IL-2與IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗協(xié)同免疫增強(qiáng)效應(yīng)探究一、引言1.1研究背景犬細(xì)小病毒（Canineparvovirus，CPV）是一種對幼犬危害極大的單鏈DNA病毒，在全球范圍內(nèi)廣泛傳播。作為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬的成員，CPV主要通過直接或間接接觸傳播，常見的傳播途徑包括與病犬、帶毒犬的直接接觸，以及攝入被CPV污染的食物和水。一旦感染，幼犬極易患上嚴(yán)重的腸道炎癥和腹瀉，病情嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致死亡。據(jù)相關(guān)研究表明，幼犬感染CPV后的病死率可高達(dá)50%-80%，給養(yǎng)犬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也讓眾多寵物主人承受著失去愛寵的痛苦。目前，預(yù)防CPV感染的主要手段是接種疫苗。傳統(tǒng)的CPV疫苗在一定程度上能夠預(yù)防病毒感染，但在實(shí)際應(yīng)用中，部分幼犬在接種后仍然表現(xiàn)出易感性，或者僅產(chǎn)生較弱的免疫反應(yīng)。這可能是由于母源抗體的干擾、疫苗質(zhì)量的參差不齊、免疫程序的不合理以及幼犬自身免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善等多種因素導(dǎo)致。例如，母源抗體雖然在幼犬早期抗感染中發(fā)揮一定作用，但過高的母源抗體水平會抑制幼犬自動免疫力的形成，使疫苗無法發(fā)揮應(yīng)有的效果。同時，市場上疫苗質(zhì)量良莠不齊，一些疫苗在運(yùn)輸、保存過程中因溫度等條件控制不當(dāng)，導(dǎo)致效價降低或失效。這些問題嚴(yán)重影響了疫苗的免疫效果，使得尋找新的免疫增強(qiáng)策略成為防治CPV感染的關(guān)鍵。近年來，基因治療作為一種新興的免疫增強(qiáng)策略，逐漸受到廣泛關(guān)注。白細(xì)胞介素-2（IL-2）和白細(xì)胞介素-7（IL-7）作為兩種重要的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL-2主要由T輔助細(xì)胞產(chǎn)生，在活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞方面具有重要作用，能夠有效增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖和功能，進(jìn)而提升機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。IL-7則是一種干細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖和分化，為細(xì)胞提供關(guān)鍵的生存信號，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持中扮演著不可或缺的角色。已有研究表明，IL-2和IL-7在其他疫苗的免疫增強(qiáng)中展現(xiàn)出良好的效果，但它們在犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗中的協(xié)同作用以及對疫苗免疫效果的影響，目前還缺乏深入的研究。因此，探究IL-2和IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用，對于優(yōu)化疫苗性能、提高幼犬對CPV的抵抗力具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價值。1.2犬細(xì)小病毒及VP2DNA疫苗概述犬細(xì)小病毒（CanineParvovirus，CPV）作為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬的一員，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。CPV粒子呈圓形或六邊形，直徑約為21-24nm，呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，且無囊膜包裹。其基因組由單股線狀DNA構(gòu)成，大小約為5.2kb，包含兩個啟動子，能夠轉(zhuǎn)錄表達(dá)三種結(jié)構(gòu)蛋白，即VP1、VP2和VP3，以及兩種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2。其中，VP2蛋白在病毒的感染和免疫過程中扮演著關(guān)鍵角色，它不僅參與構(gòu)成病毒的衣殼，決定了病毒的抗原性、組織嗜性和宿主范圍，還包含了多個抗原表位，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要抗原成分。CPV主要通過直接接觸病犬、帶毒犬，或者攝入被病毒污染的食物和水進(jìn)行傳播。這種傳播方式使得病毒在犬群中極易擴(kuò)散，尤其是在養(yǎng)犬密集的區(qū)域，如寵物店、犬舍等，一旦有感染源存在，病毒便能迅速傳播開來。幼犬由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對CPV的抵抗力較弱，因此成為了受感染的主要群體。感染后的幼犬，通常會出現(xiàn)兩種主要病型：腸炎型和心肌炎型。腸炎型較為常見，主要表現(xiàn)為劇烈嘔吐、小腸出血性壞死性炎癥以及白細(xì)胞數(shù)目顯著減少?；疾∮兹畷l繁嘔吐，嘔吐物起初可能為未消化的食物，隨后逐漸變?yōu)辄S色或黃綠色液體，同時伴有腹瀉癥狀，糞便呈番茄醬色，帶有明顯的腥臭味，嚴(yán)重時還會出現(xiàn)脫水、電解質(zhì)紊亂等癥狀，如不及時治療，極易導(dǎo)致死亡。心肌炎型則相對少見，但病情更為兇險，主要表現(xiàn)為急性非化膿性心肌炎，患病幼犬會出現(xiàn)呼吸困難、心律失常等癥狀，常在短時間內(nèi)迅速發(fā)展為心力衰竭，導(dǎo)致死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，幼犬感染CPV后的病死率可高達(dá)50%-80%，這給養(yǎng)犬業(yè)帶來了沉重的打擊，也讓眾多寵物主人痛心不已。隨著對CPV研究的不斷深入，VP2DNA疫苗應(yīng)運(yùn)而生。VP2DNA疫苗的原理是將編碼CPVVP2蛋白的基因克隆到合適的質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成重組DNA疫苗。當(dāng)將這種重組DNA疫苗導(dǎo)入犬體后，犬體細(xì)胞能夠攝取并表達(dá)VP2蛋白，從而刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對VP2蛋白的免疫應(yīng)答。在這個過程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會識別VP2蛋白為外來抗原，激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞被激活后，會分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。效應(yīng)T細(xì)胞能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞，而記憶T細(xì)胞則會在體內(nèi)長期存在，當(dāng)機(jī)體再次接觸CPV時，能夠迅速活化，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。B淋巴細(xì)胞被激活后，會分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞能夠分泌特異性抗體，這些抗體能夠與CPV結(jié)合，中和病毒的活性，阻止病毒感染宿主細(xì)胞。在實(shí)際應(yīng)用中，VP2DNA疫苗展現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢。它具有良好的穩(wěn)定性，在儲存和運(yùn)輸過程中相對方便，不需要像傳統(tǒng)疫苗那樣嚴(yán)格控制低溫條件。