生物進(jìn)行顯微觀察和圖像采集，用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、

逐面快速掃描成像，掃描限制在周叢生物樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，可以獲得周叢生物不

同深度層次的圖像。激光掃描共聚焦顯微鏡分析方法應(yīng)按照J(rèn)Y/T0586要求分析。

6.2.2.3最大厚度測定

對周叢生物樣本由內(nèi)（周叢生物與玻片相貼面）向外（周叢生物游離面）沿三維坐標(biāo)系Z軸逐層水平

掃描，步距14μm，當(dāng)出現(xiàn)2個連續(xù)的水平層面，Z軸距離較小的水平層面上能夠觀察到周叢生物結(jié)構(gòu)，Z

軸距離較大的水平層面上不能夠觀察到周叢生物結(jié)構(gòu)，則后一水平層面的Z軸距離為周叢生物最大厚

6

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度（單位為μm）。

6.3二維形態(tài)表征

6.3.1材料與設(shè)備

6.3.1.1主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、2.5%戊二醛溶液、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）和

1%鋨酸固定液等。

6.3.1.2主要材料：蓋玻片、濾膜、吸水紙和離心管等。

6.3.1.3主要設(shè)備：冷凍干燥機(jī)和掃描電子顯微鏡等。

6.3.2測定步驟

6.3.2.1樣品制備

6.3.2.1.1取適量周叢生物展片于蓋玻片或?yàn)V膜上，用2.5%戊二醛溶液固定2h，0.1mol/L磷酸鹽緩沖

液（pH=7.4）漂洗三次，每次10min，再用1%鋨酸固定液固定1h~2h，固定結(jié)束再重復(fù)磷酸鹽緩沖液

漂洗過程。

6.3.2.1.2將固定好的周叢生物樣品冷凍干燥處理，以接近于物質(zhì)的自然狀態(tài)直接放到掃描電鏡中進(jìn)行

觀察。

6.3.2.1.3若觀察割裂面結(jié)構(gòu)，應(yīng)根據(jù)需求從不同角度切割周叢生物樣品。

6.3.2.1.4若試樣導(dǎo)電性弱時(shí)，一般選擇鍍膜處理。通常情況選擇鍍金（Au）膜，如果對分辨率有較高的

要求，可以選擇鍍鉑（Pt）、鉻（Cr）、銥（Ir）。如果要對樣品進(jìn)行嚴(yán)格的化學(xué)定量分析，則不能鍍金屬膜，因

為金屬膜對X射線有較強(qiáng)的吸收，對定量有較大影響，可選用蒸鍍碳膜。

6.3.2.2掃描電子顯微鏡成像

應(yīng)按照GB/T33834要求進(jìn)行掃描電子顯微鏡成像。

6.4三維結(jié)構(gòu)表征

6.4.1材料與設(shè)備

6.4.1.1主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）等。

6.4.1.2主要材料：載玻片、濾膜和吸水紙等。

6.4.1.3主要設(shè)備：激光掃描共聚焦顯微鏡。

6.4.2測定步驟

6.4.2.1樣品制備

取小片新鮮周叢生物或直接剪切至所需大小置于潔凈載玻片上，用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=

7.4）漂洗三次，每次10min，以除去雜質(zhì)。

6.4.2.2三維結(jié)構(gòu)成像

激光掃描共聚焦顯微鏡觀察周叢生物樣品并采集不同層面圖像，構(gòu)建三維圖像。激光掃描共聚焦顯

微鏡分析方法參照J(rèn)Y/T0586。

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6.4.3注意事項(xiàng)

