致謝

本手冊的出版由UNDP/UNFPA/WHO/世界銀行人類生殖研究、發(fā)展和研究

培訓(xùn)特別規(guī)劃署及WHO人類生殖健康與研究部共同完成。我們對所有參與本手

冊籌備、編輯和校訂的人員表示誠摯的感謝。

另外感謝：MsCathyTreece,MsCharleneTollner和JimOverstreet教授

(UniversityofCalifornia,Davis,CA,USA)提供形態(tài)學(xué)顯微照片以及對媒體文件的

校對；DrRuneEliasson(SophiahemmetHospital,Stockholm,Sweden)幫助定義非

精子細胞；DrGaryNClarke(TheRoyalWomen'sHospital,Carlton,Australia),Dr

RoelofMenkveld(TygerbergAcademicHospitalandUniversityofStellenbosch,

Tygerberg,SouthAfrica)和PieterWranz教授(UniversityofStellenbosch,Tygerberg,

SouthAfrica)對本手冊編譯工作提供附注。

衷心感謝國際男科學(xué)會提供的經(jīng)濟支持。

這個版本的手冊是為紀念已故前WHO男性生育調(diào)控方法學(xué)工作組負責(zé)人

GeoffreyWaites(1928-2005),他也是第二、第三和第四版實驗室手冊的共同編輯。

編輯委員會全身心投入工作的動力來自于對Geoff誠實、公平和關(guān)心疾苦人格的

欣賞。

縮寫詞

Abantibody抗體

AIartificialinsemination人工授精

AIDartificialinseminationwithdonorsemen供精人工授精

AIHartificialinseminationwithhusband'ssemen夫精人工授精

ALHamplitudeoflateralheaddisplacement頭側(cè)擺振幅

ANOVAanalysisofvariance變量分析

APAAPalkalinephosphatase:anti-alkalinephosphatasecomplex堿性磷酸酶：抗

堿性磷酸酶復(fù)合物

ARacrosome-reacted頂體反應(yīng)

ARTassistedreproductivetechnology輔助生殖技術(shù)

ASAanti-spermantibody抗精子抗體

BCFbeat-crossfrequency(Hz)交打頻率

BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白

BWWBiggers,WhittenandWhittingham試液

CASAcomputer-aidedspermanalysis計算機輔助精子分析

CASMAcomputeraidedspermmorphometricassessment計算機輔助精子形態(tài)評

估

CBAVDcongenitalbilateralabsenceofthevasdeferens先天性雙側(cè)輸精管缺失

CDcompactdisk壓縮盤

CDcytoplasmicdroplet胞質(zhì)小滴

CD45clusterofdetermination45（pan-leukocytemarker）決定簇45（全白細胞標

記物

CD46clusterofdetermination46（acrosomalantigen）決定簇46（頂體抗原）

CIconfidenceinterval可信區(qū)間

CLconfidencelimits可信界限

CO?carbondioxide二氧化碳

DMSOdimethylsulfoxide二甲基亞颯

DNAdeoxyribonucleicacid脫氧核糖核酸

DPBSDulbecco9sphosphate-bufferedsalineDulbecco's磷酸緩沖鹽溶液

DVDdigitalversatiledisc數(shù)字多用盤

EDTAethylenediaminetetra-aceticacid乙二胺四乙酸（依地酸）

EQAexternalqualityassurance外質(zhì)量保險

EQCexternalqualitycontrol外質(zhì)量控制

ERCexcessresidualcytoplasm殘余胞質(zhì)

FITCfuoresceinisothiocyanate

FMLPfbrmyl-methionyl-leucyl-phenylalanine甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸

GIFTgameteintrafallopiantransfer輸卵管內(nèi)配子移植術(shù)

GPCglycerophosphocholine

H2O2hydrogenperoxide過氧化氫

HBSSHanks'balancedsaltsolutionHanks'平衡鹽溶液

HBVhepatitisBvirus乙肝病毒

hCGhumanchorionicgonadotrophin人絨毛膜促性腺激素

HCVhepatitisCvirus丙肝病毒

HIVhumanimmunodefciencyvirus人免疫缺陷病毒

HOPhamsteroocytepenetration倉鼠卵穿透

HOShypo-osmoticswelling低滲腫脹試驗

HPFhighpowerfield高倍視野

HRPhorseradishperoxidase辣根過氧化物酶

HSAhumanserumalbuminxiv人血清白蛋白IV

HTFhumantubalftiid人輸卵管液

IBimmunobead免疫珠

IBTimmunobeadtest免疫珠試驗

ICSIintracytoplasmicsperminjection胞漿內(nèi)精子注射

Igimmunoglobulin免疫球蛋白

IMimmotility不動

IQCinternalqualitycontrol內(nèi)質(zhì)量控制

IUinternationalunit國際單位

IUIintrauterineinsemination宮腔內(nèi)人工授精

IVFinvitrofertilization體外受精

KRMKrebs-RingerMediumKrebs-Ringer培養(yǎng)液

LINlinearity線性

LLQlowerlimitofquantifcation定量下限

LPFlowpowerfield低倍視野

MADmeanangulardisplacement平均角位移

MAImultipleanomaliesindex復(fù)合異常指數(shù)

MARmixedantiglobulinreaction混合抗球蛋白反應(yīng)

NAnumericalaperture數(shù)值孔徑

NPnon-progressive(motility)非前向的(活力)

PBSphosphate-bufferedsaline磷酸緩沖鹽溶液

PDCAplan,do,check,act

PMAphorbol12-myristate13-acetate(12-)十四酸佛波酯G13-)乙酸鹽

PMSGpregnantmareserumgonadotrophin孕馬血清

PNPGp-nitrophenolglucopyranoside對硝基苯酚口比喃葡萄糖苗

PRprogressive(motility)前向的(活力)

PSAPisumsativumagglutinin碗豆凝集素

QAqualityassurance質(zhì)量保險

QCqualitycontrol質(zhì)量控制

RCFrelativecentrifugalforce相對離心力

RIrefractiveindex屈光指數(shù)

RNAribonucleicacid核糖核酸

ROSreactiveoxygenspecies活性氧類物質(zhì)

rpmrevolutionsperminute每分鐘轉(zhuǎn)速

SDstandarddeviation標準差

SDIspermdeformityindex精子畸形指數(shù)

SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸鈉

SEstandarderror標準誤

SOPstandardoperatingprocedure標準操作流程

STRstraightness(VSL/VAP)直向

TBSTris-bufferedsalineTris緩沖鹽溶液

TGGTyrode'sglucoseglycerol

TZIteratozoospermiaindex畸形精子癥指數(shù)

