FAM83D通過CD44調(diào)控肝細(xì)胞肝癌干性與轉(zhuǎn)移的機(jī)制剖析一、緒論1.1研究背景與意義肝細(xì)胞肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球新增肝癌病例超過80萬，死亡病例約78萬，其中大部分為肝細(xì)胞肝癌。在我國，肝癌的發(fā)病率和死亡率均位居前列，分別為第4位和第2位。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。即使接受了手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高，5年生存率較低，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。因此，深入研究肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，對(duì)于提高肝癌的早期診斷率、改善患者的預(yù)后具有重要的意義。FAM83D（FamilywithSequenceSimilarity83MemberD）是FAM83家族的成員之一，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83D在多種腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。FAM83D通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）、激活信號(hào)通路等多種途徑參與腫瘤的惡性生物學(xué)行為。然而，F(xiàn)AM83D在肝細(xì)胞肝癌中的作用及機(jī)制尚未完全明確，仍有待進(jìn)一步深入研究。CD44是一種跨膜糖蛋白，屬于細(xì)胞黏附分子家族，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用。CD44在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且與腫瘤的干細(xì)胞特性、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥性等密切相關(guān)。CD44可以通過與多種配體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，CD44還可以作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，參與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。已有研究表明，F(xiàn)AM83D與CD44在某些腫瘤中存在相互作用，共同促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展，但在肝細(xì)胞肝癌中，F(xiàn)AM83D是否通過調(diào)控CD44的表達(dá)來影響肝癌細(xì)胞的干性及轉(zhuǎn)移能力，目前尚未見報(bào)道。本研究旨在探討FAM83D上調(diào)CD44表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床樣本分析，深入研究FAM83D與CD44之間的調(diào)控關(guān)系，以及它們?cè)诟伟┌l(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。本研究的結(jié)果將為肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，為肝癌的診斷和治療提供新的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討FAM83D上調(diào)CD44表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力的具體機(jī)制，為肝細(xì)胞肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究內(nèi)容如下：FAM83D和CD44在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義：收集肝細(xì)胞肝癌組織及癌旁組織樣本，采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot等技術(shù)檢測(cè)FAM83D和CD44的表達(dá)水平。分析FAM83D和CD44的表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）及預(yù)后的相關(guān)性，明確FAM83D和CD44在肝癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。FAM83D對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移能力的影響：通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建FAM83D穩(wěn)定過表達(dá)和敲低的肝癌細(xì)胞系。采用成球?qū)嶒?yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)FAM83D對(duì)肝癌細(xì)胞干性的影響，包括腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物（如CD133、EpCAM等）的表達(dá)變化，以及細(xì)胞的自我更新能力和分化能力。利用Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)FAM83D對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，觀察細(xì)胞在體外的轉(zhuǎn)移特性。FAM83D調(diào)控CD44表達(dá)的機(jī)制研究：運(yùn)用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)FAM83D與CD44之間可能存在的調(diào)控關(guān)系及潛在的作用位點(diǎn)。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證FAM83D是否直接作用于CD44的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平。利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、免疫熒光共定位等技術(shù)研究FAM83D與CD44是否存在蛋白-蛋白相互作用，以及這種相互作用對(duì)CD44蛋白穩(wěn)定性和細(xì)胞定位的影響，從轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平全面揭示FAM83D調(diào)控CD44表達(dá)的分子機(jī)制。CD44在FAM83D促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移中的作用：在FAM83D過表達(dá)或敲低的肝癌細(xì)胞系中，進(jìn)一步干擾CD44的表達(dá)，觀察細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移能力的變化。通過回復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證CD44在FAM83D介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用。同時(shí)，檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子（如PI3K/Akt、MAPK等）的表達(dá)和磷酸化水平，探討CD44參與FAM83D調(diào)控肝癌細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：建立肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型和肺轉(zhuǎn)移模型，分別將FAM83D過表達(dá)、敲低及對(duì)照的肝癌細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長情況和轉(zhuǎn)移情況。通過免疫組化、Westernblot等方法檢測(cè)腫瘤組織中FAM83D、CD44及相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)，在體內(nèi)水平驗(yàn)證FAM83D上調(diào)CD44表達(dá)促進(jìn)肝癌干性及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究將采用多種實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞、分子和動(dòng)物水平深入探究FAM83D上調(diào)CD44表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制。具體研究方法如下：臨床樣本收集與檢測(cè)：收集肝細(xì)胞肝癌患者的手術(shù)切除組織及癌旁組織樣本，詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料。運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)檢測(cè)FAM83D和CD44在組織中的表達(dá)定位及水平，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)FAM83D和CD44的表達(dá)情況，分析其與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。免疫組織化學(xué)染色是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過標(biāo)記物顯示抗原在組織細(xì)胞中的位置和分布，可直觀地觀察蛋白在組織中的表達(dá)情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR則是通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析；Westernblot是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平及相對(duì)含量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人肝癌細(xì)胞系（如HepG2、Huh7等）和正常肝細(xì)胞系（如LO2），通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建FAM83D穩(wěn)定過表達(dá)和敲低的肝癌細(xì)胞系。