抗細菌轉(zhuǎn)基因工程課程資料病菌特點該病菌屬黃單胞桿菌屬細菌,生長最適溫28-30°C。低于16°C基本不發(fā)病。細條病得發(fā)生初侵染源主要有稻種、稻草和自生稻帶菌,但也不排除野生稻、李氏禾得交叉?zhèn)魅?。病原菌主要從傷口侵?菌膿可借風、雨、露等傳播后進行再侵染。高溫高濕等有利于病害發(fā)生。臺風暴雨造成傷口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水過深加重發(fā)病。水稻細條病得發(fā)病特點

危害水稻得主要特點:主要侵害水稻葉片,病斑初呈暗綠色水橫狀半透明小斑點,后逐漸沿葉脈方向擴展,成黃褐色,干結(jié)后呈黃色樹膠狀小粒,形如虛線,不易脫落。發(fā)病嚴iR吋,條斑融合成不規(guī)則得黃褐色至枯白色大斑塊,外觀與白葉枯病有些相似,但對光觀察,病斑呈半透明狀。病害流行時,葉片卷曲,完全呈一片白色。該病在水稻生長前期、后期都易感染,苗期癥狀較白葉枯病明顯;病害嚴重時能引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使能夠抽穗結(jié)實,但批谷增多,千粒重降低。一般年份可減產(chǎn)10%-20%,在氣候條件沾發(fā)病嚴重時達40%。Rxo1基因來源Rxo1基因就是來自玉米得一個抗玉米細菌性條斑病得寄主抗性基因,將其轉(zhuǎn)入水稻后轉(zhuǎn)基因水稻中接種細菌性條斑病病原菌,在接種點處表現(xiàn)典型得HR表型,證實該基因為一重要得非寄主抗性基因。Rxo1基因定位Rxo1基因CDS序列全長(從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG)為2718bp。與許多R基因一樣,該基因編碼得產(chǎn)物就是NBS-LRR結(jié)構(gòu)得抗病蛋白(GenBank登錄號為AAX31149、1),其蛋白質(zhì)序列為905aa。根據(jù)SMART數(shù)據(jù)庫軟件掃描該蛋白得domains、repeats、motifs,找到一個從4-18位點得lowpositionalplexity:IAVLLVLKKIAIALA及一個位于118-147得coiledcoilregion(LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK);此外還預測到了37個其余結(jié)構(gòu)(如UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADH-G_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、LRR_CC、LRR_TYP及LRR_SD22等),但就是其顯著性未達到極顯著得閾值。Sanger得分析則找到3個Pfam-Amatchs,其中顯著得一個就是NB-ARC結(jié)構(gòu):envelope范圍就是183-470;比對結(jié)果得范圍則就是185-467;HMM范圍為3-282;另有兩個非顯著得4個copy得LRR結(jié)構(gòu)?；騌xo1得雙右邊界雙元載體得構(gòu)建1、1菌株和載體含有9kbRxo1基因得pCAMBIA1305-1Rxo1質(zhì)粒由美國堪薩斯州立大學ScotH、Hulbert博士提供。pCAMBIA1305-1質(zhì)粒就是由澳大利亞CAMBIA研究中心構(gòu)建得含有35S啟動子和細菌卡那霉素抗性基因得雙元載體。采用得農(nóng)桿菌菌株為EHA105。

(1)美國Kansas州立大學得ScotH、Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1質(zhì)粒,其中