VAPaveragepathvelocity平均軌道速率

VCLcurvilinearvelocity曲線速率

VSLstraight-line(rectilinear)velocity直線速率

WHOWorldHealthOrganization世界衛(wèi)生組織

WOBwobble(VAP/VCL)擺動

第1章背景

1.1導(dǎo)言

鑒于人類精液檢查標準化需求的日益增加，世界衛(wèi)生組織于1980年首次出

版了《世界衛(wèi)生組織人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》。至今,

該手冊已改版三次，被譯成多國語言。過去30年中，該手冊作為全球范圍內(nèi)的

標準被世界各地的臨床及科研工作者廣泛使用。

盡管前幾版的發(fā)行很成功，但是隨著新證據(jù)的出現(xiàn)，先前版本中的一些推薦

指標需要被修正就變得更明顯了。同時，對一些概念也需給出更多的解釋和支持

證據(jù)。出于上述考慮，WHO成立了編輯委員會，回顧手冊中描述的各種方法，

本版旨在修改、更新這些內(nèi)容。由于按照先前版本中講述的方法獲取的數(shù)據(jù)不充

分，某些情況下修正工作變得異常困難。有時，某些實驗室可以獲得的一致結(jié)果,

在其他實驗室卻無法得以驗證。鑒于這些情況，編輯委員會在對以往文獻資料評

估后，達成一致，統(tǒng)一標準。

由于需要對先前版本中講述的方法進行更詳細的描述，技術(shù)員和科學(xué)工作者

們給出了補充推薦內(nèi)容。因為前幾版手冊缺乏對細節(jié)的描述，一些實驗室采用其

它方法或是發(fā)展出自己的操作規(guī)程，然而他們卻仍申稱是按照WHO手冊進行精

液分析的。為了使全球范圍內(nèi)的比較更容易實現(xiàn)，第五版手冊包含了更多的細節(jié)

描述。當(dāng)提出不同的分析方法時，手冊中對原由做了解釋。參照該手冊在發(fā)表論

文中報道實驗結(jié)果時，我們推薦各個實驗室要指明所采用的是哪一種方法。

1.2第5版

第5版包含三部分內(nèi)容：精液分析（第2-4章），精子制備（第5、6章）

及質(zhì)量評估（第7章）。第I部分介紹精液分析，參照先前版本，但被分為三個

小章節(jié)：標準化方法（介紹決定精液質(zhì)量的常規(guī)操作流程）；可供選擇的試驗（這

些試驗用于某些特定情況下或由實驗人員選擇）；研究試驗（這些試驗?zāi)壳安蛔?/p>

為精液常規(guī)分析的方法）。由于通常在男科學(xué)實驗室不能開展精液培養(yǎng)，因此這

些內(nèi)容僅在無菌化精液標本采集部分提及。精子制備章節(jié)的內(nèi)容從射出精液擴展

到對睪丸和附睪獲得精子的制備。本手冊中散在分布的方法學(xué)注釋框有注解（方

法學(xué)解釋）、評論（結(jié)果解釋）以及說明框（包括補充解釋的物質(zhì)）。

第5版手冊的主要特點如下所列：

?精液分析章節(jié)包括涉及工作溶液的配制、操作流程、精子計數(shù)及對結(jié)果解釋

的詳細描述，以使所有給出的方法學(xué)都非常完整，與手冊中其它章節(jié)內(nèi)容的

重疊極少。

?擴展了精子制備部分的內(nèi)容，增加了關(guān)于精子冷凍保存的新章節(jié)。與宮頸粘

液分析相關(guān)的操作規(guī)程被分到可供選擇的試驗章節(jié)及附錄中粘液特征的檢查

部分。

?與先前的版本相比，第五版的附錄內(nèi)容減少。這部分內(nèi)容僅限于特殊的或者

很少被用到的信息。

?精子數(shù)目的評估。對于一份精液標本的檢查，精液的稀釋度和評估精子數(shù)目

所需觀察的計數(shù)池區(qū)域的大小均有所改變，每次需計數(shù)200條精子。新版手

冊中強調(diào)了抽樣誤差的重要性及計數(shù)結(jié)果的確定性。編輯委員會認為每次排

精的總數(shù)目比精子密度能更準確的評估睪丸功能，但這要求對精液量的測定

需準確無誤。

?無精子癥的評估。這盡管表面看起來簡單，但很多因素會影響無精子癥的診

斷，包括計數(shù)太少數(shù)目精子導(dǎo)致的明顯誤差，觀察顯微鏡視野的數(shù)目，以及

檢驗布滿碎片精子沉淀物的困難度。本手冊推薦改為檢驗固定后、未離心的

標本，以及指出所用計數(shù)方法的靈敏度。然而，當(dāng)需收集足夠數(shù)目的精子用

于治療時，離心方法仍是必需的。另外，手冊中也介紹了通過檢驗未固定標

本中的活動精子以評估輸精管切除術(shù)療效的方法。

?精子活力的評估。第五版與先前版本的主要不同在于對精子活力的分級。目

前推薦精子活力被分為前向運動、非前向運動的不動精子（而不再分為a,b,c

和d級）。

?精子形態(tài)的評估。一些實驗室僅僅評估正常精子的比例，然而有些人認為形

態(tài)異常的類型、部位及程度更加重要。

?質(zhì)控。此章第五版為重新編寫。精液分析過程的健全對于精液分析嚴格質(zhì)控

至關(guān)重要。當(dāng)質(zhì)控結(jié)果不滿意時，文中的提示和建議有助于增進實驗室水平。

?參考范圍和參考低值。本手冊參考范圍值來自12個月以內(nèi)配偶獲妊娠的男性

的精液數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)為來自3大洲的8個國家的可生育男性的400-1900份

精液樣本。傳統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)方法為取雙向參考區(qū)間的第2.5百分位作為閾值，低