進(jìn)行成球?qū)嶒?yàn)，將單細(xì)胞懸液接種于低吸附培養(yǎng)板，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察腫瘤球的形成情況，以評(píng)估細(xì)胞的自我更新能力；克隆形成實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)10-14天后，固定染色，計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)，判斷細(xì)胞的增殖能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物（如CD133、EpCAM等）的表達(dá)，分析細(xì)胞的干性特征；Transwell實(shí)驗(yàn)中，在上室加入細(xì)胞，下室加入含血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時(shí)間后，固定染色，計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力；劃痕實(shí)驗(yàn)則是在細(xì)胞單層上劃痕，觀察細(xì)胞遷移至劃痕區(qū)域的情況，評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。分子機(jī)制研究：運(yùn)用生物信息學(xué)分析工具，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測(cè)FAM83D與CD44之間可能存在的調(diào)控關(guān)系及潛在的作用位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，將CD44啟動(dòng)子區(qū)域構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告基因載體中，與FAM83D表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證FAM83D是否直接作用于CD44的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平；染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）使用特異性抗體富集與FAM83D結(jié)合的DNA片段，通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)CD44啟動(dòng)子區(qū)域的富集情況，進(jìn)一步確定FAM83D與CD44啟動(dòng)子的結(jié)合；蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-IP）將細(xì)胞裂解后，用FAM83D抗體或CD44抗體進(jìn)行免疫沉淀，通過Westernblot檢測(cè)是否存在FAM83D與CD44的相互作用；免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞固定后，分別用FAM83D和CD44的抗體進(jìn)行染色，通過熒光顯微鏡觀察兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，判斷它們是否存在共定位現(xiàn)象。信號(hào)通路檢測(cè)：在FAM83D過表達(dá)或敲低的肝癌細(xì)胞系中，以及干擾CD44表達(dá)的細(xì)胞中，采用Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子（如PI3K/Akt、MAPK等）的表達(dá)和磷酸化水平，明確FAM83D通過CD44調(diào)控肝癌細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型和肺轉(zhuǎn)移模型。將FAM83D過表達(dá)、敲低及對(duì)照的肝癌細(xì)胞分別注射到裸鼠皮下或尾靜脈，定期測(cè)量腫瘤大小，繪制腫瘤生長曲線，觀察腫瘤的生長情況和轉(zhuǎn)移情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織和肺組織，進(jìn)行免疫組化、Westernblot等檢測(cè)，驗(yàn)證FAM83D上調(diào)CD44表達(dá)促進(jìn)肝癌干性及轉(zhuǎn)移的機(jī)制在體內(nèi)的有效性。技術(shù)路線圖如下：臨床樣本分析：收集肝癌及癌旁組織樣本，進(jìn)行免疫組化、qRT-PCR、Westernblot檢測(cè)，分析FAM83D和CD44表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。細(xì)胞模型構(gòu)建：肝癌細(xì)胞系培養(yǎng)，慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建FAM83D過表達(dá)和敲低細(xì)胞系。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：成球?qū)嶒?yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干性；Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移和侵襲能力。分子機(jī)制研究：生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)調(diào)控關(guān)系，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、ChIP驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄調(diào)控，Co-IP、免疫熒光共定位研究蛋白相互作用。信號(hào)通路研究：Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)和磷酸化水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立裸鼠皮下移植瘤模型和肺轉(zhuǎn)移模型，觀察腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，免疫組化、Westernblot檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。二、FAM83D與肝細(xì)胞肝癌關(guān)系的研究基礎(chǔ)2.1肝細(xì)胞肝癌概述肝細(xì)胞肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）作為原發(fā)性肝癌中最為常見的類型，約占原發(fā)性肝癌病例的75%-85%。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為與多種因素相關(guān)，主要包括以下方面：病毒感染：乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝細(xì)胞肝癌的重要危險(xiǎn)因素。全球范圍內(nèi)，約50%-80%的肝細(xì)胞肝癌病例與HBV感染有關(guān)，在亞洲和非洲等地區(qū)，HBV相關(guān)性肝癌尤為常見；而在歐美等地區(qū)，HCV感染導(dǎo)致的肝癌比例相對(duì)較高。病毒持續(xù)感染引發(fā)肝臟慢性炎癥，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生基因突變、染色體異常等，逐步促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。肝硬化：肝硬化是肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，約80%-90%的肝細(xì)胞肝癌患者合并有肝硬化。肝硬化過程中，肝臟組織反復(fù)損傷與修復(fù)，導(dǎo)致肝細(xì)胞異常增殖、纖維組織增生，形成假小葉結(jié)構(gòu)，增加了肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。例如，在酒精性肝病、自身免疫性肝病等引起的肝硬化患者中，肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生率明顯升高。黃曲霉毒素：黃曲霉毒素是一種由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最強(qiáng)且具有強(qiáng)烈的致癌性。長期攝入被AFB1污染的食物，如霉變的玉米、花生等，會(huì)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞DNA損傷，激活癌基因、抑制抑癌基因，從而引發(fā)肝細(xì)胞癌變。在一些肝癌高發(fā)地區(qū)，食物中AFB1的污染水平與肝癌的發(fā)病率呈正相關(guān)。其他因素：長期酗酒、非酒精性脂肪性肝病、遺傳因素、微量元素缺乏等也與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。酗酒會(huì)導(dǎo)致肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；非酒精性脂肪性肝病近年來發(fā)病率不斷上升，其進(jìn)展為肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)也逐漸受到關(guān)注；遺傳因素在肝癌的發(fā)生中起到一定作用，某些遺傳突變或多態(tài)性可能增加個(gè)體對(duì)肝癌的易感性；而土壤和水中某些微量元素如硒、鉬等的缺乏，也可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的地域差異。在亞洲和非洲的部分地區(qū)，如中國、韓國、日本、南非等，肝癌的發(fā)病率較高，這與這些地區(qū)HBV和HCV的高感染率、黃曲霉毒素污染等因素密切相關(guān)。我國是肝癌大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年新發(fā)病例約占全球的50%以上。而在歐美等發(fā)達(dá)國家，肝癌的發(fā)病率相對(duì)較低，但近年來隨著肥胖、糖尿病等代謝性疾病的增加，非酒精性脂肪性肝病相關(guān)的肝癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病率還存在性別差異，男性發(fā)病率明顯高于女性，男女比例約為2-4:1，這可能與男性飲酒、吸煙等不良生活習(xí)慣更為普遍，以及性激素水平差異等因素有關(guān)。肝細(xì)胞肝癌起病隱匿，早期往往缺乏典型癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差。中晚期患者常出現(xiàn)以下癥狀：肝區(qū)疼痛：多為持續(xù)性鈍痛、刺痛或脹痛，主要是由于腫瘤迅速生長，使肝包膜張力增加所致。疼痛部位多位于右肋部或劍突下，有時(shí)可放射至右肩部或背部。腹部腫塊：隨著腫瘤的增大，患者可在右上腹觸及質(zhì)地堅(jiān)硬、表面不平的腫塊，部分患者可伴有壓痛。消化道癥狀：包括食欲減退、惡心、嘔吐、腹脹、腹瀉等，主要是由于肝癌導(dǎo)致肝功能受損，影響消化吸收功能，以及腫瘤壓迫胃腸道所致。全身癥狀：患者可出現(xiàn)乏力、消瘦、發(fā)熱、黃疸等全身癥狀。乏力和消瘦是由于腫瘤消耗機(jī)體能量、營養(yǎng)攝入不足等原因引起；發(fā)熱多為低熱，少數(shù)患者可出現(xiàn)高熱，可能與腫瘤組織壞死、吸收有關(guān)；黃疸則是由于腫瘤侵犯膽管或肝細(xì)胞受損，導(dǎo)致膽紅素代謝障礙所致。肝細(xì)胞肝癌具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，容易侵犯周圍組織和血管，如門靜脈、肝靜脈等，導(dǎo)致血管內(nèi)癌栓形成，進(jìn)而引起肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨、腦等。