6.4.3.1掃描過程耗時(shí)較長，而且只能掃描不動的微生物，許多活動的大型微生物，例如周叢生物中原生

動物等，因運(yùn)動比較劇烈而會對成像造成一定的影響。

6.4.3.2某些環(huán)境雜質(zhì)可能會對某些活體細(xì)胞的活性造成一定的負(fù)面影響。在樣品制備中盡可能清洗

干凈，同時(shí)適當(dāng)?shù)卣{(diào)整激光的光強(qiáng)，用最弱的光對樣品進(jìn)行照射掃描。

7化學(xué)指標(biāo)分析測試

7.1總有機(jī)碳、總無機(jī)碳和總碳含量

7.1.1測定方法

7.1.1.1應(yīng)按照DZ/T0279.27要求測定總有機(jī)碳含量。

7.1.1.2應(yīng)按照LY/T1250中的氣量法要求測定總無機(jī)碳含量。

7.1.1.3總碳的含量為總有機(jī)碳和總無機(jī)碳的含量之和。

7.1.2樣品預(yù)處理

7.1.2.1總有機(jī)碳：新鮮周叢生物樣品采集后，用去離子水洗凈，再用普通濾紙濾干水后，60℃條件下，烘

干8h，得到周叢生物干樣。再將周叢生物干樣經(jīng)研磨后，經(jīng)過60目（0.25mm）篩孔篩分后，精確稱取

0.5g（精準(zhǔn)到0.1mg），用長條硫酸紙將樣品置于干燥的硬質(zhì)玻璃試管內(nèi)，并加入0.1g粉末狀硫酸銀。

用移液管加入5mL重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用移液管注入5.0mL濃硫酸，搖勻，待測。

7.1.2.2總無機(jī)碳：稱取通過60目（0.25mm）篩孔的周叢生物干樣0.5g~10g于250mL錐形瓶中。用

蒸餾水潤濕樣品、瓶口和瓶壁，并向彎曲小試管中注入約10mL3mol/L的鹽酸溶液，再將其放入錐形瓶

中，塞緊。

7.1.3注意事項(xiàng)

7.1.3.1總有機(jī)碳

7.1.3.1.1測定周叢生物有機(jī)質(zhì)應(yīng)采用風(fēng)干樣品，若未風(fēng)干樣品含有較多的Fe2+、Mn2+及其他還原性物

質(zhì)消耗重鉻酸鉀，可使結(jié)果偏高。試驗(yàn)前將樣品磨細(xì)鋪開，在室內(nèi)通風(fēng)處風(fēng)干約10d。

AgSO0.1g

7.1.3.1.2本方法不適用于含氯較高的樣品，若樣品含有少量的氯則可以加少量2（4約），使氯

離子沉淀以去除其測試干擾。

7.1.3.1.3加熱時(shí)產(chǎn)生的二氧化碳?xì)馀莶皇钦嬲姆序v，待溶液表面沸騰開始計(jì)時(shí)煮沸5min。

7.1.3.1.4轉(zhuǎn)移試管溶液時(shí)，應(yīng)用少量蒸餾水進(jìn)行沖洗，勿損失溶液。

7.1.3.1.5滴定亞硫酸鐵消耗量若小于空白試驗(yàn)的1/3時(shí)，有未完全氧化的可能，應(yīng)舍去重做。

7.1.3.2總無機(jī)碳

7.1.3.2.1周叢生物中的碳酸鹽主要以碳酸鈣為主，但也有的碳酸鹽以碳酸鈣-碳酸鎂和碳酸氫鹽等存

CaCOCaCO?COgkg-1

在，不過都表示為3或者3（2·）。

7.1.3.2.2為防止誤差較大，試驗(yàn)前應(yīng)檢測氣密性。

7.1.3.2.3可用蒸餾水濕潤樣品和錐形瓶瓶壁，以緩解碳酸鹽和鹽酸反應(yīng)產(chǎn)熱的影響，也有助于瓶內(nèi)的水

氣壓平衡。

7.1.3.2.4操作過程中避免用手直接觸碰反應(yīng)器，防止因手的熱量使氣體膨脹，產(chǎn)生誤差。

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7.1.3.2.5測量過程中要隨時(shí)調(diào)整量氣管的液面與水準(zhǔn)器的液面相平，勿相差太大。

7.2總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量

7.2.1測定方法

7.2.1.1按照NY/T2017中的凱氏消煮法要求測定總氮含量。

7.2.1.2按照HJ634中的氯化鉀溶液提取?分光光度法要求測定氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。

7.2.2樣品預(yù)處理

7.2.2.1樣品采集

無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運(yùn)輸保存，并

在3d內(nèi)完成分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱中保存。新鮮樣品清洗后，用吸水紙吸干表面

