WNT5A/ROR2信號(hào)通路：解鎖卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制與治療新策略一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中極為常見且危害嚴(yán)重的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康與生活質(zhì)量。在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率統(tǒng)計(jì)中，卵巢癌僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，位居第三，但其死亡率卻高居榜首。卵巢癌早期通常缺乏明顯癥狀，這使得疾病難以在早期被察覺，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期階段。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%的卵巢癌患者在初次診斷時(shí)就已發(fā)展至晚期，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)。卵巢癌的危害是多方面的。在生理層面，隨著腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，卵巢癌會(huì)向周圍組織浸潤(rùn)或壓迫，進(jìn)而引發(fā)腹痛、腰痛或下肢疼痛等癥狀。腫瘤的消耗還會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)消瘦、貧血、惡病質(zhì)等表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的身體機(jī)能。若癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肺部，可引發(fā)呼吸困難、咳嗽咳痰等呼吸系統(tǒng)癥狀；轉(zhuǎn)移至肝臟，則會(huì)出現(xiàn)惡心嘔吐、黃疸、肝脾腫大、腹水等肝臟相關(guān)癥狀。在心理層面，卵巢癌的診斷和治療過程給患者帶來了沉重的心理負(fù)擔(dān)，患者常常面臨焦慮、恐懼、抑郁等負(fù)面情緒，生活質(zhì)量急劇下降。不僅如此，卵巢癌還會(huì)對(duì)患者的家庭和社會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，高昂的醫(yī)療費(fèi)用給家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，患者的患病也會(huì)對(duì)家庭成員的心理和生活造成不同程度的沖擊。目前，卵巢癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療以及靶向治療等多種手段。然而，由于卵巢癌具有惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、化療抵抗性強(qiáng)等特點(diǎn)，這些傳統(tǒng)治療方式面臨著諸多挑戰(zhàn)。盡管手術(shù)可以盡可能切除腫瘤組織，但對(duì)于一些微小的轉(zhuǎn)移灶和隱匿的癌細(xì)胞，手術(shù)往往難以徹底清除，這為腫瘤的復(fù)發(fā)埋下了隱患。化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，使得部分患者難以耐受化療，影響治療效果。放療雖然能夠?qū)植磕[瘤進(jìn)行照射，但同樣存在對(duì)正常組織的損傷以及治療范圍有限等問題。靶向治療雖然具有一定的針對(duì)性，但并非對(duì)所有患者都有效，且存在耐藥性等問題。因此，當(dāng)前卵巢癌的治療效果仍不盡人意，患者的5年生存率僅為30%左右，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，以提高卵巢癌的治療效果和患者的生存率。WNT5A/ROR2信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)等生理過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。近年來，越來越多的研究表明，WNT5A/ROR2信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著關(guān)鍵角色。在卵巢癌中，該信號(hào)通路的異常激活或表達(dá)失調(diào)與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及血管生成等生物學(xué)行為密切相關(guān)。深入研究WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌中的作用機(jī)制，不僅有助于我們進(jìn)一步揭示卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，還為卵巢癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估以及靶向治療提供了新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。通過對(duì)該信號(hào)通路的深入了解，我們有望開發(fā)出更加精準(zhǔn)、有效的治療方法，為卵巢癌患者帶來新的希望，改善患者的生存狀況，提高其生活質(zhì)量。因此，研究WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)WNT5A/ROR2信號(hào)通路與卵巢癌的研究開展得較早且深入。有研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)WNT5A在卵巢癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常卵巢組織，并且其高表達(dá)與卵巢癌的臨床分期、病理分級(jí)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)WNT5A的表達(dá)能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，而下調(diào)其表達(dá)則會(huì)抑制這些惡性生物學(xué)行為。通過對(duì)ROR2基因敲除或過表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，也證實(shí)了ROR2在卵巢癌發(fā)展中的關(guān)鍵作用，它能夠與WNT5A相互作用，激活下游的相關(guān)信號(hào)分子，如JNK、PKC等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在卵巢癌血管生成方面，國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Wnt5a作為一種血管生成促進(jìn)因子，在卵巢癌血管生成中扮演著重要的角色。在卵巢癌細(xì)胞中，Wnt5a能夠通過放大前列腺素E2（PGE2）/對(duì)丙硫氧嘧啶（Celecoxib）信號(hào)、激活芽突反應(yīng)分子（Twist）、增強(qiáng)VEGF信號(hào)等多種機(jī)制增加血管生成能力。具體地，Wnt5a能夠激活VEGFR2，并通過放大VEGF信號(hào)進(jìn)一步促進(jìn)血管生成。此外，Wnt5a還能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，從而促進(jìn)血管生成。然而，Wnt5a在卵巢癌血管生成中所起的作用并非完全一致。在某些條件下，Wnt5a也可能會(huì)抑制卵巢癌血管生成，如在Wnt5a低表達(dá)的情況下。國(guó)內(nèi)的研究也在不斷跟進(jìn)并取得了一系列成果。一些團(tuán)隊(duì)通過臨床樣本檢測(cè)，同樣驗(yàn)證了WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌中的異常激活，并探討了其與患者預(yù)后的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)通路的激活程度越高，患者的生存期越短，預(yù)后越差。在機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者深入探究了WNT5A/ROR2信號(hào)通路與其他相關(guān)信號(hào)通路之間的交互作用，如與PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路的相互影響，揭示了其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。有研究表明，在卵巢癌細(xì)胞中，Wnt5a可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的粘附，這可能會(huì)導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞在周圍組織中間移動(dòng)，并在此過程中釋放信號(hào)分子來刺激血管生成。盡管國(guó)內(nèi)外在WNT5A/ROR2信號(hào)通路與卵巢癌的研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足。目前對(duì)于該信號(hào)通路在卵巢癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是在不同病理類型和不同臨床分期的卵巢癌中，信號(hào)通路的激活方式和調(diào)控機(jī)制可能存在差異，這方面的研究還較為欠缺。此外，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些該信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)和相關(guān)分子，但對(duì)于它們之間的具體相互作用和調(diào)控關(guān)系，仍需要進(jìn)一步深入研究。在臨床應(yīng)用方面，如何將對(duì)WNT5A/ROR2信號(hào)通路的研究成果轉(zhuǎn)化為有效的診斷和治療手段，目前還處于探索階段，缺乏大規(guī)模的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入揭示W(wǎng)NT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及內(nèi)在分子機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義：收集卵巢癌患者的癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織樣本，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和免疫組織化學(xué)（IHC）等技術(shù)，檢測(cè)WNT5A和ROR2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與卵巢癌患者的臨床病理特征（如腫瘤分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）以及預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。同時(shí)，選取多種卵巢癌細(xì)胞系，如SKOV3、A2780等，檢測(cè)WNT5A/ROR2信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)水平，并與正常卵巢上皮細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比，明確該信號(hào)通路在卵巢癌細(xì)胞中的激活狀態(tài)。WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建WNT5A過表達(dá)和ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞模型，以及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞模型。運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力；采用Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力；利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡情況。此外，通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞在體內(nèi)成瘤能力和腫瘤生長(zhǎng)速度的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證該信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌中的作用機(jī)制研究：運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（如iTRAQ、TMT等）和生物信息學(xué)分析，篩選出WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌中的潛在下游靶點(diǎn)和相關(guān)分子。通過基因沉默、過表達(dá)等技術(shù)手段，驗(yàn)證這些靶點(diǎn)和分子與WNT5A/ROR2信號(hào)通路的相互作用關(guān)系，并深入探究其在調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為中的具體作用機(jī)制。