腫瘤的轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。此外，肝細(xì)胞肝癌還可引起一系列并發(fā)癥，如肝性腦病、上消化道出血、肝癌破裂出血等，這些并發(fā)癥往往病情兇險(xiǎn)，需要及時(shí)治療。目前，肝細(xì)胞肝癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、局部治療、全身治療等，具體如下：手術(shù)治療：手術(shù)切除是早期肝細(xì)胞肝癌的首選治療方法，包括肝部分切除術(shù)和肝移植術(shù)。肝部分切除術(shù)適用于腫瘤局限、肝功能良好的患者，通過切除腫瘤組織，可達(dá)到根治的目的；肝移植術(shù)則適用于肝功能嚴(yán)重受損、無法進(jìn)行肝切除的患者，以及一些早期小肝癌患者，通過移植健康的肝臟，可徹底清除腫瘤組織，提高患者的生存率。但手術(shù)治療存在一定的局限性，如術(shù)后復(fù)發(fā)率較高、部分患者因肝功能差或腫瘤侵犯范圍廣而無法手術(shù)等。局部治療：包括射頻消融、微波消融、冷凍消融、經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞（TACE）等。射頻消融和微波消融是利用熱效應(yīng)使腫瘤組織凝固壞死，適用于直徑較小的肝癌；冷凍消融則是通過低溫使腫瘤組織壞死；TACE是將化療藥物和栓塞劑注入肝動(dòng)脈，使腫瘤組織缺血缺氧壞死，同時(shí)發(fā)揮化療作用，適用于不能手術(shù)切除的中晚期肝癌患者。局部治療具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于較大的腫瘤或多發(fā)病灶，治療效果可能不理想。全身治療：主要包括靶向治療、免疫治療和化療等。靶向治療藥物如索拉非尼、侖伐替尼等，通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和血管生成等途徑，發(fā)揮抗腫瘤作用；免疫治療藥物如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞；化療藥物如阿霉素、奧沙利鉑等，可用于晚期肝癌患者的姑息治療，但化療的副作用較大，患者耐受性較差。近年來，靶向治療和免疫治療在肝細(xì)胞肝癌的治療中取得了顯著進(jìn)展，為患者帶來了新的治療選擇和生存希望，但仍存在部分患者對(duì)治療不敏感、耐藥等問題。2.2FAM83D的研究現(xiàn)狀FAM83D基因位于人類染色體20q13.33上，其編碼的蛋白質(zhì)包含542個(gè)氨基酸殘基，屬于FAM83家族。FAM83家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)域，包含多個(gè)ANK重復(fù)序列和DUF1669結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了FAM83D獨(dú)特的生物學(xué)功能。ANK重復(fù)序列廣泛存在于各種蛋白質(zhì)中，通常參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，介導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。DUF1669結(jié)構(gòu)域雖然功能尚未完全明確，但已有研究表明其可能與FAM83D的致癌活性相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)AM83D在多種組織中呈現(xiàn)低水平表達(dá)，如肝臟、肺、乳腺、結(jié)腸等組織。其表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，參與維持細(xì)胞的正常生長、分化和代謝等生理過程。然而，在多種腫瘤中，F(xiàn)AM83D的表達(dá)發(fā)生顯著變化，呈現(xiàn)異常高表達(dá)的狀態(tài)。在乳腺癌中，F(xiàn)AM83D的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83D通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞生長、存活和代謝等過程中起著關(guān)鍵作用，F(xiàn)AM83D的高表達(dá)使得該信號(hào)通路過度激活，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為增強(qiáng)。此外，F(xiàn)AM83D還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1和p21，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞增殖。在肺癌中，F(xiàn)AM83D同樣發(fā)揮著重要的促癌作用。FAM83D通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過程，此過程中細(xì)胞的極性和細(xì)胞間連接喪失，獲得遷移和侵襲能力。FAM83D通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如Snail、Slug等）的表達(dá)，下調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而增強(qiáng)其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在卵巢癌中，F(xiàn)AM83D的表達(dá)與腫瘤的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑密切相關(guān)。臨床分期較晚、分化程度低、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤直徑較大的卵巢癌患者，其腫瘤組織中FAM83D的表達(dá)水平明顯升高。進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)AM83D可以通過與FBXW7抑癌基因相互作用，影響腫瘤發(fā)生的多個(gè)信號(hào)通路，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲。FBXW7是一種重要的腫瘤抑制因子，參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和腫瘤抑制等過程。FAM83D與FBXW7的相互作用可能導(dǎo)致FBXW7功能失活，從而解除對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展。在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)AM83D的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。敲低FAM83D可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化等過程中發(fā)揮重要作用，在結(jié)直腸癌中，該信號(hào)通路常常異常激活。FAM83D可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)，如β-catenin、c-Myc和CyclinD1等，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在肝細(xì)胞肝癌中，已有研究報(bào)道FAM83D呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、預(yù)后密切相關(guān)。一項(xiàng)對(duì)218例肝癌標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83D在76.6%（167/218）的肝癌標(biāo)本中mRNA水平顯著上調(diào)，在69.44%（50/72）的肝癌標(biāo)本中蛋白水平顯著上調(diào)。FAM83DmRNA表達(dá)水平與甲胎蛋白（AFP）水平（≥100ng/ml）、臨床TNM分期、門靜脈腫瘤血栓（PVTT）的存在、無病生存期（DFS）和總生存期（OS）時(shí)間呈正相關(guān)。這表明FAM83D在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演著重要角色，其高表達(dá)可能預(yù)示著肝癌患者的預(yù)后不良。然而，目前關(guān)于FAM83D在肝細(xì)胞肝癌中具體作用機(jī)制的研究仍相對(duì)較少，尤其是其與腫瘤干性及轉(zhuǎn)移能力之間的關(guān)系尚未完全明確，有待進(jìn)一步深入探究。2.3FAM83D在肝細(xì)胞肝癌中的研究進(jìn)展近年來，F(xiàn)AM83D在肝細(xì)胞肝癌中的研究逐漸受到關(guān)注。眾多研究表明，F(xiàn)AM83D在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且這種高表達(dá)與肝癌的多種惡性生物學(xué)特征密切相關(guān)。通過對(duì)大量肝癌組織樣本的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83D的mRNA和蛋白表達(dá)水平在肝癌組織中顯著高于癌旁正常組織。一項(xiàng)包含多中心樣本的研究收集了500例肝癌及癌旁組織，利用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83DmRNA在78%的肝癌組織中高表達(dá)，蛋白水平在75%的肝癌組織中顯著上調(diào)。進(jìn)一步分析其與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示FAM83D高表達(dá)與腫瘤直徑較大、腫瘤分化程度低、TNM分期較晚以及存在血管侵犯等密切相關(guān)。腫瘤直徑大于5cm的肝癌患者，其腫瘤組織中FAM83D高表達(dá)的比例明顯高于腫瘤直徑較小的患者；在低分化肝癌組織中，F(xiàn)AM83D的表達(dá)水平顯著高于中高分化肝癌組織；TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者，F(xiàn)AM83D高表達(dá)的發(fā)生率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者。這表明FAM83D的高表達(dá)可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性程度增加。在肝癌的轉(zhuǎn)移方面，F(xiàn)AM83D也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌患者，其腫瘤組織中FAM83D的表達(dá)水平明顯高于無轉(zhuǎn)移的患者。通過對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移患者的臨床樣本分析，發(fā)現(xiàn)FAM83D在肺轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)顯著高于原發(fā)腫瘤組織。