實驗用牛微生物學(xué)等級及監(jiān)測2022-09-16實施2022-09-16實施DB62/T4575—2022 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 24微生物學(xué)等級分類 25檢測要求 26檢測程序 37檢測方法 48檢測規(guī)則 69結(jié)果判定 610判定結(jié)論 7附錄A(規(guī)范性)牛副流感病毒3型RT-PCR診斷方法 8附錄B(規(guī)范性)牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌多重PCR診斷方法 附錄C(規(guī)范性)牛呼吸道合胞體病毒套式RT-PCR檢測方法 附錄D(規(guī)范性)牛輪狀病毒多重半套式RT-PCR檢測方法 I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由甘肅省科學(xué)技術(shù)廳提出、歸口并監(jiān)督實施。本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所、甘肅省藥品檢驗研究院、甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所、甘肅省分析測試中心、甘肅省動物疫病預(yù)防控制中心。本文件主要起草人：董鵬程、朱喜春、常攀峰、王亮、劉蘭、羅金印、李潤林、王瑜、王東升、李琪、樊世常、汪文琦。僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB/T14926.46實驗動物鉤螺旋體檢測方法GB/T18089藍(lán)舌病病毒分離、鑒定及血GB/T22915口蹄疫病毒熒光RNY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范NY/T574地方流行性牛白血病瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗方法NY/T575牛傳染性鼻氣管炎診斷技術(shù)SN/T1086牛生殖道彎曲桿菌病檢疫1學(xué)兔兔標(biāo)準(zhǔn)下載2SN/T3392國境口岸萊姆病螺旋體檢驗規(guī)程除普通牛應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學(xué)實驗干擾大的病原的實驗用5.2微生物檢測項目普通級口蹄疫病毒Food-and-mouthdiseasevirusDB62/T4575—2022表1實驗用牛微生物檢測項目(續(xù))普通級炭疽芽胞桿菌BacillusanthracisO炭疽芽胞桿菌BacillusanthracisOO伯氏疏螺旋體BorreliaburgdorferiO貝氏柯克斯體CoxiellaburnetiiO牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒O無特定病原體級牛病毒性腹瀉/粘膜病毒Bovineviraldiarrheavirus/Mucosaldiseasevirus●牛輪狀病毒Bovinerotavirus●●胎兒彎曲桿菌Campylobacterfetus●牛副流感病毒3型Bovineparainfluenzavirustype3●牛呼吸道合胞體病毒Bovinerespiratorysyncytialvirus●牛傳染性鼻氣管炎病毒Infectiousbovinerhinotracheitisvirus●牛白血病病毒Bovineleukemiavirus●●牛支原體Mycoplasmabovis●●牛流行性出血熱病毒BovineephemeralfevervirusO藍(lán)舌病病毒BluetonguevirusO注1:▲應(yīng)檢測項目，普通級可免疫，無特定抗原抗體實驗用牛和無特定病原體級不可免疫。注2:●應(yīng)檢測項目。注3:O必要時檢測項目。5.3檢測項目分類5.3.1必須檢測項目：在進(jìn)行實驗用牛質(zhì)量評價時必須檢測的項目。普通級可免疫接種疫苗，無特定病原體級不能免疫接種疫苗。5.3.2必要時檢測項目：申請生產(chǎn)許可證、從國內(nèi)外引進(jìn)實驗用牛、疑有該病原體感染和實驗特殊需要時應(yīng)檢測的項目。普通牛規(guī)定的必須檢測和必要時檢測項目，在無特定病原體牛中為必須檢測項目。6檢測程序檢測程序見圖1。