水分，留存?zhèn)錅y。

7.2.2.2樣品消解

稱取周叢生物干樣品0.100g~0.500g（精確到0.001g）于100mL消煮管中，加入3mL濃硫酸，再

加入1.1g催化劑，加蓋回流漏斗，置于消煮爐加熱，待沒有泡沫時(shí)，適當(dāng)提高溫度，微微煮沸，使得固體完

全消失成為溶液，最終消煮液澄清透亮，呈現(xiàn)灰白色。消煮液冷卻后待用。

7.2.2.3樣品破碎

稱取新鮮周叢生物干樣品0.100g~0.500g（精確到0.001g）于100mL消化管，加入3mL氯化鉀溶

液，然后在冰浴中進(jìn)行超聲破碎處理，超聲強(qiáng)度200W，超聲時(shí)間3s，間隔10s，重復(fù)30次。破碎后，將

其轉(zhuǎn)入50mL聚乙烯離心管中，在3000r/min條件下，離心10min，將上清液保存至比色管中，待測。

7.2.3注意事項(xiàng)

7.2.3.1在重復(fù)性條件下獲得的三次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對誤差不應(yīng)超過算術(shù)平均值的7%。

7.2.3.2每批樣品應(yīng)測定10%的加標(biāo)樣品。氨氮加標(biāo)回收率應(yīng)在80%~120%之間；亞硝酸鹽氮加標(biāo)

回收率應(yīng)在70%~120%之間；硝酸鹽氮加標(biāo)回收率應(yīng)在80%~120%之間。

7.2.3.3還原柱中的鎘粉在使用前需要檢驗(yàn)其還原性。

7.3磷含量

7.3.1測定方法

應(yīng)按照NY/T88中的氫氧化鈉熔融—鉬銻抗比色法要求測定總磷含量。

7.3.2樣品預(yù)處理

精準(zhǔn)稱取0.2500g通過60目（0.25mm）篩的烘干（一般為60℃左右）的周叢生物干樣，輕輕放置于

鎳或銀坩堝底部，避免將樣品沾在坩堝壁上，加入幾滴無水乙醇稍微濕潤樣品，加2.0g（為樣品的8倍）

固體氫氧化鈉在樣品表面鋪平整，放置在干燥器中，以防吸濕潮解。將坩堝放入高溫電爐中，由室溫升到

300℃，保溫30min，再升溫至750℃，保溫15min，后冷卻坩堝，在坩堝中加10mL蒸餾水，放在電爐上

加熱至80℃左右，熔塊溶解后再煮沸5min，然后將坩堝內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用熱蒸餾水及

2mL硫酸多次洗滌坩堝并倒入容量瓶內(nèi)，盡量不要使總體積超過40mL。然后往容量瓶中加5滴1∶1

鹽酸溶液及5mL硫酸溶液，輕輕振蕩，靜置冷卻至室溫，加蒸餾水定容至50mL，搖勻后靜置至澄清或

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用無磷濾紙過濾，濾液貯于50mL三角瓶中，待測。同時(shí)做至少兩個空白試驗(yàn)。

7.3.3注意事項(xiàng)

7.3.3.1在用氫氧化鈉熔融樣品時(shí)，為防止濺跳現(xiàn)象，一般從低溫開始，逐漸脫水后，再高溫加熱。

7.3.3.2若使用銀坩堝進(jìn)行試驗(yàn)，需注意控制溫度，銀坩堝在960℃時(shí)會融化。

7.3.3.3熔融完全的熔塊冷卻后會凝結(jié)，并呈現(xiàn)出淡藍(lán)色或藍(lán)綠色，如熔塊呈棕黑色則表示還沒有熔融

完全，應(yīng)再按熔融的步驟再熔一次。

1/2HSO=0.55molL-11/2HSO)=

7.3.3.4鉬銻抗法要求顯色液中硫酸濃度為c（24）·。如果酸度小于c（24

0.45molL-11/2HSO)=0.65molL-1

·，顯色時(shí)間縮短，但穩(wěn)定時(shí)間變得較短；如果酸度大于c（24·，顯色時(shí)

間延長。如果不確定待測液中的原有酸度，要先中和處置。

7.3.3.5鉬銻抗法顯色溫度在15℃~60℃，如室溫未達(dá)到15℃，可放置在30℃~40℃烘箱中保溫

30min，冷卻后比色。

7.4鉀含量

7.4.1方法原理、主要儀器、試劑、測試步驟

應(yīng)按照NY/T2017中的電感耦合等離子體質(zhì)譜法要求測定鉀含量。

7.4.2樣品預(yù)處理

用無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運(yùn)輸保存，

并在3d內(nèi)完成測試分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱保存。將待測的周叢生物樣品干燥后研

磨，過60目（0.25mm）篩，稱取均勻干樣0.1g~0.5g（精確到0.0001g）于100mL試管內(nèi)待測。

7.4.3注意事項(xiàng)