此外，研究WNT5A/ROR2信號(hào)通路與其他已知的卵巢癌相關(guān)信號(hào)通路（如PI3K/AKT、MAPK等）之間的交互作用，揭示其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。WNT5A/ROR2信號(hào)通路作為卵巢癌治療靶點(diǎn)的可行性探索：基于對(duì)WNT5A/ROR2信號(hào)通路作用機(jī)制的研究，篩選和設(shè)計(jì)針對(duì)該信號(hào)通路的小分子抑制劑或生物制劑。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，評(píng)估這些抑制劑或生物制劑對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的抑制效果，以及對(duì)腫瘤血管生成和腫瘤微環(huán)境的影響。同時(shí)，檢測(cè)抑制劑或生物制劑的安全性和毒副作用，初步探索WNT5A/ROR2信號(hào)通路作為卵巢癌治療靶點(diǎn)的可行性和潛在應(yīng)用價(jià)值。1.4研究方法與技術(shù)路線臨床樣本收集與檢測(cè)：收集[X]例卵巢癌患者在手術(shù)切除時(shí)的癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織樣本，詳細(xì)記錄患者的年齡、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理信息。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)WNT5A和ROR2在mRNA水平的表達(dá)情況，通過對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度分析，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法，對(duì)組織樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取、分離和免疫印跡，檢測(cè)WNT5A和ROR2蛋白的表達(dá)水平，通過與內(nèi)參蛋白對(duì)比，分析其表達(dá)差異。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)組織切片進(jìn)行染色，觀察WNT5A和ROR2蛋白在組織中的定位和表達(dá)情況，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選取卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、A2780等以及正常卵巢上皮細(xì)胞系，在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將WNT5A過表達(dá)質(zhì)粒和ROR2siRNA分別轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞中，構(gòu)建WNT5A過表達(dá)和ROR2敲低的細(xì)胞模型，同時(shí)設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組。運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在不同時(shí)間點(diǎn)向培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑，孵育后檢測(cè)吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。采用EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞增殖情況，通過檢測(cè)EdU陽性細(xì)胞的比例，直觀反映細(xì)胞的DNA合成能力。利用Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在上室加入細(xì)胞懸液，下室加入含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，對(duì)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞進(jìn)行固定、染色和計(jì)數(shù)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)則通過在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)劃痕的愈合情況，量化細(xì)胞的遷移能力。利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡情況，通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，檢測(cè)不同時(shí)期細(xì)胞的比例以及凋亡細(xì)胞的數(shù)量，探究WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，將構(gòu)建好的穩(wěn)定表達(dá)WNT5A過表達(dá)或ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞，以每只裸鼠[X]個(gè)細(xì)胞的數(shù)量，接種于裸鼠的皮下。定期測(cè)量腫瘤的大小，計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行稱重、拍照，并通過免疫組織化學(xué)、qRT-PCR和Westernblot等技術(shù)，檢測(cè)腫瘤組織中WNT5A/ROR2信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)情況，以及腫瘤的增殖、凋亡、血管生成等相關(guān)指標(biāo)。機(jī)制研究：運(yùn)用iTRAQ或TMT等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)WNT5A過表達(dá)和ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和標(biāo)記，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。利用生物信息學(xué)分析，對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋、通路富集分析，預(yù)測(cè)WNT5A/ROR2信號(hào)通路的潛在下游靶點(diǎn)和相關(guān)分子。通過基因沉默、過表達(dá)等技術(shù)手段，對(duì)篩選出的靶點(diǎn)和分子進(jìn)行驗(yàn)證，采用siRNA轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，改變其表達(dá)水平，觀察對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響，以及對(duì)WNT5A/ROR2信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控作用。通過免疫共沉淀、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，進(jìn)一步探究靶點(diǎn)分子與WNT5A/ROR2信號(hào)通路關(guān)鍵分子之間的直接相互作用關(guān)系。采用Westernblot、免疫熒光等技術(shù)，研究WNT5A/ROR2信號(hào)通路與PI3K/AKT、MAPK等其他卵巢癌相關(guān)信號(hào)通路之間的交互作用，分析不同信號(hào)通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平和表達(dá)變化，揭示其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。治療靶點(diǎn)探索：基于對(duì)WNT5A/ROR2信號(hào)通路作用機(jī)制的研究，通過分子對(duì)接、虛擬篩選等方法，從化合物庫(kù)中篩選出針對(duì)該信號(hào)通路關(guān)鍵分子的小分子抑制劑?；蛘咴O(shè)計(jì)針對(duì)WNT5A或ROR2的生物制劑，如單克隆抗體、小干擾RNA等。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將篩選得到的抑制劑或生物制劑作用于卵巢癌細(xì)胞，通過CCK-8法、Transwell實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的抑制效果。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將抑制劑或生物制劑通過腹腔注射或瘤內(nèi)注射等方式給予荷瘤裸鼠，觀察對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，通過測(cè)量腫瘤體積、重量等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。同時(shí)，檢測(cè)抑制劑或生物制劑對(duì)腫瘤血管生成的影響，通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤組織中血管內(nèi)皮標(biāo)志物的表達(dá)情況，以及對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響，分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子表達(dá)等情況。此外，通過檢測(cè)血液生化指標(biāo)、組織病理學(xué)檢查等方法，評(píng)估抑制劑或生物制劑的安全性和毒副作用，初步探索WNT5A/ROR2信號(hào)通路作為卵巢癌治療靶點(diǎn)的可行性和潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，展示從臨床樣本收集、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)探索的整個(gè)研究流程，包括各步驟之間的關(guān)系和所采用的主要技術(shù)方法]二、WNT5A/ROR2信號(hào)通路概述2.1WNT5A的結(jié)構(gòu)與功能WNT5A基因位于人類染色體12q24.31上，其編碼的WNT5A蛋白屬于Wnt家族，是一種分泌型糖蛋白。WNT5A蛋白包含357個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為40kDa。在其結(jié)構(gòu)中，富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（Cysteine-richdomain，CRD）是一個(gè)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)特征，該結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)的N端，含有多個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基之間能夠形成二硫鍵，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并且對(duì)于WNT5A蛋白與受體的結(jié)合起著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，WNT5A蛋白還具有一些其他的保守結(jié)構(gòu)域，如Wnt家族特有的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域共同決定了WNT5A蛋白的生物學(xué)功能和特異性。WNT5A在細(xì)胞增殖、遷移、分化以及極性等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育過程中，WNT5A對(duì)多種組織和器官的形成與發(fā)育至關(guān)重要。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，WNT5A參與神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化，影響神經(jīng)細(xì)胞的命運(yùn)決定和神經(jīng)回路的構(gòu)建。在骨骼發(fā)育過程中，WNT5A調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性，對(duì)骨骼的生長(zhǎng)、形態(tài)塑造和骨量維持起著重要作用。研究表明，在胚胎小鼠的骨骼發(fā)育過程中，WNT5A基因敲除會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常，出現(xiàn)骨骼短小、形態(tài)畸形等問題。在成年個(gè)體中，WNT5A同樣參與組織修復(fù)和再生過程，如在皮膚損傷修復(fù)中，WNT5A能夠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，加速傷口愈合。在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，WNT5A的作用具有復(fù)雜性和多樣性，其功能表現(xiàn)取決于腫瘤的類型、微環(huán)境以及細(xì)胞背景等多種因素。在某些腫瘤中，WNT5A呈現(xiàn)出促癌作用。