CD155在食管癌發(fā)生與放療抵抗中的雙重角色及機(jī)制研究一、引言1.1研究背景食管癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類(lèi)癌癥中均位居前列。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年食管癌新發(fā)病例數(shù)眾多，死亡病例也相當(dāng)可觀，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。在中國(guó)，食管癌同樣是高發(fā)癌癥，尤其在某些地區(qū)呈現(xiàn)出明顯的地域聚集性。食管癌的發(fā)病與多種因素相關(guān)，包括飲食習(xí)慣、遺傳因素、環(huán)境因素以及感染因素等。長(zhǎng)期食用過(guò)熱、過(guò)硬、過(guò)辣的食物，吸煙、酗酒，以及缺乏某些維生素和微量元素等，都可能增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，人類(lèi)乳頭瘤病毒（HPV）感染、幽門(mén)螺桿菌感染等也與食管癌的發(fā)生發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。食管癌患者的癥狀在早期往往不明顯，隨著病情進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)吞咽困難、胸骨后疼痛、嘔吐等典型癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)攝入。吞咽困難會(huì)導(dǎo)致患者進(jìn)食障礙，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法正常攝取，進(jìn)而引發(fā)體重下降、貧血、乏力等全身性癥狀，使患者身體狀況日益惡化。由于早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤可能已經(jīng)發(fā)生局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，極大地增加了治療難度。目前，食管癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療以及免疫治療等多學(xué)科綜合治療。對(duì)于早期食管癌患者，手術(shù)切除是主要的治療方法，部分患者可通過(guò)手術(shù)獲得根治機(jī)會(huì)。然而，對(duì)于中晚期食管癌患者，單純手術(shù)治療效果往往不佳，需要結(jié)合化療、放療等手段進(jìn)行綜合治療?；熗ㄟ^(guò)使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，但化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，引發(fā)一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，降低患者的生活質(zhì)量和對(duì)治療的耐受性。放療利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞，在一定程度上能夠控制腫瘤的局部進(jìn)展，但放療也存在局限性，如對(duì)周?chē)＝M織的輻射損傷，以及部分腫瘤細(xì)胞對(duì)放療不敏感，導(dǎo)致放療抵抗現(xiàn)象的出現(xiàn)。免疫治療作為一種新興的治療方法，通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗腫瘤，為食管癌的治療帶來(lái)了新的希望，但并非所有患者都能從免疫治療中獲益，且免疫治療也可能引發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)。近年來(lái)，隨著腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐漸深入，腫瘤的免疫治療成為研究熱點(diǎn)。CD155作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子和細(xì)胞黏附分子，在腫瘤免疫逃逸和腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)。CD155，又稱(chēng)脊髓灰質(zhì)炎病毒受體（PVR）、連接樣蛋白分子5（Necl-5）等，屬于免疫球蛋白超家族成員。它是一種單次跨膜的細(xì)胞表面蛋白，其基因位于人類(lèi)19號(hào)染色體上。CD155具有多種生物學(xué)功能，在正常生理狀態(tài)下，它參與細(xì)胞間的黏附、信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程，對(duì)維持組織器官的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。在腫瘤微環(huán)境中，CD155的表達(dá)發(fā)生異常改變，在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，如胰腺癌、膽管癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌等，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。在腫瘤免疫逃逸方面，CD155通過(guò)與免疫細(xì)胞表面的受體相互作用，抑制免疫細(xì)胞的功能，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和殺傷。CD155可以與T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等免疫細(xì)胞表面的DNAX輔助分子-1（DNAM-1，CD226）、T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域（TIGIT）以及CD96等受體結(jié)合。與DNAM-1結(jié)合時(shí)，CD155可抑制DNAM-1介導(dǎo)的免疫激活信號(hào)，降低免疫細(xì)胞的活性；與TIGIT和CD96結(jié)合，則可激活免疫抑制信號(hào)通路，使T細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷功能受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠逃脫免疫攻擊，得以在體內(nèi)持續(xù)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，CD155還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路等，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。鑒于CD155在腫瘤發(fā)生發(fā)展和免疫逃逸中的重要作用，針對(duì)CD155及其受體的靶向治療成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過(guò)阻斷CD155與免疫細(xì)胞受體的相互作用，有望恢復(fù)免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷功能；或者直接靶向腫瘤細(xì)胞表面的CD155，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。目前，已有多種靶向CD155及其受體的藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，部分藥物在臨床前研究和早期臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出了一定的療效和安全性，為腫瘤治療帶來(lái)了新的希望。在食管癌的研究中，CD155的作用逐漸受到關(guān)注。已有研究表明，CD155在食管癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與食管癌的臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)CD155的食管癌患者往往具有更高的腫瘤分期、更強(qiáng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力和更差的生存預(yù)后。然而，CD155在食管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，其在食管癌放療抵抗中的作用及相關(guān)機(jī)制更是研究甚少。深入研究CD155在食管癌中的致瘤性和放療抵抗機(jī)制，對(duì)于揭示食管癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及提高食管癌的治療效果具有重要的理論和臨床意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討CD155在食管癌致瘤性和放療抵抗中的作用及其潛在分子機(jī)制，為食管癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。具體研究目的如下：明確CD155在食管癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)特征：通過(guò)免疫組化、Westernblot、qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)CD155在食管癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)與食管癌患者臨床病理參數(shù)（如腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等）之間的相關(guān)性。同時(shí)，檢測(cè)不同食管癌細(xì)胞系中CD155的表達(dá)情況，為后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)選擇合適的細(xì)胞模型。探究CD155對(duì)食管癌致瘤性的影響：利用RNA干擾技術(shù)或基因編輯技術(shù)構(gòu)建CD155低表達(dá)的食管癌穩(wěn)定細(xì)胞系，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU摻入實(shí)驗(yàn)）、克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等方法，觀察CD155表達(dá)下調(diào)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、存活和凋亡的影響。此外，通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證CD155在體內(nèi)對(duì)食管癌腫瘤生長(zhǎng)的作用，明確CD155在食管癌致瘤過(guò)程中的重要性。揭示CD155參與食管癌放療抵抗的機(jī)制：對(duì)食管癌細(xì)胞進(jìn)行不同劑量的放療處理，檢測(cè)放療前后CD155表達(dá)的變化。通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞存活曲線分析等方法，比較CD155高表達(dá)和低表達(dá)食管癌細(xì)胞在放療后的存活情況，評(píng)估CD155對(duì)食管癌放療抵抗的影響。利用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)，篩選與CD155相關(guān)的差異表達(dá)基因和信號(hào)通路，通過(guò)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（如siRNA干擾、過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)、信號(hào)通路抑制劑處理等），深入探究CD155調(diào)控食管癌放療抵抗的分子機(jī)制。評(píng)估靶向CD155治療食管癌的潛在價(jià)值：根據(jù)上述研究結(jié)果，探索靶向CD155作為食管癌治療新策略的可能性。利用特異性抗體或小分子抑制劑阻斷CD155的功能，觀察其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、放療抵抗以及腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞功能的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證靶向CD155治療聯(lián)合放療對(duì)食管癌腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果，為臨床食管癌治療提供新的思路和潛在治療靶點(diǎn)。食管癌嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，盡管目前的治療手段取得了一定進(jìn)展，但總體療效仍不理想，患者的生存率和生活質(zhì)量有待提高。