第七章生物制品生產(chǎn)的根本設(shè)施與流程一、生物制品制造的原那么1．預(yù)防用生物制品必須是平安的，不應(yīng)有明顯的副作用，無相應(yīng)的疾病、持續(xù)感染和過敏反響。2．預(yù)防用生物制品應(yīng)具有能使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫能力．類似患病后所引起的免疫效應(yīng)。3．預(yù)防用生物制品應(yīng)考慮運(yùn)輸、保存及使用上的方便。4．預(yù)防用生物制品必須經(jīng)過國家檢定機(jī)構(gòu)檢定合格，包括流行病學(xué)效果觀察證明是有效。二、生物制品制造的根本條件1.相應(yīng)的廠房和動(dòng)物舍；2.相應(yīng)的生產(chǎn)設(shè)施〔培養(yǎng)基制造和滅菌設(shè)備；細(xì)菌培育設(shè)備；細(xì)胞培養(yǎng)裝置；溫室、凍干、冷藏等〕4.具有防止散毒的設(shè)施和隔離條件5.消毒和排污條件6.供水供電7.經(jīng)國家有關(guān)部門批準(zhǔn)取得生產(chǎn)許可證。三、一般生物制品的生產(chǎn)流程1.由國家指定的部門領(lǐng)取生產(chǎn)用菌種或毒種啟封菌〔毒〕種。4.大量繁殖菌液或毒液〔1〕免疫動(dòng)物、采血制成高免血清〔2〕滅活加佐劑制成滅活疫苗〔3〕減毒加保護(hù)劑制成凍干活苗〔4〕滅活制成診斷用抗原等。5.配制成半成品6.混合分裝并冷藏?？股仄肯春婀嗳a(chǎn)聯(lián)動(dòng)線7.按規(guī)程抽樣檢驗(yàn)〔1〕純粹或無菌檢驗(yàn)〔2〕活菌計(jì)數(shù)、毒價(jià)測(cè)定〔3〕平安檢驗(yàn)〔4〕效力檢驗(yàn)〔5〕診斷液效價(jià)和特異性檢驗(yàn)〔6〕凍干的殘水，真空度測(cè)定〔7〕物理狀態(tài)檢驗(yàn)等。8.簽發(fā)合格通知交成品庫9.包裝10.發(fā)運(yùn)出廠、使用。四、菌〔毒〕種的選擇1.菌〔毒〕種的重要性：是疫苗生產(chǎn)的根本是對(duì)制品質(zhì)量的直接保證。2.菌〔毒〕種的選擇原那么：平安性：毒力能滅活或毒力低免疫原性良好遺傳學(xué)穩(wěn)定無致癌性生產(chǎn)適用性。3.本卷須知我國現(xiàn)有用于生產(chǎn)的菌〔毒〕種，都是經(jīng)過研究單位進(jìn)行大量研究之后選出的。我國?獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程?規(guī)定，凡經(jīng)部、省〔自治區(qū)〕發(fā)給批準(zhǔn)文號(hào)的產(chǎn)品，生產(chǎn)所需的菌〔毒〕種，由中監(jiān)所或中監(jiān)所委托分管的單位供給。制造用的病原微生物，必須按規(guī)程要求經(jīng)過選擇和鑒定后、符合標(biāo)準(zhǔn)的方得用于生產(chǎn)。總那么：制造死苗：標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，其免疫原性良好。制造活苗：經(jīng)過嚴(yán)格審查、鑒定的弱毒或無毒菌株，其毒力穩(wěn)定，形態(tài)特征典型，不易變異，血清型與當(dāng)?shù)亓餍械南嗤??！惨弧尘N1.菌種來源：〔1〕歷史清楚：流行地區(qū)、動(dòng)物種、流行資料清楚，別離鑒定資料完整，傳代、保存、生物學(xué)特性檢查方法明確?！?〕生物學(xué)性狀明顯：以便易于鑒別。如培養(yǎng)、電鏡、免疫、病理變化等?！?〕遺傳學(xué)性相對(duì)純一和穩(wěn)定：在生產(chǎn)中也經(jīng)常挑選、純化、克隆化等?！?〕反響原性和免疫原性優(yōu)良：在生產(chǎn)中也通常通過濃縮、提純、導(dǎo)入佐劑等方法改善?！?〕毒力在規(guī)定范圍內(nèi)。2、菌種鑒定：〔1〕形態(tài)及培養(yǎng)特性檢查：〔2〕血清凝集試驗(yàn)：〔3〕毒力鑒定：強(qiáng)毒株——本動(dòng)物、試驗(yàn)動(dòng)物的致死劑量、死亡率弱毒株——致死與不致死的劑量范圍等。例：?麻疹活疫苗規(guī)程?