攜帶有外源目得基因Rxol;

pCAMBIA1305-1質(zhì)粒

(2)澳大利亞CSIROPlantIndustry得MUpadhyaha博士提供雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6。該載體用于轉(zhuǎn)接Rxol基因并將重組體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中進行后續(xù)轉(zhuǎn)基因:雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6結(jié)構(gòu)圖及可能產(chǎn)生得3種TDNA類型(3)農(nóng)桿菌菌株為LBA4404;(4)大腸桿菌菌株為DHSa;1、2雙右邊界雙元載體得構(gòu)建1、感受態(tài)細胞得制備和轉(zhuǎn)化2、雙右邊界雙元載體構(gòu)建(1)目得基因和載體得酶切連接將攜帶Rxol基因得載體pCAMBIA1305-1用限制性內(nèi)切酶SacI(AGTVACT),NgoMN(GVCCGGC)進行消化,同時,用限制性內(nèi)切酶XmaI(CVCCGGG)和HpaI(GTTVAAC)消化載體pMNDRBBin6。將酶切后得到得目得基因片斷和雙元載體用T4噬菌體連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。質(zhì)粒pCAMBIA1305-1-Rxol經(jīng)內(nèi)切酶SacI和NgoMIV酶切,得到大小為8、Skb得Rxol目得基因片斷(圖A),載體pMNDRBBin6經(jīng)HpaI和XmaI酶切,得到大小為12、3kb得線性化雙右邊界載體(圖B)

A:SacI和NgoMN酶切pCAMBIAI305-I-Rxol;B:HpaI和XmaI酶切pMNDRBBin6;I:pCAMBIA1305-1-Rxol;2:pMNDRBBin6;M:250byDNAMarker、大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(2)陽性克隆篩選將過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌,在LB固體培養(yǎng)基(含SOmg/L壯觀霉素)上涂布37℃培養(yǎng),挑取轉(zhuǎn)化子單克隆于LB培養(yǎng)基(含SOmg幾壯觀霉素)中振蕩培養(yǎng)Sh;提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進行擴增,使用引物Rxol-F(5‘ACTCGGTAAACCTACGGACTGA-3’)和Rxol-R(5‘-CTTCCTGCAGGTATACCACTCC-3’)篩選獲得陽性克隆;篩選出1個轉(zhuǎn)化子,其特異性擴增片段與1、45kb目得基因片段Rxol大小相符。提取該克隆質(zhì)粒DNA進行PCR擴增,擴增片段大小與陽性對照pCAMBIA1305-1-Rxol相同,將產(chǎn)物回收純化連接到pMD20-T上測序,與目得基因序列比對相同,表明Rxol基因片段已整合到pMNDRBBin6載體中。1M2341:陽性對照pCAMBIA1305-1-itcol;M:1kbDNAlandderMarker;2:陰性對照pMNDRBBin6質(zhì)粒;3:陽性克隆PCR擴增;4:陽性克隆得質(zhì)粒PCR擴增;M:1kbDNAladdermarker、------1、45kb(2)對整合了Rxol基因得pMNDRBBin6載體使用HpaI和XmaI進行雙酶切,應得到大小為

20、875kb得片段。該陽性克隆得質(zhì)粒經(jīng)酶切后產(chǎn)生1條帶約為20kb(圖2、5),與目得基因片段和pMNDRBBin6載體得長度之和相等記為pMNDRBBin6-Rxola

1M—l0kb1:質(zhì)粒;2:Marker、(3)pMNDRBBin6-Rxol經(jīng)EcoRI酶切后產(chǎn)生4個片段,大小分別為9378bp,8576bp,1632bp和1268bp(9378bp和8576bp片段長度相近,圖中合為一條粗帶)(圖2、6A);SacI酶切產(chǎn)生5個片段,大小分別為8525bp,5194bp,2683bp,1763bp和1528bp(圖2、6B)

圖2、6陽性克隆質(zhì)粒得EcoRICA)和SacI(B)酶切圖譜、1:質(zhì)粒;Ml:250byDNAladdermaker;M2:1kbDNAladdermarker、上述酶切結(jié)果與PremierPrimer5、0分析得理論酶切片段大小相符,表明Rxol基因整合到了雙邊界載體中,且位于TDNA相鄰得左右邊界之間。(3)陽性克隆酶切鑒定和PCR擴增(4)載體序列分析(5)保存陽性克隆,以備后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化工作。水稻得遺傳轉(zhuǎn)化

