ICS65.020.20B05DB23黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB23/T2685—2020水稻遺傳性狀定向突變育種技術(shù)規(guī)程黑龍江省市場(chǎng)監(jiān)督管理局DB23/T2685-2020前言本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009編寫規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由黑龍江省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所、中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：來(lái)永才、朱禎、王鋒、孟英、唐傲、張磊、張喜娟、李平、董文軍、陳在杰、劉猷紅、王立志、陳麗華、姜樹(shù)坤、劉凱、劉琦、姜輝、任洋、董德建。IDB23/T2685-2020水稻遺傳性狀定向突變育種技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水稻遺傳性狀定向突變育種技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、基本要求、技術(shù)流程和操作步驟。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水稻遺傳性狀定向突變育種。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T17316水稻原種生產(chǎn)技術(shù)操作規(guī)程GB/T19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1遺傳性狀定向突變遺傳性狀定向突變技術(shù)主要使用的是CRISPR/Cas系統(tǒng)。CRISPR/Cas系統(tǒng)是成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)，其廣泛存在于細(xì)菌及古生菌中,是機(jī)體長(zhǎng)期進(jìn)化形成的RNA指導(dǎo)的降解入侵病毒或噬菌體DNA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、設(shè)備和試驗(yàn)場(chǎng)所符合GB/T19489中生物安全防護(hù)水平一級(jí)的要求。實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)通過(guò)必要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物安全管理規(guī)范的培訓(xùn)。應(yīng)包括但不限于試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束的時(shí)間，材料名稱、來(lái)源、編號(hào)、保存信息、目的基因序列信息、載體結(jié)構(gòu)、表型鑒定和突變后代的檢測(cè)結(jié)果等。1DB23/T2685-20205技術(shù)流程技術(shù)流程應(yīng)符合圖1規(guī)定：圖1遺傳性狀定向突變育種技術(shù)流程圖6操作步驟6.1目標(biāo)基因突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)比對(duì)受體材料全基因組序列，根據(jù)目標(biāo)性狀基因的來(lái)源、序列和載體啟動(dòng)子的種類選擇適合的軟件設(shè)計(jì)基因上的突變位點(diǎn)。對(duì)基因進(jìn)行突變位點(diǎn)預(yù)測(cè)，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。根據(jù)遺傳性狀定向突變的方式和對(duì)象選擇適宜的載體，經(jīng)酶切線性化、T4連接酶進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和測(cè)序鑒定，構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)載體。將正確連接的重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化受體水稻的愈傷組織，篩選培養(yǎng)獲得再生的水稻植株。根據(jù)篩選標(biāo)記、載體特異序列、目的基因序列和突變位點(diǎn)，利用專業(yè)軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)引物。6.4.2突變植株的鑒定提取突變當(dāng)代水稻的基因組DNA，利用篩選標(biāo)記和載體特征引物對(duì)突變后代進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出目的條帶的為突變植株。對(duì)突變植株的基因突變位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，鑒定突變位點(diǎn)的突變類型，選擇有效的突變類型單株進(jìn)行種子收獲并繼續(xù)種植。2DB23/T2685-20206.4.4突變體表型分析從有效的定向突變體后代中選擇純合株系進(jìn)行突變位點(diǎn)