7.4.3.1本方法的檢出限為70μg·kg-1。

7.4.3.2在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的15%。

7.5鈉含量

7.5.1測定方法

按照LY/T1246中的火焰原子吸收光譜法要求測定鈉含量。

7.5.2樣品預(yù)處理

首先，將鋁盒60℃下烘干至恒重，稱重。然后準(zhǔn)確稱取2g~3g新鮮周叢生物，用普通濾紙濾干后，

置于坩堝中，100℃下烘干（8h）。冷卻至室溫，稱重，計(jì)算周叢生物含水率。取適量干周叢生物樣品碾碎

混勻，并過60目（0.25mm）篩后放入封口袋中，備用。

7.5.3注意事項(xiàng)

7.5.3.1儀器校準(zhǔn)：在進(jìn)行火焰光度測定前，需要對光度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。通常，

會使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。

7.5.3.2激發(fā)條件：火焰溫度要適當(dāng)，溫度過低靈敏度下降，溫度太高則堿金屬電離嚴(yán)重，影響測量的線

性關(guān)系。

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7.6鈣、鎂含量

7.6.1測定方法

按照GB/T35871要求測定鈣、鎂含量。

7.6.2樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取通過60目（0.25mm）孔徑篩的周叢生物干樣0.2g，加入10mL濃硫酸，并在通風(fēng)櫥中加

熱消煮，等瓶內(nèi)硫酸開始冒白煙后，繼續(xù)加熱5min，然后靜置冷卻。等管內(nèi)溫度冷卻至70℃左右，再逐

滴滴加10滴過氧化氫溶液，滴加時(shí)應(yīng)緩慢滴加，避免容器氣壓過高。利用強(qiáng)酸的氧化性與酸性，使周叢

生物中的有機(jī)物質(zhì)完全分解、氧化，呈氣態(tài)逸出，分析物質(zhì)及共存離子轉(zhuǎn)化為無機(jī)物狀態(tài)，以穩(wěn)定的化學(xué)

形式存在于澄清溶液中。

7.6.3注意事項(xiàng)

7.6.3.1單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產(chǎn)生危險(xiǎn)，因此在日常工作中多將兩種

或兩種以上的強(qiáng)酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機(jī)物質(zhì)能快速而又平穩(wěn)地消解。

7.6.3.2元素含量小于0.1μg·g-1時(shí)，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算

術(shù)平均值的20%。

7.6.3.3元素含量在0.1μg·g-1~1μg·g-1時(shí)，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)

超過算術(shù)平均值的15%。

7.6.3.4元素含量大于lμg·g-1時(shí)，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)

平均值的10%。

7.7硫含量

7.7.1測定方法

按照LY/T1270要求測定硫含量。

7.7.2樣品預(yù)處理

用無菌硅膠刮刀將周叢生物從附著的載體上輕輕剝離，樣品采集后用冰袋保存，保持4℃運(yùn)輸保存，

并在3d內(nèi)完成分析，否則需要儲存于-20℃和-80℃冰箱保存。將待測的周叢生物樣品干燥后研磨，

稱取約0.2g~0.5g（精確到0.0001g），加入150mL高型錐形瓶中待測。

7.7.3注意事項(xiàng)

在重復(fù)性條件下，任意兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值需小于或等于算術(shù)平均值的10%。

7.8鐵含量

7.8.1測定方法

應(yīng)按照HJ/T345的要求測定總鐵和亞鐵（二價(jià)鐵離子）含量。

三價(jià)鐵離子的濃度為總鐵的濃度減去二價(jià)鐵離子的濃度。

7.8.2樣品預(yù)處理

7.8.2.1亞鐵（二價(jià)鐵離子）：準(zhǔn)確稱取5.0g干重的周叢生物（提前測定含水量）于錐形瓶中，加入浸提劑

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100mL，搖勻振蕩（5min，120r/min），離心（5min，8000r/min）獲得上清液。

7.8.2.2總鐵：稱取干重為5g的新鮮周叢生物樣品，60℃烘干8h，將烘干的周叢生物樣品在瓷研缽中

碾磨過60目（0.25mm）篩，稱取適量過篩后周叢生物樣品置于石英坩堝中，在電爐上加熱使其碳化，再

移入高溫電爐，在500℃下繼續(xù)加熱2h~3h，灰化完成，待其冷卻后，加入5mL稀硝酸溶液（1∶1）溶解

灰分，將溶液全部轉(zhuǎn)移入50mL容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度線，最后再用0.45μm濾紙過濾，得到

