miR-125b對急性心梗后心室重構的調控機制：基于心臟成纖維細胞的實驗探索一、引言1.1研究背景急性心肌梗死（AcuteMyocardialInfarction，AMI）作為心血管領域的危急重癥，嚴重威脅著人類的生命健康。近年來，隨著醫(yī)療技術的不斷進步，AMI患者的急性期死亡率有所降低，但心肌梗死后心室重構（VentricularRemodeling，VR）這一并發(fā)癥，依然是影響患者遠期預后和生活質量的關鍵因素。VR是一個復雜的病理生理過程，在AMI發(fā)生后，由于心肌組織的缺血壞死，心臟的結構和功能會發(fā)生一系列適應性改變。心臟為了維持正常的泵血功能，會啟動自我調節(jié)機制，但這種調節(jié)往往會導致心肌細胞肥大、間質纖維化、心肌組織力學性能改變等一系列不良變化，最終使心臟的幾何形狀和功能發(fā)生不可逆轉的損害。據(jù)統(tǒng)計，約30%-50%的AMI患者會在發(fā)病后的數(shù)月至數(shù)年內出現(xiàn)不同程度的心室重構，而心室重構患者發(fā)生心力衰竭、心律失常甚至心源性猝死的風險顯著增加，嚴重影響患者的生存質量和壽命，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔。在AMI后心室重構的進程中，心臟成纖維細胞（CardiacFibroblasts，CFs）扮演著極為重要的角色。CFs是心肌組織中數(shù)量最多的細胞類型之一，約占心肌細胞總數(shù)的60%-70%。正常情況下，CFs處于相對靜止的狀態(tài)，主要負責維持心肌細胞外基質（ExtracellularMatrix，ECM）的穩(wěn)態(tài)，為心肌細胞提供結構支持和力學穩(wěn)定性。然而，在AMI發(fā)生后，CFs會被迅速激活，發(fā)生一系列生物學行為的改變。被激活的CFs會發(fā)生增殖和遷移，從心肌間質遷移到梗死區(qū)域，同時合成和分泌大量的膠原蛋白等細胞外基質成分，導致心肌纖維化的發(fā)生。過度的心肌纖維化會破壞心肌組織的正常結構和功能，使心肌的順應性降低，心臟的舒張和收縮功能受損，進而促進心室重構的發(fā)展。研究表明，抑制CFs的活化和增殖，減少心肌纖維化，能夠有效減輕心室重構，改善心臟功能。因此，深入研究CFs在AMI后心室重構中的作用機制，對于尋找新的治療靶點，改善AMI患者的預后具有重要意義。微小RNA（MicroRNA，miRNA）作為一類內源性非編碼單鏈RNA分子，長度約為21-23個核苷酸，近年來在心血管疾病的研究中備受關注。miRNA通過與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UntranslatedRegion，3'-UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而實現(xiàn)對基因表達的轉錄后調控。越來越多的研究表明，miRNA參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程，在心肌梗死、心律失常、心力衰竭等多種心血管疾病中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。miR-125b作為miRNA家族中的重要成員，在心血管系統(tǒng)中的作用逐漸被揭示。已有研究表明，miR-125b在心臟發(fā)育、心肌細胞分化和功能調節(jié)等方面發(fā)揮著關鍵作用。在心肌梗死的病理過程中，miR-125b的表達水平會發(fā)生顯著變化，但其在CFs中的功能及其對AMI后心室重構的影響尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可能通過調控某些靶基因的表達，影響CFs的增殖、遷移和膠原合成等生物學行為，進而參與心室重構的進程。然而，目前關于miR-125b在AMI后CFs中的具體作用機制仍存在諸多爭議，相關的研究報道也較少。因此，深入探究miR-125b在AMI后CFs中的作用及其分子機制，對于進一步揭示心室重構的發(fā)病機制，開發(fā)新的治療策略具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的和意義本研究旨在深入探究miR-125b調控心臟成纖維細胞對急性心梗后心室重構的影響及其潛在分子機制，為急性心肌梗死的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。急性心肌梗死作為嚴重威脅人類健康的心血管疾病，盡管現(xiàn)代醫(yī)學在急性期治療方面取得了顯著進展，但心室重構這一并發(fā)癥仍然是導致患者遠期預后不良的重要因素。目前，針對心室重構的治療手段有限，主要集中在藥物治療和心臟再同步化治療等，但這些治療方法往往只能緩解癥狀，無法從根本上阻止心室重構的進程。因此，尋找新的治療靶點和干預策略，對于改善急性心肌梗死患者的預后具有迫切的臨床需求。在眾多參與心室重構的因素中，心臟成纖維細胞的活化和功能異常被認為是關鍵環(huán)節(jié)。心臟成纖維細胞在急性心梗后會發(fā)生增殖、遷移和膠原合成增加等一系列變化，導致心肌纖維化和心室重構的發(fā)生。然而，目前對于心臟成纖維細胞活化的分子機制尚未完全明確，這限制了針對心室重構的治療策略的發(fā)展。微小RNA作為一類重要的基因表達調控分子，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。miR-125b作為一種在心臟中表達豐富的微小RNA，其在急性心梗后心室重構中的作用及機制尚不清楚。已有研究表明，miR-125b可能通過調控某些靶基因的表達，影響心臟成纖維細胞的生物學行為，但具體的作用機制和靶基因仍有待進一步研究。本研究通過體外和體內實驗，深入探討miR-125b對心臟成纖維細胞的調控作用及其在急性心梗后心室重構中的作用機制，具有重要的理論和實踐意義。在理論方面，本研究將揭示miR-125b在心臟成纖維細胞中的新功能和作用機制，豐富對急性心梗后心室重構分子機制的認識，為心血管疾病的基礎研究提供新的思路和理論依據(jù)。在實踐方面，本研究的結果可能為急性心肌梗死的治療提供新的潛在治療靶點和干預策略。通過調控miR-125b的表達或其靶基因的活性，有望抑制心臟成纖維細胞的活化和心肌纖維化，從而減輕心室重構，改善心臟功能，提高急性心肌梗死患者的生存率和生活質量。此外，本研究還可能為心血管疾病的早期診斷和預后評估提供新的生物標志物，有助于實現(xiàn)心血管疾病的精準治療。二、急性心梗后心室重構與心臟成纖維細胞2.1急性心梗后心室重構的概述2.1.1定義與病理過程急性心梗后心室重構指的是在急性心肌梗死發(fā)生后，心臟為適應心肌缺血壞死所引發(fā)的一系列病理生理變化，進而導致心臟大小、形狀以及組織結構發(fā)生改變的過程。這一過程通常起始于急性心肌梗死后數(shù)小時，并可持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年，是一個動態(tài)且復雜的病理演變過程。在急性心肌梗死早期，由于冠狀動脈急性閉塞，導致心肌組織急性缺血缺氧，心肌細胞迅速發(fā)生壞死。壞死心肌組織失去正常的收縮和舒張功能，局部心肌的力學性能發(fā)生顯著改變。為了維持心臟的整體泵血功能，心臟會啟動一系列代償機制，其中包括非梗死區(qū)心肌細胞的代償性肥大。心肌細胞通過增加蛋白質合成，使細胞體積增大，以增強心肌的收縮力。同時，心臟的交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）也被激活，導致心率加快、血壓升高，以維持心輸出量。隨著病程的進展，梗死區(qū)心肌組織逐漸被纖維瘢痕組織所取代，這一過程被稱為心肌纖維化。心肌纖維化是心室重構的重要病理特征之一，其發(fā)生機制主要與心臟成纖維細胞的活化密切相關。在急性心梗后，心臟成纖維細胞被大量激活，從相對靜止狀態(tài)轉變?yōu)樵鲋郴钴S狀態(tài)。這些活化的成纖維細胞遷移至梗死區(qū)域，合成并分泌大量的細胞外基質成分，尤其是膠原蛋白。過多的膠原蛋白在心肌組織中沉積，導致心肌纖維化，使心肌組織變硬、彈性降低，心臟的順應性也隨之下降。在梗死區(qū)心肌纖維化的同時，非梗死區(qū)心肌也會發(fā)生一系列變化。非梗死區(qū)心肌細胞除了發(fā)生代償性肥大外，還會出現(xiàn)心肌細胞排列紊亂、間質纖維化等改變。這些變化進一步破壞了心肌組織的正常結構和功能，導致心臟的幾何形狀發(fā)生改變，心室腔逐漸擴大。心室擴張最初可能是一種代償性反應，通過增加心室容積來維持心輸出量，但隨著心室重構的持續(xù)進展，心室擴張逐漸超出了心臟的代償能力，導致心臟功能逐漸惡化。此外，急性心梗后心室重構還可能伴隨心臟電生理特性的改變。心肌纖維化和心肌細胞排列紊亂會影響心臟的電傳導，導致心律失常的發(fā)生風險增加。例如，心肌梗死后常見的室性心律失常，其發(fā)生機制與心室重構過程中心肌組織的電生理異質性增加密切相關。2.1.2對心臟功能的影響及臨床后果急性心梗后心室重構對心臟功能的影響是多方面且深遠的，其最終可導致心臟功能嚴重受損，引發(fā)一系列嚴重的臨床后果。從心臟的收縮功能來看，心室重構會導致心肌收縮力下降。