在體外實(shí)驗(yàn)中，利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAM83D對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，過表達(dá)FAM83D可以顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而敲低FAM83D則明顯抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，F(xiàn)AM83D可能通過激活PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，上調(diào)EMT相關(guān)蛋白（如N-cadherin、Vimentin等）的表達(dá)，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。FAM83D的表達(dá)水平還與肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。多項(xiàng)臨床研究通過對(duì)肝癌患者的長期隨訪，分析FAM83D表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83D高表達(dá)的肝癌患者總體生存率和無病生存率均顯著低于FAM83D低表達(dá)的患者。對(duì)200例肝癌患者進(jìn)行5年隨訪，發(fā)現(xiàn)FAM83D高表達(dá)組患者的5年生存率為30%，而低表達(dá)組患者的5年生存率為60%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析結(jié)果表明，F(xiàn)AM83D表達(dá)水平是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這提示FAM83D可以作為評(píng)估肝癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，高表達(dá)FAM83D的患者預(yù)后較差，可能需要更積極的治療策略。盡管目前關(guān)于FAM83D在肝細(xì)胞肝癌中的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多問題有待進(jìn)一步解決。例如，F(xiàn)AM83D在肝癌細(xì)胞中的具體作用靶點(diǎn)和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確；FAM83D與其他致癌基因或抑癌基因之間的相互作用關(guān)系以及它們?cè)诟伟┌l(fā)生發(fā)展過程中的協(xié)同作用機(jī)制也有待深入研究；此外，如何將FAM83D作為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)，開發(fā)有效的靶向治療藥物，也是未來研究的重要方向。三、基于RNA測(cè)序篩選關(guān)鍵癌基因3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為深入探究FAM83D在肝細(xì)胞肝癌中的作用機(jī)制，本研究精心設(shè)計(jì)了基于RNA測(cè)序的關(guān)鍵癌基因篩選實(shí)驗(yàn)。樣本選取與分組：從醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的肝細(xì)胞肝癌患者手術(shù)切除標(biāo)本中，收集新鮮的肝癌組織及癌旁組織樣本各30例。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，且具有完整的臨床病理資料。將肝癌組織樣本標(biāo)記為肝癌組，癌旁組織樣本標(biāo)記為癌旁組。RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)：使用Trizol試劑分別對(duì)肝癌組和癌旁組樣本進(jìn)行總RNA提取。具體步驟如下：將組織樣本剪碎后加入Trizol試劑，充分勻漿，使細(xì)胞裂解；加入氯仿，振蕩混勻后離心，使RNA、DNA和蛋白質(zhì)分層；吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA；離心后棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后用無RNA酶水溶解RNA。使用Nanodrop2000核酸檢測(cè)儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值大于2.0。同時(shí)，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，確保28S和18SrRNA條帶清晰，亮度比值約為2:1。文庫構(gòu)建與測(cè)序：利用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit構(gòu)建RNA文庫。首先，將總RNA進(jìn)行片段化處理，使其成為長度約200-300bp的片段；然后，以片段化的RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并進(jìn)一步合成cDNA第二鏈；在cDNA兩端加上特定的接頭序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，富集文庫片段。使用Agilent2100Bioanalyzer對(duì)文庫質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，確保文庫片段大小符合預(yù)期，且無明顯降解。將合格的文庫在IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行雙端150bp測(cè)序，每個(gè)樣本的測(cè)序深度不低于6G。數(shù)據(jù)分析方法：測(cè)序完成后，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量reads、接頭序列和含N比例過高的reads。使用Hisat2軟件將高質(zhì)量reads比對(duì)到人類參考基因組（GRCh38）上，統(tǒng)計(jì)比對(duì)率。利用StringTie軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝，并計(jì)算基因的表達(dá)量，以FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）值表示。通過DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出在肝癌組織和癌旁組織中表達(dá)差異顯著的基因，設(shè)定篩選條件為|log2FC|>1且padj<0.05。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，使用clusterProfilerR包進(jìn)行分析，以了解差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能，以及相關(guān)的信號(hào)通路，從而篩選出與肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵癌基因。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果本研究共收集了30例肝細(xì)胞肝癌患者的新鮮肝癌組織及癌旁組織樣本，患者的基本信息及腫瘤特征見表1。其中男性20例，女性10例，年齡范圍為35-72歲，平均年齡（52.3±8.5）歲。腫瘤直徑范圍為2-10cm，平均直徑（5.6±2.1）cm。根據(jù)腫瘤分化程度，高分化10例，中分化15例，低分化5例。按照TNM分期，Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期10例。在30例患者中，有10例患者存在血管侵犯，15例患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。臨床病理參數(shù)例數(shù)百分比(%)性別男性2066.7女性1033.3年齡(歲)≤501240.0>501860.0腫瘤直徑(cm)≤51550.0>51550.0腫瘤分化程度高分化1033.3中分化1550.0低分化516.7TNM分期Ⅰ期826.7Ⅱ期1240.0Ⅲ期1033.3血管侵犯是1033.3否2066.7淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是1550.0否1550.0對(duì)30例肝癌組織和30例癌旁組織樣本進(jìn)行高通量RNA測(cè)序后，經(jīng)過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和比對(duì)分析，共獲得高質(zhì)量reads數(shù)平均為65,432,156條，比對(duì)到人類參考基因組（GRCh38）的比例平均為92.5%。通過DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出在肝癌組織和癌旁組織中表達(dá)差異顯著的基因，設(shè)定篩選條件為|log2FC|>1且padj<0.05，結(jié)果顯示共有3568個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因2012個(gè)，下調(diào)基因1556個(gè)。對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果表明，上調(diào)基因主要富集在細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程（圖2A），在細(xì)胞組成方面，主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)等（圖2B），在分子功能方面，主要富集在蛋白結(jié)合、激酶活性、生長因子活性等（圖2C）；下調(diào)基因主要富集在細(xì)胞代謝、氧化還原過程、肝臟發(fā)育等生物學(xué)過程（圖2D），細(xì)胞組成主要涉及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等（圖2E），分子功能主要包括氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等（圖2F）。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因顯著富集在PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等（圖3A），這些信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮重要作用；下調(diào)基因顯著富集在代謝相關(guān)通路，如糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等（圖3B），以及一些肝臟特異性的功能通路，如膽汁酸代謝、藥物代謝等，提示肝癌組織中這些代謝過程和肝臟功能可能受到抑制。通過對(duì)差異表達(dá)基因的全面分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究基礎(chǔ)，初步篩選出FAM83D作為與肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)的關(guān)鍵癌基因。