澄清濾液，進(jìn)行下一步總鐵含量的測定。

7.8.3注意事項(xiàng)

新鮮周叢生物從培養(yǎng)基取出后，應(yīng)盡快測量，沒有用完的樣品勿放回培養(yǎng)基，以免造成污染。

7.9錳含量

7.9.1測定方法

應(yīng)按照GB/T35871要求測定錳含量。

7.9.2樣品預(yù)處理

5g150mL30mLHNO?HClO

準(zhǔn)確稱取的周叢生物干樣，置于錐形瓶中，加入34酸混合溶液

HNOHClO51

（3與4的體積比為∶），不要晃動錐形瓶，可在錐形瓶上方放一個漏斗，在漏斗中放一顆稍大

于漏斗口徑的玻璃珠，以減少靜置過程中溶液的揮發(fā)以及消煮過程中溶液的蒸發(fā)，將加完酸的溶液靜置

于通風(fēng)櫥中過夜。在通風(fēng)櫥中，把靜置一夜后的錐形瓶置于調(diào)溫板或調(diào)溫爐上加熱消煮5h左右（溫度

應(yīng)控制在能讓消煮液微沸），消煮過程中會產(chǎn)生棕色二氧化氮?dú)怏w（戴帶上護(hù)具，注意防護(hù)），當(dāng)不再產(chǎn)生

棕色氣體時(shí)，逐漸升溫，將溶液加熱至幾乎被蒸干。冷卻過后，將溶液及不溶性顆粒物全部轉(zhuǎn)移至50mL

容量瓶中，用蒸餾水定容后，再用0.45μm濾紙過濾，得到澄清濾液，待測。

7.9.3注意事項(xiàng)

單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產(chǎn)生危險(xiǎn)，因此，在日常工作中多將兩種或兩

種以上的強(qiáng)酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機(jī)物質(zhì)能快速而又平穩(wěn)地消解。

7.10銅含量

7.10.1測定方法

應(yīng)按照GB/T35871要求測定銅含量。

7.10.2樣品預(yù)處理

在錐形瓶中加入周叢生物干樣0.500g~1.000g（精確到0.0001g），然后加入30mL提前制備的混

合酸，蓋上表面皿，以減少沸騰過程中的蒸發(fā)。調(diào)節(jié)電熱板溫度以保持錐形瓶中的液體沸騰，錐形瓶中會

NONO

出現(xiàn)大量2棕色氣體。當(dāng)不再釋放2氣體時(shí)升高溫度，至消化液澄清透明（無色或微黃色）。如果

消化液變成深棕色，滴入少量硝酸，此時(shí)消化液釋放白色煙，消化液的顏色進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色透明，抑或

是轉(zhuǎn)變成微黃色時(shí)，將消化液靜置至冷卻，待測。

7.10.3注意事項(xiàng)

7.10.3.1單一的氧化性酸不易將樣品分解完全，且在操作中容易產(chǎn)生危險(xiǎn)，因此，在日常工作中多將兩

種或兩種以上的強(qiáng)酸或氧化劑聯(lián)合使用，使有機(jī)物質(zhì)能快速而又平穩(wěn)地消解。

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7.10.3.2在重復(fù)性條件下對周叢生物中的銅含量進(jìn)行兩次獨(dú)立的測定，計(jì)算兩次測定的周叢生物中的

銅含量的絕對差值和算術(shù)平均值，絕對差值不能超過算術(shù)平均值的20%。

7.10.3.3此方法中所使用的試劑的純度均為優(yōu)級純（GR）。

7.10.3.4此方法中所用的水為去離子水或重蒸餾水。

7.11鋅含量

7.11.1測定方法

按照LY/T1270要求測定鋅含量。

7.11.2樣品預(yù)處理

稱取過60目（0.25mm）篩的烘干周叢生物樣品1.000g于50mL三角瓶中，以少量水潤濕，加入

8mL濃硫酸，振蕩或放置過夜（優(yōu)選）后，滴加10滴高氯酸，搖勻，瓶口放一小漏斗，置于電爐上加熱消煮

至瓶內(nèi)液體開始轉(zhuǎn)白后，繼續(xù)消煮20min，全部消煮時(shí)間為45min~60min，將冷卻后的消煮液用去離子

水洗入100mL容量瓶中，沖洗時(shí)用水應(yīng)少量多次，輕輕搖動容量瓶，蒸餾水定容，用干燥漏斗和濾紙濾

入干燥的100mL三角瓶中。

7.12鉬含量

7.12.1方法原理、主要儀器、試劑、測試步驟

應(yīng)按照GB/T35871要求測定鉬含量。

7.12.2樣品預(yù)處理

稱取過60目（0.25mm）篩的烘干周叢生物樣品1.000g于塑料瓶中待用。

7.12.3注意事項(xiàng)