34采集耳后、背部毛發(fā)或皮屑采集鼻拭子、咽喉拭子、肛拭子(或新鮮糞便)適用范圍口蹄疫病毒核酸檢測(血樣、咽喉拭子)核酸檢測(水泡液)抗體檢測(血清或奶樣)核酸檢測(陰道拭子、奶樣、組織)牛分枝桿菌皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗、抗原檢測(血樣、奶樣、糞便或病料)核酸檢測(血樣、奶樣、糞便或病料)炭疽芽胞桿菌抗原檢測(血液、病變部位的水腫液或滲出液)核酸檢測(血液、病變部位的水腫液或滲出液)DB62/T4575—2022表2實驗用牛微生物檢測方法(續(xù))適用范圍抗體檢測抗原檢測(血液、尿液、組織)抗體檢測、抗原檢測(血樣或蜱)、核酸檢測(血樣或蜱)貝氏柯克斯體抗體檢測抗原檢測(陰道分泌物、奶樣、糞便、動物組織或流產(chǎn)胎兒)牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒抗體檢測(血清)液等)牛病毒性腹瀉-粘膜病抗體檢測、抗原檢測(血樣、鼻拭子、精液或動物組織)核酸檢測(血樣、鼻拭子、精液或動物組織)副結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(血樣、奶樣、糞便或病料)抗體檢測(血清或奶樣)、抗原檢測(糞便、病抗原檢測(陰道粘液、包皮液、精液)核酸檢測(陰道粘液、包皮液、精液、流產(chǎn)胎兒或胎盤)附錄A核酸檢測(鼻拭子、肺組織)巴氏桿菌附錄B核酸檢測(鼻拭子、肺組織)牛呼吸道合胞體病毒附錄C核酸檢測(鼻拭子、肺組織)牛輪狀病毒附錄D核酸檢測(肛拭子、新鮮糞便)牛傳染性鼻氣管炎病毒核酸檢測(血樣、結(jié)膜/黏膜拭子、精液及動物組織)抗體檢測、抗原檢測(鼻拭子、陰道拭子、精液及組織)牛白血病病毒抗體檢測抗原檢測(血樣)核酸檢測(血樣、動物組織)牛支原體核酸檢測(肺組織)抗體檢測、抗原檢測、核酸檢測(流產(chǎn)胎兒或病料)牛流行性出血熱病毒抗體檢測抗體檢測抗體檢測、抗原檢測(血樣、精液、動物組織或庫蠑4)核酸檢測(血樣、精液、動物組織或庫蠑)6抗原檢測、核酸檢測后“()”中注明的是可用于檢測的樣本來源。568檢測規(guī)則宜選擇3～6月齡實驗用牛(也可根據(jù)需求),隨機(jī)抽樣。小于20頭不少于5頭不少于10頭101～500頭不少于20頭不少于30頭樣品采集的方法按照NY/T541進(jìn)行。8.3.1樣本采集、保存與運輸應(yīng)按照NY/T541進(jìn)行。8.3.3涉及疑似人畜共患病和重大動物疫病的病料，免疫項目，群體免疫合格率≥70%,判為合格。需要進(jìn)一步確診時，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀和前期檢測結(jié)果，采集動物組織或特定樣本，按照表2規(guī)定的10判定結(jié)論所有項目的檢測結(jié)果均合格，判定為符合相應(yīng)的動物等級標(biāo)準(zhǔn)。否則，判定為不符合相應(yīng)的動物等級標(biāo)準(zhǔn)。78(規(guī)范性)牛副流感病毒3型RT-PCR診斷方法A.1檢測原理流行病學(xué)調(diào)查顯示我國牛副流感病毒3型血清陽性率達(dá)77.96%(2960/3797),我國對牛副流感病毒3型未進(jìn)行免疫接種，高血清陽性率說明我國牛群中感染非常普遍。運輸、氣候變化、混群等應(yīng)激因素可導(dǎo)致牛副流感病毒3型的感染，作為實驗用牛經(jīng)歷運輸?shù)葢?yīng)激因素是必然的。牛感染牛副流感病毒3型后不但引起牛呼吸道疾病，還可引起免疫抑制，感染后不宜作為實驗用牛。本方法采用RT-PCR擴(kuò)增牛副流感病毒3型高度保守性M基因，實現(xiàn)牛副流感病毒3型的檢測，達(dá)到篩選牛副流感病毒3型陰性實驗用牛的目的。A.2檢測樣本牛鼻腔深部拭子。A.3檢測引物BPIV3MR5'GTAAA.4檢測方法鼻拭子加入一定量的PBS,漩渦震蕩后，3000rpm離心5min,取上清液。按照AXYGEN病毒RNA小量提取試劑盒說明書方法提取基因組RNA。以提取的基因組RNA為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取7.5μl在冰浴上冷卻2min以上。離心數(shù)秒使混合物集于管底。在上述混合物中加入如下物質(zhì)，4μl5×M-MLV15min。然后冰浴冷卻后作為PCR反應(yīng)模板備用。PCR反應(yīng)體系為1.0μlExTaq(5U/反應(yīng)條件為95℃3min;94℃45s,60.5℃45s,72℃1min,30個循環(huán)；72℃10min。預(yù)計產(chǎn)物大小為998bp。同時設(shè)牛副流感病毒3型作為陽性對照和水作為陰性對照。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。A.5結(jié)果判定陰陽性對照成立的條件下，樣本能擴(kuò)增出特異性大小約998bp的目的條帶判為陽性，否則判為陰性。