深入研究CD155在食管癌致瘤性和放療抵抗中的作用，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值：理論意義：有助于進(jìn)一步揭示食管癌的發(fā)病機(jī)制和放療抵抗的分子機(jī)制。CD155作為一種在腫瘤免疫和細(xì)胞生物學(xué)中具有重要作用的分子，其在食管癌中的研究相對(duì)較少。本研究將填補(bǔ)CD155在食管癌領(lǐng)域的部分研究空白，豐富對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。臨床應(yīng)用價(jià)值：CD155可能成為食管癌診斷、預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)食管癌患者組織或血液中CD155的表達(dá)水平，有助于早期診斷食管癌、判斷腫瘤的惡性程度和預(yù)后情況，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化治療方案提供參考依據(jù)。同時(shí)，靶向CD155及其相關(guān)信號(hào)通路可能為食管癌的治療提供新的策略。開(kāi)發(fā)針對(duì)CD155的特異性抗體、小分子抑制劑或其他靶向治療藥物，有望打破食管癌放療抵抗，提高放療療效，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷功能，為食管癌患者帶來(lái)新的治療希望，改善患者的生存預(yù)后和生活質(zhì)量。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞水平、動(dòng)物模型以及臨床樣本等多個(gè)層面深入探究CD155在食管癌致瘤性和放療抵抗中的作用及機(jī)制，具體研究方法如下：臨床樣本收集與檢測(cè)：收集食管癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，詳細(xì)記錄患者的臨床病理信息，包括年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度等。運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)檢測(cè)組織標(biāo)本中CD155蛋白的表達(dá)水平及定位，通過(guò)圖像分析軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行量化分析；采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分別從蛋白和mRNA水平檢測(cè)CD155的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，明確CD155在食管癌組織中的表達(dá)特征。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用多種食管癌細(xì)胞系，如KYSE150、KYSE450、EC9706等，采用Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)各細(xì)胞系中CD155的表達(dá)水平，選擇CD155高表達(dá)的細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)構(gòu)建針對(duì)CD155的小干擾RNA（siRNA），通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA導(dǎo)入食管癌細(xì)胞，干擾CD155的表達(dá)，采用Westernblot和qRT-PCR驗(yàn)證干擾效果，建立CD155低表達(dá)的食管癌細(xì)胞模型。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的克隆形成能力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況，探究CD155對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、存活和凋亡的影響。使用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，分析CD155對(duì)食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取無(wú)胸腺裸鼠，將CD155高表達(dá)和低表達(dá)的食管癌細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，建立裸鼠移植瘤模型。定期測(cè)量腫瘤體積，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。待腫瘤生長(zhǎng)至一定體積后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行稱(chēng)重、拍照，并通過(guò)IHC、Westernblot等方法檢測(cè)腫瘤組織中CD155及相關(guān)蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證CD155在體內(nèi)對(duì)食管癌腫瘤生長(zhǎng)的影響。對(duì)裸鼠移植瘤模型進(jìn)行放療處理，設(shè)置不同放療劑量組和對(duì)照組，觀察放療后腫瘤生長(zhǎng)情況，比較CD155高表達(dá)和低表達(dá)組腫瘤對(duì)放療的敏感性差異。放療結(jié)束后，處死裸鼠，取腫瘤組織進(jìn)行組織學(xué)分析、凋亡檢測(cè)等，深入研究CD155在食管癌放療抵抗中的作用。機(jī)制研究：運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（如iTRAQ、TMT等）和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（如RNA-seq），對(duì)CD155高表達(dá)和低表達(dá)的食管癌細(xì)胞進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)與CD155相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K-AKT、MAPK等。針對(duì)篩選出的關(guān)鍵信號(hào)通路和基因，采用siRNA干擾、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、信號(hào)通路抑制劑處理等方法進(jìn)行功能驗(yàn)證，明確CD155調(diào)控食管癌致瘤性和放療抵抗的分子機(jī)制。利用流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等）的比例和功能變化，通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α等）的分泌水平，探究CD155對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境的影響及其在免疫逃逸中的作用機(jī)制。靶向治療研究：選用針對(duì)CD155的特異性單克隆抗體或小分子抑制劑，處理食管癌細(xì)胞和裸鼠移植瘤模型，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及腫瘤生長(zhǎng)的影響。將靶向CD155治療與放療聯(lián)合應(yīng)用于裸鼠移植瘤模型，評(píng)估聯(lián)合治療的效果，包括腫瘤生長(zhǎng)抑制率、生存率等指標(biāo)。通過(guò)免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)聯(lián)合治療后腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況、細(xì)胞凋亡水平以及相關(guān)信號(hào)通路的激活狀態(tài)，探討靶向CD155聯(lián)合放療治療食管癌的潛在機(jī)制和協(xié)同作用效果。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：研究視角創(chuàng)新：目前關(guān)于CD155在腫瘤中的研究多集中于其在腫瘤免疫逃逸方面的作用，而本研究不僅關(guān)注CD155在食管癌免疫逃逸中的作用，還深入探討其在食管癌致瘤性和放療抵抗中的作用及機(jī)制，從多個(gè)角度全面揭示CD155在食管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用，為食管癌的研究提供了新的視角和思路。研究方法創(chuàng)新：綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，如蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因編輯技術(shù)、動(dòng)物模型等，從分子、細(xì)胞、組織和整體動(dòng)物水平多層次研究CD155的功能和機(jī)制，為深入理解CD155在食管癌中的作用提供了全面、系統(tǒng)的研究方法。通過(guò)多組學(xué)技術(shù)篩選與CD155相關(guān)的差異表達(dá)基因和信號(hào)通路，并結(jié)合功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究，這種整合分析的方法有助于發(fā)現(xiàn)新的分子機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)。治療策略創(chuàng)新：基于對(duì)CD155在食管癌致瘤性和放療抵抗中作用機(jī)制的研究，探索靶向CD155作為食管癌治療新策略的可能性。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向CD155治療聯(lián)合放療對(duì)食管癌的治療效果，為臨床食管癌治療提供了新的思路和潛在治療靶點(diǎn)，有望打破食管癌放療抵抗的困境，提高食管癌的治療效果，改善患者的生存預(yù)后。二、CD155與食管癌的基礎(chǔ)理論2.1CD155的結(jié)構(gòu)與功能概述2.1.1CD155的分子結(jié)構(gòu)CD155基因位于人類(lèi)19號(hào)染色體（NC_U000019.10）上，其DNA序列長(zhǎng)度約為20kb。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，CD155基因被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)由8個(gè)不同外顯子組成的mRNA序列。這8個(gè)外顯子經(jīng)過(guò)復(fù)雜的剪接機(jī)制，最終翻譯形成不同亞型的CD155蛋白。如果8個(gè)外顯子全部翻譯，總共可編碼417個(gè)氨基酸。CD155屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種單次跨膜的細(xì)胞表面蛋白。它具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，從細(xì)胞膜外到細(xì)胞膜內(nèi)依次為三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。其三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域在空間上形成特定的構(gòu)象，這對(duì)于CD155與其他分子的相互作用至關(guān)重要。這些結(jié)構(gòu)域包含多個(gè)保守的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)基序，通過(guò)這些結(jié)構(gòu)，CD155能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合其配體分子，如DNAX輔助分子-1（DNAM-1，CD226）、T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域（TIGIT）以及CD96等。由于差異mRNA剪接，CD155形成了四個(gè)不同的亞型，分別稱(chēng)為PVRα、PVRβ、PVRγ和PVRδ。PVRα和PVRδ是跨膜的選擇性剪接亞型，其中PVRδ定位于頂端和基底外側(cè)質(zhì)膜，而PVRα定位于極化上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜。這兩種跨膜亞型在細(xì)胞表面的定位差異，暗示它們可能在不同的細(xì)胞生理過(guò)程或細(xì)胞微環(huán)境中發(fā)揮獨(dú)特的功能。例如，它們可能參與不同類(lèi)型細(xì)胞間的黏附作用，或者在不同組織的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中扮演不同角色。PVRβ和PVRγ則是缺乏跨膜區(qū)域的剪接亞型，被描述為可溶或分泌的亞型存在于許多不同的體液中，如血液、淋巴液等。雖然目前其具體作用尚未得到詳細(xì)研究，但由于各種癌癥患者的血清中可溶性CD155水平增加，因此PVRβ和PVRγ型CD155有可能作為癌癥發(fā)展和進(jìn)展的潛在標(biāo)志。