于此閾值則可認為來自不同的人群。但是，單向參考區(qū)間更適用于精液分析，

因為任意參數(shù)的高值并不能對生育作出決定性的判斷。第5百分位可作為最

低參考值，每一參數(shù)的完全分布區(qū)間見附錄1。

1.3本手冊的范圍

本手冊所載的方法可作為指南以增進精液的綜合分析和可比性。但并非為

地方、國家或全球性的實驗室認證機構(gòu)所必備。精液分析在臨床和研究機構(gòu)對男

性生育功能的調(diào)節(jié)和追蹤中，其對男性生育狀態(tài)和精子發(fā)生的監(jiān)控都是極為必要

的。

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院生殖中心曹少峰博士）

第2章標準程序

2.1簡介

正常精液是一種混合物，在射精時由睪丸和附睪的分泌液及懸浮其中的精子

與前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。最終射出的混合物是一種粘稠

的液體，即射出的精液以團塊狀連續(xù)數(shù)次射出，通過輸精管切除術(shù)前后的比較顯

示，就體積而言有90%是自附屬腺體的分泌物，其中主要是前列腺和精囊腺，少

部分來自尿道球腺和附睪。

精液的兩個主要量化指標：

1.精子總數(shù)，反應(yīng)睪丸的生精狀況和睪丸后管道系統(tǒng)的通暢程度。

2.體積反應(yīng)腺體的分泌能力。

精子功能組要受精子自身的活力、運動、形態(tài)和精漿成份的影響。

在性交排精時，最初富含精子和前列腺液部分的精液可能和延續(xù)在陰道中宮

頸粘液絲相互接觸，而其余部分在形成而在實驗留取標本時，全部精液留取在一

個容器中，精子限在由精囊腺分泌蛋白導(dǎo)致的凝塊中，隨后在前列腺分泌的酶作

用下而水解。

有證據(jù)表明精液樣本質(zhì)量的變化與取樣方式和地點有關(guān)，通常在家里用性交

法留取的質(zhì)量較高，說明不同排精方式明顯影響樣本的檢驗結(jié)果。

在固定條件下精液樣本質(zhì)量主要受睪丸生精功能、附屬腺體的分泌、近期患

病情況尤其高熱性疾病，以及其它如禁欲時間的長短，這些在解釋監(jiān)測結(jié)果時都

應(yīng)考慮進去。

精液質(zhì)量分析結(jié)果主要受以下因素的影響：

1.樣本收集是否完整。射精時前面富含精子部分的精液避免丟失，后面部

分精液主要是由精囊腺的分泌物構(gòu)成，所以，前面部分精液的丟失比后半部分丟

失對精液分析結(jié)果影響更大。

2.在射精時，附屬腺體分泌物沖淡含高度濃度精子的附睪液。精子濃度不

能直接反應(yīng)睪丸的精子產(chǎn)量，因為還受其他生殖器官功能的影響，而精子總數(shù)(精

子密度X精液體積)精子密度對于年輕人和老年人沒有區(qū)別，但精子總數(shù)可能存

在差異，至少人群中有部分人存在隨著年齡增大而精液體積和精子下降的現(xiàn)象。

3.精子的活力和染色體不受禁欲時間長短的影響，除非附睪功能受到影響。

由于前次射精不徹底，附睪沒完全排空，有部分精子殘存，精子老化會影響精子

質(zhì)量，其程度很難確定，所以也很少做考慮。

4.睪丸體積的大小不僅能反應(yīng)睪丸的生精水平還影響到每次射精的精子總

數(shù)和精子形態(tài)。

注釋:精液質(zhì)量的巨大生理變化是上述所列多種因素的反映(Castilla等,

2006),因而同精液相關(guān)的所有分析都要精確全面。

這些多變的非可控因素解釋了眾所周知的個體精液成分的變化(Baker&

Kovacs,1985;Alvarez等,2003).圖2.1顯示了參與一個雄性激素避孕藥研究的

安慰劑組的5名年輕志愿者，根據(jù)WHO推薦的方法的精液評估結(jié)果，其精液成分

是伴隨時間發(fā)生變化的。這一變化表明要對精液分析進行如下說明：

1.僅憑一次精液檢查不能確定精子質(zhì)量。

2.檢查兩到三次有助于獲得可靠的基本數(shù)據(jù)(Poland等，1985;Berman等，

1996;Carlsen等,2004;Castilla等,2006;Keel,2006)o

雖然對整個精液樣本進行了分析，但其結(jié)果并不能確定那些少數(shù)到達受精部

位精子的受精能力，精液分析能為臨床提供有關(guān)患者個人狀況的一些重要信息。

樣本的采集和檢查都按照規(guī)范化程序進行，其結(jié)果才有價值。本章所述操作

流程被認定為進行精液評估的基本組成步驟。

圖2.1在超過18個月的時間內(nèi)精子總數(shù)目和精液濃度的變化

60120180240300360420480540060120180240300360420480540

（以上數(shù)據(jù)提供由先靈葆雅和拜耳藥業(yè)提供）

精液分析包括以下幾個步驟（在以后章節(jié)中詳述）：

【在最初五分鐘】

將受精精液樣本容器放置在溫控臺或水浴箱里（37℃）等待液化。

在30到60分鐘期間

評估精液的液化情況和物理性狀。

測量精液體積。

如有需要則檢測精液的pH值。

準備濕片觀察顯微鏡下精子的活動情況，計數(shù)時還需進行稀釋。

如活動精子較少，需評估精子活動率。

制作精液涂片評估精子形態(tài)。

對精液進行稀釋后做精子密度評估。

對精子進行計數(shù)。

如有需要可進行抗免疫珠混合反應(yīng)檢測。

如發(fā)現(xiàn)圓形細胞則可檢測過氧化酶陽性細胞。

如有需要可對精子做免疫珠試驗的準備。

如需檢測精漿生化指標則對精液進行離心。

【在三小時內(nèi)】

將精液樣本送至微生物檢驗室（如有需要）。

【四小時后】

對精液涂片進行固定、染色以備精子形態(tài)學(xué)檢查。

【在當(dāng)日稍后（如冷凍樣本則可在次日）】

檢查附屬腺體功能的指標。

進行間接免疫珠試驗檢測（如有需要）。

2.2樣本采集

2.2.1準備

為了減少外界溫度和樣本收集到檢測期間過長對精液檢測結(jié)果的影響，樣本

采集應(yīng)在靠近實驗室比較私密的房間里進行?？s短樣本從采集到檢測的間隔時

間，標本采集時間應(yīng)為禁欲至少兩天，最長不超過七天。如需復(fù)查每次禁欲的天

數(shù)應(yīng)盡可能恒定。

給患者一個明確的書面或口頭有關(guān)采樣指導(dǎo)說明，應(yīng)該強調(diào)樣本收集必須完

整，如有樣本丟失及時告訴醫(yī)生。

在報告中應(yīng)包括如下信息：患者姓名、出生日期、禁欲時間、采樣日期、樣

本是否完整、采樣是否困難及從采樣到檢測的間隔時間。

2.2.2為了診斷和研究目的樣本采集

應(yīng)用手淫的方法取精液，并射入一干凈的、廣口的玻璃或塑料容器中。應(yīng)通

過實驗證實容器對精子沒有毒性作用（見框2.1）。

盛有精液的容器應(yīng)放置在20?37℃環(huán)境中，以免溫差變化影響精子活力，容

器必須標明受檢者姓名（和/或身份證號碼）以及標本采集的日期和時間。

將盛有精液樣本的容器置于恒溫臺或水浴箱中，等待其液化。報告中應(yīng)注明

樣本采集是否完整，尤其富含精子的射精最初部分。如有丟失應(yīng)在禁欲2?7天后

再次采集作進一步檢測。

評述2.1精液收集管兼容性的判定

選取若干精子濃度高且精子活力佳的精液樣本。每份標本的一半置入已知無

毒的容器（對照）內(nèi),另一半置入待測容器。室溫yTC下,在4小時內(nèi)每隔1小時

重復(fù)評估精子活力（見25章）。如果每一時間點對照容器和待測容器間無差異

（配對t檢驗P>0.05）,則待測容器可以被認定為無精子毒性,因而符合精液收

集器具的標準。

2.2.3用于輔助受孕的精液樣本的消毒

對于用來臨床診斷，但收集樣本容器、吸頭及用來混勻的吸管同樣要進行消

毒。

2.2.4對要進行微生物檢測精液樣本的采集

這時，必須要避免來自精液以外的污染（外周皮膚）收集樣本容器、吸頭及

用來混勻的吸管同樣要進行消毒。

患者需按下列步驟進行：

排尿；

用肥皂清洗手和陰莖；

沖去殘留肥皂；

用一次性毛巾擦手和陰莖；

射入干凈的容器中。

注:精液樣本的收集和實驗室顯微生物操作開始的時間間隔不可超過3小時。

2.2.5家中樣本采集

對于除了在自家以外的環(huán)境下取精的確困難者，可以在家中進行樣本采集。

給患者以明確的書面或口頭形式的有關(guān)精液樣本的采集和轉(zhuǎn)運指導(dǎo)說明，應(yīng)