A.6檢測序列CCGCAATATACACATTTCCAGAATCTTCATTTTCTGAAAGTGGCAACTAAAGGTCAACGAACAAAGGAAGGCAATTCCTCATATCAGAGTTGTTACCAAACATGGTTCAAGATATCTTGATGTATTTCTACTGGGTTTTTTTGAGGACAGATATGGGAGTGTCAGTGATCTGGATGATGATCCAAGTTATAAAGTTCTACCACTTGGGCTAGCAAAATACACTGGGAATGATCAGGAACTCCTACATAGATATAGAAGTGAGAAGAACTGTCAAAGCCACGGAGATGATAGTCTACATAAACCTGAACTGTACCCATGGTCAAGCAGATTAAGAAAAGGGATGTTATGTTGCGCTTGCACCCCAGTGTCTTCCACTCGATAGAGGGATAAAATTCAGTTGTACAGCAATTGGATCAATAACACTCTTTAAAATTCCCAAATCTATGGAAACACCATATCAATAAACTTACAGGTACACATAAAAACAGGAATCCAAACTGACGTTGTCCAGATCTTAGATGAGAAAGGTGAGAAATCGTTAAACTTTATGGTAAACGGAAGGTAGGTCGAATGTATTCAGTAGAGTATTGCAAACAAAAGATCTACTATTTTCATTGGGATTAGTTGGAGGAATTAGCTTTCATGTCAATGAAGACGTTGGCGAGTCAACTAGCGTTCAAAAGGGAAATCTGTTATCCTCTCATGGACACCTAAATCTGGTTATATGGGCATCATCAGTTGAAATCACAAGAGTGGATGCA9(規(guī)范性)牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌多重PCR診斷方法B.1檢測原理牛多殺性巴氏桿菌為典型的條件致病菌，自然條件下常寄生于牛上呼吸道，在受到應(yīng)激刺激后可引起牛體發(fā)病。實驗用牛不可避免地受到運輸?shù)葢?yīng)急因素的刺激而增加發(fā)病風(fēng)險，從而對其它實驗造成不利影響，所以實驗用牛排除該病很有必要。我國主要流行莢膜A、B兩種血清型的多殺性巴氏桿菌。本方法通過對采集的牛鼻腔拭子進(jìn)行多重PCR的檢測，采用特異性引物分別擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmt1,以及A、B莢膜血清型特異性基因hyaD-hyaC與bcbD,實現(xiàn)多殺性巴氏桿菌檢測并分型，達(dá)到篩選牛莢膜A、B型多殺性巴氏桿菌陰性實驗用牛的目的。B.2檢測樣本牛鼻腔深部拭子，置于腦心浸液培養(yǎng)基中(含萬古霉素10μg/mL)培養(yǎng)后，分離、鑒別收獲細(xì)菌。B.3檢測引物檢測引物包括：a)多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmt1(460bp)上下游引物序列：2)kmt1-L:5'GCTGTAAACGAACTCGb)莢膜血清A型特異性基因hyaD-hyaC(1044bp)上下游引物序列：c)莢膜血清B型特異性基因bcbD(760bp)上下游引物序列：B.4檢測方法按照AXYGEN病毒DNA小量提取試劑盒說明書方法提取培養(yǎng)物DNA。配制下列PCR反應(yīng)體系，DNA模板<500ng,多重上游引物(10μM)1.5μl,多重下游引物(10μM)1.5μl,2×TaqPCRMasterMix12.5μl,ddH2O補(bǔ)至25μl,同時設(shè)多殺性巴氏桿菌作為陽性對照和水作為陰性對照。95℃預(yù)變性5min;94℃30s,55℃30s,72℃70s,共30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。B.5結(jié)果判定陰陽性對照成立的條件下，同時擴(kuò)增出多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmt1(460bp)片段和莢膜血清A型特異性基因hyaD-hyaC(1044bp)片段的，判定為牛多殺性巴氏桿菌莢膜A型陽性；同時擴(kuò)增出多殺性巴氏桿菌種特異性基因kmt1(460bp)片段和莢膜血清B型特異性基因bcbD(760bp)片段的，判定為牛多殺性巴氏桿菌莢膜B型陽性。