例如，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)分泌PVRβ和PVRγ進(jìn)入血液，通過(guò)檢測(cè)血液中這些可溶性亞型的含量，或許可以輔助判斷腫瘤的發(fā)展階段和預(yù)后情況。CD155的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包含免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM），這一結(jié)構(gòu)域可以招募重要的信號(hào)分子，如含SH2的酪氨酸磷酸酶-2（SHP-2），以啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)CD155與配體結(jié)合后，ITIM結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生磷酸化修飾，進(jìn)而招募SHP-2等信號(hào)分子，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件，最終影響細(xì)胞的增殖、遷移、存活等生物學(xué)行為。例如，在腫瘤細(xì)胞中，CD155與配體結(jié)合后通過(guò)ITIM介導(dǎo)的信號(hào)通路，可能會(huì)激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。2.1.2CD155的正常生理功能在正常生理狀態(tài)下，CD155在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要涉及細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)以及免疫調(diào)節(jié)等方面。在細(xì)胞黏附方面，CD155作為一種細(xì)胞黏附分子，參與細(xì)胞間的相互作用，對(duì)維持組織器官的正常結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。它可以介導(dǎo)同型細(xì)胞間的黏附，即CD155與相鄰細(xì)胞表面的CD155相互結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞之間的緊密連接，增強(qiáng)細(xì)胞群體的穩(wěn)定性。例如，在正常上皮組織中，上皮細(xì)胞之間通過(guò)CD155的同型黏附作用，形成緊密的細(xì)胞層，有助于維持上皮組織的完整性和屏障功能，防止外界病原體的侵入。CD155還可以介導(dǎo)異型細(xì)胞間的黏附，與其他細(xì)胞表面的不同分子相互作用，參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附過(guò)程。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，CD155在神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮作用，神經(jīng)嵴細(xì)胞表面的CD155與周?chē)?xì)胞外基質(zhì)中的配體分子結(jié)合，引導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞沿著特定的路徑遷移到正確的位置，從而參與神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在信號(hào)傳導(dǎo)方面，CD155作為一種信號(hào)分子，能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。當(dāng)CD155與配體結(jié)合后，會(huì)引起其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化，進(jìn)而招募相關(guān)的信號(hào)分子，激活下游的信號(hào)通路。如前所述，CD155與生長(zhǎng)因子受體如血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）相互作用，能夠增強(qiáng)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。在免疫細(xì)胞中，CD155與DNAM-1結(jié)合后，可激活免疫細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。例如，在T細(xì)胞和NK細(xì)胞中，CD155與DNAM-1結(jié)合后，通過(guò)激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路，促使T細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞和病原體感染細(xì)胞的功能。在免疫調(diào)節(jié)方面，CD155在免疫系統(tǒng)中扮演著重要的角色。它可以作為免疫細(xì)胞上激活和抑制受體識(shí)別的配體，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和活性。在正常免疫應(yīng)答過(guò)程中，CD155與免疫細(xì)胞表面的激活受體DNAM-1結(jié)合，能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力，有效地清除病原體和腫瘤細(xì)胞。當(dāng)免疫應(yīng)答過(guò)度激活時(shí)，CD155又可以與抑制受體TIGIT和CD96結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活性，防止免疫反應(yīng)過(guò)度，維持免疫平衡。例如，在感染后期，TIGIT和CD96與CD155結(jié)合，抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，避免免疫細(xì)胞對(duì)機(jī)體自身組織造成損傷，促進(jìn)免疫應(yīng)答的消退和免疫穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)。CD155在正常生理狀態(tài)下通過(guò)參與細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，對(duì)維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮著不可或缺的作用。2.2食管癌的概述2.2.1食管癌的流行病學(xué)特征食管癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球食管癌新發(fā)病例約60.4萬(wàn)例，死亡病例約54.4萬(wàn)例，其發(fā)病率和死亡率在各類(lèi)惡性腫瘤中分別位居第7位和第6位。食管癌的發(fā)病率和死亡率在不同國(guó)家和地區(qū)之間存在顯著差異，呈現(xiàn)出明顯的地域聚集性。從全球范圍來(lái)看，東亞、中亞和南非等地區(qū)是食管癌的高發(fā)區(qū)域。其中，中國(guó)、日本、韓國(guó)等東亞國(guó)家的食管癌發(fā)病率明顯高于其他地區(qū)。中國(guó)作為食管癌高發(fā)國(guó)家，新發(fā)病例和死亡病例分別占全球總數(shù)的53.7%和55.7%。在國(guó)內(nèi)，食管癌的發(fā)病也存在明顯的地域分布差異，太行山區(qū)附近的河南、河北、山西等地，以及山東、安徽、江蘇蘇北區(qū)域是我國(guó)食管癌的高發(fā)地區(qū)。此外，四川南充、四川鹽亭、廣東汕頭、福建福州等地區(qū)也有較高的發(fā)病率。這些高發(fā)地區(qū)的食管癌發(fā)病率可達(dá)到10萬(wàn)分之30以上，而在一些低發(fā)地區(qū)，發(fā)病率則相對(duì)較低，僅為10萬(wàn)分之5以下。食管癌的發(fā)病率在性別上也存在差異，男性發(fā)病率普遍高于女性，男女發(fā)病率之比約為2-3:1。這種性別差異可能與男性吸煙、飲酒等不良生活習(xí)慣更為普遍有關(guān)，同時(shí)也可能與性激素水平等因素有關(guān)。從年齡分布來(lái)看，食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)隨年齡增長(zhǎng)而增加，發(fā)病高峰年齡主要集中在45-80歲之間。隨著人口老齡化的加劇，食管癌的發(fā)病負(fù)擔(dān)也將進(jìn)一步加重。食管癌的發(fā)病率和死亡率不僅受到地域、性別和年齡等因素的影響，還與社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況、生活方式、飲食習(xí)慣等密切相關(guān)。在一些經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，由于居民飲食結(jié)構(gòu)不合理，缺乏新鮮蔬菜和水果的攝入，過(guò)多食用腌制、霉變食物，以及衛(wèi)生條件較差等原因，食管癌的發(fā)病率相對(duì)較高。而在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，雖然居民的生活條件和飲食結(jié)構(gòu)有所改善，但隨著肥胖、胃食管反流病等疾病的增多，食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也在逐漸上升。2.2.2食管癌的發(fā)病機(jī)制與病理類(lèi)型食管癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素、飲食習(xí)慣以及感染因素等多個(gè)方面。遺傳因素在食管癌的發(fā)病中起著重要作用。研究表明，食管癌具有明顯的家族聚集現(xiàn)象，家族中有食管癌患者的個(gè)體，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于普通人群。一些與食管癌相關(guān)的基因突變和遺傳多態(tài)性被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如p53基因、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（CDKN2A）基因等的突變，以及細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）等基因的多態(tài)性，這些遺傳變異可能影響細(xì)胞的增殖、凋亡、DNA修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程，從而增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。環(huán)境因素也是食管癌發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。長(zhǎng)期暴露于致癌物質(zhì)，如亞硝胺類(lèi)化合物、多環(huán)芳烴、真菌毒素等，可顯著增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。亞硝胺類(lèi)化合物是一類(lèi)強(qiáng)致癌物質(zhì)，廣泛存在于腌制、熏制食物以及被污染的水源中。在食管癌高發(fā)地區(qū)，居民飲食中常含有較高水平的亞硝胺類(lèi)化合物，這與當(dāng)?shù)厥彻馨┑母甙l(fā)病率密切相關(guān)。此外，長(zhǎng)期吸煙和酗酒也是食管癌的重要危險(xiǎn)因素。香煙煙霧和酒精中含有多種致癌物質(zhì)，如苯并芘、亞硝基化合物等，這些物質(zhì)可直接損傷食管黏膜，導(dǎo)致食管上皮細(xì)胞的異常增生和癌變。飲食習(xí)慣對(duì)食管癌的發(fā)生發(fā)展有著重要影響。長(zhǎng)期食用過(guò)熱、過(guò)硬、過(guò)辣的食物，以及進(jìn)食過(guò)快、暴飲暴食等不良習(xí)慣，可反復(fù)刺激食管黏膜，導(dǎo)致食管黏膜的慢性損傷和炎癥，進(jìn)而增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，長(zhǎng)期食用溫度超過(guò)65℃的熱飲或食物，會(huì)使食管黏膜反復(fù)受到熱損傷，促進(jìn)食管上皮細(xì)胞的異常增殖和分化，最終引發(fā)食管癌。感染因素也與食管癌的發(fā)病相關(guān)。人類(lèi)乳頭瘤病毒（HPV）感染、幽門(mén)螺桿菌感染等在食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定作用。HPV是一種嗜上皮細(xì)胞的DNA腫瘤病毒，與食管癌關(guān)系較為密切的HPV主要為6型、16型及18型。有研究認(rèn)為，HPV16型與食管鱗癌發(fā)生有關(guān)，HPV18型與食管腺癌發(fā)生有關(guān)。幽門(mén)螺桿菌感染可引起胃食管反流病，導(dǎo)致食管黏膜的損傷和炎癥，從而增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)組織學(xué)特征，食管癌主要分為鱗狀細(xì)胞癌和腺癌兩種病理類(lèi)型。在全球范圍內(nèi)，鱗狀細(xì)胞癌約占食管癌病例的80%以上，而腺癌的比例相對(duì)較低。在中國(guó)，鱗狀細(xì)胞癌是食管癌的主要病理類(lèi)型，約占90%以上。