而且，VP2DNA疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，為犬提供較為全面的免疫保護(hù)。然而，目前VP2DNA疫苗也存在一些局限性，其中最主要的問題就是免疫水平有限。部分犬在接種VP2DNA疫苗后，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不夠強(qiáng)烈，無法有效抵抗CPV的感染。這可能是由于多種因素導(dǎo)致的，一方面，DNA疫苗在體內(nèi)的表達(dá)效率可能受到質(zhì)粒載體、導(dǎo)入方式等因素的影響，導(dǎo)致VP2蛋白的表達(dá)量不足，無法充分刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)。另一方面，犬的個體差異，如年齡、遺傳背景、健康狀況等，也會對疫苗的免疫效果產(chǎn)生影響。例如，幼犬的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，對疫苗的應(yīng)答能力相對較弱；而一些患有其他疾病的犬，其免疫系統(tǒng)可能受到抑制，也會影響疫苗的免疫效果。此外，母源抗體的干擾也是導(dǎo)致VP2DNA疫苗免疫水平有限的一個重要因素。幼犬在出生后，會從母犬體內(nèi)獲得母源抗體，這些母源抗體在幼犬早期能夠提供一定的抗感染保護(hù)。但當(dāng)幼犬接種VP2DNA疫苗時，過高的母源抗體水平會中和疫苗中的抗原，抑制疫苗的免疫效果，使得幼犬無法產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答。因此，如何提高VP2DNA疫苗的免疫水平，增強(qiáng)其對CPV的預(yù)防效果，成為了當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。1.3IL-2與IL-7基因的免疫調(diào)節(jié)作用白細(xì)胞介素-2（IL-2）作為一種關(guān)鍵的細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著多方面的重要作用。IL-2主要由T輔助細(xì)胞（Th）產(chǎn)生，其最顯著的功能之一是活化T細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體受到病原體入侵時，T細(xì)胞表面的受體與抗原呈遞細(xì)胞（APC）表面的抗原肽-MHC復(fù)合物結(jié)合，同時接受共刺激信號，在這一過程中，T輔助細(xì)胞被激活并分泌IL-2。IL-2與T細(xì)胞表面的IL-2受體（IL-2R）結(jié)合，啟動一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，開始增殖和分化。通過這一機(jī)制，IL-2能夠快速擴(kuò)充T細(xì)胞的數(shù)量，使其更好地應(yīng)對病原體的威脅。在病毒感染的免疫應(yīng)答中，IL-2激活的T細(xì)胞能夠特異性地識別并殺傷被病毒感染的細(xì)胞，有效抑制病毒的復(fù)制和傳播。除了對T細(xì)胞的作用，IL-2在活化自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）方面也發(fā)揮著重要作用。NK細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有無需預(yù)先致敏就能直接殺傷靶細(xì)胞的能力。IL-2能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，使其對腫瘤細(xì)胞和被病毒感染的細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力。研究表明，IL-2可以促進(jìn)NK細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞毒性分子，如穿孔素和顆粒酶。穿孔素能夠在靶細(xì)胞膜上形成小孔，使顆粒酶等物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞凋亡途徑，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。此外，IL-2還能促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和存活，增強(qiáng)其分泌細(xì)胞因子的能力，如干擾素-γ（IFN-γ）等。IFN-γ可以進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御功能。在增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖和功能方面，IL-2同樣表現(xiàn)出色。IL-2不僅能促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖，還能增強(qiáng)B細(xì)胞的功能。B細(xì)胞在受到抗原刺激后，會在多種細(xì)胞因子的協(xié)同作用下活化、增殖并分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體。IL-2可以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，提高抗體的產(chǎn)生水平。在體液免疫應(yīng)答中，IL-2能夠增強(qiáng)B細(xì)胞對TD抗原（胸腺依賴性抗原）的應(yīng)答，促進(jìn)IgG、IgA等抗體的類別轉(zhuǎn)換，使機(jī)體產(chǎn)生更高效的體液免疫反應(yīng)。IL-2還能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的存活和凋亡。它可以抑制淋巴細(xì)胞的凋亡，維持淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能穩(wěn)定，確保免疫系統(tǒng)能夠持續(xù)有效地發(fā)揮作用。白細(xì)胞介素-7（IL-7）則是一種干細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和維持中扮演著不可或缺的角色。IL-7主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞等產(chǎn)生，它的一個重要功能是促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖和分化。在骨髓中，造血干細(xì)胞是所有血細(xì)胞的起源。IL-7能夠與造血干細(xì)胞表面的IL-7受體結(jié)合，為造血干細(xì)胞提供增殖和分化的信號。IL-7可以刺激造血干細(xì)胞向淋巴細(xì)胞譜系分化，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育。在T淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中，IL-7對于胸腺細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要。它能夠促進(jìn)胸腺細(xì)胞從雙陰性階段向雙陽性階段轉(zhuǎn)變，增加成熟T細(xì)胞的數(shù)量。在B淋巴細(xì)胞發(fā)育中，IL-7也參與了早期B細(xì)胞前體的增殖和分化過程，對B細(xì)胞的成熟和功能發(fā)揮有著重要影響。IL-7還能為細(xì)胞提供關(guān)鍵的生存信號。對于成熟的淋巴細(xì)胞，IL-7是維持其存活和功能的重要細(xì)胞因子。在體內(nèi)，淋巴細(xì)胞需要不斷接受生存信號才能保持活性，否則會發(fā)生凋亡。IL-7通過與淋巴細(xì)胞表面的IL-7受體結(jié)合，激活一系列抗凋亡信號通路，抑制淋巴細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，IL-7可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而維持淋巴細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，確保淋巴細(xì)胞的存活。