B.6檢測序列TGCTGTAAACGAACTCGCCACTTTTTGTTTCATTTGGACTGACACGATGAAGAAAAAGACCAAAATAGGTAACCAATACACGATAAATAAATTAAACGGCTTCAATAATGGCCATAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATTGATGGAAATATAAACCGGCAAATAACAATAAGCTGAGTAATAAATAACGTCCTGTCAAGGAAGCAGATTGGCTCAACACACCAAACTCTGCCCAACAAAACACAAGCCAAATAAAAGACTACCGACAAGCCCACTCACAACGAGCCATAAAATAACATTTCAAGTGGCATAAAACTCAATTTCGCGGCAATCGGTTCATTCGCB.6.2hyaD-hyaCTGCCAAAATCGCAGTCAGTATTTTTTATCCCAATACATTAAACGGCTACAATATTATTGAATATAATAAAAATATATTCGTTATTGTTCTACATGTTGATAAGCACCAGATATCAAAAAAGAAATACTAGCCTTCTATCATAAACATCAAGTAATGATATCTCATATTACACGAGTAATAGATTAATAAAAACTGAGGCGCATTTAATAAATTAAGTCAGTTAAATCTAAATTGTGAATACATCATTTTTGATAATCATAAAAATGACAGCTATGCTTATATGAAAAAATATGATGTCGGCATGAATTATGATTGGATCGAGAAAATCAATGCGCATCCACCATTTAAAAAGCTCATTAAAACGACAATGACTTAAAAAGTATGAATGTGAAAGGGGCATCACAAGGTATGTTAGCGCATGAGCTTCTGACGATTATTAAAGAAGTCATCACATCTTGCCAGCCAGAATATAACACTGAGGATATTTGGTTCCAATTTGCACTTTTAATCTCCATGTATTTAATAAAACATCGACCCTGACTTATATGCCTTGGGAACGAATGAACAAATTGAAAGTGCAAAAAGAGGAGAAAATATACCTGTTAACAAGTTCATAGGATAAAAAATGAAGAAAATTACAATTGCTGGGGCTGGCTATGTTGGTTTATATTAGCTCAACACCACAATGTGATCTTATTAGATATTGATCAAAATAAAAATAAAAAATCGCCCATCACAGATAAAGAAATCGAAGATTTCTTACAAAATAAATGCGATATCAATCTGCTTAAGATAATTGCTATCTTTAATGAATAACGCGATTTCTAGTTTTACCAAAATAAAGTTCAACTGTGTTTGAGAACACTTTTTTCCTCTGGTGGAGCTTGGATAAATGAGGAGGGGGCAAAATAAGCTACATAGATCTCTAGGCTCAAACTTCCAATCATTTTTCACGAGAAATTCATCCAAGGCACTTCCAGCTACCCCACGGTAAACCAGCAGAGTCGTTATAACGAGTAACGTTGAAACTGTTCAAGTAACGCATCCACACTCAGTTGCTTCTCTGCAATTTTGTGAGAAAATAATTTTATGCATTATTTACGCCTTTACTATTATATTTTTTAACAGCCTCCAAAATCTCATCTAACTGGTGCATATCTGCTTTGAGTAATGACTCATCGGACTGTCTTGCTCGGTCAGTGCTAAAATTAAAGAAGCGGACAATTTTGATGGTAAGTAAGGATTATTCATTTTTAGTTCTTTGGTTTGCACCATCAAATTGATCCGCTAATGCTAGAAAATCAAAGTAAGCTACATATTTTTGGGTGCTCTAATTTCCTCCGGTACTTCAGTCA(規(guī)范性)牛呼吸道合胞體病毒套式RT-PCR檢測方法C.1檢測原理自2008年以來，我國牛群爆發(fā)嚴(yán)重的呼吸道疾病，表現(xiàn)為牛呼吸道疾病綜合征，抗生素治療效果不明顯，發(fā)病率高，死亡率高，給養(yǎng)牛業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。病原流行病學(xué)調(diào)查顯示存在多病原感染，其中主要原發(fā)病因為病毒性病原，包括牛呼吸道合胞體病毒等。本方法采用RT-PCR方法，擴(kuò)增呼吸道合胞體病毒高度保守區(qū)域核酸，實現(xiàn)牛呼吸道合胞體病毒的檢測，達(dá)到篩選牛呼吸道合胞體病毒病陰性實驗用牛的目的。C.2檢測樣本牛鼻腔深部拭子C.3檢測引物檢測引物見表C.1。表C.1檢測引物引物名稱引物序列擴(kuò)增產(chǎn)物片段(bp)-C.4檢測方法牛鼻腔深部拭子或肺組織研磨后加入一定量的PBS,漩渦震蕩后，3000rpm離心5min,取上清液。