鱗狀細(xì)胞癌起源于食管鱗狀上皮細(xì)胞，多發(fā)生于食管的中、上段。其癌細(xì)胞具有鱗狀上皮細(xì)胞的形態(tài)特征，可形成角化珠或細(xì)胞間橋。腺癌則主要起源于食管下段的腺上皮細(xì)胞，近年來(lái)，隨著肥胖、胃食管反流病等因素的影響，腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)。腺癌的癌細(xì)胞具有腺上皮細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，可分泌黏液，形成腺管樣結(jié)構(gòu)。除了鱗狀細(xì)胞癌和腺癌外，食管癌還包括一些少見(jiàn)的病理類(lèi)型，如小細(xì)胞癌、未分化癌、腺鱗癌等，這些類(lèi)型的食管癌相對(duì)較為罕見(jiàn)，其生物學(xué)行為和治療方法與鱗狀細(xì)胞癌和腺癌有所不同。2.3CD155與食管癌的相關(guān)性研究現(xiàn)狀近年來(lái)，CD155在食管癌中的研究逐漸受到關(guān)注，目前已有多項(xiàng)研究探討了CD155在食管癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。在表達(dá)情況方面，多項(xiàng)研究表明，CD155在食管癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中CD155蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織。在對(duì)100例食管癌患者的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中CD155的陽(yáng)性表達(dá)率為70%，而癌旁正常組織中僅為10%。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）從蛋白和mRNA水平檢測(cè)，也進(jìn)一步證實(shí)了食管癌組織中CD155的表達(dá)水平明顯高于正常組織。在與臨床病理特征的關(guān)系方面，研究發(fā)現(xiàn)CD155的表達(dá)與食管癌的多個(gè)臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。CD155的高表達(dá)與食管癌的腫瘤分期密切相關(guān)。隨著腫瘤分期的升高，CD155的表達(dá)水平也逐漸升高。在早期食管癌患者中，CD155的陽(yáng)性表達(dá)率相對(duì)較低；而在中晚期食管癌患者中，CD155的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增加。這表明CD155可能參與了食管癌的進(jìn)展過(guò)程，其高表達(dá)可能提示腫瘤的惡性程度更高，預(yù)后更差。CD155的表達(dá)與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也存在顯著相關(guān)性。有研究表明，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者，其腫瘤組織中CD155的表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。通過(guò)對(duì)一組食管癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中CD155的陽(yáng)性表達(dá)率為85%，而無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中僅為50%。這提示CD155可能在食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤的分化程度也與CD155的表達(dá)相關(guān)。低分化的食管癌組織中CD155的表達(dá)水平通常高于高分化的組織。低分化的食管癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和侵襲能力，而CD155的高表達(dá)可能進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的這些惡性生物學(xué)行為，導(dǎo)致腫瘤的分化程度更低，預(yù)后更差。CD155的表達(dá)還與食管癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。一些研究通過(guò)對(duì)食管癌患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，發(fā)現(xiàn)CD155高表達(dá)的患者總體生存率和無(wú)病生存率明顯低于CD155低表達(dá)的患者。在一項(xiàng)隨訪5年的研究中，CD155高表達(dá)組患者的5年生存率為30%，而CD155低表達(dá)組患者的5年生存率為60%。這表明CD155可以作為評(píng)估食管癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，高表達(dá)CD155的患者預(yù)后不良，需要更積極的治療策略。目前關(guān)于CD155在食管癌中的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些局限性。大多數(shù)研究樣本量相對(duì)較小，研究結(jié)果的普遍性和可靠性有待進(jìn)一步驗(yàn)證；現(xiàn)有研究主要集中在CD155的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析上，對(duì)于其在食管癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制，尤其是在致瘤性和放療抵抗中的作用機(jī)制研究還不夠深入，需要進(jìn)一步開(kāi)展基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)行深入探討。三、CD155在食管癌致瘤性中的作用機(jī)制3.1CD155促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖的機(jī)制3.1.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為深入探究CD155促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制，本研究開(kāi)展了一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。選取了多種食管癌細(xì)胞系，如KYSE150、KYSE450、EC9706等，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)各細(xì)胞系中CD155的表達(dá)水平，結(jié)果顯示KYSE150和KYSE450細(xì)胞系中CD155表達(dá)水平較高，因此選擇這兩種細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)構(gòu)建針對(duì)CD155的小干擾RNA（siRNA），通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將siRNA導(dǎo)入KYSE150和KYSE450細(xì)胞，干擾CD155的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用Westernblot和qRT-PCR驗(yàn)證干擾效果，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中CD155的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低，成功建立了CD155低表達(dá)的食管癌細(xì)胞模型。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，將CD155低表達(dá)的食管癌細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞分別接種于96孔板中，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔。在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)），向每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度（OD值）。結(jié)果顯示，CD155低表達(dá)組細(xì)胞的OD值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對(duì)照組，表明CD155表達(dá)下調(diào)后，食管癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。EdU摻入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將CD155低表達(dá)的食管癌細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2小時(shí)。然后按照EdU檢測(cè)試劑盒的步驟進(jìn)行固定、通透、染色等操作，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）的比例明顯高于CD155低表達(dá)組，說(shuō)明CD155低表達(dá)的食管癌細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞增殖能力下降。3.1.2相關(guān)信號(hào)通路的激活在細(xì)胞增殖過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。為了深入探究CD155促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，本研究對(duì)可能涉及的信號(hào)通路進(jìn)行了分析。Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的促增殖信號(hào)通路之一，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該信號(hào)通路的激活可促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明，CD155可與血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）等生長(zhǎng)因子受體相互作用，從而增強(qiáng)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)。在食管癌細(xì)胞中，CD155高表達(dá)可能通過(guò)與PDGFR結(jié)合，激活Ras蛋白，使其從與GDP結(jié)合的無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榕cGTP結(jié)合的活性狀態(tài)。激活的Ras進(jìn)一步招募Raf蛋白，使其磷酸化并激活，激活的Raf再依次磷酸化并激活MEK和ERK蛋白。磷酸化的ERK可進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等。c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程；CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK4/6）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。為驗(yàn)證CD155是否通過(guò)激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖，本研究使用了Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路抑制劑U0126處理CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞。將KYSE150和KYSE450細(xì)胞分為對(duì)照組、CD155高表達(dá)組和CD155高表達(dá)+U0126組，其中CD155高表達(dá)組通過(guò)轉(zhuǎn)染CD155過(guò)表達(dá)質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)CD155高表達(dá)，CD155高表達(dá)+U0126組在轉(zhuǎn)染CD155過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后用10μMU0126處理24小時(shí)。采用Westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞中ERK的磷酸化水平，結(jié)果顯示，CD155高表達(dá)組細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而CD155高表達(dá)+U0126組細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平顯著降低，接近對(duì)照組水平。