強調(diào)采集樣本必須完整，如有部分丟失應(yīng)在報告中加以說明。

對已標上姓名和身份證號的容器進行稱重，然后交給患者。

患者應(yīng)記錄采集的時間，并在一小時內(nèi)送至實驗室。

在送至實驗室途中樣本應(yīng)保持在20?37℃的環(huán)境中。

報告中應(yīng)注明樣本采集的地點是在家還是在其他實驗室以外的地方。

2.2.6用避孕套采集樣本

對通過手淫法采集精液困難的情況下，才采用避孕套通過性交法獲取精液。

只能用經(jīng)特殊設(shè)計對精子沒有毒性的避孕套來采樣，這種避孕套現(xiàn)已有售。

應(yīng)告知患者使用避孕套方法以及如何將樣本轉(zhuǎn)運至實驗室。

應(yīng)記錄樣本采集的時間，并在一小時內(nèi)送至實驗室。

在送至實驗室途中樣本應(yīng)保持在20?37℃的環(huán)境中。

報告應(yīng)注明樣本的采集是在利用避孕套通過性交法及采集地點。

注:一定不可使用普通避孕套收集精液,因為它們一般含有干擾精子活力的成分

（Jones等1986）.

注釋1:體外射精不是精液收集的可靠手段,因為含有大量精子的精液初始部分

可能遺失。而且,這可能造成樣本的細菌性或真菌性污染,且陰道內(nèi)的酸性環(huán)境

會對精子活力造成不利影響。

注^2：如果患者無法提供精液樣本,性交后試驗（￡3.3.1可能會提供其精

子情況的相關(guān)信息。

2.2.7樣本的安全處理

精液樣本可能含有害的病原體（如乙肝病毒、HIV）,應(yīng)作為生物污染物處

理，如是為了宮腔內(nèi)人工授精、體外受精、單精子胞漿內(nèi)注射、培養(yǎng)，注意消毒

應(yīng)嚴格按照附錄2中安全處理指南進行，實驗室試驗應(yīng)以安全為基礎(chǔ)。

2.3初步肉眼觀察

精液液化后經(jīng)簡單觀察應(yīng)立即進行檢查分析，最好在30分鐘內(nèi)完成，不要超

過一個小時。以免水分丟失或溫度的變化而影響精液質(zhì)量。

2.3.1液化

精液射入容器后立即形成典型的半透明凝塊，室溫下在數(shù)分鐘內(nèi)，精液通常

開始液化（變?。藭r可以看到不均勻的凝塊在液體中。隨著繼續(xù)液化，精液

將變成均勻的水樣物，最后只看到很小的凝塊，室溫下一般在15分鐘內(nèi)通常都能

完全液化，很少超過60分鐘。如在60分鐘內(nèi)沒完全液化，應(yīng)記錄這種情況，在家

或利用避孕套采集的樣本通常在送達實驗室時都已液化。正常精液可以含有不液

化的膠凍狀顆粒，這一現(xiàn)象似乎沒有任何臨床意義。粘液絲的出現(xiàn)可能干擾精液

分析。

注1:液化可以通過宏觀（如上所述）和微觀兩方面來斷定。固化精子可通過精

液液化而獲得運動能力。如果在顯微檢測中觀察到固化精子,則需更多時間以保

證液化過程的完成。

注2：在液化過程中,持續(xù)輕柔的混勻或旋轉(zhuǎn)樣本容器可以降低精液密度測定過

程中的誤差。

注3：如果精液在30分鐘內(nèi)未液化,不要進行任何精液分析,而應(yīng)再等待30分鐘。

如果在60分鐘內(nèi)精液仍未液化,則參照23L1節(jié)進行處理。

2.3.1.1液化延遲

偶有精液不液化，需另行處理，機械混勻或用酶消化可能是必要的。

1.加入等量的培養(yǎng)液（如杜氏磷酸鹽緩沖液，詳見附錄4,A4.2節(jié)），然后重

復(fù)用加樣器吹打也可以使某些樣本液化。

2.用帶有規(guī)格為18或19號注射針頭的注射器對精液進行反復(fù)抽吸6?10次。

3.用菠蘿蛋白酶或糜蛋白酶（EC3422.32）的消化作用可以促進精液液化（見

框22）。制備方法為10IU/1的菠蘿蛋白酶置入杜氏磷酸鹽緩沖液（見附錄A4.2）

4.對液化確困難的精液，可以將樣本與酶按比例（1:2）進行混勻置于37℃水

浴箱內(nèi)10分鐘，即可液化，再做進一步檢測。

注釋:這些處理可能會影響到精漿的生化性質(zhì),精子活力以及精子外形,如有使

用必須記錄。用菠蘿蛋白酶以1+1（1:2）的方式稀釋精液必須在評估了精子濃度

后以其結(jié)果作為說明。

2.3.2精液粘稠度

液化后，用口徑約L5mm的塑料吸管緩慢地將精液吸入，觀察在重心作用下

精液形成粘液絲的長度，正常時為液滴不間斷落下，異常時粘液絲長超過2cm,

也可以觀察用玻璃棒插入精液提起后形成粘液絲的長度，超過2cm即為異常，這

都應(yīng)作記錄。部分不液化樣本，表現(xiàn)為精液粘稠度不隨時間延長而改變，對于那

些高度黏稠的樣本減輕粘稠的方法同處理精液液化延長相同（見231.1節(jié)）。

注釋:高粘稠度會干擾對就精子活力、密度的判定以及對覆蓋在精子表面的抗體

和生化標志物的檢測。

2.3.3精液外觀

正常精液液化后應(yīng)呈均質(zhì)、灰白色的外觀。

如果精子密度非常低，精液可顯得透明一些。如有紅細胞，精液可呈紅褐色；

病人如有黃疸或服用某些維生素，精液可呈黃色。

2.3.4精液體積

精液主要是由精囊腺和前列腺的分泌物和占小部分的尿道球腺和附睪分泌

物構(gòu)成，體積的精確測量對評估精液非常重要，他影響精液中精子總數(shù)和非精子

細胞數(shù)的計算。最佳辦法是采集樣本容器的稱重。

用事先稱重的一次性清潔容器收集樣本；

給裝有樣本的容器稱重；

減去容器的重量；

根據(jù)樣本重量計算體積，假定精液密度為1g/ml精液密度在1.043和1.102

g/ml之間（Huggins等，1942;Brazil等,2004a;Cooper等,2007））。

注:空樣本容器可能具有不同的重量,所以每一容器必須提前分別稱重。用不退

色標記筆在容器上標明或粘貼標簽標識其重量。如粘貼標簽標識其重量,應(yīng)在稱

重前即粘貼標簽。

此外，可以直接測量精液體積。

將精液直接射入廣口帶有刻度的錐形底量筒中，器材均可從市場上購得。

從量筒上直接讀取數(shù)值（精確到0.1ml）o

注:不推薦用移液器或是注射器從標本容器中吸取樣本然后注入量筒中測量體

積,因該方式無法保證不損失樣本,而這會導(dǎo)致對體積的低估。該法導(dǎo)致的體積

損失量在03至心9nl之間（Brazil等，2004a；hvamoto等,2006；Cooper等,

2007）o

注釋1：低精液體積是生殖道梗阻或先天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVD）（delaTaille