一方面，梗死區(qū)心肌組織壞死，失去了正常的收縮能力，這直接減少了心臟的有效收縮面積。另一方面，非梗死區(qū)心肌細胞的代償性肥大雖然在一定程度上試圖維持心臟的收縮功能，但隨著心室重構的進展，肥大的心肌細胞會逐漸出現(xiàn)能量代謝障礙、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等問題，導致心肌收縮性逐漸減弱。此外，心肌纖維化使心肌組織的僵硬度增加，限制了心肌的正常收縮和舒張，進一步降低了心臟的收縮功能。心臟收縮功能下降的直接表現(xiàn)為心輸出量減少，無法滿足機體各組織器官的代謝需求，患者可出現(xiàn)乏力、疲勞、活動耐力下降等癥狀。在心臟舒張功能方面，心室重構同樣會造成嚴重影響。心肌纖維化和心室擴張使得心室壁的順應性降低，心室在舒張期不能充分充盈。這導致左心室舒張末壓升高，肺靜脈回流受阻，進而引起肺淤血。患者可出現(xiàn)呼吸困難，起初可能僅在活動時出現(xiàn)，隨著病情進展，即使在休息時也會出現(xiàn)呼吸困難，嚴重影響患者的生活質量。心室重構還與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關。隨著心室重構的不斷惡化，心臟的收縮和舒張功能持續(xù)受損，當心臟無法維持足夠的心輸出量以滿足機體代謝需求時，就會發(fā)生心力衰竭。心力衰竭是急性心梗后心室重構最嚴重的臨床后果之一，其病死率較高，嚴重威脅患者的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，約50%的心?；颊咴诎l(fā)病后的5年內會發(fā)展為心力衰竭，而心室重構是導致心力衰竭發(fā)生的關鍵因素。心律失常也是急性心梗后心室重構常見的臨床后果之一。如前所述，心室重構過程中心肌組織的結構和電生理特性發(fā)生改變，導致心肌細胞的電活動不穩(wěn)定，容易引發(fā)心律失常。室性心律失常是急性心梗后最常見且危險的心律失常類型，包括室性早搏、室性心動過速和心室顫動等。這些心律失?？蓪е滦呐K泵血功能急劇下降，甚至引發(fā)心臟驟停，是急性心梗患者猝死的主要原因之一。此外，心房顫動等房性心律失常在急性心梗后心室重構患者中也較為常見，心房顫動會進一步加重心臟功能負擔，增加血栓形成和栓塞的風險。除了心力衰竭和心律失常外，急性心梗后心室重構還可能導致心臟破裂、室壁瘤形成等嚴重并發(fā)癥。在急性心肌梗死后的早期，由于梗死區(qū)心肌組織的結構完整性受到嚴重破壞，心肌壁變薄，在心臟收縮力的作用下，梗死區(qū)心肌可能發(fā)生破裂，這是一種極其兇險的并發(fā)癥，病死率極高。室壁瘤則是由于梗死區(qū)心肌組織在愈合過程中形成的局部薄弱區(qū)域，在心臟內壓力的作用下向外膨出形成瘤樣結構。室壁瘤不僅會影響心臟的正常收縮和舒張功能，還容易導致血栓形成，血栓脫落可引起肺栓塞、腦栓塞等嚴重的栓塞性疾病。2.2心臟成纖維細胞在心室重構中的作用2.2.1心臟成纖維細胞的特性與分布心臟成纖維細胞是心肌組織中數(shù)量最為豐富的細胞類型之一，在維持心臟正常結構和功能方面發(fā)揮著基礎性作用。從形態(tài)學角度來看，心臟成纖維細胞呈現(xiàn)出長梭形或不規(guī)則的星形外觀，具有一個較大的、呈卵圓形的細胞核，核仁清晰可見。其細胞質相對較少，且富含大量的內質網(wǎng)和高爾基體，這些細胞器的豐富分布與心臟成纖維細胞活躍的蛋白質合成與分泌功能密切相關。內質網(wǎng)是蛋白質合成和加工的重要場所，高爾基體則主要負責蛋白質的修飾、加工以及分泌到細胞外的過程，二者協(xié)同工作，確保心臟成纖維細胞能夠高效地合成和分泌各類細胞外基質成分以及生物活性因子。在生理特性方面，心臟成纖維細胞具有獨特的生物學特征。正常情況下，心臟成纖維細胞處于相對靜止的狀態(tài)，代謝活動較為緩慢，主要執(zhí)行維持心肌細胞外基質穩(wěn)態(tài)的功能。然而，當心臟受到各種損傷因素刺激時，如急性心肌梗死、炎癥反應等，心臟成纖維細胞會迅速被激活，進入增殖和分化狀態(tài)，其代謝活動也會顯著增強。被激活的心臟成纖維細胞能夠合成和分泌多種細胞外基質成分，如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等，這些成分對于維持心肌組織的結構完整性和力學穩(wěn)定性至關重要。此外，心臟成纖維細胞還能夠分泌一系列生物活性因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）、胰島素樣生長因子（IGF）等，這些因子在細胞增殖、遷移、分化以及細胞間信號傳遞等過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。在心臟組織中，心臟成纖維細胞廣泛分布于心肌間質內，環(huán)繞在心肌細胞周圍，形成一個復雜的三維網(wǎng)絡結構。它們與心肌細胞之間通過多種細胞連接方式相互作用，如縫隙連接、黏著連接等，這些連接方式不僅保證了心臟成纖維細胞與心肌細胞之間的物理聯(lián)系，還使得二者能夠進行有效的信息交流和信號傳導。在心肌組織的不同區(qū)域，心臟成纖維細胞的分布密度和功能狀態(tài)存在一定的差異。例如，在心房和心室的心肌組織中，心臟成纖維細胞的分布密度相對較高，且在心室肌的不同層次中，其分布也呈現(xiàn)出一定的梯度變化。此外，在心臟的血管周圍和瓣膜組織中，也存在著大量的心臟成纖維細胞，它們在維持血管和瓣膜的正常結構和功能方面發(fā)揮著重要作用。2.2.2心梗后心臟成纖維細胞的活化與增殖急性心梗后，心臟成纖維細胞會迅速發(fā)生活化，這一過程涉及多種復雜的信號通路和分子機制。首先，心肌缺血壞死會導致局部微環(huán)境發(fā)生顯著改變，釋放出一系列損傷相關分子模式（DAMPs），如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、熱休克蛋白等。這些DAMPs能夠被心臟成纖維細胞表面的模式識別受體（PRRs）識別，如Toll樣受體（TLRs），從而激活下游的信號傳導通路。以TLR4為例，當HMGB1與TLR4結合后，會招募髓樣分化因子88（MyD88），進而激活核因子-κB（NF-κB）信號通路。NF-κB是一種重要的轉錄因子，被激活后會進入細胞核，調控一系列與細胞活化、增殖和炎癥反應相關基因的表達，促使心臟成纖維細胞從靜止狀態(tài)轉變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。同時，急性心梗后，機體的神經(jīng)內分泌系統(tǒng)也會被激活，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）和交感神經(jīng)系統(tǒng)在其中發(fā)揮著關鍵作用。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為RAAS的關鍵活性物質，能夠與心臟成纖維細胞表面的血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）結合，通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，如細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，促進心臟成纖維細胞的增殖和活化。此外，交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放的去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質，也能夠通過與心臟成纖維細胞表面的β-腎上腺素能受體結合，激活腺苷酸環(huán)化酶，升高細胞內cAMP水平，進而激活蛋白激酶A（PKA），調節(jié)相關基因的表達，促進心臟成纖維細胞的活化和增殖?；罨蟮男呐K成纖維細胞會進入快速增殖階段，這一過程對心室重構進程產(chǎn)生了重要的推動作用。從細胞周期角度來看，活化的心臟成纖維細胞會從靜止期（G0期）進入細胞周期，依次經(jīng)過DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有絲分裂期（M期），實現(xiàn)細胞數(shù)量的快速增加。在細胞增殖過程中，心臟成纖維細胞會合成大量的DNA、RNA和蛋白質，為細胞分裂提供物質基礎。同時，細胞骨架也會發(fā)生重排，以適應細胞形態(tài)和功能的變化。心臟成纖維細胞的增殖使得梗死區(qū)域的細胞數(shù)量迅速增多，這些新增的細胞能夠遷移至梗死部位，參與心肌組織的修復過程。然而，過度的增殖也會帶來一系列負面影響。過多的心臟成纖維細胞會導致心肌組織中細胞密度增加，細胞間的相互作用發(fā)生改變，進而影響心肌的正常結構和功能。此外，增殖活躍的心臟成纖維細胞會持續(xù)合成和分泌大量的細胞外基質成分，進一步加劇心肌纖維化的程度，導致心肌組織的僵硬度增加，順應性降低，心臟的舒張和收縮功能受損，從而推動心室重構的進展。研究表明，在急性心梗后的早期階段，抑制心臟成纖維細胞的增殖能夠有效減輕心肌纖維化和心室重構的程度，改善心臟功能，這也進一步說明了心臟成纖維細胞增殖在心室重構中的重要作用。