IL-7還能促進(jìn)記憶性T細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞的存活和功能維持。記憶性淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的“記憶庫”，在機(jī)體再次接觸相同病原體時，能夠迅速活化并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。IL-7對于記憶性淋巴細(xì)胞的長期存活和功能維持起著關(guān)鍵作用，它可以促進(jìn)記憶性T細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞的增殖和分化，使其在再次感染時能夠快速產(chǎn)生免疫反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受病原體的侵害。1.4研究目的與意義本研究旨在深入探究IL-2與IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用，具體而言，一是構(gòu)建IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體，與犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗聯(lián)合，通過體外和體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，評估其對疫苗免疫效果的提升，包括病毒抗體水平、細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)等方面的變化；二是明確IL-2和IL-7基因聯(lián)合作用時，對淋巴細(xì)胞增殖、免疫細(xì)胞活化以及細(xì)胞因子分泌等免疫調(diào)節(jié)過程的具體影響機(jī)制。本研究具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價值。在理論層面，有助于深入了解IL-2與IL-7基因在犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗免疫過程中的協(xié)同作用機(jī)制，豐富基因免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域的理論知識，為其他病毒疫苗的免疫增強(qiáng)研究提供新思路和理論依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，若能證實(shí)IL-2與IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗具有顯著的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用，將為優(yōu)化犬細(xì)小病毒疫苗提供切實(shí)可行的方案，提高疫苗的免疫效果，增強(qiáng)幼犬對犬細(xì)小病毒的抵抗力，從而有效降低犬細(xì)小病毒病的發(fā)病率和死亡率，減少養(yǎng)犬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，保障寵物犬的健康和福利。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動物選用6-8周齡的SPF級BALB/c小鼠60只，體重18-22g，購自[供應(yīng)商名稱]實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證號]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的屏障環(huán)境動物房內(nèi)，自由采食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。健康成年犬40只，雌雄各半，體重5-8kg，購自[養(yǎng)殖場名稱]。實(shí)驗(yàn)前對所有犬進(jìn)行健康檢查，包括體溫、血常規(guī)、糞便檢查等，確保犬只無犬細(xì)小病毒感染及其他傳染性疾病。犬只飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)場地名稱]，每只犬單獨(dú)飼養(yǎng)，給予充足的清潔飲水和營養(yǎng)均衡的犬糧，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔衛(wèi)生，定期進(jìn)行消毒。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器構(gòu)建載體所需的質(zhì)粒pVAX1購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；DNAMarker、DL2000購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；PrimeSTARHSDNAPolymerase購自TaKaRa公司。制備疫苗所需的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自QIAGEN公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自Invitrogen公司。檢測免疫指標(biāo)所需的犬細(xì)小病毒VP2蛋白ELISA檢測試劑盒購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]；小鼠IL-2、IL-7、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒購自[試劑盒供應(yīng)商名稱]；流式細(xì)胞術(shù)檢測所需的熒光標(biāo)記抗體CD3、CD4、CD8、CD19等購自BDBiosciences公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司。其他試劑包括無水乙醇、異丙醇、氯仿、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等均為國產(chǎn)分析純試劑。實(shí)驗(yàn)儀器包括PCR儀（Bio-Rad公司）、核酸電泳儀（北京六一儀器廠）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）、離心機(jī)（Eppendorf公司）、酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司）、流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司）等。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體的構(gòu)建從健康成年犬的脾臟組織中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank中犬IL-2和IL-7基因的序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時，在上下游引物的5'端分別引入EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)，并添加保護(hù)堿基。以cDNA為模板，使用PrimeSTARHSDNAPolymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2μL，上下游引物（10μM）各1μL，dNTPs（2.5mM）4μL，PrimeSTARHSBuffer（5×）5μL，PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。將擴(kuò)增得到的IL-2和IL-7基因片段分別進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的IL-2和IL-7基因片段與pVAX1質(zhì)粒分別用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為：目的片段或質(zhì)粒5μL，EcoRI1μL，HindIII1μL，10×Buffer2μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。37℃酶切3h。