局部每批至少10只成鼠〔15~20g〕，腦內(nèi)接種0.03ml和腹腔接種0.5ml，觀察21d，至少有原接種小鼠80%成活，并且無一小鼠呈現(xiàn)因病毒種子中外源性傳染因子感染，那么試驗(yàn)合格。所有死后24h后或有病癥的小鼠均應(yīng)解剖接種5只，觀察21d?！?〕免疫原性鑒定〔免疫力試驗(yàn)〕：用于制造菌苗的各菌種，按各自的制造方法制成菌苗，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)過1~3周后，攻擊致死劑量或假設(shè)干致死劑量的強(qiáng)毒菌，觀察動(dòng)物發(fā)病、死亡和保護(hù)等情況。菌種抗致死量強(qiáng)毒越多，保護(hù)率越高，免疫原性越好。保護(hù)率一般應(yīng)能達(dá)50~80%小鼠成活，各制品的指標(biāo)各不相同?！?〕穩(wěn)定性試驗(yàn)：制造弱毒活苗的菌種，要特別注意其毒力是否穩(wěn)定在培養(yǎng)基上傳20~30代后，其菌落形態(tài)無變化、毒力不明顯增強(qiáng)，免疫原性不減弱，那么初步認(rèn)為是穩(wěn)定的。接種動(dòng)物傳代5~10代后，其毒力不增強(qiáng)那么穩(wěn)定。〔6〕毒性試驗(yàn)：按規(guī)定制成死苗——注射小鼠〔15~18g〕〔不參加防腐劑〕，注射后3天，小鼠體重不應(yīng)有降低。7天后增重不少于對(duì)照組60%增重，且不得有死亡?！捕扯痉N例1、豬瘟毒株豬瘟兔化弱毒株接種家兔

經(jīng)過一定潛伏期出現(xiàn)定型熱而無明顯可見的病癥。例2新城疫病毒1.無菌試驗(yàn)2.病毒毒力3.純毒試驗(yàn)。五、菌苗制造五、菌苗制造〔二〕細(xì)菌滅活苗1.將強(qiáng)菌株的純培養(yǎng)物用物理或化學(xué)方法將其殺死或使之失去活力，再參加防腐劑或參加佐劑制成。2.此類疫苗平安，但疫苗用量大，局部有反響。五、菌苗制造3.制造程序：菌種——種子培養(yǎng)〔純粹檢查〕——種子液——菌液培養(yǎng)〔活菌計(jì)數(shù)〕——滅活——濃縮〔稀釋〕——配苗〔加佐劑、防腐劑〕——分裝?！惨娎忱贺i肺疫氫氧化鋁菌苗選取菌株〔B型多殺性巴氏桿菌〕——接種血瓊脂斜面24h作為種子——馬丁肉湯37℃20h，作為種子液——接種大量馬丁肉湯培養(yǎng)基，參加量為1%，36~37℃12~24h，——純粹檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)——參加0.1%甲醛——37℃7~12h——參加菌液:Al(OH)3=5:1的Al(OH)3——分裝。使用：免疫期持續(xù)6個(gè)月，皮下5ml，2~5℃保存1年，16~28℃9個(gè)月。五、菌苗制造〔三〕細(xì)菌弱毒凍干活苗1.將檢驗(yàn)合格的種子液，按1~2%的量接種于適量的液體〔或固體〕培養(yǎng)基中，37℃8~24h，然后進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，無雜菌污染時(shí)，用于配苗，然后按7:1~5:1的比例參加保護(hù)劑〔明膠蔗糖等〕，混合分裝，凍干。2.制造程序：菌種——種子培養(yǎng)〔純粹檢查〕——種子液——菌液培養(yǎng)〔活菌計(jì)數(shù)〕——濃縮〔稀釋〕——配苗〔加保護(hù)劑〕——分裝——預(yù)凍——真空枯燥。六、疫苗制造病毒性疫苗生產(chǎn)流程及區(qū)域劃分〔一〕接種易感動(dòng)物制苗即用動(dòng)物培養(yǎng)繁殖病毒1.動(dòng)物的選擇：其對(duì)動(dòng)物的選擇十分重要〔對(duì)該病毒易感性高；盡量使用純種、體重和年齡應(yīng)符合?規(guī)程?的要求；外購動(dòng)物要經(jīng)過嚴(yán)格的隔離觀察〕。常用：小白鼠、家兔、綿羊、牛、驢、馬。2.病毒材料處理〔1〕液體材料——直接離心取上清液體?！?〕組織剪成小塊研磨加緩沖液1:10稀釋加1000ug鏈霉素和1000u青霉素，37℃1h或4℃過夜。3.接種動(dòng)物4.采集材料病毒繁殖后，取含毒量高的組織器官，如脾臟、肝臟、淋巴結(jié)等5.