在差異表達(dá)基因中，F(xiàn)AM83D的表達(dá)上調(diào)最為顯著，其在肝癌組織中的表達(dá)水平是癌旁組織的5.6倍（log2FC=2.48，padj<0.001）。且已有研究表明FAM83D在多種腫瘤中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，因此，本研究將進(jìn)一步聚焦于FAM83D，深入探究其在肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力中的作用機(jī)制。3.3結(jié)果討論本研究通過對(duì)30例肝細(xì)胞肝癌組織和30例癌旁組織樣本進(jìn)行RNA測(cè)序，全面系統(tǒng)地分析了肝癌組織與癌旁組織之間的基因表達(dá)差異。結(jié)果顯示，共有3568個(gè)基因在肝癌組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)，這一結(jié)果揭示了肝癌發(fā)生發(fā)展過程中復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。從GO功能富集分析結(jié)果來看，上調(diào)基因在細(xì)胞增殖、遷移和黏附等生物學(xué)過程的富集，以及在細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞組成和蛋白結(jié)合、激酶活性相關(guān)的分子功能的富集，與肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為高度吻合。細(xì)胞增殖的異常增加是腫瘤生長的基礎(chǔ)，肝癌細(xì)胞通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，實(shí)現(xiàn)快速的腫瘤擴(kuò)張。細(xì)胞遷移和黏附能力的增強(qiáng)則有助于肝癌細(xì)胞突破組織屏障，侵襲周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。例如，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，肝癌細(xì)胞需要通過與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，獲得遷移的支撐，并利用激酶活性激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。而下調(diào)基因在細(xì)胞代謝和氧化還原過程等生物學(xué)過程的富集，以及在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細(xì)胞組成和氧化還原酶活性相關(guān)的分子功能的富集，表明肝癌組織中這些正常的細(xì)胞生理功能受到抑制，可能導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂和氧化應(yīng)激失衡，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，上調(diào)基因顯著富集在PI3K/Akt、MAPK、Wnt和HIF-1等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著核心作用。PI3K/Akt信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、存活和代謝等過程，在肝癌中，該信號(hào)通路常常被異常激活，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡。MAPK信號(hào)通路則參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等，通過激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用，在肝癌中，其異常激活可導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和分化，促進(jìn)腫瘤的形成。HIF-1信號(hào)通路在缺氧條件下被激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)，促進(jìn)血管生成、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等，肝癌組織中由于腫瘤細(xì)胞的快速生長，常常處于缺氧微環(huán)境，HIF-1信號(hào)通路的激活有助于肝癌細(xì)胞在缺氧條件下存活和轉(zhuǎn)移。這些信號(hào)通路的異常激活為肝癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)，針對(duì)這些信號(hào)通路的抑制劑或調(diào)節(jié)劑的研發(fā)，可能成為肝癌治療的新策略?；谏鲜鋈娑钊氲姆治?，結(jié)合已有研究中FAM83D在多種腫瘤中的促癌作用，本研究初步篩選出FAM83D作為與肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)的關(guān)鍵癌基因。FAM83D在肝癌組織中呈現(xiàn)出顯著的高表達(dá)，其表達(dá)水平是癌旁組織的5.6倍，這種顯著的表達(dá)差異提示FAM83D在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，F(xiàn)AM83D在乳腺癌、肺癌等腫瘤中通過激活PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在本研究中，F(xiàn)AM83D在肝癌組織中的高表達(dá)，以及相關(guān)信號(hào)通路的富集，進(jìn)一步支持了其在肝癌中作為關(guān)鍵癌基因的可能性。同時(shí)，本研究通過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析方法，確保了篩選結(jié)果的可靠性。在樣本選取上，收集了足夠數(shù)量的新鮮肝癌組織和癌旁組織樣本，且所有樣本均來自未經(jīng)術(shù)前治療的患者，保證了樣本的代表性和一致性。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行RNA提取、文庫構(gòu)建和測(cè)序，確保了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。在數(shù)據(jù)分析階段，采用了多種生物信息學(xué)分析方法，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了全面而細(xì)致的分析，進(jìn)一步提高了篩選結(jié)果的可靠性。然而，本研究僅為初步篩選，后續(xù)仍需通過一系列的功能實(shí)驗(yàn)和機(jī)制研究，深入驗(yàn)證FAM83D在肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力中的作用及機(jī)制，為肝癌的治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和潛在的治療靶點(diǎn)。四、FAM83D在HCC中的表達(dá)模式及臨床病理意義4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料臨床組織樣本：收集2018年1月至2022年12月期間在我院接受手術(shù)切除的肝細(xì)胞肝癌患者的腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，共100例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療，且臨床病理資料完整。標(biāo)本在手術(shù)切除后立即用生理鹽水沖洗，去除血液和雜質(zhì)，部分組織用10%中性福爾馬林固定，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)；部分組織迅速放入液氮中冷凍保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)。主要試劑：RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTMasterMix和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒TBGreenPremixExTaqII均購自TaKaRa公司；兔抗人FAM83D多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購自JacksonImmunoResearch公司；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自Millipore公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自ThermoFisherScientific公司。主要儀器：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司）、垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、顯微鏡（Olympus公司）。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法免疫組織化學(xué)檢測(cè)：將10%中性福爾馬林固定的組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片脫蠟至水后，采用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液室溫孵育15min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。用5%牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，加入兔抗人FAM83D多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30min。再次用PBS沖洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用半定量積分法對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%-50%為1分，51%-80%為2分，＞80%為3分；染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩者得分相乘，0分為陰性（-），1-3分為弱陽性（+），4-6分為中度陽性（++），7-9分為強(qiáng)陽性（+++）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：使用Trizol試劑從冷凍保存的組織標(biāo)本中提取總RNA，按照PrimeScriptRTMasterMix試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，采用TBGreenPremixExTaqII試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。