酶切后的產(chǎn)物再次進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切后的目的片段和pVAX1質(zhì)粒。使用T4DNA連接酶將酶切后的IL-2和IL-7基因片段依次連接到pVAX1質(zhì)粒上。連接反應(yīng)體系為：酶切后的pVAX1質(zhì)粒1μL，IL-2基因片段3μL，T4DNALigase1μL，10×T4DNALigaseBuffer2μL，ddH?O補(bǔ)足至20μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16h。從平板上挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)體系和條件與擴(kuò)增IL-2和IL-7基因時相同。將PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切鑒定，酶切體系和條件同上。最后，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行序列測定。通過與GenBank中犬IL-2和IL-7基因的序列進(jìn)行比對，驗(yàn)證構(gòu)建的共表達(dá)載體是否正確。2.2.2犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗和共表達(dá)載體的制備與鑒定將含有犬細(xì)小病毒VP2基因的重組質(zhì)粒pVAX1-VP2和構(gòu)建好的IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體pVAX1-IL-2/IL-7分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12-16h。從平板上挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h。使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒大量提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒pVAX1-VP2和pVAX1-IL-2/IL-7分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前24h，將293T細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine3000說明書進(jìn)行操作。將質(zhì)粒與Lipofectamine3000分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者混合，室溫孵育15min。將混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后6h，更換為含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用PBS洗滌3次，然后加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min。12000rpm離心15min，取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液中的蛋白濃度。將上清液進(jìn)行SDS電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，然后加入鼠抗犬細(xì)小病毒VP2蛋白單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（1:5000稀釋），室溫孵育1h。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。如果在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗和共表達(dá)載體成功表達(dá)。2.2.3體外免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與執(zhí)行將犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗（pVAX1-VP2）、IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體（pVAX1-IL-2/IL-7）以及兩者的混合物（pVAX1-VP2+pVAX1-IL-2/IL-7）分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染至狗肺細(xì)胞（MDCK）或狗腸道細(xì)胞（CCL-81）中。同時設(shè)置空白對照組（只轉(zhuǎn)染Lipofectamine3000）和陰性對照組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pVAX1）。轉(zhuǎn)染前24h，將細(xì)胞以1×10?個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入1mL含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine3000說明書進(jìn)行操作。將質(zhì)粒與Lipofectamine3000分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者混合，室溫孵育15min。將混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后6h，更換為含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。使用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清液中犬細(xì)小病毒VP2抗體的水平。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。將細(xì)胞用PBS洗滌3次，然后加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min。12000rpm離心15min，取上清液。使用ELISA試劑盒測定上清液中IL-2、IL-7、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的水平。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。為了檢測細(xì)胞免疫水平，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用PBS洗滌3次。加入適量的胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄上清液。用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入適量的熒光標(biāo)記抗體CD3、CD4、CD8等，4℃避光孵育30min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次1000rpm離心5min。最后，用500μLPBS重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。2.2.4體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與執(zhí)行將40只健康成年犬隨機(jī)分為4組，每組10只。第一組為VP2DNA疫苗組，肌肉注射犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗（pVAX1-VP2），劑量為100μg/只；第二組為共表達(dá)載體組，肌肉注射IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體（pVAX1-IL-2/IL-7），劑量為100μg/只；第三組為VP2+IL-2/IL-7組，肌肉注射犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗（pVAX1-VP2）和IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體（pVAX1-IL-2/IL-7）的混合物，劑量均為100μg/只；第四組為對照組，肌肉注射等量的PBS。