7.1.2.3.1鉬含量小于0.1mg/kg時(shí)，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算

術(shù)平均值的20%。

7.12.3.2鉬含量在0.1mg/kg~1mg/kg時(shí)，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)

超過算術(shù)平均值的15%。

7.12.3.3鉬含量大于1mg/kg時(shí)，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)

平均值的10%。

7.13硅含量

7.13.1測定方法

應(yīng)按照LY/T1270要求測定硅含量。

7.13.2樣品預(yù)處理

稱取過60目（0.25mm）篩的烘干周叢生物樣品1.000g（精確至0.0001g）于50mL錐形瓶中待用。

7.13.3注意事項(xiàng)

7.13.3.1如周叢生物樣品含鐵較多，可先用100g·L-1鹽酸洗滌沉淀，以免濾液體積過大。

7.13.3.2整個二氧化硅分離過程要連續(xù)操作，不可加熱煮沸，要保持漏斗處于溫?zé)釥顟B(tài)，并防止濾紙

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穿孔。

7.13.3.3檢查Fe3+表示已洗凈：在白瓷比色板凹槽中，接一滴濾液，加一滴100g·L-1硫氰化鉀，溶液呈

紅色表示有Fe3+存在，無色表示已洗凈。

7.13.3.4高氯酸應(yīng)稀釋到60%后再使用，過濃易引起爆炸。

7.13.3.5消化時(shí)高氯酸已分解完畢，但殘留物仍呈黑色或棕色時(shí)，說明由于硝酸不足或溫度過高，硝酸

分解過快，氧化不完全。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)立即將樣品取下，冷卻后再加3mL~4mL硝酸和1mL高氯

酸，繼續(xù)消化直到消化液完全呈白色為止。若小漏斗上有黑色物質(zhì)，應(yīng)使用少量濃硝酸沖洗，再重新

消化。

7.13.3.6因?yàn)殁浛沙恋頌楦呗人徕洠蕬?yīng)把過多的高氯酸排除，不至在消化液中形成高氯酸鉀沉淀，因

此，消化終了時(shí)，要求出現(xiàn)硫酸回流即可。

7.13.3.7為避免已脫水的二氧化硅再次水化溶解，當(dāng)以鹽酸作溶劑時(shí)，同時(shí)要考慮鹽酸的濃度，以阻止

二氧化硅再度水化為宜。

7.14氯含量

7.14.1測定方法

應(yīng)按照NY/T1378要求測定氯含量。

7.14.2樣品預(yù)處理

稱取過60目（0.25mm）篩的烘干周叢生物樣品5.000g（精確至0.0001g）于250mL塑料瓶中，準(zhǔn)

確加入50mL純水，用橡皮塞塞緊后超聲30min。

7.14.3注意事項(xiàng)

7.14.3.1所有玻璃器皿均需在使用前用5%的硝酸浸泡4h，然后用去離子水浸泡并反復(fù)沖洗3次~

5次，晾干備用。

7.14.3.2在重復(fù)性條件下獲得兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值，氯離子含量小于100mg·kg-1時(shí)，不應(yīng)超

過算術(shù)平均值的5%，氯離子含量大于或等于100mg·kg-1時(shí)，不應(yīng)超過算術(shù)平均值的3%。

7.15硼含量

7.15.1測定方法

應(yīng)按照NY/T149要求測定硼含量。

7.15.2樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取0.5g過篩周叢生物干品（精確到0.0001g），加1mL~2mL飽和氫氧化鈣溶液混勻，低溫

蒸干，并加熱炭化至無煙。隨即將其移入馬弗爐中，升溫至400℃并保持30min，然后升溫至500℃并保

持1.5h進(jìn)行灰化。冷卻取出后加入10mL硫酸溶液溶解灰分，靜置1h。將溶解液全部轉(zhuǎn)移至50mL

容量瓶中并定容至標(biāo)度。用干濾紙過濾，濾液儲存于聚乙烯試劑瓶中供測硼用。

7.15.3注意事項(xiàng)