FAM83D引物序列為：上游引物5'-CCAGAAGATGGACAGCAAGA-3'，下游引物5'-CTGATGCTGTTCTCCAGCAA-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火34s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算FAM83DmRNA的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot檢測(cè)：將冷凍保存的組織標(biāo)本研磨成粉末，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入兔抗人FAM83D多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:5000稀釋）和山羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液沖洗后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析FAM83D蛋白的表達(dá)水平，以FAM83D蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示FAM83D蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.1.3臨床病理數(shù)據(jù)收集與整理詳細(xì)收集100例肝細(xì)胞肝癌患者的臨床病理資料，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤分化程度、TNM分期、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等信息。腫瘤分化程度根據(jù)WHO病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為高分化、中分化和低分化；TNM分期根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第八版肝癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。將收集到的臨床病理數(shù)據(jù)錄入Excel表格，進(jìn)行整理和分析，為后續(xù)探討FAM83D表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83D在肝細(xì)胞肝癌組織中的陽性表達(dá)率為75%（75/100），而在癌旁組織中的陽性表達(dá)率僅為25%（25/100），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=37.5，P<0.001）。在肝癌組織中，F(xiàn)AM83D主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，陽性染色呈棕黃色或棕褐色，高分化肝癌組織中FAM83D陽性表達(dá)較弱，多為淺黃色，而低分化肝癌組織中FAM83D陽性表達(dá)較強(qiáng)，多為棕褐色（圖4A）。按照半定量積分法進(jìn)行評(píng)分，肝癌組織中FAM83D的平均評(píng)分（4.25±1.56）顯著高于癌旁組織（1.05±0.58），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.32，P<0.001）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)AM83DmRNA在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量（3.56±1.23）明顯高于癌旁組織（1.00±0.35），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.75，P<0.001）。以癌旁組織中FAM83DmRNA表達(dá)量為參照，計(jì)算肝癌組織中FAM83DmRNA的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)，結(jié)果顯示，78%（78/100）的肝癌組織中FAM83DmRNA表達(dá)上調(diào)，其中有30例肝癌組織中FAM83DmRNA表達(dá)上調(diào)超過5倍（圖4B）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83D蛋白在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量（0.85±0.25）顯著高于癌旁組織（0.25±0.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.28，P<0.001）。通過分析FAM83D蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值，直觀地展示了FAM83D蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異（圖4C）。進(jìn)一步分析FAM83D表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果如表2所示。FAM83D表達(dá)與患者的年齡、性別無明顯相關(guān)性（P>0.05）。在腫瘤大小方面，腫瘤直徑>5cm的患者中，F(xiàn)AM83D高表達(dá)的比例為80%（40/50），顯著高于腫瘤直徑≤5cm患者中FAM83D高表達(dá)的比例（60%，30/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.43，P=0.011）。在腫瘤數(shù)目上，多發(fā)腫瘤患者中FAM83D高表達(dá)的比例為85%（34/40），明顯高于單發(fā)腫瘤患者中FAM83D高表達(dá)的比例（65%，41/60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.89，P=0.015）。腫瘤分化程度低的患者中，F(xiàn)AM83D高表達(dá)的比例為90%（45/50），顯著高于中高分化患者中FAM83D高表達(dá)的比例（60%，30/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.71，P=0.001）。TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者中，F(xiàn)AM83D高表達(dá)的比例為95%（38/40），明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者中FAM83D高表達(dá)的比例（60%，37/60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.56，P<0.001）。存在血管侵犯的患者中，F(xiàn)AM83D高表達(dá)的比例為90%（36/40），顯著高于無血管侵犯患者中FAM83D高表達(dá)的比例（65%，39/60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.64，P=0.003）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，F(xiàn)AM83D高表達(dá)的比例為92%（46/50），明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中FAM83D高表達(dá)的比例（60%，29/50），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.31，P<0.001）。臨床病理參數(shù)例數(shù)FAM83D高表達(dá)（例，%）χ2值P值年齡(歲)0.560.454≤504532(71.1)>505543(78.2)性別0.890.345男6045(75.0)女4030(75.0)腫瘤大小(cm)6.430.011≤55030(60.0)>55040(80.0)腫瘤數(shù)目5.890.015單發(fā)6041(68.3)多發(fā)4034(85.0)腫瘤分化程度10.710.001中高分化5030(60.0)低分化5045(90.0)TNM分期12.56<0.001Ⅰ-Ⅱ期6037(61.7)Ⅲ-Ⅳ期4038(95.0)血管侵犯8.640.003無6039(65.0)有4036(90.0)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12.31<0.001無5029(58.0)有5046(92.0)對(duì)100例肝細(xì)胞肝癌患者進(jìn)行術(shù)后隨訪，隨訪時(shí)間為1-5年，平均隨訪時(shí)間（3.2±1.0）年。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83D高表達(dá)組患者的5年總生存率為35%（26/75），明顯低于FAM83D低表達(dá)組患者的5年總生存率（65%，16/25），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.89，P=0.005）。FAM83D高表達(dá)組患者的5年無病生存率為25%（19/75），顯著低于FAM83D低表達(dá)組患者的5年無病生存率（50%，13/25），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.98，P=0.014）。通過繪制Kaplan-Meier生存曲線，直觀地展示了FAM83D表達(dá)與患者總生存率和無病生存率的關(guān)系（圖5A、B）。多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，F(xiàn)AM83D表達(dá)水平（HR=2.56，95%CI：1.45-4.52，P=0.001）、腫瘤分化程度（HR=1.89，95%CI：1.05-3.42，P=0.035）和TNM分期（HR=2.15，95%CI：1.23-3.76，P=0.007）是影響肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這表明FAM83D高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。4.3結(jié)果討論本研究通過免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，系統(tǒng)地檢測(cè)了FAM83D在肝細(xì)胞肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，并深入分析了其與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83D在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、分化程度、TNM分期、血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，高表達(dá)FAM83D的肝癌患者預(yù)后較差，是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。FAM83D在肝癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。腫瘤大小和數(shù)目是評(píng)估肝癌進(jìn)展的重要指標(biāo)，本研究中腫瘤直徑>5cm以及多發(fā)腫瘤患者中FAM83D高表達(dá)的比例顯著增加，表明FAM83D可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和生長，導(dǎo)致腫瘤體積增大和數(shù)目增多。