免疫前，對所有犬進(jìn)行體溫測量、血常規(guī)檢查和糞便檢查，確保犬只健康。免疫后，每天觀察犬只的精神狀態(tài)、食欲、體溫等情況，連續(xù)觀察7天。在免疫后的第0、7、14、21、28天，分別采集犬只的血液樣本，分離血清。使用ELISA試劑盒測定血清中犬細(xì)小病毒VP2抗體的水平。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。在免疫后的第28天，采集犬只的脾臟和淋巴結(jié)組織，制備單細(xì)胞懸液。使用ELISA試劑盒測定單細(xì)胞懸液中IL-2、IL-7、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的水平。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。為了檢測細(xì)胞免疫水平，將單細(xì)胞懸液用PBS洗滌3次。加入適量的熒光標(biāo)記抗體CD3、CD4、CD8、CD19等，4℃避光孵育30min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次1000rpm離心5min。最后，用500μLPBS重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1共表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果通過PCR擴(kuò)增，成功獲得了預(yù)期大小的犬IL-2和IL-7基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，IL-2基因片段大小約為500bp，IL-7基因片段大小約為450bp，與理論值相符，條帶清晰且特異性良好，無明顯雜帶（圖1）。將擴(kuò)增得到的基因片段與pVAX1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上長出了單菌落。挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和PCR鑒定，結(jié)果顯示，陽性克隆均能擴(kuò)增出與目的基因大小一致的條帶（圖2）。對PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見與預(yù)期大小相符的線性化pVAX1質(zhì)粒條帶以及IL-2和IL-7基因片段條帶（圖3），進(jìn)一步證實(shí)了目的基因已成功插入到pVAX1質(zhì)粒中。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與GenBank中犬IL-2和IL-7基因的序列進(jìn)行比對，同源性均達(dá)到99%以上，且無堿基突變和移碼突變，表明成功構(gòu)建了IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體pVAX1-IL-2/IL-7。為了驗(yàn)證共表達(dá)載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況，將pVAX1-IL-2/IL-7轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，48h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。使用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中IL-2和IL-7的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pVAX1-IL-2/IL-7的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2和IL-7的含量均顯著高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pVAX1的對照組（P<0.05），表明構(gòu)建的共表達(dá)載體能夠介導(dǎo)IL-2與IL-7基因在真核細(xì)胞中同步分泌表達(dá)。此外，通過Westernblot檢測細(xì)胞裂解液中IL-2和IL-7蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果在相應(yīng)位置出現(xiàn)了特異性條帶，進(jìn)一步證實(shí)了共表達(dá)載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)（圖4）。3.2體外免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體外免疫實(shí)驗(yàn)中，對不同處理組的細(xì)胞和培養(yǎng)上清液進(jìn)行了病毒抗體水平及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測，以評估IL-2和IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用。使用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清液中犬細(xì)小病毒VP2抗體的水平，結(jié)果如圖5所示。與空白對照組和陰性對照組相比，單獨(dú)轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測到了一定水平的VP2抗體，表明VP2DNA疫苗能夠在體外刺激細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)染pVAX1-IL-2/IL-7共表達(dá)載體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VP2抗體水平略有升高，但差異不顯著（P>0.05）。而轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2+pVAX1-IL-2/IL-7混合物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VP2抗體水平顯著高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2的組（P<0.05），比單獨(dú)轉(zhuǎn)染pVAX1-IL-2/IL-7的組也有明顯提升（P<0.05），這說明IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體與VP2DNA疫苗聯(lián)合使用，能夠顯著增強(qiáng)體外細(xì)胞對VP2抗體的分泌，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用。對細(xì)胞裂解液中IL-2、IL-7、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的水平檢測結(jié)果表明（圖6），轉(zhuǎn)染pVAX1-IL-2/IL-7共表達(dá)載體的細(xì)胞上清液中IL-2和IL-7的含量顯著高于其他組（P<0.05），這與共表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)結(jié)果一致，證明了共表達(dá)載體能夠有效表達(dá)IL-2和IL-7細(xì)胞因子。轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2+pVAX1-IL-2/IL-7混合物的細(xì)胞上清液中IFN-γ和TNF-α的水平顯著高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2和pVAX1-IL-2/IL-7的組（P<0.05）。IFN-γ和TNF-α是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，它們的升高表明IL-2和IL-7基因與VP2DNA疫苗聯(lián)合使用，能夠激活細(xì)胞免疫相關(guān)的信號通路，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD3、CD4、CD8的表達(dá)情況，以評估細(xì)胞免疫水平（圖7）。