2.2.3分泌功能與細胞外基質重塑心臟成纖維細胞具有強大的分泌功能，在急性心梗后，其分泌的各類因子對細胞外基質的成分和結構產(chǎn)生了深遠影響，在心肌纖維化過程中扮演著核心角色。在眾多分泌因子中，轉化生長因子-β（TGF-β）是最為關鍵的一種。急性心梗后，心臟成纖維細胞被激活，TGF-β的表達和分泌顯著增加。TGF-β通過與細胞表面的TGF-β受體結合，激活下游的Smad信號通路?；罨腟mad蛋白會進入細胞核，與其他轉錄因子相互作用，調控一系列與細胞外基質合成相關基因的表達。其中，TGF-β能夠顯著上調Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白基因的表達，促進膠原蛋白的合成和分泌。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，在正常心肌組織中，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白保持著相對穩(wěn)定的比例，維持著心肌的正常結構和功能。然而，在急性心梗后，由于TGF-β的作用，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成大量增加，且Ⅰ型膠原蛋白的增加更為顯著，導致Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比例失衡。這種比例失衡使得細胞外基質的結構發(fā)生改變，變得更加致密和僵硬，從而影響了心肌的順應性和舒縮功能。除了TGF-β，血小板衍生生長因子（PDGF）也是心臟成纖維細胞分泌的重要因子之一。PDGF具有強大的促有絲分裂作用，能夠刺激心臟成纖維細胞的增殖和遷移。在急性心梗后，PDGF的分泌增加，吸引大量的心臟成纖維細胞遷移至梗死區(qū)域，同時促進這些細胞的增殖，為細胞外基質的合成提供了充足的細胞來源。此外，PDGF還能夠上調基質金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）的表達。MMPs能夠降解細胞外基質成分，而TIMPs則抑制MMPs的活性，二者之間的平衡對于維持細胞外基質的穩(wěn)態(tài)至關重要。在急性心梗后的病理狀態(tài)下，PDGF的作用使得MMPs/TIMPs的平衡失調，導致細胞外基質的降解減少，進一步促進了細胞外基質的沉積和纖維化。胰島素樣生長因子（IGF）同樣參與了心臟成纖維細胞對細胞外基質的調控過程。IGF能夠與心臟成纖維細胞表面的IGF受體結合，激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，促進細胞的增殖和存活。同時，IGF還能夠調節(jié)膠原蛋白和其他細胞外基質成分的合成，通過上調相關基因的表達，增加細胞外基質的合成量。此外，IGF還能夠抑制細胞凋亡，使得心臟成纖維細胞在梗死區(qū)域持續(xù)存活并發(fā)揮作用，進一步加劇了心肌纖維化的進程。心臟成纖維細胞分泌的這些因子相互作用，共同導致了細胞外基質的重塑和心肌纖維化的發(fā)生。心肌纖維化是急性心梗后心室重構的重要病理特征之一，過度的心肌纖維化會破壞心肌組織的正常結構和功能，導致心臟的順應性降低，舒張和收縮功能受損。心肌纖維化還會影響心臟的電生理特性，增加心律失常的發(fā)生風險。因此，深入研究心臟成纖維細胞的分泌功能及其在細胞外基質重塑和心肌纖維化中的作用機制，對于尋找有效的治療靶點，干預急性心梗后心室重構具有重要意義。三、miR-125b與心臟成纖維細胞的關聯(lián)3.1miR-125b的生物學特性3.1.1分子結構與表達特征miR-125b是一種內源性非編碼單鏈RNA分子，在人類中，miR-125b家族包含miR-125b-1和miR-125b-2兩個成員，它們分別位于不同的染色體位置。miR-125b-1定位于11號染色體，而miR-125b-2則位于21號染色體。盡管兩者在染色體定位上存在差異，但它們的成熟序列高度相似，均由約22個核苷酸組成。以人類miR-125b-5p為例，其成熟序列為5'-UCACAGUAGCACCUGGUUGUU-3'，這種特定的核苷酸序列賦予了miR-125b獨特的生物學功能。從二級結構來看，miR-125b通常形成典型的莖環(huán)結構。其前體RNA（pre-miR-125b）長度約為70-100個核苷酸，通過自身折疊形成一個發(fā)夾狀結構，包含莖部和環(huán)部。莖部由互補的核苷酸配對形成雙鏈結構，而環(huán)部則是一段單鏈核苷酸序列。在細胞內，pre-miR-125b首先由RNA聚合酶Ⅱ轉錄生成初級轉錄本（pri-miR-125b），pri-miR-125b在核酸酶Drosha和其輔助因子DGCR8的作用下，被切割成pre-miR-125b，隨后pre-miR-125b被轉運出細胞核，在細胞質中被另一種核酸酶Dicer識別并進一步切割，最終形成成熟的miR-125b。這種精確的加工過程確保了miR-125b能夠以正確的結構發(fā)揮其生物學功能。miR-125b在不同組織和細胞中呈現(xiàn)出特異性的表達模式。在正常生理狀態(tài)下，miR-125b在心臟、腦、肺、肝臟、腎臟等多種組織中均有表達，但表達水平存在差異。在心臟組織中，miR-125b呈現(xiàn)出相對較高的表達水平，這表明其在心臟的正常生理功能維持中可能發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b在心肌細胞和心臟成纖維細胞中均有表達，且在心肌細胞發(fā)育和分化過程中，miR-125b的表達水平會發(fā)生動態(tài)變化。在胚胎發(fā)育早期，miR-125b的表達水平相對較低，隨著心肌細胞的分化和成熟，其表達水平逐漸升高，這提示miR-125b可能參與了心肌細胞的發(fā)育和成熟過程。在腦和肺組織中，miR-125b也有一定程度的表達，且在神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持中發(fā)揮著重要作用。在肝臟和腎臟組織中，miR-125b的表達水平相對較低，但其在肝臟的代謝功能和腎臟的排泄功能中可能也具有一定的調節(jié)作用。3.1.2在心血管系統(tǒng)中的生理功能在心血管系統(tǒng)中，miR-125b對心臟發(fā)育、心肌細胞功能維持等方面發(fā)揮著不可或缺的作用，其作用機制涉及多個層面。在心臟發(fā)育過程中，miR-125b參與調控心肌細胞的增殖、分化和凋亡等關鍵生物學過程。研究表明，miR-125b能夠通過靶向調控某些關鍵基因的表達，影響心肌細胞的增殖能力。在胚胎心臟發(fā)育早期，miR-125b的表達水平較低，此時心肌細胞處于快速增殖階段。隨著心臟發(fā)育的推進，miR-125b的表達逐漸升高，其通過抑制一些促進細胞增殖的基因，如細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）和細胞周期蛋白D1（CyclinD1），使心肌細胞逐漸退出細胞周期，進入分化階段，從而確保心臟正常的形態(tài)發(fā)生和結構形成。此外，miR-125b還在心肌細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。它能夠調控心肌特異性轉錄因子的表達，如GATA結合蛋白4（GATA4）和心肌肌球蛋白重鏈（MyHC），促進心肌細胞向成熟心肌細胞分化，形成具有正常收縮和舒張功能的心肌組織。在心肌細胞功能維持方面，miR-125b對心肌細胞的收縮功能、能量代謝和鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)等起著重要的調節(jié)作用。心肌細胞的收縮功能依賴于肌節(jié)的正常結構和功能，miR-125b能夠通過靶向調節(jié)一些與肌節(jié)相關的基因，如肌鈣蛋白T（TnT）和肌動蛋白（Actin），維持肌節(jié)的穩(wěn)定性，從而保證心肌細胞的正常收縮功能。在能量代謝方面，心肌細胞需要大量的能量來維持其持續(xù)的收縮活動，miR-125b參與調控心肌細胞的能量代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b能夠調節(jié)脂肪酸代謝相關基因的表達，如脂肪酸轉運蛋白1（FATP1）和肉堿/有機陽離子轉運體2（OCTN2），影響脂肪酸的攝取和氧化，為心肌細胞提供充足的能量。此外，miR-125b還在心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用。心肌細胞的收縮和舒張過程與細胞內鈣濃度的變化密切相關，miR-125b通過靶向調控一些鈣轉運相關蛋白，如肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a（SERCA2a）和蘭尼堿受體2（RyR2），維持細胞內鈣穩(wěn)態(tài)，確保心肌細胞正常的興奮-收縮偶聯(lián)過程。miR-125b還在心臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。在急性心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病中，miR-125b的表達水平會發(fā)生顯著變化。