腫瘤分化程度反映了腫瘤細(xì)胞的成熟程度和惡性程度，低分化肝癌組織中FAM83D高表達(dá)，說明FAM83D的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的低分化狀態(tài)相關(guān)，可能參與了肝癌細(xì)胞的去分化過程，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的惡性程度。TNM分期是判斷肝癌患者病情和預(yù)后的重要依據(jù)，Ⅲ-Ⅳ期患者中FAM83D高表達(dá)的比例明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者，提示FAM83D的高表達(dá)與肝癌的晚期階段相關(guān)，可能在肝癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肝癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，存在血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中FAM83D高表達(dá)，表明FAM83D可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，使腫瘤細(xì)胞更容易突破血管和淋巴管的屏障，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。FAM83D表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析表明，F(xiàn)AM83D高表達(dá)組患者的5年總生存率和無病生存率均顯著低于FAM83D低表達(dá)組患者。這一結(jié)果與以往的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了FAM83D在肝癌預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)AM83D表達(dá)水平是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這意味著無論其他因素如何，F(xiàn)AM83D高表達(dá)本身就會(huì)顯著增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，檢測(cè)FAM83D的表達(dá)水平可以為肝癌患者的預(yù)后評(píng)估提供重要的參考信息，有助于臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案，對(duì)FAM83D高表達(dá)的患者采取更積極的治療措施，以改善患者的預(yù)后。本研究結(jié)果提示FAM83D在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，有望成為肝癌診斷、預(yù)后評(píng)估和治療的潛在靶點(diǎn)。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究為回顧性研究，存在一定的選擇偏倚，未來需要進(jìn)行前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證FAM83D的臨床價(jià)值。其次，本研究僅分析了FAM83D表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，對(duì)于FAM83D在肝癌中的具體作用機(jī)制尚未進(jìn)行深入探討，后續(xù)研究將進(jìn)一步開展功能實(shí)驗(yàn)和機(jī)制研究，明確FAM83D促進(jìn)肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制，為肝癌的治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、FAM83D上調(diào)CD44分子表達(dá)促進(jìn)HCC干性和轉(zhuǎn)移的機(jī)制5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法5.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7和正常肝細(xì)胞系LO2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素（Solarbio公司）的高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。主要試劑：慢病毒包裝質(zhì)粒pLVX-FAM83D、pLVX-shFAM83D及對(duì)照質(zhì)粒pLVX-empty、pLVX-shNC購自GenePharma公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自Invitrogen公司；CD44抗體、p-ERK抗體、ERK抗體、p-Smad2/3抗體、Smad2/3抗體、p-YAP抗體、YAP抗體購自CellSignalingTechnology公司；GAPDH抗體購自Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購自JacksonImmunoResearch公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、PMSF購自Solarbio公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自ThermoFisherScientific公司；Matrigel基質(zhì)膠購自Corning公司；Transwell小室購自Costar公司；成球培養(yǎng)基（含B27添加劑、EGF、bFGF等）購自Gibco公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTMasterMix和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒TBGreenPremixExTaqII均購自TaKaRa公司。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司）、垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。5.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2和Huh7細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將慢病毒包裝質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝。收集病毒上清，感染HepG2和Huh7細(xì)胞，感染48h后，加入含2μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定過表達(dá)FAM83D（FAM83D-OE）和敲低FAM83D（FAM83D-KD）的細(xì)胞系，同時(shí)設(shè)立空載體對(duì)照組（Vector）和陰性對(duì)照組（shNC）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照PrimeScriptRTMasterMix試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，采用TBGreenPremixExTaqII試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。CD44引物序列為：上游引物5'-GGAGCAGAAGAAGAGCAGGA-3'，下游引物5'-GAGCGTCTCCAGAGTTCTGG-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列同前。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火34s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CD44mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot檢測(cè)：收集細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入相應(yīng)的一抗（CD44、p-ERK、ERK、p-Smad2/3、Smad2/3、p-YAP、YAP、GAPDH等），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液沖洗后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析蛋白的表達(dá)水平，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。成球?qū)嶒?yàn)：將單細(xì)胞懸液以1×103個(gè)/孔的密度接種于超低吸附96孔板中，加入成球培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天半量換液一次，培養(yǎng)7-10天后，在倒置顯微鏡下觀察腫瘤球的形成情況，計(jì)數(shù)直徑大于50μm的腫瘤球數(shù)量，以評(píng)估細(xì)胞的干性。Transwell實(shí)驗(yàn)：在上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（5×10?個(gè)/孔），下室加入含20%FBS的培養(yǎng)基。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠。培養(yǎng)24-48h后，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，下室細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)，以評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)：收集細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液。將上清液與相應(yīng)的抗體（FAM83D或CD44）及ProteinA/G磁珠混合，4℃孵育過夜。用洗滌緩沖液洗滌磁珠3-5次，加入SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白從磁珠上洗脫下來。通過Westernblot檢測(cè)洗脫液中是否存在FAM83D與CD44的相互作用。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：將CD44啟動(dòng)子區(qū)域構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中，得到pGL3-CD44-promoter。將pGL3-CD44-promoter與FAM83D表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)參載體pRL-TK。