病毒材料粉碎〔參考2步驟方法處理〕〔1〕搗粹后參加適當(dāng)?shù)南♂屢骸睵BS〕〔2〕銅紗網(wǎng)過濾除去粗粒，制成乳劑6.滅活〔活苗加保護(hù)劑凍干〕7.檢驗(yàn)8.分裝例1：水貂病毒性腸炎臟器滅活苗病毒水貂、仔貓、仔犬出現(xiàn)典型病癥后、捕殺取胃、腸、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟。稱重、搗粹制成13~15%的生理鹽水水乳劑多層紗布過濾。測(cè)定HA在1:120以上、HI陽性參加甲醛使之終濃度在0.35%，37℃24h然后在無菌的條件下開蓋，包以無菌紗布，使甲醛揮發(fā)24h，必要時(shí)參加0.01%的結(jié)晶紫。例2：豬瘟活疫苗豬瘟病毒反復(fù)通過豬和兔交叉繼代家兔假設(shè)干代。20~40倍稀釋乳劑接種3~5日齡乳兔1ml/只36~40h凍死取心、肝、脾、肌肉組織制苗〔此種乳劑液體亦稱為濕苗，或參加保護(hù)劑制成凍干疫苗〕。例：NDI系弱毒疫苗〔三〕細(xì)胞培養(yǎng)制苗1.自50年代起，細(xì)胞培養(yǎng)即廣泛用于病毒工作中。細(xì)胞培養(yǎng)分為：原代細(xì)胞——常用于病毒的別離、疫苗生產(chǎn)、血清學(xué)測(cè)定等；傳代細(xì)胞——制苗、病毒的別離細(xì)胞系——不適合制苗?！?〕兔、地鼠、綿羊、山羊、豬腎臟細(xì)胞：用于偽狂犬病、馬腦炎、羊痘、豬瘟等疫苗的制造?！?〕牛、羊睪丸細(xì)胞：用于豬瘟、綿羊痘、山羊痘等弱毒疫苗的制造?！?〕驢白細(xì)胞：用于培養(yǎng)馬傳染性貧血病毒，制造弱毒疫苗。細(xì)胞培養(yǎng)制苗:細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：蛋白質(zhì)、微生物、酶、激素等凍干后變性很少，生物活性仍能得到保持。優(yōu)點(diǎn):〔1〕使不穩(wěn)定的物質(zhì)在凍干過程中失去絕大局部水分，保持不變質(zhì)，延長有效的保存時(shí)間，便于儲(chǔ)藏?！?〕凍干制品加水后易于溶解恢復(fù)原狀，便于使用?！惨弧忱鋬稣婵湛菰锏母驹?.原理：〔1〕根據(jù)熱力學(xué)中的相平衡理論，隨壓力的降低，水的冰點(diǎn)變化不大，而沸點(diǎn)卻越來越低，向冰點(diǎn)靠近?！?〕當(dāng)壓力降到一定的真空度時(shí)，水的沸點(diǎn)和冰點(diǎn)重合，冰就可以不經(jīng)液態(tài)而直接汽化為氣體，這一過程稱為升華?！?〕真空冷凍枯燥是在水的三相點(diǎn)以下，即在低溫低壓條件下，使生物制品中凍結(jié)的水分升華而脫去。2.真空冷凍枯燥器〔1〕冷凍枯燥機(jī)組成:制冷系統(tǒng)真空系統(tǒng)加熱系統(tǒng)控制系統(tǒng)。〔二〕冷凍真空枯燥的操作程序1.預(yù)凍：共熔點(diǎn)：不同溶劑和溶質(zhì)全部凝成固體的溫度。一般共溶點(diǎn)在——-20~-35℃，故預(yù)冷那么在-40℃以下。要求：〔1〕快速冷凍對(duì)細(xì)胞的影響較小，緩慢冷凍容易引起細(xì)胞死亡。〔2〕生物制品一般預(yù)凍時(shí)間為3~4h即可開始升華。2.枯燥：通常在24左右，有低于共溶點(diǎn)下抽真空和高于共溶點(diǎn)下抽真空。預(yù)凍結(jié)束之時(shí)即是抽真空開始，按要求在30min左右真空度必須到達(dá)10Pa?！?〕升華枯燥階段1〕在共熔點(diǎn)溫度將凍結(jié)物質(zhì)中的水分除去的過程稱為升華。2〕制品在升華枯燥中可除去85％以上的水分。3〕制品在升華時(shí)需要吸收熱量，必須對(duì)制品進(jìn)行加溫，但不能使制品的溫度超過共熔點(diǎn)溫度，凍結(jié)物質(zhì)的共熔點(diǎn)溫度亦即其升華溫度。4〕升華枯燥的制品溫度如果低于共熔點(diǎn)溫度過多，那么升華的速率降低，升華時(shí)間延長；如果高于共熔點(diǎn)溫度，那么制品發(fā)生溶化，枯燥后發(fā)生體積縮小、出現(xiàn)氣泡、顏色加深、溶解困難等現(xiàn)象?！捕辰馕菰镫A段：使與物質(zhì)結(jié)合的水分子通過加熱方式除去的過程稱為解吸枯燥。1〕在解吸枯燥階段，可以使制品的溫度迅速上升到該制品的最高容許溫度，