研究表明，在急性心肌梗死模型中，心肌組織中miR-125b的表達水平明顯降低，這可能與心肌細胞的損傷和凋亡有關。通過上調miR-125b的表達，可以抑制心肌細胞的凋亡，減輕心肌損傷，改善心臟功能。在心力衰竭模型中，miR-125b的表達異常也與心肌重構和心臟功能惡化密切相關。深入研究miR-125b在心血管系統(tǒng)中的生理功能和作用機制，對于揭示心血管疾病的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點具有重要意義。3.2miR-125b對心臟成纖維細胞的調控作用3.2.1調控心臟成纖維細胞增殖的機制在急性心梗后的病理環(huán)境中，miR-125b對心臟成纖維細胞增殖的調控機制涉及多個關鍵信號通路和靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可通過靶向作用于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）基因，影響心臟成纖維細胞的增殖過程。SPARC是一種細胞外基質相關蛋白，在心臟成纖維細胞的增殖和遷移過程中發(fā)揮著重要作用。miR-125b通過與SPARC基因mRNA的3'-UTR互補配對，抑制其翻譯過程，導致SPARC蛋白表達水平降低。當SPARC蛋白表達減少時，會影響細胞外基質與細胞表面受體之間的相互作用，進而干擾細胞內的信號傳導通路。具體而言，SPARC蛋白的減少會抑制整合素-粘著斑激酶（FAK）信號通路的激活。整合素是一類細胞表面受體，能夠與細胞外基質成分結合，而FAK則是整合素信號通路中的關鍵激酶。在正常情況下，SPARC與整合素結合，激活FAK，進而激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，促進心臟成纖維細胞的增殖。然而，當miR-125b上調，SPARC蛋白表達受抑制時，整合素-FAK信號通路被阻斷，PI3K/Akt信號通路的活性降低，使得心臟成纖維細胞的增殖受到抑制。除了SPARC基因，miR-125b還可能通過調控細胞周期相關基因來影響心臟成纖維細胞的增殖。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（p27Kip1）是一種重要的細胞周期調控蛋白，它能夠抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的活性，從而阻止細胞從G1期進入S期，抑制細胞增殖。研究表明，miR-125b可以直接靶向p27Kip1基因的3'-UTR，抑制其表達。當miR-125b表達升高時，p27Kip1蛋白水平下降，解除了對CDKs的抑制作用，使得心臟成纖維細胞能夠順利通過G1/S期檢查點，進入細胞周期，促進細胞增殖。相反，當miR-125b表達被抑制時，p27Kip1蛋白表達上調，CDKs活性受到抑制，心臟成纖維細胞增殖受阻。miR-125b還可能通過調節(jié)其他信號通路來間接影響心臟成纖維細胞的增殖。例如，miR-125b可能參與調節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。在急性心梗后，MAPK信號通路被激活，包括細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，這些激酶的激活能夠促進心臟成纖維細胞的增殖和活化。miR-125b可能通過靶向作用于MAPK信號通路上的某些關鍵分子，如MAPK激酶（MKK）或其他上游調節(jié)因子，抑制MAPK信號通路的激活，從而減少心臟成纖維細胞的增殖。此外，miR-125b還可能與其他微小RNA或信號分子相互作用，形成復雜的調控網(wǎng)絡，共同調節(jié)心臟成纖維細胞的增殖過程。3.2.2對心臟成纖維細胞遷移能力的影響miR-125b對心臟成纖維細胞遷移能力的影響主要通過改變細胞骨架結構和相關蛋白表達來實現(xiàn)。細胞骨架是細胞內的一種蛋白質纖維網(wǎng)絡結構，主要包括微絲、微管和中間絲，其在細胞的形態(tài)維持、運動和遷移等過程中發(fā)揮著關鍵作用。研究表明，miR-125b能夠通過調控相關基因的表達，影響微絲和微管的組裝與動態(tài)變化，從而改變心臟成纖維細胞的遷移能力。在微絲方面，miR-125b可以靶向調節(jié)Rho家族小GTP酶（如RhoA、Rac1和Cdc42）及其下游效應分子的表達。Rho家族小GTP酶是一類重要的分子開關，它們在細胞骨架的重組和細胞遷移過程中起著核心調控作用。以RhoA為例，當miR-125b表達上調時，它能夠抑制RhoA基因的表達，使RhoA蛋白水平降低。RhoA蛋白的減少會導致其下游的Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）的活性降低。ROCK是RhoA的主要效應分子之一，它能夠磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC），促進肌動蛋白微絲的組裝和收縮，從而增強細胞的遷移能力。當ROCK活性受到抑制時，MLC的磷酸化水平降低，肌動蛋白微絲的組裝和收縮受到影響，細胞的遷移能力減弱。相反，當miR-125b表達下調時，RhoA蛋白表達增加，ROCK活性增強，心臟成纖維細胞的遷移能力增強。miR-125b還會對微管相關蛋白的表達產(chǎn)生影響。微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成的中空管狀結構，其動態(tài)變化對于細胞的遷移至關重要。微管相關蛋白（MAPs）能夠與微管結合，調節(jié)微管的穩(wěn)定性和動力學。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可以通過靶向作用于某些MAPs，如微管相關蛋白4（MAP4），影響微管的穩(wěn)定性。當miR-125b表達升高時，MAP4蛋白表達降低，微管的穩(wěn)定性下降，細胞的遷移能力受到抑制。這是因為MAP4能夠促進微管的聚合和穩(wěn)定，維持微管的正常結構和功能，當MAP4表達減少時，微管容易發(fā)生解聚，影響細胞的遷移過程。除了細胞骨架相關蛋白，miR-125b還可能通過調節(jié)細胞粘附分子的表達來影響心臟成纖維細胞的遷移。細胞粘附分子是一類介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間相互作用的蛋白質，它們在細胞遷移過程中起著重要的橋梁作用。例如，miR-125b可以調節(jié)整合素家族成員的表達。整合素能夠與細胞外基質中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分結合，形成粘著斑，介導細胞與細胞外基質的粘附。當miR-125b表達改變時，整合素的表達水平也會發(fā)生相應變化，從而影響細胞與細胞外基質的粘附能力，進而影響細胞的遷移能力。當miR-125b表達上調，整合素表達降低時，細胞與細胞外基質的粘附力減弱，細胞的遷移能力下降；反之，當miR-125b表達下調，整合素表達增加時，細胞與細胞外基質的粘附力增強，細胞的遷移能力增強。3.2.3在心臟成纖維細胞分化中的作用在心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的過程中，miR-125b發(fā)揮著關鍵的調控作用，其調控機制涉及多個層面。心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化是急性心梗后心室重構過程中的一個重要事件，肌成纖維細胞具有更強的收縮能力和合成細胞外基質的能力，過度的分化會導致心肌纖維化和心室重構的加劇。miR-125b可通過靶向調控轉化生長因子-β（TGF-β）信號通路來影響心臟成纖維細胞的分化。TGF-β是一種重要的細胞因子，在心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞分化過程中起著核心調控作用。在急性心梗后，TGF-β的表達和分泌增加，它能夠與心臟成纖維細胞表面的TGF-β受體結合，激活下游的Smad信號通路?；罨腟mad蛋白會進入細胞核，與其他轉錄因子相互作用，上調α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白等肌成纖維細胞特異性標志物的表達，促進心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。研究表明，miR-125b可以直接靶向TGF-β信號通路中的關鍵分子，如Smad2和Smad3。當miR-125b表達上調時，它能夠抑制Smad2和Smad3基因的表達，使Smad2和Smad3蛋白水平降低。Smad2和Smad3蛋白的減少會阻斷TGF-β/Smad信號通路的激活，從而抑制心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化。相反，當miR-125b表達下調時，Smad2和Smad3蛋白表達增加，TGF-β/Smad信號通路激活，促進心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。