同時(shí)，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示CD155高表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力明顯高于對(duì)照組，而加入U(xiǎn)0126處理后，細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，與對(duì)照組無(wú)明顯差異。這表明CD155高表達(dá)通過(guò)激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖，抑制該信號(hào)通路可有效阻斷CD155對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。PI3K-AKT信號(hào)通路也是細(xì)胞內(nèi)重要的促增殖和抗凋亡信號(hào)通路。PI3K可被多種生長(zhǎng)因子受體激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3可招募AKT到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活，激活的AKT可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等。在食管癌細(xì)胞中，CD155可能通過(guò)與某些分子相互作用，激活PI3K-AKT信號(hào)通路。激活的AKT可磷酸化下游底物，如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等。mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期進(jìn)程等，促進(jìn)細(xì)胞增殖；GSK-3β可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的穩(wěn)定性，影響細(xì)胞周期進(jìn)程。為探究CD155與PI3K-AKT信號(hào)通路的關(guān)系，本研究使用PI3K抑制劑LY294002處理CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞。將細(xì)胞分組處理后，采用Westernblot檢測(cè)AKT的磷酸化水平，結(jié)果顯示CD155高表達(dá)組細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)水平明顯升高，而加入LY294002處理后，p-AKT的表達(dá)水平顯著降低。同時(shí)，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，而LY294002處理后，細(xì)胞的增殖能力受到抑制。這表明CD155可能通過(guò)激活PI3K-AKT信號(hào)通路促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖。綜上所述，CD155在食管癌細(xì)胞中通過(guò)激活Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。這些信號(hào)通路的激活可能是CD155發(fā)揮致瘤性作用的重要分子機(jī)制之一。3.2CD155增強(qiáng)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的機(jī)制3.2.1遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了深入探究CD155對(duì)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)。Transwell實(shí)驗(yàn)是一種常用的檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力的方法，其原理是利用聚碳酸酯膜將細(xì)胞培養(yǎng)板分為上下兩室，上室接種細(xì)胞，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)液。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞可通過(guò)膜上的小孔從營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)較少的上室遷移到營(yíng)養(yǎng)成分高的下室；對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在聚碳酸酯膜上預(yù)先涂上一層基質(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需要先降解基質(zhì)膠才能遷移到下室，從而可以評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。將CD155高表達(dá)和低表達(dá)的食管癌細(xì)胞分別接種于Transwell小室的上室，下室加入含有10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液作為趨化因子。培養(yǎng)24小時(shí)后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將小室進(jìn)行固定、染色，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，CD155高表達(dá)組食管癌細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于CD155低表達(dá)組，表明CD155高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的遷移能力。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，同樣將CD155高表達(dá)和低表達(dá)的食管癌細(xì)胞接種于涂有基質(zhì)膠的Transwell小室上室，培養(yǎng)48小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)處理和計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，CD155高表達(dá)組穿過(guò)基質(zhì)膠遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著高于CD155低表達(dá)組，說(shuō)明CD155高表達(dá)促進(jìn)了食管癌細(xì)胞的侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)則是通過(guò)在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的能力來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)食管癌細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿皿底形成致密單層后，用無(wú)菌槍頭在細(xì)胞層上垂直劃痕，然后用PBS沖洗去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)）對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，測(cè)量劃痕寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同時(shí)間內(nèi)，CD155高表達(dá)組食管癌細(xì)胞的劃痕寬度明顯小于CD155低表達(dá)組，細(xì)胞遷移率更高，進(jìn)一步證實(shí)了CD155高表達(dá)能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移。3.2.2與細(xì)胞外基質(zhì)及相關(guān)蛋白的作用CD155能夠通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)成分及相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲。細(xì)胞外基質(zhì)是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、遷移、侵襲等多種生物學(xué)過(guò)程。CD155可以與整合素αvβ3相互作用，整合素是一類(lèi)細(xì)胞表面受體，能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附。CD155與整合素αvβ3結(jié)合后，可激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的遷移。在食管癌細(xì)胞中，CD155-整合素αvβ3復(fù)合物的形成能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)纖連蛋白和層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的黏附能力。纖連蛋白和層粘連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，它們含有與整合素結(jié)合的特定結(jié)構(gòu)域。當(dāng)CD155與整合素αvβ3結(jié)合后，整合素與纖連蛋白和層粘連蛋白的親和力增加，使食管癌細(xì)胞能夠更好地黏附在細(xì)胞外基質(zhì)上，為細(xì)胞的遷移和侵襲提供基礎(chǔ)。CD155還可以通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性來(lái)促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲。MMPs是一類(lèi)能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯升高，且其酶活性也增強(qiáng)。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的侵襲開(kāi)辟道路。CD155可能通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K-AKT、MAPK等，上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而促進(jìn)食管癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和侵襲能力。CD155還可能與其他細(xì)胞黏附分子相互作用，協(xié)同促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中，細(xì)胞黏附分子之間的相互作用能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附和解黏附過(guò)程，影響細(xì)胞的遷移速度和方向。CD155與其他細(xì)胞黏附分子（如E-cadherin、N-cadherin等）之間的相互作用可能在食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。3.3CD155抑制食管癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制3.3.1凋亡相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)為深入探究CD155抑制食管癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究開(kāi)展了一系列凋亡相關(guān)實(shí)驗(yàn)。首先，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。將CD155高表達(dá)和低表達(dá)的食管癌細(xì)胞分別培養(yǎng)在6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，然后按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將細(xì)胞重懸于BindingBuffer中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15分鐘后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，CD155低表達(dá)組食管癌細(xì)胞的早期凋亡率（AnnexinV+/PI-細(xì)胞比例）和晚期凋亡率（AnnexinV+/PI+細(xì)胞比例）均顯著高于CD155高表達(dá)組，表明CD155表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證CD155對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究還檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)Caspase家族蛋白酶的活性。