在結(jié)直腸癌中，WNT5A的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，WNT5A可以通過激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，如Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2?通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞極性，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。具體來說，WNT5A與受體結(jié)合后，激活下游的Rho家族小GTP酶，如RhoA、Rac1和Cdc42等，這些小GTP酶能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的聚合和解聚，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。同時(shí)，WNT5A還可以通過激活蛋白激酶C（PKC）和鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（CamKII）等信號(hào)分子，影響細(xì)胞的黏附和遷移行為。在乳腺癌中，WNT5A也被報(bào)道能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使得癌細(xì)胞能夠獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。WNT5A可以通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug和Twist等，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。然而，在另一些腫瘤中，WNT5A卻表現(xiàn)出抑癌作用。在前列腺癌的部分研究中，發(fā)現(xiàn)WNT5A能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。通過激活Hippo通路，WNT5A可以下調(diào)YAP1/TAZ活性，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。在黑色素瘤中，也有研究表明WNT5A能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。WNT5A可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期依賴性激酶的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，WNT5A還可以激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，減少腫瘤細(xì)胞的存活。2.2ROR2的結(jié)構(gòu)與功能ROR2全稱為受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2（receptortyrosinekinase-likeorphanreceptor2），其編碼基因位于人類染色體9q22.31位置。ROR2蛋白屬于受體酪氨酸激酶（Receptortyrosinekinases，RTKs）家族中的I-setdomaincontaining家族，是一種I型跨膜蛋白，由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域三部分組成。胞外結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)重要的結(jié)構(gòu)基序。其中，富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（CRD）能夠特異性地與Wnt家族蛋白中的配體結(jié)合，在WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活過程中起到關(guān)鍵的起始作用。研究表明，ROR2的CRD結(jié)構(gòu)域與WNT5A的結(jié)合具有高度的親和力和特異性，這種特異性結(jié)合是信號(hào)通路激活的基礎(chǔ)。同時(shí)，胞外結(jié)構(gòu)域還含有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（Ig-likedomain），該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持ROR2蛋白的空間構(gòu)象和穩(wěn)定性具有重要意義，并且可能參與調(diào)節(jié)ROR2與其他細(xì)胞表面分子的相互作用，進(jìn)一步影響信號(hào)傳導(dǎo)的特異性和效率。跨膜結(jié)構(gòu)域由一段疏水氨基酸序列組成，它將ROR2蛋白錨定在細(xì)胞膜上，起到連接胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的橋梁作用，確保信號(hào)能夠從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則包含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（Tyrosinekinasedomain，TKD），這是ROR2發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)功能的核心區(qū)域。當(dāng)ROR2與配體WNT5A結(jié)合后，其胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生自身磷酸化，從而激活下游的一系列信號(hào)分子，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。除了酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域還含有一些其他的調(diào)節(jié)性結(jié)構(gòu)域和氨基酸殘基，它們?cè)谛盘?hào)傳導(dǎo)過程中參與調(diào)節(jié)激酶的活性、與其他信號(hào)分子的相互作用以及信號(hào)通路的反饋調(diào)節(jié)等。例如，某些氨基酸殘基的磷酸化或去磷酸化可以影響ROR2與下游效應(yīng)分子的結(jié)合親和力，從而調(diào)節(jié)信號(hào)通路的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。ROR2在胚胎發(fā)育過程中扮演著不可或缺的角色，尤其是在骨骼和軟骨的形成與發(fā)育方面。在胚胎期，ROR2在軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中高度表達(dá)，參與調(diào)控這些細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎發(fā)育過程中，ROR2基因敲除會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼發(fā)育異常，表現(xiàn)為四肢短小、骨骼形態(tài)畸形以及軟骨內(nèi)骨化過程受阻等。具體機(jī)制可能與ROR2調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)，它可以通過激活下游的信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路，來促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而影響骨骼的生長(zhǎng)和發(fā)育。在腫瘤發(fā)生發(fā)展方面，ROR2的作用也備受關(guān)注。在部分腫瘤中，ROR2呈現(xiàn)出促癌作用。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)ROR2的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。ROR2可以通過激活下游的FAK/PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。具體來說，ROR2與配體結(jié)合后，激活FAK（粘著斑激酶），進(jìn)而激活PI3K（磷脂酰肌醇-3激酶），使AKT（蛋白激酶B）磷酸化，活化的AKT可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌中，ROR2也被報(bào)道能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。雖然ROR2主要參與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，但在某些情況下，它也可以與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相互作用。在結(jié)直腸癌中，ROR2可以通過與Frizzled受體和LRP5/6形成復(fù)合物，激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)位，從而上調(diào)與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，如c-myc、CyclinD1等。然而，在另一些腫瘤中，ROR2卻發(fā)揮著抑癌作用。在前列腺癌中，研究表明ROR2能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。通過上調(diào)ROR2的表達(dá)，可以抑制miR-199a-5p的表達(dá)，進(jìn)而增加PIAS3（蛋白抑制因子激活STAT3）的表達(dá)，PIAS3可以抑制AKT2的表達(dá)和磷酸化，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在黑色素瘤中，也有研究發(fā)現(xiàn)ROR2能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。ROR2可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期依賴性激酶的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，ROR2還可以激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，減少腫瘤細(xì)胞的存活。2.3WNT5A/ROR2信號(hào)通路的組成與激活機(jī)制WNT5A/ROR2信號(hào)通路主要由配體WNT5A、受體ROR2以及一系列下游信號(hào)分子組成。當(dāng)細(xì)胞外環(huán)境中存在一定濃度的WNT5A蛋白時(shí)，WNT5A作為配體，其富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（CRD）能夠與ROR2受體胞外的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，從而啟動(dòng)信號(hào)通路的激活過程。這種特異性結(jié)合是信號(hào)通路激活的關(guān)鍵起始步驟，決定了信號(hào)傳導(dǎo)的特異性和靶向性。在結(jié)合過程中，WNT5A與ROR2的結(jié)合親和力受到多種因素的影響，包括蛋白質(zhì)的構(gòu)象、周圍環(huán)境中的離子濃度、其他輔助分子的存在等。研究表明，某些小分子物質(zhì)或蛋白質(zhì)修飾可以調(diào)節(jié)WNT5A與ROR2的結(jié)合親和力，進(jìn)而影響信號(hào)通路的激活強(qiáng)度。一些細(xì)胞外基質(zhì)成分可能與WNT5A或ROR2相互作用，改變它們的空間構(gòu)象，從而間接影響兩者的結(jié)合。ROR2受體在與WNT5A結(jié)合后，會(huì)發(fā)生一系列的分子構(gòu)象變化。其胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（TKD）被激活，發(fā)生自身磷酸化。自身磷酸化后的ROR2能夠招募并激活下游的適配蛋白和信號(hào)分子，如生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）、鳥苷酸交換因子（SOS）等。這些適配蛋白和信號(hào)分子在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，將信號(hào)進(jìn)一步傳遞下去。Grb2與ROR2結(jié)合后，能夠招募SOS，SOS可以激活Ras蛋白，Ras蛋白作為一種小GTP酶，在結(jié)合GTP后被激活，進(jìn)而激活下游的Raf-MEK-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ROR2激活下游信號(hào)分子還涉及到一些其他的機(jī)制。ROR2可以通過與細(xì)胞膜上的其他分子相互作用，形成信號(hào)微結(jié)構(gòu)域，在這些微結(jié)構(gòu)域中，信號(hào)分子的濃度和相互作用效率得到提高，從而增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)。ROR2與一些支架蛋白結(jié)合，這些支架蛋白可以將多個(gè)信號(hào)分子聚集在一起，促進(jìn)它們之間的相互作用，加速信號(hào)的傳遞。此外，ROR2的激活還可能導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)組成發(fā)生變化，影響信號(hào)分子在膜上的定位和活性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)。