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2+pVAX1-IL-2/IL-7混合物的細(xì)胞中，CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例顯著高于其他組（P<0.05）。CD3是T細(xì)胞的表面標(biāo)志物，CD4+T細(xì)胞主要參與輔助免疫應(yīng)答，CD8+T細(xì)胞則具有細(xì)胞毒性，能夠直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞。這些細(xì)胞比例的升高進(jìn)一步證實(shí)了IL-2和IL-7基因與VP2DNA疫苗聯(lián)合使用能夠增強(qiáng)體外細(xì)胞的細(xì)胞免疫水平，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。3.3體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果在體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)中，密切觀察并記錄了不同組犬注射后的各項(xiàng)生理指標(biāo)和免疫反應(yīng)數(shù)據(jù)，以全面評估IL-2和IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗免疫效果的影響。在體溫和毒素反應(yīng)方面，免疫后每天對犬只的體溫進(jìn)行測量，并觀察其精神狀態(tài)、食欲等情況。結(jié)果顯示，對照組注射PBS后，犬只體溫始終保持在正常范圍（38-39℃），精神狀態(tài)良好，食欲正常，未出現(xiàn)明顯的毒素反應(yīng)。VP2DNA疫苗組在注射后的第1-2天，部分犬只出現(xiàn)體溫輕度升高的現(xiàn)象，最高體溫達(dá)到39.5℃，但均在24小時內(nèi)恢復(fù)正常，同時伴有短暫的精神萎靡和食欲下降，之后逐漸恢復(fù)正常，未出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等嚴(yán)重毒素反應(yīng)。共表達(dá)載體組注射后，犬只體溫和精神狀態(tài)、食欲等基本無明顯變化，與對照組相似。VP2+IL-2/IL-7組在注射后的第1天，少數(shù)犬只體溫略有升高，最高為39.3℃，持續(xù)時間不超過12小時，隨后恢復(fù)正常，精神狀態(tài)和食欲在短暫波動后也迅速恢復(fù)，同樣未出現(xiàn)嚴(yán)重的毒素反應(yīng)。整體來看，各實(shí)驗(yàn)組犬只在免疫后出現(xiàn)的體溫和毒素反應(yīng)均在可接受范圍內(nèi)，且VP2+IL-2/IL-7組的反應(yīng)程度相對較輕，持續(xù)時間較短。對不同時間采集的犬只血清進(jìn)行犬細(xì)小病毒VP2抗體水平檢測，結(jié)果如圖8所示。在免疫后的第0天，各組犬只血清中VP2抗體水平均處于較低水平，無顯著差異（P>0.05）。隨著免疫時間的推移，VP2DNA疫苗組的VP2抗體水平逐漸升高，在第21天達(dá)到一個相對較高的水平，之后略有上升并趨于穩(wěn)定。共表達(dá)載體組的VP2抗體水平雖有一定升高，但始終顯著低于VP2DNA疫苗組（P<0.05）。VP2+IL-2/IL-7組的VP2抗體水平在免疫后上升速度明顯快于VP2DNA疫苗組，在第14天就已超過VP2DNA疫苗組在第21天的水平，且在第28天達(dá)到了更高的水平，與VP2DNA疫苗組相比差異極顯著（P<0.01）。這表明IL-2和IL-7基因與VP2DNA疫苗聯(lián)合使用，能夠顯著提高犬只體內(nèi)VP2抗體的產(chǎn)生水平和速度。在細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)方面，免疫后第28天采集犬只的脾臟和淋巴結(jié)組織，制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測。ELISA試劑盒檢測結(jié)果顯示（圖9），VP2+IL-2/IL-7組單細(xì)胞懸液中IL-2、IL-7、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的水平均顯著高于VP2DNA疫苗組和共表達(dá)載體組（P<0.05）。IL-2和IL-7細(xì)胞因子水平的升高與共表達(dá)載體的作用密切相關(guān)，而IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子水平的顯著升高則進(jìn)一步證明了IL-2和IL-7基因與VP2DNA疫苗聯(lián)合使用能夠有效激活細(xì)胞免疫，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD3、CD4、CD8、CD19的表達(dá)情況，結(jié)果如圖10所示。VP2+IL-2/IL-7組中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例顯著高于VP2DNA疫苗組和共表達(dá)載體組（P<0.05），表明聯(lián)合免疫能夠促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。VP2+IL-2/IL-7組中CD19+B細(xì)胞的比例也有所升高，雖與VP2DNA疫苗組相比差異不顯著（P>0.05），但從趨勢上看，聯(lián)合免疫對B細(xì)胞的活化和增殖也有一定的促進(jìn)作用，有助于增強(qiáng)體液免疫功能。四、分析與討論4.1IL-2和IL-7基因?qū)σ呙缑庖咴鰪?qiáng)的單獨(dú)作用從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，單獨(dú)接種IL-2VP2DNA疫苗時，在體外免疫實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測到一定水平的VP2抗體，而轉(zhuǎn)染pVAX1-IL-2/IL-7共表達(dá)載體（主要表達(dá)IL-2和IL-7）的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VP2抗體水平略有升高，雖差異不顯著，但仍可看出IL-2基因有促進(jìn)VP2抗體產(chǎn)生的趨勢。在體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)中，VP2DNA疫苗組在免疫后VP2抗體水平逐漸升高，而共表達(dá)載體組（主要含IL-2基因）的VP2抗體水平雖有升高，但始終顯著低于VP2DNA疫苗組。這表明單獨(dú)的IL-2基因?qū)P2抗體的產(chǎn)生有一定促進(jìn)作用，但效果不如VP2DNA疫苗單獨(dú)作用明顯。IL-2主要由T輔助細(xì)胞產(chǎn)生，它能夠活化T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化。在疫苗免疫過程中，IL-2可以激活T淋巴細(xì)胞，使其更好地識別VP2抗原，進(jìn)而促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和分化，產(chǎn)生更多的VP2抗體。但由于單獨(dú)的IL-2基因表達(dá)，缺乏VP2抗原的持續(xù)刺激，所以抗體產(chǎn)生水平相對較低。單獨(dú)接種IL-7VP2DNA疫苗時，體外免疫實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到轉(zhuǎn)染含IL-7基因的共表達(dá)載體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VP2抗體水平有上升趨勢。體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)里，共表達(dá)載體組（主要含IL-7基因）的VP2抗體水平也有所升高，但低于VP2DNA疫苗組。IL-7作為干細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖和分化，為淋巴細(xì)胞提供生存信號。在疫苗免疫中，IL-7可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和成熟，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對VP2抗原的反應(yīng)能力，從而有助于VP2抗體的產(chǎn)生。