miR-125b還可能通過調節(jié)其他轉錄因子的表達來影響心臟成纖維細胞的分化。例如，血清反應因子（SRF）是一種重要的轉錄因子，它在心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。SRF能夠與α-SMA基因啟動子區(qū)域的CArG盒結合，促進α-SMA基因的轉錄，從而促進心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞分化。研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可以靶向作用于SRF基因的3'-UTR，抑制其表達。當miR-125b表達升高時，SRF蛋白水平下降，α-SMA基因的轉錄受到抑制，心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化受阻。此外，miR-125b還可能通過調節(jié)其他與細胞分化相關的信號通路，如Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路、Notch信號通路等，間接影響心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化過程。這些信號通路之間相互作用，形成復雜的調控網(wǎng)絡，共同調節(jié)心臟成纖維細胞的分化，而miR-125b在這個調控網(wǎng)絡中扮演著重要的調節(jié)節(jié)點角色。四、研究設計與實驗方法4.1實驗動物與細胞模型的建立4.1.1實驗動物的選擇與分組本研究選用健康的成年雄性C57BL/6小鼠作為實驗動物，小鼠作為常用的實驗動物，具有繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低、遺傳背景明確等優(yōu)勢，且其心血管系統(tǒng)與人類有一定的相似性，能夠較好地模擬人類急性心肌梗死及心室重構的病理過程，有利于深入研究相關機制。實驗小鼠購自[供應商名稱]，動物許可證號為[具體許可證號]。小鼠在溫度（22±2）℃、相對濕度（50±5）%的環(huán)境中飼養(yǎng)，給予標準飼料和自由飲水，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。將小鼠隨機分為以下三組：對照組（Control組）：小鼠僅進行開胸操作，但不結扎冠狀動脈，作為正常生理狀態(tài)下的對照，用于評估正常心臟的結構和功能，以及后續(xù)實驗結果的對比分析，每組10只小鼠。急性心梗組（AMI組）：通過結扎冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗死模型，以觀察急性心梗后心室重構的自然進程，每組15只小鼠。由于急性心梗模型構建過程中存在一定的手術死亡率，適當增加該組小鼠數(shù)量，以確保實驗數(shù)據(jù)的可靠性。miR-125b干預組（miR-125b組）：在建立急性心肌梗死模型的基礎上，通過尾靜脈注射等方式給予miR-125b模擬物或抑制劑，以調控miR-125b的表達水平，探究其對急性心梗后心室重構的影響，每組15只小鼠。同樣考慮到手術死亡率和實驗操作的影響，設置此數(shù)量的小鼠。4.1.2急性心肌梗死動物模型的構建急性心肌梗死動物模型的構建采用冠狀動脈結扎法，這是目前應用最為廣泛且經(jīng)典的建模方法，能夠較為可靠地模擬人類急性心肌梗死的病理生理過程。具體步驟如下：術前準備：小鼠術前禁食不禁水12小時，以減少術中嘔吐和誤吸的風險。用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射進行麻醉，待小鼠麻醉生效后，將其仰臥位固定于小動物手術臺上。使用脫毛劑去除小鼠胸部的毛發(fā)，然后用碘伏對手術區(qū)域進行消毒，鋪無菌手術巾，以確保手術過程的無菌環(huán)境。氣管插管與呼吸機輔助呼吸：在頸部正中做一縱向切口，鈍性分離氣管，插入氣管插管，并連接小動物呼吸機。設置呼吸機參數(shù)為：呼吸頻率120次/分鐘，潮氣量2-3ml，吸呼比1:2。氣管插管和呼吸機輔助呼吸能夠保證小鼠在手術過程中的氧氣供應，維持正常的呼吸功能，減少因呼吸抑制導致的死亡。開胸與心臟暴露：沿胸骨左緣切開皮膚和肌肉，剪斷第3-4肋骨，打開胸腔，暴露心臟。用鑷子輕輕提起心包膜，用眼科剪小心剪開，充分暴露心臟，以便后續(xù)操作。冠狀動脈結扎：在顯微鏡下，找到左心耳與肺動脈圓錐之間的冠狀動脈左前降支，用7-0絲線在左心耳根部下方約2mm處進行結扎。結扎時需注意力度適中，以觀察到結扎線下方心肌顏色變暗、搏動減弱，同時心電圖ST段明顯抬高為成功標志，表明心肌缺血梗死。結扎冠狀動脈左前降支可導致其供血區(qū)域的心肌急性缺血，進而引發(fā)心肌梗死，模擬人類急性心肌梗死的病理過程。關胸與術后護理：結扎完成后，用5-0絲線逐層縫合胸壁肌肉和皮膚。術后將小鼠置于37℃的恒溫加熱墊上，待其蘇醒后放回動物飼養(yǎng)籠中。給予青霉素鈉（40萬U/kg）肌肉注射，連續(xù)3天，以預防感染。密切觀察小鼠的生命體征和行為變化，如呼吸、心率、飲食、活動等，及時發(fā)現(xiàn)并處理異常情況。4.1.3心臟成纖維細胞的原代培養(yǎng)與鑒定心臟成纖維細胞的原代培養(yǎng)采用組織塊貼壁法，結合差速貼壁技術進行分離純化，以獲得高純度的心臟成纖維細胞，具體步驟如下：取材：取新生1-3天的C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死后，迅速將其浸泡于75%酒精中消毒3-5分鐘，以減少細菌污染。在無菌條件下打開胸腔，取出心臟，置于預冷的PBS緩沖液中，去除心臟表面的血液、脂肪和結締組織，用PBS沖洗3次，以確保心臟組織的清潔。組織塊制備：將清洗后的心臟剪成1mm×1mm×1mm左右的組織小塊，盡量保證組織塊大小均勻，有利于后續(xù)細胞的生長和貼壁。將組織小塊均勻地鋪在培養(yǎng)瓶底部，每瓶接種約20-30個組織塊，然后加入適量含20%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml）的DMEM培養(yǎng)基，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使組織塊均勻分布，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。組織塊貼壁后，細胞會從組織塊邊緣爬出并逐漸生長。差速貼壁分離：培養(yǎng)24小時后，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，去除未貼壁的組織塊和懸浮細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后，每2-3天換液一次。由于心臟成纖維細胞貼壁速度較快，而心肌細胞等其他細胞貼壁速度相對較慢，利用這一特性，在培養(yǎng)48小時后進行首次差速貼壁分離，棄去含有未貼壁心肌細胞等的上清液，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)心臟成纖維細胞。通過多次差速貼壁，可進一步提高心臟成纖維細胞的純度。傳代培養(yǎng)：當原代培養(yǎng)的心臟成纖維細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細胞2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察，當細胞變圓、開始脫離瓶壁時，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后將細胞懸液按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。細胞鑒定方面，采用免疫熒光染色法對心臟成纖維細胞進行鑒定，主要鑒定指標為波形蛋白（Vimentin）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）。具體操作如下：細胞爬片：將第2-3代心臟成纖維細胞接種于預先放置無菌蓋玻片的24孔板中，每孔接種細胞數(shù)為5×10?個，培養(yǎng)至細胞生長至50%-60%融合。細胞爬片用于后續(xù)的免疫熒光染色，可使細胞在蓋玻片上生長，便于觀察和檢測。固定與通透：取出蓋玻片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘，以去除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質。然后用4%多聚甲醛室溫固定20分鐘，使細胞結構固定，便于后續(xù)抗原抗體結合。固定后用PBS沖洗3次，每次5分鐘，再用0.1%TritonX-100室溫孵育10分鐘，增加細胞膜的通透性，使抗體能夠進入細胞內與抗原結合。孵育后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。封閉：將蓋玻片放入含有10%山羊血清的封閉液中，37℃孵育1小時，以減少非特異性染色，提高檢測的特異性。封閉后無需沖洗，直接進行下一步操作。