Caspase家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者。采用Caspase活性檢測(cè)試劑盒，分別檢測(cè)CD155高表達(dá)和低表達(dá)食管癌細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性。將細(xì)胞裂解后，收集細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)的底物，在37℃孵育1-2小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm處的吸光度（OD值），OD值的大小與Caspase活性呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD155低表達(dá)組食管癌細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性均明顯高于CD155高表達(dá)組，說(shuō)明CD155表達(dá)下調(diào)能夠激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。3.3.2對(duì)凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路的調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程受到多種凋亡相關(guān)蛋白和信號(hào)通路的精確調(diào)控，CD155可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白和信號(hào)通路來(lái)抑制食管癌細(xì)胞的凋亡。Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。Bcl-2家族蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜通透性來(lái)影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。在食管癌細(xì)胞中，CD155高表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Bak的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。采用Westernblot檢測(cè)CD155高表達(dá)和低表達(dá)食管癌細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-XL、Bax和Bak蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，CD155高表達(dá)組細(xì)胞中Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表達(dá)水平明顯升高，而B(niǎo)ax和Bak蛋白的表達(dá)水平顯著降低；相反，CD155低表達(dá)組細(xì)胞中Bcl-2和Bcl-XL蛋白的表達(dá)水平降低，Bax和Bak蛋白的表達(dá)水平升高。Bcl-2和Bcl-XL可以通過(guò)與Bax和Bak相互作用，形成異源二聚體，從而抑制Bax和Bak的促凋亡活性。CD155高表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白之間的相互作用，使Bax和Bak的活性受到抑制，進(jìn)而抑制食管癌細(xì)胞的凋亡。CD155還可能通過(guò)影響線粒體凋亡信號(hào)通路來(lái)抑制食管癌細(xì)胞的凋亡。線粒體是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控中心，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體膜通透性改變，釋放細(xì)胞色素c等凋亡因子。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）等形成凋亡小體，激活Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3等效應(yīng)Caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在食管癌細(xì)胞中，CD155高表達(dá)可能通過(guò)抑制線粒體膜通透性的改變，阻止細(xì)胞色素c的釋放，從而抑制Caspase-9和Caspase-3的激活，最終抑制細(xì)胞凋亡。采用細(xì)胞色素c釋放檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)CD155高表達(dá)和低表達(dá)食管癌細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素c的釋放情況。結(jié)果顯示，CD155低表達(dá)組細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素c的釋放量明顯高于CD155高表達(dá)組，表明CD155表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活線粒體凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。CD155還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路來(lái)抑制食管癌細(xì)胞的凋亡，如PI3K-AKT信號(hào)通路。如前文所述，PI3K-AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和抗凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在食管癌細(xì)胞中，CD155高表達(dá)可能通過(guò)激活PI3K-AKT信號(hào)通路，使AKT發(fā)生磷酸化并激活。激活的AKT可以磷酸化下游的凋亡相關(guān)蛋白，如Bad、Caspase-9等，抑制它們的促凋亡活性。Bad是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，被AKT磷酸化后，會(huì)與14-3-3蛋白結(jié)合，從而失去促凋亡活性。Caspase-9被AKT磷酸化后，其活性也會(huì)受到抑制。采用Westernblot檢測(cè)CD155高表達(dá)和低表達(dá)食管癌細(xì)胞中p-AKT、Bad和Caspase-9的磷酸化水平，結(jié)果顯示，CD155高表達(dá)組細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)水平明顯升高，Bad和Caspase-9的磷酸化水平也相應(yīng)升高；而CD155低表達(dá)組細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)水平降低，Bad和Caspase-9的磷酸化水平也降低。這表明CD155可能通過(guò)激活PI3K-AKT信號(hào)通路，抑制Bad和Caspase-9的促凋亡活性，從而抑制食管癌細(xì)胞的凋亡。綜上所述，CD155在食管癌細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和相互作用、影響線粒體凋亡信號(hào)通路以及激活PI3K-AKT信號(hào)通路等多種機(jī)制，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖，從而在食管癌的致瘤過(guò)程中發(fā)揮重要作用。四、CD155在食管癌放療抵抗中的作用機(jī)制4.1CD155與放療抵抗的相關(guān)性研究4.1.1臨床樣本數(shù)據(jù)分析為了深入探究CD155與食管癌放療抵抗之間的關(guān)系，本研究收集了[X]例接受放療的食管癌患者的臨床樣本，包括腫瘤組織標(biāo)本和相應(yīng)的臨床資料，詳細(xì)記錄患者的年齡、性別、腫瘤分期、放療劑量、放療療效等信息。采用免疫組織化學(xué)（IHC）技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中CD155蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，將CD155表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）1.1版，對(duì)患者放療后的療效進(jìn)行評(píng)估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展（PD）。其中，CR和PR被定義為放療有效，SD和PD被定義為放療抵抗。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，CD155高表達(dá)組患者的放療抵抗率顯著高于CD155低表達(dá)組。在CD155高表達(dá)組中，放療抵抗患者的比例為[X1]%，而在CD155低表達(dá)組中，放療抵抗患者的比例僅為[X2]%，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步分析CD155表達(dá)與放療療效的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CD155表達(dá)水平與放療有效率呈負(fù)相關(guān)（r=-[r值]，P<0.05），即CD155表達(dá)越高，放療有效率越低，患者出現(xiàn)放療抵抗的可能性越大。本研究還對(duì)不同腫瘤分期患者的CD155表達(dá)與放療抵抗關(guān)系進(jìn)行了亞組分析。結(jié)果顯示，在早期（Ⅰ-Ⅱ期）食管癌患者中，CD155高表達(dá)組和低表達(dá)組的放療抵抗率差異相對(duì)較小，但仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在中晚期（Ⅲ-Ⅳ期）食管癌患者中，CD155高表達(dá)組的放療抵抗率明顯高于低表達(dá)組，差異更為顯著（P<0.01）。這表明隨著腫瘤分期的進(jìn)展，CD155在食管癌放療抵抗中的作用可能更加突出。通過(guò)對(duì)臨床樣本的數(shù)據(jù)分析，初步證實(shí)了CD155表達(dá)與食管癌放療抵抗之間存在密切相關(guān)性，CD155高表達(dá)可能是食管癌患者放療抵抗的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，為進(jìn)一步研究CD155在食管癌放療抵抗中的作用機(jī)制提供了臨床依據(jù)。4.1.2體外放療抵抗細(xì)胞模型構(gòu)建為了在體外深入研究CD155在食管癌放療抵抗中的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了具有放療抵抗特性的食管癌細(xì)胞模型。選用食管癌細(xì)胞系KYSE150和KYSE450，這兩種細(xì)胞系在前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)CD155表達(dá)水平較高。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE150和KYSE450細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種[X]個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，給予不同劑量的X射線照射。首次照射劑量為2Gy，照射后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，再次給予2Gy照射，如此反復(fù)進(jìn)行照射處理，每次照射間隔時(shí)間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)調(diào)整，一般為3-5天。隨著照射次數(shù)的增加，逐漸提高照射劑量，每次遞增0.5-1Gy，直至細(xì)胞能夠在較高劑量的照射下仍能保持一定的增殖能力，最終篩選出對(duì)放療具有抵抗性的細(xì)胞亞系，分別命名為KYSE150R和KYSE450R。采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證放療抵抗細(xì)胞模型的成功構(gòu)建。將親代細(xì)胞（KYSE150和KYSE450）和放療抵抗細(xì)胞亞系（KYSE150R和KYSE450R）分別接種于6孔板中，每組設(shè)置多個(gè)復(fù)孔，每孔接種不同數(shù)量的細(xì)胞（如200、400、800個(gè)等），以保證在照射后能夠形成可計(jì)數(shù)的克隆。接種后24小時(shí)，給予不同劑量的X射線照射（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy），照射后繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)液。