然而，與VP2DNA疫苗單獨(dú)免疫相比，單獨(dú)IL-7基因的作用相對有限，可能是因?yàn)镮L-7雖然能增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的基礎(chǔ)功能，但缺乏VP2抗原特異性的免疫刺激，無法充分激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答。4.2IL-2和IL-7基因?qū)σ呙绲膮f(xié)同免疫增強(qiáng)作用聯(lián)合接種IL-2和IL-7VP2DNA疫苗時，體內(nèi)外免疫實(shí)驗(yàn)均展現(xiàn)出顯著的協(xié)同免疫增強(qiáng)效應(yīng)。在體外免疫實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2+pVAX1-IL-2/IL-7混合物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VP2抗體水平顯著高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染pVAX1-VP2和pVAX1-IL-2/IL-7的組。這是因?yàn)镮L-2和IL-7的聯(lián)合作用，一方面，IL-2激活T淋巴細(xì)胞后，增強(qiáng)了T細(xì)胞對VP2抗原的識別和呈遞能力，使得更多的T輔助細(xì)胞能夠輔助B淋巴細(xì)胞活化。另一方面，IL-7促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和成熟，增加了具有免疫活性的淋巴細(xì)胞數(shù)量。兩者協(xié)同作用，使得B淋巴細(xì)胞能夠更高效地分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生更多的VP2抗體。同時，該組細(xì)胞上清液中IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的水平顯著升高。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力，還能促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化和增殖；TNF-α則可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，吸引免疫細(xì)胞聚集到感染部位，增強(qiáng)免疫防御。IL-2和IL-7聯(lián)合刺激，激活了免疫細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號通路，促進(jìn)了這些免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步增強(qiáng)了免疫應(yīng)答。在體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)中，VP2+IL-2/IL-7組犬只血清中VP2抗體水平在免疫后上升速度明顯快于VP2DNA疫苗組，且在第28天達(dá)到了更高的水平。這表明IL-2和IL-7基因聯(lián)合使用，能夠更有效地激發(fā)犬只體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答，使機(jī)體更快、更多地產(chǎn)生VP2抗體。從細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)來看，VP2+IL-2/IL-7組單細(xì)胞懸液中IL-2、IL-7、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子的水平均顯著高于其他組。IL-2和IL-7的聯(lián)合表達(dá)，持續(xù)為免疫細(xì)胞提供活化和增殖的信號，使得免疫細(xì)胞能夠持續(xù)分泌多種細(xì)胞因子，維持和增強(qiáng)免疫應(yīng)答。該組中CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例顯著升高，表明聯(lián)合免疫能夠極大地促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。IL-2和IL-7分別從不同方面作用于T細(xì)胞，IL-2促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，IL-7則促進(jìn)T細(xì)胞的發(fā)育和成熟，兩者協(xié)同，全面提升了T細(xì)胞的免疫功能。CD19+B細(xì)胞的比例也有所升高，說明聯(lián)合免疫對B細(xì)胞的活化和增殖也有一定的促進(jìn)作用，有助于增強(qiáng)體液免疫功能。綜合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，IL-2和IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗具有顯著的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用，通過多方面調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，提高了疫苗的免疫效果。4.3研究結(jié)果對犬細(xì)小病毒防控的意義本研究結(jié)果為犬細(xì)小病毒（CPV）感染的防治提供了全新的思路和策略。傳統(tǒng)的CPV疫苗在免疫效果上存在一定的局限性，部分幼犬接種后免疫反應(yīng)不足，仍易感染CPV。而本研究中，IL-2和IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗展現(xiàn)出顯著的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用。這一發(fā)現(xiàn)提示，可以將IL-2和IL-7基因作為免疫增強(qiáng)劑，與VP2DNA疫苗聯(lián)合使用，開發(fā)新型的CPV疫苗。通過這種方式，有望克服傳統(tǒng)疫苗的免疫缺陷，提高幼犬對CPV的抵抗力，降低CPV感染的發(fā)病率和死亡率。例如，在實(shí)際應(yīng)用中，可以將構(gòu)建好的IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體與VP2DNA疫苗按照一定比例混合，制備成聯(lián)合疫苗。這種聯(lián)合疫苗能夠同時激活機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性和功能，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，從而為幼犬提供更全面、更有效的免疫保護(hù)。從優(yōu)化傳統(tǒng)疫苗的角度來看，本研究結(jié)果具有潛在的重要價值。目前市場上的CPV疫苗多為傳統(tǒng)的滅活疫苗或弱毒疫苗，這些疫苗在生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用過程中存在諸多問題。滅活疫苗的免疫原性相對較弱，需要多次接種才能達(dá)到較好的免疫效果，且可能存在滅活不完全導(dǎo)致的安全隱患。弱毒疫苗雖然免疫原性較強(qiáng)，但存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險，可能導(dǎo)致接種犬感染發(fā)病。本研究中IL-2和IL-7基因與VP2DNA疫苗的協(xié)同作用，為優(yōu)化傳統(tǒng)疫苗提供了新的方向?？梢越梃b這種基因增強(qiáng)的策略，對傳統(tǒng)疫苗進(jìn)行改進(jìn)。例如，在傳統(tǒng)疫苗的制備過程中，引入IL-2和IL-7基因，使其在疫苗接種后能夠在犬體內(nèi)表達(dá)，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。這樣不僅可以減少疫苗的接種次數(shù)，降低生產(chǎn)成本，還能提高疫苗的安全性和有效性。