一抗孵育：吸去封閉液，加入稀釋好的兔抗小鼠Vimentin抗體（1:200）和鼠抗小鼠α-SMA抗體（1:200），4℃孵育過夜，使抗體與細胞內的抗原充分結合。孵育后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。二抗孵育：加入稀釋好的山羊抗兔IgG-FITC（1:200）和山羊抗鼠IgG-TRITC（1:200）二抗，37℃避光孵育1小時，使二抗與一抗特異性結合，從而顯示出抗原的位置。孵育后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。細胞核染色：用DAPI（1:1000）室溫避光孵育5分鐘，對細胞核進行染色，以便觀察細胞形態(tài)和計數(shù)。孵育后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。封片與觀察：將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，Vimentin陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光，α-SMA陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光，細胞核呈現(xiàn)藍色熒光。通過觀察熒光染色結果，計算Vimentin和α-SMA陽性細胞的比例，以鑒定心臟成纖維細胞的純度。正常情況下，心臟成纖維細胞Vimentin陽性表達，而α-SMA在靜止期心臟成纖維細胞中表達較低，在活化的心臟成纖維細胞中表達增加。若Vimentin陽性細胞比例大于95%，則可認為所培養(yǎng)的細胞為高純度的心臟成纖維細胞。4.2實驗試劑與材料細胞培養(yǎng)相關試劑：DMEM培養(yǎng)基（高糖型）購自[供應商1]，貨號為[具體貨號1]，用于心臟成纖維細胞的培養(yǎng)，為細胞提供生長所需的營養(yǎng)物質和適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS）來自[供應商2]，貨號[具體貨號2]，富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進細胞的生長和增殖，在培養(yǎng)基中的添加比例為10%-20%。胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）購自[供應商3]，貨號[具體貨號3]，用于消化細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進行傳代培養(yǎng)。青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×）購自[供應商4]，貨號[具體貨號4]，在培養(yǎng)基中添加雙抗可有效防止細菌污染，保證細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。miR-125b相關試劑：miR-125bmimic和miR-125binhibitor由[公司名稱]合成，其序列經(jīng)過嚴格設計和驗證，確保能夠準確模擬或抑制內源性miR-125b的功能。miR-125bmimic是一種模擬內源性成熟miR-125b的雙鏈RNA分子，能夠上調細胞內miR-125b的表達水平；miR-125binhibitor則是一種與miR-125b互補的單鏈RNA分子，能夠特異性地抑制miR-125b的活性。此外，還購買了陰性對照mimic（NCmimic）和陰性對照inhibitor（NCinhibitor），用于排除非特異性影響，其序列與任何已知的miRNA序列均無同源性。轉染試劑選用Lipofectamine3000（Invitrogen公司，貨號[具體貨號5]），該試劑具有高效的轉染效率和較低的細胞毒性，能夠將miR-125bmimic、inhibitor以及陰性對照高效地轉染至心臟成纖維細胞中。熒光定量PCR相關試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司，貨號[具體貨號6]）用于提取細胞或組織中的總RNA，其能夠迅速裂解細胞，保持RNA的完整性，通過氯仿抽提和異丙醇沉淀等步驟，可獲得高質量的總RNA。逆轉錄試劑盒選用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司，貨號[具體貨號7]），該試劑盒能夠高效地將RNA逆轉錄為cDNA，同時具有去除基因組DNA污染的功能，提高了后續(xù)PCR反應的特異性。SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司，貨號[具體貨號8]）用于熒光定量PCR反應，其含有熱啟動TaqDNA聚合酶、SYBRGreenI熒光染料、dNTPs等成分，能夠在PCR擴增過程中實時監(jiān)測熒光信號的變化，從而對目的基因的表達水平進行定量分析。此外，還根據(jù)目的基因（如miR-125b、相關靶基因等）和內參基因（如U6、GAPDH等）的序列，設計并合成了特異性引物，引物由[引物合成公司名稱]合成，確保引物的特異性和擴增效率。westernblot相關試劑：RIPA裂解液（強）購自[供應商5]，貨號[具體貨號9]，用于裂解細胞或組織，提取總蛋白，其含有多種蛋白酶抑制劑，能夠有效防止蛋白降解。BCA蛋白定量試劑盒（[供應商6]，貨號[具體貨號10]）用于測定蛋白樣品的濃度，通過與標準蛋白曲線對比，可準確計算出樣品中的蛋白含量。SDS凝膠制備試劑盒（[供應商7]，貨號[具體貨號11]）用于制備聚丙烯酰胺凝膠，用于分離不同分子量的蛋白質。轉膜緩沖液、TBST緩沖液等試劑均按照標準配方自行配制。一抗包括針對相關靶蛋白（如SPARC、p27Kip1、α-SMA、Smad2、Smad3等）的特異性抗體，購自[抗體供應商名稱]，貨號分別為[具體貨號12-16]，二抗則選用相應的辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG抗體（[供應商8]，貨號[具體貨號17-18]）。ECL化學發(fā)光試劑盒（[供應商9]，貨號[具體貨號19]）用于檢測結合了二抗的靶蛋白，通過化學發(fā)光反應，使靶蛋白條帶在X光膠片上顯影，從而對蛋白表達水平進行半定量分析。其他試劑與材料：蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自[供應商10]，貨號[具體貨號20]，用于對心臟組織切片進行染色，觀察心肌組織的形態(tài)學變化。Masson三色染色試劑盒（[供應商11]，貨號[具體貨號21]）用于檢測心肌纖維化程度，使膠原纖維染成藍色，肌纖維染成紅色，從而直觀地觀察心肌組織中膠原纖維的沉積情況。TUNEL凋亡檢測試劑盒（[供應商12]，貨號[具體貨號22]）用于檢測心肌細胞的凋亡情況，通過標記凋亡細胞中的DNA斷裂末端，在熒光顯微鏡下可觀察到凋亡細胞發(fā)出綠色熒光。此外，還包括PBS緩沖液、多聚甲醛、二甲苯、乙醇等常規(guī)試劑，用于組織固定、脫水、透明等處理，以及各種規(guī)格的細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、離心管、移液器吸頭、凍存管等耗材，均購自[耗材供應商名稱]。4.3實驗技術與檢測指標4.3.1實時熒光定量PCR檢測miR-125b表達在細胞或組織樣品收集后，使用TRIzol試劑提取總RNA，具體操作如下：取適量細胞或組織，加入1mlTRIzol試劑，用移液器反復吹打，使其充分裂解，室溫放置5分鐘，以確保細胞內的核酸與蛋白質充分分離。接著，向裂解液中加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋后手動劇烈振蕩15秒，使溶液充分混勻，15-30℃孵育2-3分鐘，促進相分離。隨后，將樣品置于4℃，12000rpm離心15分鐘，此時混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無色水相上層，RNA全部被分配于水相中。小心吸取水相上層轉移至一干凈無RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，以沉淀其中的RNA，15-30℃孵育10分鐘后，4℃下12000rpm離心10分鐘，此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。棄去上清液，每1mlTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（用DEPC水配制），清洗RNA沉淀，混勻后4℃下7000rpm離心5分鐘，以去除殘留的雜質和鹽離子。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘，注意避免過度干燥導致RNA難以溶解。最后，加入適量無RNA酶的水，用槍反復吹打幾次，使RNA沉淀完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。RNA質量檢測采用紫外吸收法，先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以測定RNA溶液的濃度和純度。