等,1998;Weiske等,2000;Daudin等,2000;vonEckardstein等,2000）的特征。同

時也可能是精囊發(fā)育不良的一個表現(xiàn)。

注釋2：低精液體積也可能是在精液收集過程中產(chǎn)生了問題（如損失了部分精液）,

也可能為部分逆行射精或有男科缺陷。

注釋3：高精液體積可以反映附屬性腺分泌旺盛,可能存在活動炎癥的情況。

2.3.4.1參考值下限

精液體積的參考值下限為1.5ml（95%置信區(qū)間（C/）,L4-L7）。

2.3.5精液pH值

精液pH值主要反映出由精囊腺分泌的堿性液體和由前列腺分泌的酸性液體

之間的平衡情況。應(yīng)在精液液化30分鐘后進行，無論如何不要超過1個小時，以

免因CO2丟失而影響檢測結(jié)果，正常情況下選用范圍在6.0到10.0之間的試紙。

均勻攪拌樣本（見框2.3）。

將一滴精液在pH試紙上均勻展開。

等待浸濕區(qū)域的顏色均勻一致（等候時間〈30秒）。

與標準帶比色讀出其pH值。

注:pH試紙的準確性應(yīng)該按照已知標準進行檢測。對于粘稠的樣本,可取小份

樣本用專為測量粘稠溶液設(shè)計的pH量尺進行檢測。（Haugen和Grotmol,1998）。

2.3.5.1參考值

對于生育男性精液pH值的參考值尚未確定，現(xiàn)保持原有下限值7.2。

注釋1:如低體積低精子數(shù)目的精液樣本的pH低于7.0,可能存在生殖道梗阻或先

天性雙側(cè)輸精管缺如（CBAVD）（delaTaille等1998;Weiske<2000;Daudin

<2000;vonEckardstein等,2000）。同時也可能是精囊發(fā)育不良的一個表現(xiàn)。

法模2：精液的pH值如隨時間推移而升高,可能是由于自然緩沖物減少,所以高

pH值不能提供有價值的臨床信息。

2.4顯微鏡初檢

建議使用相差顯微鏡對所有未染色的新鮮精液標本進行檢查，初檢的總放大

倍數(shù)為100倍（即物鏡10X和目鏡10X）,對標本進行一般觀察包括：

粘液絲；

精子凝集；

非精子細胞包括：上皮細胞、圓形細胞（白細胞和未成熟精子細胞）及斷裂

的精子頭部或尾部，這應(yīng)在總放大倍數(shù)為200或400倍的條件下進行；

評估精子活力（見2.5節(jié)）；

根據(jù)精子計數(shù)要求決定稀釋倍數(shù)（見2.8節(jié)）。

2.4.1充分混勻精液和取樣

充分均勻液化的精液本身就有利于解決化驗取樣是誤差的問題，如樣本不夠

均勻，觀察同一份精液制備兩份標本有關(guān)精子活動、活力、密度及形態(tài)等結(jié)果時

可能出現(xiàn)明顯偏差，為了給生育力的評估提供可靠資料，在檢測前，精液樣本必

須充分混勻（見框2.3）,兩等份的數(shù)值必須相符才可接受測量結(jié)果。兩份標本經(jīng)泊

松分類的精子數(shù)目（見框2.7和2.10,表2.4和2.5）和其百分率的二項分布（見框

2.5和2.6,表2.1）需要一致。

框2.3充分混勻精液:

在取微量樣本進行檢測前,樣本必須在容器內(nèi)充分混勻,力度要輕柔以免氣

泡產(chǎn)生,可通過向樣本中插入一個寬孔（直徑接近1.5mm）的一次性無菌塑料吸

液管抽吸10次來達到混勻標本的目的。不可用高速渦旋器,以免對精子造成損傷。

2.4.2濕片的制作

充分混勻精液樣本（見框2.3）；

混勻后立即取樣，以免精子在懸液中沉淀；

再次取樣前還需進行混勻，進行分析檢查時精液體積和蓋玻片的尺寸必須標

準化，以保持精子在固定厚度約20同11條件下自由游動將10川的定量精液滴在干

凈載玻片上；

蓋上22mmX22mm的蓋玻片，形成近20日01厚度，蓋玻片的重量使標本均勻

展開；

應(yīng)注意避免在蓋玻片和載玻片之間產(chǎn)生氣泡；

對新制成的濕片，等到玻片上界面不再晃動時應(yīng)盡快進行檢測。

框2.4濕片的厚度:

涂片的厚度（DRn）是樣本的體積（V,^l=mm3）除以它的液面寬度（A,

2

mm）：D=V/AO如,體積為10必的精液置于一張潔凈的載玻片上,加蓋面積為

22mmX22nun的蓋玻片（面積為4841rm2）,則其厚度應(yīng)為207jim；若體積為65成

的樣本上加蓋■—張18mmXI8mm的蓋玻片（面積為324mm2）,則其厚度為

20.1nm；如體積為11林1的樣本上加蓋一張21mmX26mm的蓋玻片（面積為546

mm2）,則其厚度為20.1年；偶爾會出現(xiàn)大厚度的情況,如40林I的樣本上加蓋一

張24mmX50mm的蓋玻片（面積為1200nun））,則其厚度為33.3；

注1：涂片的深度小于20林m會限制精子的旋轉(zhuǎn)運動（LeLannon<1992：

Kraemer等1998）

注2：如厚度過大,則會因為精子在視野中來回運動而難以進行精子評估。

注3：如每一視野中精子的數(shù)目差異過大,則樣本可能是不具有代表性的。如出

現(xiàn)此種情況則應(yīng)重新充分混勻精液標本（見框23）并按照上述步驟重新制備一

張涂片。

注4：欠缺代表性也可能會導(dǎo)致粘稠度和液化的異常（見23.1節(jié)），精子的聚集

（見243節(jié)）或精子的凝集（見2.4.4節(jié)）。

2.4.3精子聚集

不活動精子之間、活動精子與粘液絲之間、非精子細胞成分或細胞碎片等粘

在一起，為非特異性聚集（圖2.2）,這種情況應(yīng)如實記錄。

圖2.2精液中精子的非特異性聚集

圖示為精子與上皮細胞（a）,細胞殘渣（b）及精子（c,d）的聚集現(xiàn)象。

顯微圖像由CBrazil提供

2.4.4精子凝集

精子凝集是指活動精子以不同方式，頭對頭、尾對尾或混合型，如頭對尾，

彼此粘在一起。劇烈震蕩會使精子活力過度表現(xiàn)，但有時由于凝集會限制精子的

活動力。任何精子的頭部，尾部或中段有粘附現(xiàn)象都應(yīng)如實記錄。凝集的類型（反

應(yīng)其程度（1-4級））和吸附狀態(tài)（A-E級）也應(yīng)記錄（Rose等，1976）（見圖2.3）。

一級：輕度聚集指每個凝塊中少于10條精子；

二級：中度聚集指每個凝塊有10到50條精子，精子運動自如；

三級：大片聚集指每個凝塊有多余50條精子，精子仍然運動自由；

四級：整個精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互連接。又可分根據(jù)程度又可

分abcdo

注:運動的精子粘附于細胞,細胞碎片或是非運動的精子（聚集）應(yīng)該記為凝集。

圖2.3精子聚集程度分類表

聚集等級

完全分離中等聚集高度聚集完全聚集

涉及部聚集精子數(shù)V10聚集精子數(shù)10?50聚集精子數(shù)＞50所有精子

分個，個，個，均聚集一

多數(shù)精子為游離有游離精子部分精子游離團，無游

狀態(tài)離精子

1.輕度聚集指每個凝塊中少于10條精子；

2.中度聚集指每個凝塊有10到50條精子，精子運動自由；

3.大片聚集指每個凝塊有多余50條精子，精子仍然運動自由;

4.整個精子聚集，所有精子聚集在一起彼此相互連接。

A.頭對頭

C.尾端對尾端

D.混合型

E.糾結(jié)型

注釋1:存在凝集并不能充分證實為不育的免疫性原因,但是能夠說明有抗精子

抗體的存在;還需進一步檢查以明確診斷（見2.20節(jié)）。

注釋2：嚴重的精子凝集能夠影響對精子活力和密度的評估。

2.4.5其他非精子細胞成分

精液中常含有一定的非精子細胞成分，部分與臨床關(guān)系密切。通常包括泌尿

生殖道上皮細胞、前列腺細胞、生精細胞和白細胞，后兩種統(tǒng)稱為“圓細胞”

（Johanisson等,2000）。這些細胞成分在染色后的涂片中（放大1000倍）難以區(qū)

別（見2.12節(jié)，表13和14,以及2.19節(jié)）?？梢酝ㄟ^過氧化物酶技術(shù)和全白細胞

單克隆抗原技術(shù)來進行鑒別。非精子細胞成分計數(shù)用與精子相同的方法進行，或

根據(jù)染片（見2.18.1.5節(jié)）中生精細胞或白細胞與精子的比例來進行計算。

（山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖中心董乾

江蘇無錫婦幼保健院生殖中心王洪華）

2.5精子活力分析

精子活力程度與妊娠率有關(guān)，電腦輔助法評估精子的運動性見第352節(jié)。

精子活力評估應(yīng)在精液樣本液化后盡快（最好在30分鐘之內(nèi)）進行，務(wù)必在射

精后1個小時之內(nèi)進行。防止時間過長，因脫水、pH值及溫度的變化對評估結(jié)

果產(chǎn)生的負面影響。

過程如下：

?將精液樣本混勻。

-拌勻后立即（防止精子沉淀）取出一等份。

?重新攪拌精液樣本的剩下部分，取出另一等份。

?將上面的兩份樣本分別滴大約20^1深的濕制劑（見242節(jié)）的載玻片

上。

-等到樣本停止懸?。?分鐘以內(nèi)）。

-用200或者400倍率的相差顯微鏡觀察載玻片。

?每個標本大概評估200個精子左右，以便算出各自不同類型精子的百分

比。

?若標本的觀察值在可接受的范圍，記錄下數(shù)據(jù)，否則重新制作標本。

注1：該過程應(yīng)該在室溫或者顯微鏡載物臺預(yù)先加熱至37℃的標準試驗室內(nèi)

進行,如果在37℃下進行評估,精液樣本需要放置在37℃環(huán)境中一段時間,并

且制作標本的載玻片、蓋玻片也應(yīng)該預(yù)熱至37

注2：建議采用帶有網(wǎng)格標線的目鏡以便選擇觀察區(qū)域,先數(shù)積極運動型精

子數(shù)量,然后數(shù)非積極運動型精子數(shù)量,最后評估完全不動型精子數(shù)量。（見25.1

節(jié)）。

2.5.1精子活力分類

建議采用一個簡單的精液運動分類方法，該方法根據(jù)精子運動功能的不同分

成以下幾類：

?運動活躍型（PR）：精子運動活躍、線性運動或者在較大的范圍內(nèi)運動

（不考慮運動的速度）。

?非運動活躍型（NP）：精子運動但不活躍，如精子在較小的范圍內(nèi)運動，

精子頭部輕微移位或盡有鞭毛擺動o

?完全不動型（IM）：精子完全不動。

注1:該手冊之前的版本介紹的分類方法將積極活躍型根據(jù)精子運動速度的快慢

進行細分,如將在37℃下精子運動速度大于25微米/秒的定義為A等,這種方

法存在的不足之處是實驗人員很難客觀準確的判斷觀察到的精子運動到底該歸

到哪一等。

注2：當(dāng)討論精子活動率時,細分精子的總能動性（PR+NP）和活躍精子能動性

（PR）非常重要。

2.5.2精液樣本的準備和評估

如果在37rl的溫度下評估，提前10分鐘開啟恒溫箱，以確保溫度恒定在

37V.

■準備20年1深的計數(shù)板（見242節(jié)）。

?用200或者400倍率的相差顯微鏡觀察載玻片。

?等到樣本停止懸浮。

?在離蓋玻片至少5gm的區(qū)域內(nèi)觀察精子的運動（蓋玻片邊緣的精子運動

性受到干燥物質(zhì)的影響）。

?系統(tǒng)性地觀察載玻片以防止重復(fù)觀察同一個區(qū)域，不斷改變觀察區(qū)域，避

免基于精子活動數(shù)量多少來選擇觀察區(qū)域（觀察區(qū)域選擇應(yīng)該隨機）。

?計數(shù)開始時間的選擇應(yīng)該隨機，計數(shù)要迅速，不要等到精子游到所選區(qū)域

后才開始計數(shù)。

■評估所選區(qū)域的所有精子的活動率，區(qū)域選擇最好通過目鏡標線來確定，

選擇區(qū)域的大小應(yīng)根據(jù)精液的濃度，如當(dāng)精液濃度較大時，選擇最上面一排網(wǎng)格，

濃度低時，選擇全部的網(wǎng)格。

?計數(shù)應(yīng)該迅速，避免運動精子的數(shù)量估計值比實際值多，快速計數(shù)網(wǎng)格內(nèi)