在WNT5A/ROR2信號(hào)通路激活后，下游會(huì)激活多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其中較為重要的包括Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2?通路。在Wnt/PCP通路中，ROR2與WNT5A結(jié)合后，通過激活Dishevelled（Dvl）蛋白，進(jìn)一步激活Rho家族小GTP酶，如RhoA、Rac1和Cdc42等。這些小GTP酶能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞極性，從而影響細(xì)胞的遷移、侵襲和形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)過程。RhoA可以激活Rho激酶（ROCK），ROCK通過磷酸化肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的聚合和交聯(lián)，從而改變細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞的收縮能力和遷移能力。而Rac1和Cdc42則可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的突起形成和運(yùn)動(dòng)方向，通過激活下游的效應(yīng)分子，如PAK（p21-activatedkinase）等，影響細(xì)胞的遷移和侵襲行為。在Wnt/Ca2?通路中，ROR2與WNT5A結(jié)合后，通過激活G蛋白，使磷脂酶C（PLC）活化。PLC可以水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），產(chǎn)生三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG）。IP3能夠與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2?，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。升高的Ca2?可以激活一系列Ca2?依賴的信號(hào)分子，如蛋白激酶C（PKC）、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（CamKII）等。PKC可以通過磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。CamKII則可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和基因表達(dá)，通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子等方式，影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。Ca2?還可以與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin）結(jié)合，激活其活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)活化的T細(xì)胞核因子（NFAT）的去磷酸化和核轉(zhuǎn)位，影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。三、WNT5A/ROR2信號(hào)通路與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)3.1臨床樣本中WNT5A/ROR2信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)分析為了深入探究WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先對(duì)臨床卵巢癌樣本中WNT5A、ROR2等信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)與分析。通過與醫(yī)院婦產(chǎn)科及病理科緊密合作，收集了[X]例卵巢癌患者在手術(shù)切除時(shí)的癌組織樣本，同時(shí)獲取了配對(duì)的癌旁正常組織樣本作為對(duì)照。這些患者在術(shù)前均未接受化療、放療或其他針對(duì)卵巢癌的特殊治療，以確保樣本的原始性和可靠性，詳細(xì)記錄了患者的年齡、病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理信息。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)樣本中WNT5A和ROR2的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取樣本總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，設(shè)置了多個(gè)技術(shù)重復(fù)和內(nèi)參基因，內(nèi)參基因選擇了在各種組織中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的GAPDH基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，卵巢癌組織中WNT5AmRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，平均相對(duì)表達(dá)量約為癌旁組織的[X]倍。ROR2mRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)同樣顯著上調(diào)，平均相對(duì)表達(dá)量為癌旁組織的[X]倍。這表明WNT5A和ROR2在卵巢癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，暗示該信號(hào)通路在卵巢癌中處于激活狀態(tài)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，并從蛋白質(zhì)水平分析WNT5A和ROR2的表達(dá)情況，采用了蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）。首先對(duì)組織樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，通過裂解細(xì)胞、離心等步驟獲得總蛋白，然后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將定量后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，隨后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，以減少非特異性結(jié)合。接著，加入針對(duì)WNT5A和ROR2的特異性一抗，4℃孵育過夜，使一抗與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。最后，通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目標(biāo)蛋白的條帶，并使用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。結(jié)果顯示，卵巢癌組織中WNT5A和ROR2蛋白的表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織，與qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌組織中的異常激活。利用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)，對(duì)WNT5A和ROR2蛋白在組織中的定位和表達(dá)情況進(jìn)行了直觀觀察。將卵巢癌組織和癌旁正常組織制成石蠟切片，脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，以暴露目標(biāo)抗原。采用3%過氧化氫溶液孵育切片，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，減少非特異性染色。加入正常山羊血清封閉切片，減少背景染色。然后，加入WNT5A和ROR2的特異性一抗，37℃孵育1-2小時(shí)。接著，加入生物素標(biāo)記的二抗，孵育30-60分鐘，再加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，孵育30-60分鐘。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌組織中，WNT5A和ROR2蛋白主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的棕黃色染色，且陽性細(xì)胞比例較高。而在癌旁正常組織中，WNT5A和ROR2蛋白的表達(dá)較弱，陽性細(xì)胞數(shù)量較少，染色較淺。通過對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，進(jìn)一步量化分析了WNT5A和ROR2蛋白在不同組織中的表達(dá)差異，結(jié)果同樣表明卵巢癌組織中WNT5A和ROR2蛋白的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。本研究還對(duì)WNT5A和ROR2的表達(dá)與卵巢癌患者的臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了深入分析。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，WNT5A和ROR2的表達(dá)水平與卵巢癌的臨床分期密切相關(guān)。在臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期的卵巢癌患者中，WNT5A和ROR2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者。這表明隨著卵巢癌病情的進(jìn)展，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活程度逐漸增強(qiáng)，提示該信號(hào)通路可能在卵巢癌的晚期發(fā)展過程中發(fā)揮更為重要的作用。WNT5A和ROR2的表達(dá)與卵巢癌的病理分級(jí)也存在顯著關(guān)聯(lián)。在高病理分級(jí)（G3）的卵巢癌組織中，WNT5A和ROR2的表達(dá)水平明顯高于低病理分級(jí)（G1-G2）的組織。這說明WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活與卵巢癌的惡性程度相關(guān)，其高表達(dá)可能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的分化異常和惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤的惡性程度增加。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是評(píng)估卵巢癌預(yù)后的重要指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者，其癌組織中WNT5A和ROR2的表達(dá)水平顯著高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這表明WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活可能與卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，該信號(hào)通路的異常激活可能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，使其更容易通過淋巴管轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)。3.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響為了進(jìn)一步深入探究WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體影響，本研究精心選取了兩種具有代表性的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780，以及正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSEpiC，在含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，將其置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功構(gòu)建了WNT5A過表達(dá)和ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞模型。對(duì)于WNT5A過表達(dá)模型，將攜帶WNT5A基因的過表達(dá)質(zhì)粒利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照組，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性。