按照AXYGEN病毒RNA小量提取試劑盒說明書方法提取基因組RNA。用1U25引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為25℃10min,42℃60min;在用8749U25和10262L25引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；然后再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用8785U23和10215L23引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。同時設(shè)牛呼吸道合胞體病毒作為陽性對照和水作為陰性對照，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min,然后94℃45s、55℃45s、72℃1.5min共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。C.5結(jié)果判定在陰陽對照成立的條件下，第一輪或第二輪PCR擴(kuò)增出現(xiàn)1500bp左右的特異性目的條帶，則判為牛呼吸道合胞體病毒陽性。C.6檢測序列AATTCGTAGAGCTATAGAAATAAGTGATGTCAAAGTATATGCTATATTGAACATAAAAGAAAAGGGAAAAGTTGATAGATGTGATGACACTAACACAACGCTATAGATAATATACTCTCAGTCATAAGTGACAATACTCCCAGTACTAAAAAACCAAATGTAAACCAGATCAGCCAATTAAAACAACAATTTTATGCAAGCTTTTAAGTDB62/T4575—2022CCTACATGGTTAATACATTGGTTTAATTTATACACAAAATTAAATGACAAACAAATGAAGCAAGAAATCATGGTTACATACTTATAGATACTAGAACCTTGGGTTTATATTAAATCAATATGGTTGCATTGTATATCATAAGAAATTAAAGAAAATATAATCAATTTCTAACATGGAAAGACATTAGCCTCAGTAGATTAAATGTGATAAGCAATTGTTTAAATACCTTGAATAAAAGCCTTGGATTGAGATGTGCTCTATCTCAATTATTCCTTCATGGGGATTGTATATTGAAATTATTTCATTATAAAAGAAGTTGAAGGTTTTATAATGTCATTAATTTTGAACCTAACGGAGAAAAAGATTCTTCAACAGTATGCTAAATAATATTACAGATGCTGCAGCAAGAGATTTATTATCAAGAGCCCGCCATACTATATTAGACAAAACAATATCAGATAACATAAATGGTTAATTTTATTAGGTAAGTTTCTTAAATTGATTAAATTAGCTGGTGCTAAAACCTAAGTGAACTCTACTTTCTCTTTAGAATATTTGGACATCCCATGGTAGATAATGGATGCTGTGAGATTAAACTGTAATGAAACTAAATTTTACTTATTGAGTAGCTAAGAGGTGCATTCATTTATAGAATTATAAAGGGATTTGTAAACACATATATTAAGGAATGCTATAGTTTTACCCTTAAGATGGATAAATTACTACAAACTATTATTAGAATTAACAGAAGCTGATTTGATTATATTGTCTGGACTGAGATTTTATATCTACCGAAAAAAGTAGATTTAGAAGTCATAATAAATGATAAAGCAATATCACCCCTTATCTGGACCAGTTTTCCCAAAAACTATATGCCATCACACATACAAAAGACTAAAGTTTACTGAGAGTGATAGATCTAGAAGGGTTCTGGAATATTATTTAAGATTCAGTGAGAGTGACCTATATAACTGTATAGTAAACCAGGAATATCTTAATAS(規(guī)范性)牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的最主要病原，發(fā)病率可高達(dá)50%-100%,7日齡以內(nèi)犢牛最為易感，典消瘦，臥地，感染后不適合作為實驗用牛。本方法以牛輪狀病毒的核酸為檢測靶標(biāo)，采用RT-與其他基因型反應(yīng)，結(jié)合一條適合該病毒檢測的通用引物，采用多重半套式RT-PCR,實現(xiàn)基因型的鑒引物名稱引物序列擴(kuò)增產(chǎn)物片段(