同時，這種優(yōu)化后的疫苗在運(yùn)輸和保存過程中也可能具有更好的穩(wěn)定性，更便于在實(shí)際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。4.4研究的局限性與展望本研究在探究IL-2與IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用過程中，取得了一定的成果，但也存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，雖然本研究設(shè)置了多個實(shí)驗(yàn)組和對照組，涵蓋了體外免疫實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，但對于基因表達(dá)載體的選擇相對單一，僅采用了pVAX1質(zhì)粒作為構(gòu)建共表達(dá)載體的基礎(chǔ)。不同的質(zhì)粒載體可能具有不同的表達(dá)效率、穩(wěn)定性以及對宿主細(xì)胞的影響。在后續(xù)研究中，可以嘗試使用多種不同特性的質(zhì)粒載體，如具有更高表達(dá)效率的載體、能夠靶向特定細(xì)胞類型的載體等，進(jìn)一步優(yōu)化基因表達(dá)系統(tǒng)，提高IL-2和IL-7基因的表達(dá)水平和效果。樣本數(shù)量也是本研究的一個局限性。在體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)中，僅選用了40只健康成年犬進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。犬的個體差異較大，較小的樣本數(shù)量可能無法全面反映IL-2和IL-7基因?qū)Σ煌瑐€體犬的免疫增強(qiáng)作用。未來研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)犬的樣本數(shù)量，涵蓋不同品種、年齡、性別和健康狀況的犬，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和普適性。還可以考慮進(jìn)行多中心的臨床試驗(yàn)，在不同地區(qū)、不同環(huán)境條件下進(jìn)行研究，以更好地評估聯(lián)合疫苗在實(shí)際應(yīng)用中的效果。本研究主要聚焦于IL-2和IL-7基因?qū)P2DNA疫苗免疫效果的影響，對于其他可能具有免疫增強(qiáng)作用的細(xì)胞因子或基因的研究相對較少。在免疫系統(tǒng)中，存在多種細(xì)胞因子和基因相互作用，共同調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。未來可以進(jìn)一步探索其他細(xì)胞因子，如IL-12、IL-15等，與IL-2和IL-7基因聯(lián)合使用對VP2DNA疫苗免疫增強(qiáng)的效果。也可以研究不同基因組合之間的協(xié)同作用機(jī)制，為開發(fā)更高效的疫苗免疫增強(qiáng)策略提供更多的選擇。展望未來，深入研究IL-2和IL-7基因在犬細(xì)小病毒感染中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制是關(guān)鍵方向之一。雖然本研究已經(jīng)觀察到IL-2和IL-7基因?qū)P2DNA疫苗具有協(xié)同免疫增強(qiáng)作用，但對于其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探究?？梢岳矛F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等，全面分析IL-2和IL-7基因?qū)γ庖呒?xì)胞內(nèi)信號通路、基因表達(dá)譜等方面的影響。通過這些研究，能夠更深入地了解IL-2和IL-7基因在免疫調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制，為優(yōu)化疫苗設(shè)計(jì)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。進(jìn)一步評估IL-2和IL-7基因聯(lián)合VP2DNA疫苗在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性也是未來研究的重要內(nèi)容。在實(shí)際應(yīng)用中，疫苗的安全性是至關(guān)重要的。需要進(jìn)行長期的動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，觀察聯(lián)合疫苗在不同年齡段、不同健康狀況犬只中的不良反應(yīng)和安全性指標(biāo)。還需要評估聯(lián)合疫苗在大規(guī)模犬群中的免疫效果，包括疫苗的保護(hù)率、免疫持續(xù)時間等。只有在確保聯(lián)合疫苗安全有效的前提下，才能將其廣泛應(yīng)用于犬細(xì)小病毒的防控中。五、結(jié)論本研究通過構(gòu)建IL-2和IL-7基因共表達(dá)載體，并與犬細(xì)小病毒VP2DNA疫苗聯(lián)合進(jìn)行體外和體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地評估了IL-2與IL-7基因?qū)P2DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-2和IL-7基因?qū)θ?xì)小病毒VP2DNA疫苗具有顯著的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用。聯(lián)合接種IL-2和IL-7VP2DNA疫苗時，在體外免疫實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VP2抗體水平顯著升高，IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子的分泌增加，CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例顯著上升；在體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)中，犬只血清中VP2抗體水平上升速度更快且達(dá)到更高水平，脾臟和淋巴結(jié)組織單細(xì)胞懸液中多種細(xì)胞因子水平顯著升高，T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和增殖也得到促進(jìn)。這些研究結(jié)果為犬細(xì)小病毒的防控提供了新的策略和方法，證明了IL-2和IL-7基因聯(lián)合應(yīng)用作為免疫增強(qiáng)劑與VP2DNA疫苗聯(lián)合使用的可行性和有效性，有望為開發(fā)新型、高效的犬細(xì)小病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。盡管本研究存在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣本數(shù)量等方面的局限性，但為后續(xù)研究指明了方向，未來應(yīng)進(jìn)一步深入探究IL-2和IL-7基因在犬細(xì)小病毒感染中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，評估其在臨床應(yīng)用中的安全性和有效性，以推動犬細(xì)小病毒病防治技術(shù)的發(fā)展。六、參考文獻(xiàn)[1]BuonavogliaD,BuonavogliaC.Canineparvovirus:Virology,PathogenesisandImmunity[J].VetJ,2012,187(1):23-27.[2]RomzekN,etal.IL-2/IL-7-induciblefactorspioneerthepathtoTcellidentity[J].TrendsImmunol,2017,38(4):270-271.[3]FrobertE,etal.IL-7isabystanderregulatorofthymocytes[J].JImmunol,2007,178(11):6516-6520.[4]SunL,etal.ReconstitutionofhematopoieticsystemwithgeneticallymodifiedIL-7andIL-15expressingOP9cellline[J].CellImmunol,2017,318:1-7.[5]MauroC,et