對(duì)于ROR2敲低模型，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)ROR2基因的小干擾RNA（siRNA），通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞中，同樣設(shè)置陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示W(wǎng)NT5A過表達(dá)組中WNT5A的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，ROR2敲低組中ROR2的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明成功構(gòu)建了相應(yīng)的細(xì)胞模型。運(yùn)用CCK-8法對(duì)細(xì)胞增殖能力進(jìn)行了檢測(cè)。在96孔板中接種適量的細(xì)胞，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，分別在接種后的0h、24h、48h、72h和96h向每孔加入10μLCCK-8試劑，孵育1-2小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。結(jié)果顯示，WNT5A過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值均顯著高于對(duì)照組，表明細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。而ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值則顯著低于對(duì)照組，說明細(xì)胞增殖受到明顯抑制。EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞增殖情況。將細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含有EdU的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，然后按照試劑盒說明書進(jìn)行固定、染色等操作。通過熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)EdU陽性細(xì)胞的比例，結(jié)果與CCK-8法一致，WNT5A過表達(dá)組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，ROR2敲低組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組。利用Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，在上室中加入無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將下室的細(xì)胞固定、染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室預(yù)先鋪好Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WNT5A過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組，說明細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。而ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量則顯著少于對(duì)照組，表明細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到明顯抑制。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)也用于量化細(xì)胞的遷移能力。在6孔板中接種細(xì)胞，待細(xì)胞融合至80%-90%時(shí)，用無菌的200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上制造劃痕，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞，然后加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕后的0h、24h和48h，在顯微鏡下對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算劃痕愈合率。結(jié)果顯示，WNT5A過表達(dá)組的劃痕愈合率明顯高于對(duì)照組，ROR2敲低組的劃痕愈合率明顯低于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用。利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡情況。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，然后加入70%預(yù)冷的乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。次日，離心去除乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞，加入含有碘化丙啶（PI）和RNaseA的染色液，37℃避光孵育30分鐘，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。對(duì)于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，收集細(xì)胞后，用AnnexinV-FITC和PI雙染法進(jìn)行染色，按照試劑盒說明書操作，然后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WNT5A過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞G1期細(xì)胞比例減少，S期和G2/M期細(xì)胞比例增加，說明細(xì)胞周期進(jìn)程加快，促進(jìn)了細(xì)胞增殖。同時(shí)，凋亡細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，表明WNT5A過表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡。而ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制了細(xì)胞增殖。凋亡細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，表明ROR2敲低促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。3.3動(dòng)物模型中WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響為了更深入、全面地探究WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中的作用，本研究精心構(gòu)建了裸鼠荷瘤動(dòng)物模型。選取4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，將其隨機(jī)分為多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組[X]只。實(shí)驗(yàn)組分別接種穩(wěn)定表達(dá)WNT5A過表達(dá)或ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞，對(duì)照組則接種轉(zhuǎn)染空載體或陰性對(duì)照siRNA的卵巢癌細(xì)胞。在嚴(yán)格的無菌條件下，將細(xì)胞以每只裸鼠[X]個(gè)細(xì)胞的數(shù)量，接種于裸鼠的皮下，確保接種部位和細(xì)胞數(shù)量的一致性，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。在接種后的觀察期內(nèi)，定期使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小，測(cè)量時(shí)需輕柔操作，避免對(duì)裸鼠造成過度刺激。按照公式V=0.5×長(zhǎng)×寬2（其中V表示腫瘤體積，長(zhǎng)和寬分別為腫瘤的最長(zhǎng)徑和最短徑）計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，接種WNT5A過表達(dá)卵巢癌細(xì)胞的裸鼠，其腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組。在接種后的第[X]天，WNT5A過表達(dá)組的腫瘤平均體積達(dá)到了[X]mm3，而對(duì)照組僅為[X]mm3。這表明WNT5A過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)卵巢癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中WNT5A對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。接種ROR2敲低卵巢癌細(xì)胞的裸鼠，腫瘤生長(zhǎng)速度則明顯慢于對(duì)照組。在接種后的第[X]天，ROR2敲低組的腫瘤平均體積為[X]mm3，顯著低于對(duì)照組。這說明ROR2敲低能夠有效抑制卵巢癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中ROR2敲低對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用一致。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將裸鼠處死，對(duì)其重要器官（如肺、肝、淋巴結(jié)等）進(jìn)行仔細(xì)解剖和觀察，同時(shí)進(jìn)行病理切片檢查，以確定腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種WNT5A過表達(dá)卵巢癌細(xì)胞的裸鼠，其肺、肝和淋巴結(jié)等器官的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯多于對(duì)照組。在肺部，WNT5A過表達(dá)組的平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為[X]個(gè)，而對(duì)照組僅為[X]個(gè)。這表明WNT5A過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)卵巢癌的轉(zhuǎn)移能力。接種ROR2敲低卵巢癌細(xì)胞的裸鼠，其器官的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量則明顯少于對(duì)照組。在肺部，ROR2敲低組的平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為[X]個(gè)，顯著低于對(duì)照組。這說明ROR2敲低能夠有效抑制卵巢癌的轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步探究WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移影響的機(jī)制，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)、qRT-PCR和Westernblot等檢測(cè)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，WNT5A過表達(dá)組的腫瘤組織中，增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，提示W(wǎng)NT5A過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)降低，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)升高，表明WNT5A過表達(dá)可能通過誘導(dǎo)EMT過程，增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。ROR2敲低組的腫瘤組織中，Ki-67的陽性表達(dá)率明顯低于對(duì)照組，說明ROR2敲低抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。E-cadherin的表達(dá)升高，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)降低，表明ROR2敲低可能通過抑制EMT過程，減弱了卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組織化學(xué)的結(jié)果，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活或抑制，會(huì)影響下游相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)，如Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2?通路中的關(guān)鍵分子。在WNT5A過表達(dá)組中，Wnt/PCP通路中的RhoA、Rac1和Cdc42等小GTP酶的表達(dá)上調(diào)，Wnt/Ca2?通路中的PLC、PKC和CamKII等信號(hào)分子的表達(dá)也增加。而在ROR2敲低組中，這些信號(hào)分子的表達(dá)則明顯下調(diào)。這表明WNT5A/ROR2信號(hào)通路可能通過激活下游的Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2?