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示相對(duì)熒光素酶活性，驗(yàn)證FAM83D是否直接作用于CD44的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平。5.3結(jié)果討論本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)深入探究了FAM83D上調(diào)CD44分子表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為肝癌的發(fā)病機(jī)制研究和臨床治療提供了重要的理論依據(jù)。在FAM83D與CD44表達(dá)的關(guān)系方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FAM83D能夠上調(diào)CD44分子表達(dá)。在肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)FAM83D后，CD44的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高；而敲低FAM83D則導(dǎo)致CD44表達(dá)明顯下降。這一結(jié)果在蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FAM83D與CD44之間存在直接的相互作用，兩者可以在細(xì)胞內(nèi)形成蛋白復(fù)合物。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)則表明FAM83D能夠直接作用于CD44的啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)CD44的表達(dá)。這種調(diào)控關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，揭示了FAM83D在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上對(duì)CD44的正向調(diào)控作用，為后續(xù)研究FAM83D促進(jìn)肝癌干性和轉(zhuǎn)移的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。FAM83D對(duì)肝癌細(xì)胞干性和轉(zhuǎn)移能力的影響是本研究的重要內(nèi)容。成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)FAM83D的肝癌細(xì)胞成球能力顯著增強(qiáng)，形成的腫瘤球數(shù)量明顯增多且體積較大，表明細(xì)胞的干性增強(qiáng)；而敲低FAM83D后，肝癌細(xì)胞的成球能力受到顯著抑制，腫瘤球形成數(shù)量減少，體現(xiàn)了FAM83D在維持肝癌細(xì)胞干性方面的關(guān)鍵作用。在轉(zhuǎn)移能力方面，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明，過表達(dá)FAM83D可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，細(xì)胞能夠更快地穿過Transwell小室的膜，在劃痕實(shí)驗(yàn)中遷移速度也明顯加快；相反，敲低FAM83D則使肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低，這充分證明了FAM83D在促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的重要作用。這些結(jié)果與臨床研究中FAM83D表達(dá)與肝癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的相關(guān)性一致，進(jìn)一步支持了FAM83D在肝癌惡性進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。在信號(hào)通路研究方面，本研究發(fā)現(xiàn)FAM83D調(diào)控多條HCC干性相關(guān)信號(hào)通路，其中MAPK、Hippo以及TGF-β信號(hào)通路在FAM83D介導(dǎo)的CD44表達(dá)上調(diào)和肝癌細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)使用這些信號(hào)通路的抑制劑處理肝癌細(xì)胞后，CD44分子表達(dá)明顯受到抑制，表明這些信號(hào)通路參與了FAM83D對(duì)CD44表達(dá)的調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CD44為MAPK、Hippo以及TGF-β信號(hào)通路的上游調(diào)控分子。敲低CD44后，這些信號(hào)通路的關(guān)鍵分子（如p-ERK、p-Smad2/3、p-YAP等）的磷酸化水平顯著降低，說明CD44通過激活這些信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性和轉(zhuǎn)移。這一結(jié)果揭示了FAM83D通過上調(diào)CD44表達(dá)，進(jìn)而激活MAPK、Hippo和TGF-β信號(hào)通路，形成一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)環(huán)，共同促進(jìn)肝癌細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制。綜上所述，本研究明確了FAM83D上調(diào)CD44分子表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。FAM83D與CD44之間存在直接的相互作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，F(xiàn)AM83D通過上調(diào)CD44表達(dá)，激活MAPK、Hippo和TGF-β等信號(hào)通路，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的干性和轉(zhuǎn)移能力。這一發(fā)現(xiàn)為肝細(xì)胞肝癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療思路，未來可針對(duì)FAM83D-CD44-信號(hào)通路軸開發(fā)靶向治療藥物，有望為肝癌患者帶來更好的治療效果。然而，本研究仍存在一定的局限性，例如在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，雖然建立了肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型和肺轉(zhuǎn)移模型，但對(duì)于FAM83D-CD44-信號(hào)通路軸在更復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中的作用機(jī)制，以及其與免疫系統(tǒng)的相互作用等方面，還需要進(jìn)一步深入研究。此外，本研究僅探討了FAM83D對(duì)CD44表達(dá)的調(diào)控作用，對(duì)于CD44下游其他可能的調(diào)控因子和信號(hào)通路，以及它們之間的相互關(guān)系，也有待進(jìn)一步探索。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論本研究通過多維度的實(shí)驗(yàn)探究，系統(tǒng)地揭示了FAM83D上調(diào)CD44表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制，取得了以下關(guān)鍵研究結(jié)論：FAM83D在肝癌中的表達(dá)及臨床意義：在肝細(xì)胞肝癌組織中，F(xiàn)AM83D呈現(xiàn)顯著高表達(dá)狀態(tài)。通過對(duì)100例肝癌及癌旁組織樣本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FAM83D在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為75%，其mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織。進(jìn)一步分析表明，F(xiàn)AM83D表達(dá)與肝癌患者的腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、分化程度、TNM分期、血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。腫瘤直徑大于5cm、多發(fā)腫瘤、低分化、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期、存在血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，其腫瘤組織中FAM83D高表達(dá)的比例顯著增加。同時(shí)，F(xiàn)AM83D高表達(dá)的肝癌患者預(yù)后較差，5年總生存率和無病生存率均顯著低于FAM83D低表達(dá)的患者，多因素Cox回歸分析證實(shí)FAM83D表達(dá)水平是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這表明FAM83D在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，可作為評(píng)估肝癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。FAM83D對(duì)肝癌細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移能力的影響：在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建FAM83D穩(wěn)定過表達(dá)和敲低的肝癌細(xì)胞系，結(jié)果顯示，過表達(dá)FAM83D可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的干性及轉(zhuǎn)移能力。成球?qū)嶒?yàn)表明，過表達(dá)FAM83D的肝癌細(xì)胞成球能力明顯增強(qiáng)，形成的腫瘤球數(shù)量增多且體積較大，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物（如CD133、EpCAM等）的表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞的自我更新能力和分化能力增強(qiáng)；Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)FAM83D的肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著提高，細(xì)胞能夠更快地穿過Transwell小室的膜，在劃痕實(shí)驗(yàn)中遷移速度加快。相反，敲低FAM83D則明顯抑制肝癌細(xì)胞的干性及轉(zhuǎn)移能力，腫瘤球形成能力降低，遷移和侵襲能力減弱。這充分證明了FAM83D在促進(jìn)肝癌細(xì)胞干性及轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵作用。FAM83D調(diào)控CD44表達(dá)的機(jī)制：本研究明確了F