A260下讀值為1表示40μgRNA/ml，樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/ml。RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍應在1.8-2.1之間，若比值低于1.8，可能存在蛋白質或酚類污染；若比值高于2.1，可能存在RNA降解。隨后，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser為例，在冰上配制逆轉錄反應體系，總體積為10μl，包含2μl逆轉錄buffer、0.2μl上游引物、0.2μl下游引物、0.1μldNTP、0.5μl逆轉錄酶MMLV、5μlDEPC水和2μlRNA模板。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心，使反應體系充分混勻?；旌弦涸诩尤肽孓D錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，以破壞RNA的二級結構，提高逆轉錄效率，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘，進行逆轉錄反應。反應結束后，立即95℃干浴3分鐘，使逆轉錄酶失活，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。采用SYBRGreenPCRMasterMix進行熒光定量PCR反應，反應體系為20μl，包含10μlSYBRGreenPCRMasterMix、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、2μlcDNA模板以及7μlddH?O。引物根據(jù)目的基因miR-125b和內參基因U6的序列進行設計并合成，引物序列經(jīng)過驗證，確保其特異性和擴增效率。將反應體系加入到96孔板中，每個樣品設置3個復孔，以減少實驗誤差。將96孔板放入熒光定量PCR儀中，按照以下反應條件進行擴增：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，在退火階段收集熒光信號。反應結束后，根據(jù)儀器自帶的分析軟件，以U6為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算miR-125b的相對表達量，通過比較不同組間miR-125b的相對表達量，了解其在不同條件下的表達變化情況。4.3.2Westernblot檢測相關蛋白表達將細胞或組織樣品用RIPA裂解液（強）進行裂解，以提取總蛋白。取適量細胞或組織，加入預冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑，按1:100比例添加），冰上孵育30分鐘，期間每隔5-10分鐘渦旋振蕩一次，使細胞充分裂解。然后，將樣品于4℃、12000×g離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中，即為總蛋白樣品。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品的濃度，具體操作如下：將BCA工作液按照A液：B液=50:1的比例混合均勻，取不同濃度的標準蛋白（如0、2、4、6、8、10mg/ml）各20μl，加入到96孔板中，同時取20μl待測蛋白樣品加入到96孔板中，每個樣品設置3個復孔。向各孔中加入200μlBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘，使蛋白與BCA試劑充分反應。反應結束后，在酶標儀上測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算出樣品中的蛋白含量。根據(jù)蛋白濃度，取適量蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使終濃度為1×，煮沸5分鐘，使蛋白變性。然后，將變性后的蛋白樣品進行SDS凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，如對于分子量較小的蛋白（<50kDa），可選擇12%-15%的分離膠；對于分子量較大的蛋白（>100kDa），可選擇8%-10%的分離膠。電泳時，先在濃縮膠中以80V電壓電泳30-40分鐘，使蛋白樣品在濃縮膠中充分濃縮，然后在分離膠中以120V電壓電泳1-2小時，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，使不同分子量的蛋白得到有效分離。電泳結束后，將蛋白從凝膠轉移至PVDF膜上，采用濕轉法進行轉膜。轉膜緩沖液為含有25mMTris、192mM甘氨酸和20%甲醇的溶液，在冰浴條件下進行轉膜，以避免蛋白變性。將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其充分活化，然后將PVDF膜、凝膠和濾紙按照“負極-濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙-正極”的順序依次放置在轉膜裝置中，注意排除氣泡，以確保轉膜效率。在100V電壓下轉膜1-2小時，根據(jù)目的蛋白分子量大小調整轉膜時間，分子量較小的蛋白轉膜時間可適當縮短，分子量較大的蛋白轉膜時間可適當延長。轉膜結束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性結合。封閉后，將PVDF膜與一抗孵育，一抗包括針對相關靶蛋白（如SPARC、p27Kip1、α-SMA、Smad2、Smad3等）的特異性抗體，按照抗體說明書進行稀釋，如通常稀釋比例為1:500-1:2000，4℃孵育過夜，使一抗與靶蛋白充分結合。孵育后，用TBST緩沖液（含0.1%Tween-20的Tris-HCl緩沖液）洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結合的一抗。然后，將PVDF膜與相應的辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二抗孵育，二抗稀釋比例為1:2000-1:5000，室溫孵育1-2小時。孵育后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結合的二抗。最后，使用ECL化學發(fā)光試劑盒對結合了二抗的靶蛋白進行檢測，將PVDF膜浸入ECL工作液中，孵育1-2分鐘，使靶蛋白條帶在X光膠片上顯影，通過ImageJ等圖像分析軟件對蛋白條帶進行灰度分析，以半定量分析蛋白表達水平的變化，通過比較不同組間蛋白條帶的灰度值，了解相關蛋白在不同條件下的表達差異。4.3.3細胞增殖與遷移實驗細胞增殖實驗采用CCK-8法和EdU法。CCK-8法操作如下：將心臟成纖維細胞以5×103-1×10?個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組設置5-6個復孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、24、48、72小時后進行檢測。檢測時，每孔加入10μlCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時，使CCK-8試劑與細胞內的脫氫酶反應生成Formazan染料。反應結束后，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值，吸光度值與細胞數(shù)量成正比，通過比較不同時間點和不同組間的吸光度值，繪制細胞生長曲線，以評估細胞的增殖能力。EdU法檢測細胞增殖則是利用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標記正在進行DNA合成的細胞。將心臟成纖維細胞以5×10?-1×10?個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組設置3-4個復孔。培養(yǎng)24小時后，向每孔中加入EdU工作液（按照EdU試劑盒說明書進行配制，終濃度一般為50-100μM），繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時，使EdU摻入正在合成DNA的細胞中。孵育結束后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，以去除未摻入的EdU。然后，按照EdU試劑盒說明書進行細胞固定、通透和染色等步驟，固定細胞常用4%多聚甲醛，室溫固定15-20分鐘；通透細胞使用0.5%TritonX-100，室溫孵育10分鐘；染色則使用含有Apollo熒光染料的反應液，室溫避光孵育30分鐘。染色結束后，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計EdU陽性細胞（即摻入EdU的細胞，呈現(xiàn)紅色熒光）的數(shù)量，計算EdU陽性細胞占總細胞數(shù)的比例，以評估細胞的增殖能力。