通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，從而影響卵巢癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。四、WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌中的作用機(jī)制4.1對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，涉及多個(gè)關(guān)鍵基因與蛋白的協(xié)同作用，通過多種分子機(jī)制影響細(xì)胞的命運(yùn)。在細(xì)胞增殖方面，該信號(hào)通路主要通過激活下游的Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2?通路來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)WNT5A與ROR2結(jié)合后，首先激活Wnt/PCP通路中的關(guān)鍵分子Dishevelled（Dvl）蛋白。Dvl蛋白作為信號(hào)傳導(dǎo)的樞紐，能夠進(jìn)一步激活Rho家族小GTP酶，如RhoA、Rac1和Cdc42等。這些小GTP酶在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用，它們可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，為細(xì)胞增殖提供必要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。RhoA通過激活Rho激酶（ROCK），促使肌動(dòng)蛋白絲的聚合和交聯(lián)，增強(qiáng)細(xì)胞的收縮能力，從而有利于細(xì)胞的分裂和增殖。Rac1和Cdc42則參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的突起形成和運(yùn)動(dòng)方向，通過激活下游的效應(yīng)分子，如PAK（p21-activatedkinase）等，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖。PAK可以磷酸化一系列底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，加速細(xì)胞增殖。Wnt/Ca2?通路在卵巢癌細(xì)胞增殖調(diào)控中也起著關(guān)鍵作用。WNT5A/ROR2信號(hào)通路激活后，通過激活G蛋白，使磷脂酶C（PLC）活化。PLC水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），產(chǎn)生三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2?，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。升高的Ca2?激活蛋白激酶C（PKC）和鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（CamKII）等信號(hào)分子。PKC通過磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。在卵巢癌細(xì)胞中，PKC可以磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）等關(guān)鍵蛋白，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。CamKII則通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和基因表達(dá)，影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，也在一定程度上促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的增殖。Ca2?還可以與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin）結(jié)合，激活其活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)活化的T細(xì)胞核因子（NFAT）的去磷酸化和核轉(zhuǎn)位，影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物可能參與細(xì)胞增殖的調(diào)控。WNT5A/ROR2信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)一些與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。c-myc基因是一種重要的原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物c-myc蛋白在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活能夠上調(diào)c-myc基因的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。其機(jī)制可能是通過激活下游的信號(hào)分子，如ERK等，ERK可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Elk-1，使其與c-myc基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)c-myc基因的轉(zhuǎn)錄活性。CyclinD1也是細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)鍵蛋白，它與CDK4/6形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。WNT5A/ROR2信號(hào)通路可以通過激活相關(guān)信號(hào)分子，上調(diào)CyclinD1的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活通常會(huì)抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。該信號(hào)通路通過多種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)這一調(diào)控作用。WNT5A/ROR2信號(hào)通路激活后，會(huì)抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性。Bax是一種促凋亡蛋白，它可以在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究表明，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活能夠下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。其機(jī)制可能是通過激活下游的信號(hào)分子，如PI3K/AKT信號(hào)通路，AKT可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a，使其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，無法與Bax基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而抑制Bax基因的轉(zhuǎn)錄，降低Bax蛋白的表達(dá)水平。WNT5A/ROR2信號(hào)通路還可以通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)來抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，它可以抑制Bax等促凋亡蛋白的活性，阻止細(xì)胞色素c的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活能夠上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的抗凋亡能力。其機(jī)制可能是通過激活下游的信號(hào)分子，如NF-κB等，NF-κB可以與Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而提高Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。WNT5A/ROR2信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位來抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。線粒體膜電位的維持對(duì)于細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要，當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放，激活細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活能夠維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，如電壓依賴性陰離子通道（VDAC）等，VDAC的功能狀態(tài)會(huì)影響線粒體膜電位的穩(wěn)定性，WNT5A/ROR2信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)VDAC的表達(dá)或活性，維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。4.2對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控機(jī)制WNT5A/ROR2信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控是其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中作用的重要方面，涉及多個(gè)關(guān)鍵分子和復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過程。當(dāng)WNT5A與ROR2結(jié)合后，首先激活下游的Wnt/PCP通路。在該通路中，ROR2通過與WNT5A的特異性結(jié)合，激活Dishevelled（Dvl）蛋白。Dvl蛋白作為信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，進(jìn)一步激活Rho家族小GTP酶，包括RhoA、Rac1和Cdc42等。這些小GTP酶在細(xì)胞遷移和侵襲過程中發(fā)揮著核心作用。RhoA激活Rho激酶（ROCK），ROCK通過磷酸化肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，如肌球蛋白輕鏈（MLC）等，促使肌動(dòng)蛋白絲的聚合和交聯(lián)，增強(qiáng)細(xì)胞的收縮能力，從而推動(dòng)細(xì)胞的遷移和侵襲。研究表明，在卵巢癌細(xì)胞中，抑制RhoA或ROCK的活性，可以顯著降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Rac1和Cdc42則參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的突起形成和運(yùn)動(dòng)方向。Rac1激活下游的PAK（p21-activatedkinase），PAK通過磷酸化一系列底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排，促進(jìn)片狀偽足的形成，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。Cdc42則通過調(diào)節(jié)絲狀偽足的形成和延伸，影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)方向和侵襲能力。在卵巢癌細(xì)胞中，過表達(dá)Rac1或Cdc42可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而敲低它們的表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞的這些惡性生物學(xué)行為。Wnt/Ca2?通路在卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。WNT5A/ROR2信號(hào)通路激活后，通過激活G蛋白，使磷脂酶C（PLC）活化。PLC水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），產(chǎn)生三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2?，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?濃度升高。升高的Ca2?激活蛋白激酶C（PKC）和鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II（CamKII）等信號(hào)分子。PKC通過磷酸化多種底物蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲過程。在卵巢癌細(xì)胞中，PKC可以磷酸化細(xì)胞粘附分子，如E-cadherin等，降低細(xì)胞間的粘附力，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。