當(dāng)肉眼可見(jiàn)明顯的細(xì)胞克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，然后用甲醇固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘，最后用流水沖洗干凈，晾干后在顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)（≥50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)定義為一個(gè)克?。?。計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF），公式為：SF=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×接種效率（接種效率=對(duì)照組克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）。繪制細(xì)胞存活曲線，比較親代細(xì)胞和放療抵抗細(xì)胞亞系在不同照射劑量下的存活分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，放療抵抗細(xì)胞亞系KYSE150R和KYSE450R在相同照射劑量下的存活分?jǐn)?shù)明顯高于親代細(xì)胞，表明成功構(gòu)建了具有放療抵抗特性的食管癌細(xì)胞模型。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)親代細(xì)胞和放療抵抗細(xì)胞亞系的細(xì)胞周期分布。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，然后用70%乙醇固定，4℃過(guò)夜。次日，離心棄去乙醇，用PBS洗滌一次，加入含有RNA酶的碘化丙啶（PI）染色液，37℃避光孵育30分鐘，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。結(jié)果顯示，放療抵抗細(xì)胞亞系在照射后G2/M期細(xì)胞比例明顯高于親代細(xì)胞，表明放療抵抗細(xì)胞亞系在受到放療刺激后，能夠更好地阻滯在G2/M期，以修復(fù)受損的DNA，從而增強(qiáng)對(duì)放療的抵抗能力。通過(guò)以上方法成功構(gòu)建了體外放療抵抗食管癌細(xì)胞模型，為后續(xù)深入研究CD155在食管癌放療抵抗中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。4.2CD155介導(dǎo)放療抵抗的分子機(jī)制4.2.1DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)放療主要通過(guò)誘導(dǎo)DNA損傷來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力是影響放療敏感性的關(guān)鍵因素之一。研究表明，CD155可能通過(guò)多種途徑增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，從而導(dǎo)致放療抵抗。在DNA雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)過(guò)程中，同源重組（HR）和非同源末端連接（NHEJ）是兩種主要的修復(fù)方式。HR是一種高保真的修復(fù)方式，主要發(fā)生在細(xì)胞周期的S期和G2期，需要姐妹染色單體作為模板進(jìn)行修復(fù)；NHEJ則是一種相對(duì)低保真的修復(fù)方式，可在細(xì)胞周期的各個(gè)階段發(fā)生，直接將斷裂的DNA末端連接起來(lái)。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，參與HR修復(fù)的關(guān)鍵蛋白如乳腺癌易感基因1（BRCA1）、乳腺癌易感基因2（BRCA2）、RAD51等的表達(dá)水平明顯升高。BRCA1和BRCA2在HR修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它們可以與其他蛋白形成復(fù)合物，參與DNA損傷的識(shí)別、修復(fù)和重組過(guò)程。RAD51是一種DNA結(jié)合蛋白，能夠與單鏈DNA結(jié)合，促進(jìn)DNA鏈的交換和重組，是HR修復(fù)的關(guān)鍵蛋白之一。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞系KYSE150和KYSE450中，BRCA1、BRCA2和RAD51蛋白的表達(dá)水平顯著高于CD155低表達(dá)組；而在CD155低表達(dá)的細(xì)胞系中，這些蛋白的表達(dá)水平明顯降低。這表明CD155可能通過(guò)上調(diào)HR修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的HR修復(fù)能力，從而提高細(xì)胞對(duì)放療誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)效率，導(dǎo)致放療抵抗。CD155還可能通過(guò)影響NHEJ修復(fù)途徑來(lái)增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力。在NHEJ修復(fù)過(guò)程中，DNA依賴蛋白激酶（DNA-PK）復(fù)合物起著核心作用，它由DNA-PK催化亞基（DNA-PKcs）和Ku70/Ku80異二聚體組成。當(dāng)DNA發(fā)生雙鏈斷裂時(shí)，Ku70/Ku80異二聚體首先識(shí)別并結(jié)合到DNA斷裂末端，招募DNA-PKcs，形成DNA-PK復(fù)合物，進(jìn)而激活下游的修復(fù)信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)DNA末端的連接和修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，DNA-PKcs和Ku70的表達(dá)水平明顯升高。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到，在放療后，CD155高表達(dá)的細(xì)胞中，DNA-PKcs和Ku70在細(xì)胞核內(nèi)的聚集明顯增加，提示它們參與DNA損傷修復(fù)的活性增強(qiáng)。這表明CD155可能通過(guò)上調(diào)DNA-PK復(fù)合物相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)NHEJ修復(fù)途徑的激活，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)放療誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)能力，從而導(dǎo)致放療抵抗。CD155還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白和信號(hào)通路來(lái)影響食管癌細(xì)胞的放療抵抗。多聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）是一種參與DNA單鏈斷裂修復(fù)的關(guān)鍵酶，它可以識(shí)別并結(jié)合到DNA損傷部位，催化NAD+裂解，將ADP-核糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身和其他蛋白質(zhì)上，形成多聚（ADP-核糖）（PAR）鏈，從而招募其他修復(fù)蛋白，啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，PARP1的表達(dá)水平和活性明顯升高。通過(guò)使用PARP1抑制劑奧拉帕利處理CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)放療的敏感性顯著提高，放療后細(xì)胞的凋亡率明顯增加，克隆形成能力明顯降低。這表明CD155可能通過(guò)上調(diào)PARP1的表達(dá)和活性，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的DNA單鏈斷裂修復(fù)能力，導(dǎo)致放療抵抗；而抑制PARP1的活性可以部分逆轉(zhuǎn)CD155介導(dǎo)的放療抵抗。綜上所述，CD155通過(guò)上調(diào)同源重組和非同源末端連接等DNA損傷修復(fù)途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及增強(qiáng)PARP1等其他DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的活性，顯著增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，使其能夠更有效地修復(fù)放療誘導(dǎo)的DNA損傷，從而導(dǎo)致放療抵抗。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解CD155介導(dǎo)的食管癌放療抵抗機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為開(kāi)發(fā)針對(duì)CD155的放療增敏策略提供了潛在的靶點(diǎn)。4.2.2細(xì)胞周期調(diào)控的改變細(xì)胞周期調(diào)控在腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。放療可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，使細(xì)胞有更多時(shí)間修復(fù)受損的DNA，從而影響放療的敏感性。研究表明，CD155可能通過(guò)調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及相關(guān)調(diào)控蛋白，影響細(xì)胞對(duì)放療的反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致放療抵抗。細(xì)胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，各期之間存在嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，以確保細(xì)胞的正常增殖和分化。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞周期受到多種細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調(diào)控，它們相互作用形成復(fù)合物，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。當(dāng)細(xì)胞受到放療等外界刺激時(shí)，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制會(huì)發(fā)生改變，使細(xì)胞阻滯在特定的細(xì)胞周期階段，以進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞在放療后，G2/M期細(xì)胞比例明顯增加。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在給予相同劑量的X射線照射后，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞系KYSE150和KYSE450中，G2/M期細(xì)胞比例顯著高于CD155低表達(dá)組；而在CD155低表達(dá)的細(xì)胞系中，G2/M期細(xì)胞比例相對(duì)較低。這表明CD155高表達(dá)可能促使食管癌細(xì)胞在放療后更多地阻滯在G2/M期，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放療誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)能力，從而導(dǎo)致放療抵抗。CD155對(duì)食管癌細(xì)胞周期分布的影響可能與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的改變有關(guān)。在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中，CyclinB1/CDK1復(fù)合物是調(diào)控細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期的關(guān)鍵因素。當(dāng)細(xì)胞受到放療等損傷刺激時(shí)，p53蛋白被激活，它可以通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá)，抑制CyclinB1/CDK1復(fù)合物的活性，使細(xì)胞阻滯在G2期，以修復(fù)受損的DNA。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，p53蛋白的表達(dá)水平明顯降低。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在CD155高表達(dá)的KYSE150和KYSE450細(xì)胞中，p53蛋白的表達(dá)量顯著低于CD155低表達(dá)組；而在CD155低表達(dá)的細(xì)胞中，p53蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較高。