細胞遷移實驗采用劃痕實驗和Transwell實驗。劃痕實驗操作如下：將心臟成纖維細胞以1×10?-2×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，待細胞生長至80%-90%融合時，用10μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃痕，盡量保證劃痕寬度一致。劃痕后，用PBS輕輕洗滌細胞3次，以去除劃下的細胞碎片，然后加入無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0、12、24小時在顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，細胞遷移率=（0小時劃痕寬度-t小時劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%，通過比較不同組間的細胞遷移率，評估細胞的遷移能力。Transwell實驗則使用Transwell小室（8μm孔徑），上室加入200μl無血清DMEM培養(yǎng)基重懸的心臟成纖維細胞（細胞密度為1×10?-5×10?個/ml），下室加入600μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于24孔板中，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時。培養(yǎng)結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將小室浸入4%多聚甲醛中固定15-20分鐘，再用0.1%結晶紫染色10-15分鐘。染色結束后，用PBS沖洗小室3次，在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數(shù)遷移到下室膜表面的細胞數(shù)量，通過比較不同組間遷移細胞的數(shù)量，評估細胞的遷移能力。4.3.4動物心臟功能檢測在小鼠急性心肌梗死后的不同時間點（如術后1周、2周、4周等），使用超聲心動圖對小鼠心臟功能進行檢測。檢測前，先將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉生效后，將其仰臥位固定于小動物專用超聲檢測臺上，使用脫毛劑去除小鼠胸部的毛發(fā)，以減少超聲信號的衰減。然后，在小鼠胸部涂抹適量的超聲耦合劑，以確保超聲探頭與皮膚之間的良好接觸。使用高頻超聲心動圖儀（如Vevo2100ImagingSystem，配備30MHz線性陣列換能器）進行檢測，在多個視圖下完成二維長軸、連續(xù)短軸視圖和四腔心多普勒超聲檢查。在二維長軸視圖下，測量左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、左心室舒張末期后壁厚度（LVPWd）、左心室舒張末期前壁厚度（LVAWd）等結構參數(shù)；在M型超聲心動圖模式下，測量左心室射血分數(shù)（EF）、短軸縮短率（FS）等功能參數(shù)，EF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%，F(xiàn)S=（LVEDD-LVESD）/LVEDD×100%，其中LVEDV為左心室舒張末期容積，LVESV為左心室收縮末期容積。通過測量這些參數(shù)，可以評估小鼠心臟的結構和功能變化，EF和FS是反映心臟收縮功能的重要指標，EF值降低、FS值減小提示心臟收縮功能受損；LVEDD和LVESD增大、LVPWd和LVAWd增厚則提示心臟發(fā)生了重構。同時，利用頻譜多普勒超聲心動圖評估心臟瓣膜反流速度和壓力階差等血流動力學參數(shù)，如檢測二尖瓣反流速度、主動脈瓣口血流速度等，這些參數(shù)可以反映心臟瓣膜的關閉功能和血流的通暢程度，二尖瓣反流速度增加、主動脈瓣口血流速度異常改變可能提示心臟瓣膜病變或心臟功能異常。在檢測過程中，盡量避免在圖像采集時對小鼠胸部造成任何壓縮，控制多普勒波束與流向截角在60°以內，以確保測量數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。每個參數(shù)測量3-5次，取平均值，通過比較不同組間小鼠心臟功能參數(shù)的差異，分析miR-125b對急性心梗后小鼠心臟功能的影響。4.3.5心肌組織病理學分析小鼠處死后，迅速取出心臟，用4%多聚甲醛固定24-48小時，使心肌組織的形態(tài)和結構得以固定。固定后的心臟經(jīng)梯度乙醇脫水（依次用70%、80%、90%、95%、100%乙醇各浸泡1-2小時），二甲苯透明（浸泡30分鐘-1小時），然后進行石蠟包埋，將心臟組織包埋在石蠟中，制成石蠟塊。使用切片機將石蠟塊切成厚度為4-5μm的切片，將切片裱貼在載玻片上，60℃烤片1-2小時，使切片牢固附著在載玻片上。進行HE染色時，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15分鐘，以脫蠟；然后依次經(jīng)過100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡3-5分鐘，進行水化；接著將切片放入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細胞核染成藍色；用自來水沖洗切片，去除多余的蘇木精染液，再將切片放入1%鹽酸乙醇分化液中分化3-5秒，使細胞核顏色清晰；然后用自來水沖洗切片，再將切片放入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細胞質染成紅色；最后依次經(jīng)過70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各浸泡3-5分鐘，進行脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡10-15分鐘，進行透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)學變化，正常心肌組織心肌細胞排列整齊，細胞質豐富均勻，間質正常；急性心梗組心肌組織可見部分心肌細胞核丟失五、實驗結果與分析5.1miR-125b在急性心梗后心臟組織及心臟成纖維細胞中的表達變化利用實時熒光定量PCR技術，對急性心梗后不同時間點的小鼠心臟組織以及體外培養(yǎng)的心臟成纖維細胞中miR-125b的表達水平進行了檢測。在急性心梗小鼠心臟組織中，結果顯示（圖1）：與對照組相比，急性心梗組小鼠在術后1天，心臟組織中miR-125b的表達水平開始出現(xiàn)明顯下降（P<0.05），至術后3天，miR-125b的表達進一步降低，達到最低水平（P<0.01）。隨后，在術后7天和14天，miR-125b的表達水平雖有一定程度的回升，但仍顯著低于對照組（P<0.05）。這表明在急性心梗后的早期階段，miR-125b的表達受到明顯抑制，隨著時間的推移，其表達有一定的恢復趨勢，但仍處于較低水平。[此處插入急性心梗后小鼠心臟組織中miR-125b表達變化的折線圖，橫坐標為時間（天），縱坐標為miR-125b相對表達量，包含對照組、急性心梗術后1天、3天、7天、14天的數(shù)據(jù)]對于體外培養(yǎng)的心臟成纖維細胞，將細胞分為正常對照組和缺氧處理組，模擬急性心梗后的缺氧微環(huán)境。結果發(fā)現(xiàn)（圖2）：缺氧處理24小時后，心臟成纖維細胞中miR-125b的表達水平顯著低于正常對照組（P<0.01）。進一步延長缺氧時間至48小時，miR-125b的表達水平持續(xù)下降（P<0.01）。這說明在缺氧條件下，心臟成纖維細胞內miR-125b的表達明顯降低，且隨著缺氧時間的延長，這種抑制作用更為顯著。[此處插入缺氧處理后心臟成纖維細胞中miR-125b表達變化的柱狀圖，橫坐標為處理組（正常對照、缺氧24h、缺氧48h），縱坐標為miR-125b相對表達量]通過對急性心梗后心臟組織及心臟成纖維細胞中miR-125b表達變化的檢測，明確了miR-125b在急性心梗后的表達趨勢，為后續(xù)研究miR-125b對心臟成纖維細胞功能的調控以及對急性心梗后心室重構的影響奠定了基礎。5.2miR-125b對心臟成纖維細胞功能的影響5.2.1對細胞增殖能力的影響為探究miR-125b對心臟成纖維細胞增殖能力的影響，分別進行了CCK-8實驗和EdU實驗。CCK-8實驗結果（圖3）顯示：在正常培養(yǎng)條件下，對照組細胞的增殖呈現(xiàn)出穩(wěn)定的上升趨勢。當轉染miR-125bmimic以過表達miR-125b后，細胞在24、48和72小時的OD450值均顯著低于對照組（P<0.05），表明細胞增殖能力受到明顯抑制。相反，轉染miR-125binhibitor抑制miR-125b表達后，細胞在各時間點的OD450值顯著高于對照組（P<0.05），細胞增殖能力明顯增強。這說明miR-125b的表達水平與心臟成纖維細胞的增殖能力呈負相關，過表達miR-125b可抑制細胞增殖，而抑制miR-125b表達則促進細胞增殖。[此處插入CCK-8實驗檢測心臟成纖維細胞增殖能力的柱狀圖，橫坐標為時間（小時）和處理組