CamKII則通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和基因表達(dá)，影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Ca2?還可以與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（Calcineurin）結(jié)合，激活其活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)活化的T細(xì)胞核因子（NFAT）的去磷酸化和核轉(zhuǎn)位，NFAT可以調(diào)控一系列與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲提供空間。WNT5A/ROR2信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程來影響卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使得癌細(xì)胞能夠獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在卵巢癌中，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活能夠上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，如Snail、Slug和Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以與E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)。E-cadherin是一種重要的上皮細(xì)胞粘附分子，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力減弱，上皮細(xì)胞的極性消失，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。WNT5A/ROR2信號(hào)通路還可以上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，如N-cadherin和Vimentin等，進(jìn)一步增強(qiáng)癌細(xì)胞的間質(zhì)特性和遷移侵襲能力。研究表明，在卵巢癌細(xì)胞中，敲低WNT5A或ROR2的表達(dá)，可以抑制EMT過程，降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力。WNT5A/ROR2信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間的交互作用也在卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。該信號(hào)通路與PI3K/AKT信號(hào)通路存在密切的相互聯(lián)系。在卵巢癌細(xì)胞中，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活可以通過激活下游的信號(hào)分子，間接激活PI3K/AKT信號(hào)通路。PI3K被激活后，將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活?；罨腁KT可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。AKT可以磷酸化GSK-3β，抑制其活性，導(dǎo)致β-catenin的積累和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)節(jié)與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。PI3K/AKT信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。WNT5A/ROR2信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路也存在交互作用。在卵巢癌細(xì)胞中，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活可以激活MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如Ras、Raf、MEK和ERK等。ERK被激活后，可以磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos和c-Jun等，這些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如MMPs、纖連蛋白（Fibronectin）等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，纖連蛋白則可以促進(jìn)細(xì)胞的粘附和遷移，從而增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。MAPK信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，影響卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程。4.3與其他信號(hào)通路的交互作用及對(duì)卵巢癌發(fā)展的影響WNT5A/ROR2信號(hào)通路并非孤立地發(fā)揮作用，而是與其他多種信號(hào)通路存在廣泛而復(fù)雜的交互作用，這些交互作用共同構(gòu)成了卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)卵巢癌的生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲、血管生成以及腫瘤微環(huán)境等方面產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。與PI3K/AKT信號(hào)通路的交互作用在卵巢癌發(fā)展中具有重要意義。在卵巢癌細(xì)胞中，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活能夠通過多條途徑間接激活PI3K/AKT信號(hào)通路。WNT5A與ROR2結(jié)合后，激活下游的一些適配蛋白和信號(hào)分子，如生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子（SOS），進(jìn)而激活Ras蛋白。Ras蛋白的激活可以進(jìn)一步激活PI3K，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活?；罨腁KT可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。AKT可以磷酸化GSK-3β，抑制其活性，導(dǎo)致β-catenin的積累和核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，如c-myc、CyclinD1等。PI3K/AKT信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。在卵巢癌的動(dòng)物模型中，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，可以部分逆轉(zhuǎn)WNT5A/ROR2信號(hào)通路激活所導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)的現(xiàn)象。這表明WNT5A/ROR2信號(hào)通路與PI3K/AKT信號(hào)通路之間存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展。WNT5A/ROR2信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路也存在密切的交互作用。當(dāng)WNT5A與ROR2結(jié)合后，激活的Ras蛋白可以激活MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如Raf、MEK和ERK等。ERK被激活后，可以磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos和c-Jun等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，如MMPs、纖連蛋白（Fibronectin）等。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，纖連蛋白則可以促進(jìn)細(xì)胞的粘附和遷移，從而增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在卵巢癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，抑制MAPK信號(hào)通路的活性，可以顯著降低WNT5A/ROR2信號(hào)通路激活所導(dǎo)致的細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)。這說明WNT5A/ROR2信號(hào)通路通過激活MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。MAPK信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響卵巢癌細(xì)胞的增殖。ERK可以磷酸化細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）等關(guān)鍵蛋白，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的過渡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。這表明WNT5A/ROR2信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲方面存在協(xié)同作用。與Notch信號(hào)通路的交互作用同樣對(duì)卵巢癌發(fā)展產(chǎn)生重要影響。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，WNT5A/ROR2信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路之間存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。在卵巢癌細(xì)胞中，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活可以上調(diào)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，如Notch1、Jagged1等。Notch1與Jagged1結(jié)合后，激活Notch信號(hào)通路，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移。其機(jī)制可能是通過激活下游的Hes1和Hey1等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。Notch信號(hào)通路的激活也可以反過來影響WNT5A/ROR2信號(hào)通路的活性。Notch信號(hào)通路激活后，可以調(diào)節(jié)一些與WNT5A/ROR2信號(hào)通路相關(guān)的分子，如Dvl蛋白等，從而影響WNT5A/ROR2信號(hào)通路的傳導(dǎo)。在卵巢癌的動(dòng)物模型中，抑制Notch信號(hào)通路的活性，可以部分抑制WNT5A/ROR2信號(hào)通路激活所導(dǎo)致的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)的現(xiàn)象。這表明WNT5A/ROR2信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路之間存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展。WNT5A/ROR2信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路之間也存在交互作用。NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在卵巢癌細(xì)胞中，WNT5A/ROR2信號(hào)通路的激活可以通過激活下游的一些信號(hào)分子，如PKC等，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路。NF-κB信號(hào)通路激活后，其亞基p65和p50可以進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB可以上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-xL等，抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。NF-κB還可以上調(diào)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如c-myc、CyclinD1等，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。