的精子，避免因計數(shù)時間過長，將計數(shù)時游進網(wǎng)格的活動精子也計算入內(nèi)而導(dǎo)致

估計值多于實際值。

?首先數(shù)所選區(qū)域內(nèi)的運動活躍型精子（PR）,然后是非運動活躍型精子

（NP）,最后是完全不動型精子（IM）o根據(jù)經(jīng)驗，也可以同時計數(shù)一個網(wǎng)格內(nèi)

的三種類型的精子然后再數(shù)另一網(wǎng)格內(nèi)的三種類型的精子，直到將所選區(qū)域數(shù)

一

yG0

■通過實驗室計數(shù)器的輔助完成計數(shù)。

?每個標本至少在5個不同的區(qū)域計數(shù)，所數(shù)的精子總數(shù)應(yīng)該不低于200個

以避免小樣本錯誤。

?分別計算兩個標本的PR、NP和IM比例，然后計算各自的均值和差值。

?將計算的結(jié)果對照表2.1（在95%的置信區(qū)間內(nèi)，在某一均值下，兩個比

例差距可接受的最大值）。

■參照表2.1若兩個比例差值在可接受范圍之內(nèi)，記錄PR、NP和IM比例

的均值，若差值過大，超過可接受范圍，重新制作2個精液標本。

?通過四舍五入記錄PR、NP和IM比例均值的整數(shù)值。

注1：僅計數(shù)完整的精子（有頭部和尾部，見273節(jié)）不要計數(shù)只能看見小部

分的精子。

注2：活性精子計數(shù)時往往會多數(shù),要通過改變計數(shù)順序（如先數(shù)NP精子數(shù)或

IM精子數(shù)）,盡可能知到潛在影響計數(shù)的偏見（見7.T33節(jié)）并避免它們。

注3：有時,樣本不均勻,即使三個標本都不能得到可接受的差值,這時，記錄

下兩兩的均值及差值。

圖2.4目鏡標線對活性精子計數(shù)很有幫助（圖a）,系統(tǒng)性地選擇計數(shù)區(qū)域，

計數(shù)范圍應(yīng)該至少距蓋玻片5pim（圖b）。

表2.1

在某一均值下，兩個比例差距可接受的最大值（每個標本計數(shù)200個精子的

情況下）。

AcceptableAcceptable

Average(%)Average(%)

Difference*Difference*

0166-769

1277-838

2384-687

3-4489-926

5-7593-955

8-11696-974

12-167983

17-238992

24-3491001

35-6510

框2.6：關(guān)于百分比的比例值和差值處理

百分比要四舍五入成整數(shù)，若尾數(shù)是0.5則將其轉(zhuǎn)換至離兩者均值較近的整

數(shù),如將32.5%寫成32%,而將3.5%寫成4%。這些四舍五入成的百分比全部加

起來可能不等于100%。

對照表2.1,若兩個標本PR、NP、1M比例的差值剛好等于可接受的最大差

值,則接受該值。

若差值大于可接受的最大值,一般認為是數(shù)錯了、吸取錯誤或者精液樣本沒

有攪拌均勻。

當(dāng)差值大于可接受的最大值時,不要采納之前的數(shù)據(jù),而應(yīng)重新制作標本重

新計數(shù)。（千萬不要再做一份相同的標本，計算三個標本的平均值,或者選擇數(shù)

據(jù)接近的兩個計算平均值）。

2.5.3示例

例1：某兩份精液標本（每個標本的精子運動活躍型精子分別占5%

和15%；完全不動型精子分別占65%和35%。占比例最大的為完全不動型，它

們的均值為50%。對照表2.1,在均值為50%的情況下，差值大于10%,認為僅

是偶然發(fā)生事件。觀察值大于10%（65%-35%）,因此需重新制作兩份標本進行

評估。

例2：某兩份精液標本（每個標本的精子數(shù)均大于200）的精子能動性分析

如下：運動活躍型精子分別占37%和28%；非運動活躍型精子分別占5%和6%；

完全不動型精子分別占60%和66%,占比例最大的為完全不動型，它們的均值

為63%。對照表2.1,在均值為63%的情況下，兩者差距大于10%,認為僅是偶

然發(fā)生事件。觀察值小于10%（66%-30%）,因此，接受該觀察值，并記錄如下：

運動型精子占32%,非運動型精子占4%,完全不動型精子占63%。

2.5.4參考下限

總運動精子（PR+NP）比例的參考下限為40%（95%的可信度，38-42的可

信區(qū)間）；積極運動精子（PR）比例的參考下限為32%（95%的可信度，31-34

的可信區(qū)間）。

注:一次射精的精液中的運動活躍型精子總數(shù)具有生理上的意義,它的值

等于精液中的總精子數(shù)乘以運動活躍型精子的比例。

2.6精子活率

精子活率的評估通過精子細胞膜的完整性程度來完成，通常每個樣本都可以

評估其活率。尤其當(dāng)積極活躍型精子比例小于40%時，評估精子活性就非常必要。

這時，精子活性評估可以檢驗精子能動性評估的正確性，因為死亡精子的比例不

應(yīng)該超過完全不動型精子的比例，存活精子的比例應(yīng)該超過運動精子的比例。

活精子的比例通過評估精子細胞膜的完整程度來完成，而細胞膜的完整程度

評估運用染色排除法或低滲透腫脹法。染色排除法基于以下原理:損壞的細胞膜，

例如死亡細胞膜，允許有色物質(zhì)進入；滲透腫脹法則假設(shè)：在低滲透壓溶液中只

有擁有完整細胞膜的細胞才會腫脹。下面將會對這兩種方法分別舉例。

精子活率的評估應(yīng)在精液樣本液化后盡快（最好在30分鐘之內(nèi)）進行，務(wù)

必在射精后1個小時之內(nèi)完成。防止時間過長，因脫水及溫度的變化對評估結(jié)果

產(chǎn)生的負面影響。

注1：臨床上,知道完全不動型精子是否是活的非常有必要,因此,精子活率的

評估要在精子能動性評估結(jié)果的基礎(chǔ)上進行。

注2：若出現(xiàn)完全不動且為活性精子的比例較大的情況,則提示精子鞭毛存在結(jié)