兩次測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過10%。

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8生物指標(biāo)分析測試

8.1微生物組成和多樣性

8.1.1通則

8.1.1.116SrDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，具有10個保守區(qū)域和9個高變

區(qū)域，宜用于測定周叢生物中原核微生物的組成與物種多樣性。

8.1.1.218SrDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，宜用于定量周叢生物中真核微

生物的組成與物種多樣性。

8.1.1.3ITS分為兩個區(qū)域ITS1h和ITS2，ITS1位于真核生物rDNA序列18S和5.8S之間，ITS2位

于真核生物rDNA序列5.8S和28S之間。對ITS1或ITS2進(jìn)行測序，用于測定周叢生物微生物中真菌

群落組成與多樣性。

8.1.2測定步驟

8.1.2.1DNA提取

應(yīng)按照GB/T30988提取周叢生物DNA。

8.1.2.2引物選擇

8.1.2.2.116SrDNA引物為：

515F（5'?GTGCCAGCMGCCGCGGTAA?3'）/907R（5'?CCGTCAATTCMTTTRAGTTT?3'）

8.1.2.2.318SrDNA引物為：

528F（5'?GCGGTAATTCCAGCTCCAA?3')/706R（5'?AATCCRAGAATTTCACCTCT?3'）

8.1.3其他

其他測序步驟應(yīng)按照GB/T30989要求。

8.2磷脂脂肪酸群落結(jié)構(gòu)

8.2.1儀器與試劑

8.2.1.1主要儀器：振蕩器、離心機(jī)、氮吹儀、水浴鍋和氣相色譜儀。

8.2.1.2主要試劑：蒸餾水或同等純度的水、磷酸鹽緩沖液、三氯甲烷、甲醇、丙酮、甲苯、氫氧化鉀、正己

烷和乙酸等。

8.2.1.3主要材料：錐形瓶、離心管和硅膠（6mL，500mg）層析柱等。

8.2.2操作步驟

稱取10mg新鮮的去雜質(zhì)的周叢生物于錐形瓶中，依次加磷酸鹽緩沖液7.2mL、三氯甲烷8mL、甲

醇16mL，振蕩器振搖60min，靜置（避光）12h；再加入磷酸鹽緩沖液7.2mL、三氯甲烷8mL，振搖

30min，靜置過夜；離心3min（2500r/min)分離水相、三氯甲烷相及固體相三相，移出三氯甲烷相，并用

N6mL500mg

2將其吹干；三氯甲烷相過硅膠（，）層析柱，依次用三氯甲烷、丙酮、甲醇洗滌層析柱，收集甲

N1mL111mL0.2mol/L

醇洗滌液，用2吹干；用體積比為∶的甲醇和甲苯的混合溶液與的氫氧化鉀溶

液溶解樣品，并在30℃~35℃的水浴中保溫15min，冷卻至室溫，再加入2mL體積比為4∶1的正己烷、

三氯甲烷混合溶液，用乙酸將溶液調(diào)至中性，加2mL蒸餾水，振搖5min，去水相，取底部正己烷相進(jìn)行

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氣相色譜測試，再利用計(jì)算機(jī)對PLFA圖譜分析測定其成分及含量。

8.2.3數(shù)據(jù)分析

8.2.3.1PLFA的結(jié)構(gòu)分析

脂肪酸可分為直鏈飽和脂肪酸（SSFA）、支鏈飽和脂肪酸（BSFA）、單鍵不飽和脂肪酸（MUFA）、環(huán)

丙烷脂肪酸（CFA）、羥基脂肪酸（OHFA）和多鍵不飽和脂肪酸（PUFA），按照所得脂肪酸的結(jié)構(gòu)分成上

述6種，并統(tǒng)計(jì)其相對含量及絕對含量。

8.2.3.2分布特性分析

將所獲得的數(shù)據(jù)先進(jìn)行單因子方差分析，后構(gòu)建矩陣，并將數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化，以歐式距離為聚類尺

度，用組間連接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類。

8.2.3.3PLFA多樣性分析

引入ShannonWiener多樣性指數(shù)（H）、Pielou均勻度（J）和Simpson優(yōu)勢度（D）進(jìn)行分析。

8.2.3.4多樣性指數(shù)

ShannonWiener多樣性指數(shù)（H）按公式（2）計(jì)算.。