NF-κB還可以調(diào)節(jié)一些細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，如IL-6、IL-8等，影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在卵巢癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，抑制NF-κB信號(hào)通路的活性，可以顯著降低WNT5A/ROR2信號(hào)通路激活所導(dǎo)致的細(xì)胞增殖和抗凋亡能力的增強(qiáng)。這說明WNT5A/ROR2信號(hào)通路通過激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的增殖和存活。NF-κB信號(hào)通路的激活也可以反過來影響WNT5A/ROR2信號(hào)通路的活性。NF-κB信號(hào)通路激活后，可以調(diào)節(jié)一些與WNT5A/ROR2信號(hào)通路相關(guān)的分子，如ROR2蛋白等，從而影響WNT5A/ROR2信號(hào)通路的傳導(dǎo)。五、基于WNT5A/ROR2信號(hào)通路的卵巢癌治療策略探索5.1靶向WNT5A/ROR2信號(hào)通路的藥物研發(fā)現(xiàn)狀隨著對(duì)WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵作用認(rèn)識(shí)的不斷深入，靶向該信號(hào)通路的藥物研發(fā)成為卵巢癌治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，針對(duì)WNT5A/ROR2信號(hào)通路的藥物研發(fā)主要集中在小分子抑制劑和生物制劑兩個(gè)方向。在小分子抑制劑方面，研究人員通過高通量篩選和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)等技術(shù)，試圖尋找能夠特異性阻斷WNT5A與ROR2結(jié)合，或抑制ROR2激酶活性的小分子化合物。一些研究報(bào)道了具有潛在活性的小分子抑制劑?；衔颴是通過對(duì)大量小分子庫(kù)進(jìn)行篩選得到的，它能夠與WNT5A蛋白的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而干擾WNT5A與ROR2的相互作用，阻斷信號(hào)通路的激活。在卵巢癌細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中，化合物X表現(xiàn)出了顯著的抑制效果。將不同濃度的化合物X作用于SKOV3卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著化合物X濃度的增加，卵巢癌細(xì)胞的增殖能力逐漸受到抑制。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)化合物X處理后的卵巢癌細(xì)胞遷移能力明顯下降，Transwell小室下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到化合物X能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力，穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯降低。然而，小分子抑制劑的研發(fā)面臨著諸多挑戰(zhàn)。小分子抑制劑的特異性和選擇性有待提高，以避免對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生不必要的副作用。由于WNT5A/ROR2信號(hào)通路與其他信號(hào)通路存在復(fù)雜的交互作用，小分子抑制劑在阻斷目標(biāo)信號(hào)通路的可能會(huì)影響其他正常生理信號(hào)通路的功能?；衔颴雖然能夠有效抑制WNT5A/ROR2信號(hào)通路，但在高濃度下，也會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的其他激酶產(chǎn)生一定的抑制作用，這可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的正常生理功能受到干擾。小分子抑制劑的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)也需要進(jìn)一步優(yōu)化，以確保其能夠在體內(nèi)有效地到達(dá)腫瘤組織并維持足夠的藥物濃度。許多小分子抑制劑在體內(nèi)的穩(wěn)定性較差，容易被代謝或清除，導(dǎo)致其在腫瘤組織中的濃度較低，影響治療效果。在生物制劑方面，針對(duì)WNT5A或ROR2的單克隆抗體、小干擾RNA（siRNA）等生物制劑的研發(fā)也在積極進(jìn)行中。單克隆抗體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合WNT5A或ROR2蛋白，從而阻斷信號(hào)通路的激活。研究人員開發(fā)了一種針對(duì)WNT5A的單克隆抗體mAb-WNT5A，它能夠高親和力地結(jié)合WNT5A蛋白，阻止其與ROR2受體的結(jié)合。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將mAb-WNT5A注射到荷瘤裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，荷瘤裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩，腫瘤體積顯著減小。通過對(duì)腫瘤組織的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，mAb-WNT5A處理組的腫瘤組織中，增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)明顯降低，表明腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。小干擾RNA（siRNA）則可以通過RNA干擾技術(shù)特異性地沉默WNT5A或ROR2基因的表達(dá)，從而阻斷信號(hào)通路。研究人員設(shè)計(jì)了針對(duì)ROR2基因的siRNA，將其轉(zhuǎn)染到卵巢癌細(xì)胞中，結(jié)果顯示，ROR2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也受到明顯抑制。在細(xì)胞周期分析中，發(fā)現(xiàn)siRNA處理后的卵巢癌細(xì)胞G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少，表明細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制了細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)siRNA處理后的卵巢癌細(xì)胞凋亡率明顯升高，表明細(xì)胞凋亡增加。生物制劑的研發(fā)同樣面臨一些問題。單克隆抗體的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本較高，限制了其臨床應(yīng)用的廣泛推廣。單克隆抗體的免疫原性也是一個(gè)需要關(guān)注的問題，可能會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。小干擾RNA的遞送效率和穩(wěn)定性是其面臨的主要挑戰(zhàn)。由于siRNA是一種核酸分子，在體內(nèi)容易被核酸酶降解，且難以有效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。為了解決這些問題，研究人員嘗試采用各種納米載體、脂質(zhì)體等遞送系統(tǒng)來提高siRNA的遞送效率和穩(wěn)定性，但這些方法仍處于研究階段，需要進(jìn)一步優(yōu)化和完善。5.2潛在治療靶點(diǎn)的篩選與驗(yàn)證基于對(duì)WNT5A/ROR2信號(hào)通路在卵巢癌中作用機(jī)制的深入研究，本研究進(jìn)一步開展了潛在治療靶點(diǎn)的篩選與驗(yàn)證工作，旨在尋找能夠有效阻斷該信號(hào)通路，抑制卵巢癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶點(diǎn)。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如iTRAQ（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）和TMT（tandemmasstags）等，對(duì)WNT5A過表達(dá)和ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞以及對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)組分析。通過對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選和生物信息學(xué)分析，初步確定了一系列與WNT5A/ROR2信號(hào)通路密切相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。這些潛在靶點(diǎn)涉及多個(gè)生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲以及信號(hào)傳導(dǎo)等。在篩選出的潛在靶點(diǎn)中，重點(diǎn)關(guān)注了一些在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用的分子。分子A是一種與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的蛋白，在WNT5A過表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞中，其表達(dá)水平顯著上調(diào)。通過基因沉默實(shí)驗(yàn)，利用siRNA特異性地沉默分子A的表達(dá)，結(jié)果顯示卵巢癌細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，分子AsiRNA處理組的卵巢癌細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值均顯著低于對(duì)照組，表明細(xì)胞增殖速度明顯減緩。EdU摻入實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果，分子AsiRNA處理組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著降低，說明細(xì)胞DNA合成能力減弱，增殖受到抑制。通過細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，分子AsiRNA處理后的卵巢癌細(xì)胞G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少，表明細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，進(jìn)一步驗(yàn)證了分子A在卵巢癌細(xì)胞增殖調(diào)控中的關(guān)鍵作用。分子B是一種與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的蛋白，在ROR2敲低的卵巢癌細(xì)胞中，其表達(dá)水平顯著下調(diào)。為了驗(yàn)證分子B的功能，通過基因過表達(dá)技術(shù)，將分子B的過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞中。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分子B過表達(dá)組的卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組，說明細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果，分子B過表達(dá)組的劃痕愈合率明顯高于對(duì)照組，表明細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，分子B可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重排和細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，影響卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。分子B可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為癌細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些潛在靶點(diǎn)與WNT5A/ROR2信號(hào)通路的相互作用關(guān)系，采用了免疫共沉淀、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分子A和分子B均能夠與WNT5A/ROR2信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子發(fā)生相互作用。分子A可以與ROR2蛋白直接結(jié)合，這種結(jié)合可能影響ROR2的激酶活性和信號(hào)傳導(dǎo)功能。分子B則可以與WNT5A/ROR2信號(hào)通路下游的一些信號(hào)分子相互作用，如RhoA、Rac1等，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析，進(jìn)一步確定了分子A和分子B在WNT5A/ROR2信號(hào)通路中的作用位置和機(jī)制。結(jié)果顯示，分子A位于WNT5A/ROR2信號(hào)通路的上游，可能通過調(diào)節(jié)ROR2的活性來影響整個(gè)信