構(gòu)性缺陷;若完全不動且為死亡精子比例較大則提示附睪存在病理。

2.6.1曙紅（伊紅）一苯胺黑法評估精子的活率

這種方法通過苯胺黑染色劑，只需要一個步驟，增強精子頭部顏色與背景顏

色的對比度，很容易就可以看出精子是否具有活率。將染色后的精液制成標本放

到顯微鏡下觀察。

2.6.1.1準備試劑

1.曙紅Y：將0.67克曙紅和0.9克氯化鈉溶入到100毫升純凈水中，并輕微

加熱。

2.曙紅一苯胺黑：將10克苯胺黑加到配好的100毫升的曙紅Y試劑中。

3.將其加熱至沸騰，然后冷卻至室溫。

4.用濾紙（如90g/m2）濾掉渣滓及凝膠狀沉淀物，然后存儲于黑色密封的玻

璃瓶內(nèi)。

2.6.1.2步驟

1.將精液樣本拌勻。

2.將1/5的精液與5似伊紅溶液混合，置于顯微鏡載玻片上，用移液管混勻，

在載玻片上均勻展開。

3.重新攪拌精液樣本，然后重復(fù)步驟2制作另外相同一份。

4.將兩份樣本的懸浮液分別涂抹在不同的載波片上（見2.13.2節(jié)），然后置

于空氣中風(fēng)干。

5.標本干后立即觀察，或者將其置于永久非水介質(zhì)（見2.1425）中，以后

再觀察。

6.用100倍的油浸物鏡觀察。

7.在實驗室計數(shù)器的輔助下，計數(shù)已被染色的精子（死亡精子）和沒有被

染色的精子（活性精子）數(shù)量。

8.為了避免樣本錯誤，每個標本至少要數(shù)200個精子。

9.分別計算兩個標本活性精子的比例，以及兩者之間的差值。

10.對照表2.1（在某一均值下，兩個比例差距可接受的最大值）以確定差

值是否可以接受。

11.若均值可以接受，記錄下兩個標本活性精子比例的平均值，否則，重新

制作兩個相同的標本并且重復(fù)以上步驟。

12.用四舍五入法記錄所得的比例值。

圖2.5在明場視野鏡下觀察曙紅一苯胺黑精液標本圖

頭部變紅的精子（D1）或者暗紅（D2）的精子認為是死的（細胞膜受損）；

頭部為白色（L）或者淡粉色的精子認為是活的（細胞膜完整）。

2.6.13Scoring

1.Thenigrosinprovidesadarkbackground,whichmakesiteasiertodiscern

faintlystainedspermatozoa.

2.6.1.3計數(shù)

1.苯胺黑使整個標本的背景成為黑色，因此容易分辨被染色的與未被染色

的精子。

2.在明場視野顯微鏡下，活精子具有白色頭部，而死精具有紅色或暗紅色

頭部（見圖2.5）,淡紅色頭部的精子認為是活的。

3.如果精子頭部僅有小部分被染色，認為是頸膜泄漏，不是細胞死亡和全

部膜破壞的跡象。這種情況下認為該精子是活的。

2.6.1.4正常參考下限

活精子（細胞膜完整精子）比例的參考下限為58%（置信度為95%,置信

區(qū)間為55-63）。

注:一次射精量中（￡2.8.7節(jié)）,精子細胞膜完整的精子總數(shù)具有生理學(xué)意義,

可以通過精子總數(shù)乘以具有完整精子細胞膜的比例得到。

2.6.2僅用曙紅（伊紅）染料評估精子活力

該方法簡單快速，但所制備濕片無法儲存以用于質(zhì)量控制。

2.6.2.1試劑的制備

1.NaCL0.9%（w/v）：將0.9gNaCl溶于100ml凈化水中。

2.曙紅Y染劑，0.5%（w/v）：將0.5g曙紅Y（比色指數(shù)，45380）染料溶于

100ml濃度為0.9%的NaCl溶液中。

注:一些商用曙紅溶液是會對精子結(jié)構(gòu)造成破壞的低滲溶液,這會造成假陽性結(jié)

果。如果使用這種溶液,需向100ml溶液中添加0國的NaCl以提高滲透壓。

2.6.2.2操作步驟

1.充分混勻精液樣本（見框2.3）。

2.吸取5M的精液樣本，同5川的曙紅溶液在載玻片上混勻?？墒褂靡埔浩?/p>

頭在載玻片樣本上充分攪拌以保證混合均勻。

3.用22mmX22mm的蓋玻片覆蓋，反應(yīng)30秒。

4.重新混勻精液樣本，重新吸取樣本，重復(fù)上述步驟2和3。

5檢驗所制備的玻片，以放大倍數(shù)為200或400倍的負相位光學(xué)顯微鏡（正

相位目鏡難以辨明染為淡粉色的頭部）檢驗為佳。

6.用實驗室計數(shù)器來計數(shù)染色（死亡）和非染色（存活）細胞的數(shù)目。

7.為了達到可接受的低樣本誤差，每張玻片評估200個精子（見框2.5）。

8.統(tǒng)計所制備的兩張玻片中活動精子的平均數(shù)和百分率的差異。

9,以表2.1或是圖A7.2,附錄7為標準（在僅考慮樣本誤差的前提下，均

顯示95%的樣本其兩個百分率的最大差異是可以接受的），推斷是否為可接受的

差異。

10.如果其百分率上的差異是可以接受的，則可報告其活力的平均百分比。

如果差異過高，則重新制備標本再次進行評估（見框26）。

11.所報告的精子活力的百分比應(yīng)盡可能涵蓋所有的精子數(shù)目。

2.623計分

1.存活精子的頭部染色為白色或淡粉色，死亡精子的頭部染色為紅色或深

粉色。

2.如果染色僅限于頸部區(qū)域，剩余的頭部未染色，則可認為是“頸部細胞

膜不全”，這并非是細胞死亡和細胞膜崩解的標志，此類細胞應(yīng)被認為是存活細

胞。

3.如果難以辨識淺染的頭部，可使用苯胺黑以增加背景的對比度（見261

節(jié)）。

2.6.2A正常參考下限

活精子（細胞膜完整精子）比例的參考下限為58%（置信度為95%,置信

區(qū)間為55-63）。

注:一次射精量中（JE2.8.7節(jié)）,精子細胞膜完整的精子總數(shù)具有生理學(xué)意義,

可以通過精子總數(shù)乘以具有完整精子細胞膜的比例得到。

2.6.3活精子的低滲膨脹檢驗

作為一種可供選擇的染色排除方法，低滲膨脹（HOS）檢驗可以用于評估精

子的存活情況（Jeyendran等，1984）。當(dāng)無法進行染色時，如選擇用于ICSI的

精子，該法為最有效地評估方法。細胞膜完整的精子在低滲介質(zhì)中會于5分鐘膨

脹，且其形狀會在30分鐘內(nèi)保持穩(wěn)定（Hossain等，1998）。

使用方法：

?如為常規(guī)診斷用途可孵化30分鐘

?如果為治療目的則只可孵化5分鐘

2.6.3.1試劑制備

1.用于診斷的膨脹液的制備：將0.735g二水檸檬酸鈉和1.351g右旋果糖溶

于100ml的凈化水中。該溶液需保存于-20℃的環(huán)境中。

2.如用于治療用途，以1+1（1：2）的比例用無菌凈化水溶解介質(zhì)。

2.63.2操作步驟

1.使用前溶解膨脹液充分混勻。

2.以37℃密閉的微型離心管中加熱1ml的膨脹液或1+1（1：2）的稀釋媒

介5分鐘。

3.充分混勻樣本（見框2.3）。

4.吸取100可的精液樣本并添加膨脹液。用移液器緩慢抽吸混勻。

5.37℃下準確孵化5分鐘或30分鐘（見上），之后取10口液體置于潔凈的

載玻片上，加蓋22mmX22mm的蓋玻片。

6.按上述步驟，再次混勻精液樣本，再次吸取標本，混入膨脹液，孵化，

再次制備涂片。