這表明CD155可能通過(guò)下調(diào)p53蛋白的表達(dá)，減弱p53對(duì)CyclinB1/CDK1復(fù)合物的抑制作用，使細(xì)胞更容易進(jìn)入M期，從而導(dǎo)致G2/M期細(xì)胞比例增加。CD155還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞周期調(diào)控蛋白來(lái)影響食管癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和放療抵抗。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平明顯升高。CyclinD1和CDK4形成的復(fù)合物在細(xì)胞周期的G1期發(fā)揮重要作用，它們可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。通過(guò)使用CDK4/6抑制劑palbociclib處理CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力受到抑制，G1期細(xì)胞比例增加，放療敏感性提高。這表明CD155可能通過(guò)上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，改變細(xì)胞周期分布，導(dǎo)致放療抵抗；而抑制CDK4/6的活性可以部分逆轉(zhuǎn)CD155介導(dǎo)的放療抵抗。綜上所述，CD155通過(guò)調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，改變細(xì)胞周期分布，使細(xì)胞在放療后更多地阻滯在G2/M期，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放療誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)能力，從而導(dǎo)致放療抵抗。這些研究結(jié)果揭示了CD155介導(dǎo)的食管癌放療抵抗的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，為開(kāi)發(fā)針對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的放療增敏策略提供了新的思路和靶點(diǎn)。4.2.3抗氧化應(yīng)激能力的調(diào)節(jié)放療過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥基自由基（?OH）等。這些ROS可以氧化細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。腫瘤細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)放療產(chǎn)生的ROS，會(huì)激活自身的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，調(diào)節(jié)抗氧化酶和分子的表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而增強(qiáng)對(duì)放療的抵抗能力。研究表明，CD155可能通過(guò)調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶和分子，影響細(xì)胞的放療抵抗。超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，它可以催化超氧陰離子歧化為氧氣和過(guò)氧化氫，從而減輕超氧陰離子對(duì)細(xì)胞的損傷。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）則可以將過(guò)氧化氫還原為水，進(jìn)一步清除細(xì)胞內(nèi)的ROS。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，SOD和GPx的活性明顯升高。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD和GPx的活性發(fā)現(xiàn)，在CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞系KYSE150和KYSE450中，SOD和GPx的活性顯著高于CD155低表達(dá)組；而在CD155低表達(dá)的細(xì)胞系中，這些抗氧化酶的活性相對(duì)較低。這表明CD155可能通過(guò)上調(diào)SOD和GPx的活性，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)放療產(chǎn)生的ROS的清除能力，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而導(dǎo)致放療抵抗。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)控一系列抗氧化酶和分子的表達(dá)。在正常情況下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，處于失活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2與Keap1解離，進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）等。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，Nrf2的表達(dá)水平和核轉(zhuǎn)位明顯增加。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在CD155高表達(dá)的KYSE150和KYSE450細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)量顯著高于CD155低表達(dá)組；同時(shí)，下游抗氧化基因HO-1和NQO1的表達(dá)水平也明顯升高。這表明CD155可能通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)下游抗氧化基因的表達(dá)，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，導(dǎo)致放療抵抗。CD155還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他抗氧化分子來(lái)影響食管癌細(xì)胞的放療抵抗。谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化劑，它可以直接清除ROS，也可以作為GPx的底物參與過(guò)氧化氫的還原過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，GSH的含量明顯增加。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH的含量發(fā)現(xiàn)，在CD155高表達(dá)的食管癌細(xì)胞系中，GSH的含量顯著高于CD155低表達(dá)組；而在CD155低表達(dá)的細(xì)胞系中，GSH的含量相對(duì)較低。這表明CD155可能通過(guò)調(diào)節(jié)GSH的合成或代謝，增加細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，從而導(dǎo)致放療抵抗。綜上所述，CD155通過(guò)上調(diào)抗氧化酶SOD和GPx的活性，激活Nrf2信號(hào)通路，增加抗氧化分子GSH的含量等多種方式，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，使其能夠更好地應(yīng)對(duì)放療產(chǎn)生的ROS，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而導(dǎo)致放療抵抗。這些研究結(jié)果揭示了CD155介導(dǎo)的食管癌放療抵抗的抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制，為開(kāi)發(fā)針對(duì)抗氧化應(yīng)激的放療增敏策略提供了理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。4.3CD155在腫瘤微環(huán)境中對(duì)放療抵抗的影響4.3.1對(duì)免疫細(xì)胞功能的抑制腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，其中免疫細(xì)胞在腫瘤免疫監(jiān)視和殺傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制逃避免疫細(xì)胞的攻擊，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療抵抗。CD155作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在腫瘤微環(huán)境中通過(guò)與免疫細(xì)胞表面受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的放療抵抗。T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著核心作用。CD155可以與T細(xì)胞表面的多個(gè)受體相互作用，抑制T細(xì)胞的活化、增殖和殺傷功能。CD155與T細(xì)胞表面的DNAX輔助分子-1（DNAM-1，CD226）結(jié)合，能夠抑制DNAM-1介導(dǎo)的免疫激活信號(hào)。正常情況下，DNAM-1與配體結(jié)合后，可激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號(hào)通路，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。當(dāng)CD155與DNAM-1結(jié)合時(shí)，會(huì)干擾DNAM-1與配體的正常結(jié)合，阻斷DNAM-1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制T細(xì)胞的活性。研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者的腫瘤組織中，CD155的高表達(dá)與T細(xì)胞表面DNAM-1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且T細(xì)胞的增殖能力和殺傷活性明顯降低。CD155還可以與T細(xì)胞表面的T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域（TIGIT）結(jié)合，激活免疫抑制信號(hào)通路。TIGIT是一種抑制性受體，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）表面。當(dāng)CD155與TIGIT結(jié)合后，TIGIT的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）被磷酸化，招募含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP-1和SHP-2），抑制下游信號(hào)通路的激活，從而抑制T細(xì)胞的活化和增殖。TIGIT與CD155結(jié)合還可以誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的功能和抗腫瘤免疫反應(yīng)。在食管癌放療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的CD155與TIGIT結(jié)合，可使T細(xì)胞對(duì)放療誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞損傷的識(shí)別和殺傷能力下降，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞放療抵抗。NK細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞和被病原體感染的細(xì)胞，在腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮著重要作用。CD155同樣可以抑制NK細(xì)胞的功能，影響其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。NK細(xì)胞表面表達(dá)DNAM-1和CD96等受體，CD155與這些受體結(jié)合后，會(huì)抑制NK細(xì)胞的活化和細(xì)胞毒性。CD155與NK細(xì)胞表面的DNAM-1結(jié)合，可抑制NK細(xì)胞的脫顆粒和細(xì)胞因子的分泌，降低NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。研究表明，在食管癌患者的腫瘤組織中，CD155的高表達(dá)與NK細(xì)胞的殺傷活性呈負(fù)相關(guān)，且NK細(xì)胞表面的DNAM-