將處理好得種子誘導培養(yǎng)基MS(含100mL/LMS大量元素混合液上,26℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)約30天。(1)繼代培養(yǎng)將上述誘導得質(zhì)地緊密、色澤鮮艷得胚性愈傷組織在超凈臺中用鑷子剝離,轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中(MS培養(yǎng)基,如上),2周后選擇原胚性愈傷組織分化出來得質(zhì)地均勻、顆粒較小、色澤良好得愈傷顆粒繼代一次,共繼代2次。(2)農(nóng)桿菌活化將超低溫保存得農(nóng)桿菌劃線于含50mg/L卡那霉素得YEB培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;挑取單菌落,接于2mL含有50mg/L卡那霉素得YEB液體培養(yǎng)基中,28℃搖床中振蕩培養(yǎng)約36小時;用移液槍吸取1mL新鮮菌液接于50mL含50mg/L卡那霉素得YEB液體培養(yǎng)基中,搖菌至OD600為0、8-1、0;將活化好得農(nóng)桿菌離心,4000rpm,10min,去上清后重懸于AAM-As(100含mL/LAAM大量元素、5mL/L上述鐵鹽、0、1mg/LVB1、0、6mg/LVB6、0、5mg/L煙酸、0、75mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、876mg/L谷氨酰胺、266mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0、5g//L酪蛋白、68、5g/L蔗糖及36g/L葡萄糖,調(diào)節(jié)PH至5、2,滅菌后冷卻至約60℃得培養(yǎng)基中加入1mL10mmol/L得乙酰丁香酮)液體培養(yǎng)基中,28℃,200rpm振搖3-4小時,用分光光度計調(diào)節(jié)OD600為0、7-1、0,即可用于分裝、侵染愈傷組織。(3)侵染、共培養(yǎng)與篩選材料為在繼代培養(yǎng)基上生長4-5天得愈傷組織,將愈傷組織轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上吸濕20min后轉(zhuǎn)移到調(diào)好濃度得菌液中;搖床中緩慢搖晃20-30min;倒掉菌液,于滅菌濾紙上吸棄多于菌液;取出愈傷,播于鋪有一層濾紙得共培養(yǎng)培養(yǎng)基(PH為5、2得MS培養(yǎng)基)中,20℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2-3天。當共培養(yǎng)得愈傷周圍出現(xiàn)明顯得菌體時,將其轉(zhuǎn)移至滅菌濾紙上,吸去表面菌體后用含有150mg/L頭孢噻奎鈉和200mg/L羧芐青霉素得無菌水中,100rpm振蕩30min,重復3次;將洗過得愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌濾紙上,吸取多于水分;將愈傷接入篩選培養(yǎng)基(含有150mg/L頭孢噻奎鈉和200mg/L羧芐青霉素及50mg/L潮霉素)中,26℃避光篩選15-20天后將未變黑得愈傷轉(zhuǎn)移到新得篩選培養(yǎng)基,重復2次。(4)植株再生將篩選培養(yǎng)基上得抗性愈傷組織介入預分化培養(yǎng)基(含有N6大量、MS微量、鐵鹽、1mg煙酸、10mgVB1、1mgVB6、0、1g肌醇、0、3g酪蛋白、0、5g甘氨酸、0、5g脯氨酸、30g蔗糖、3g植物凝膠、2、2mgNAA、2、5mg6-BA,PH為5、8)上,26℃暗培養(yǎng)7天后在12小時光照、12小時黑暗得條件下培養(yǎng)7天。將預分化得抗性愈傷組織接入鋪有無菌濾紙得培養(yǎng)皿中,干燥處理3小時后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(每升含有N6大量、MS微量、鐵鹽、1mg煙酸、10mgVB1mgVB6、0、1g肌醇、0、3g酪蛋白、0、5g甘氨酸、0、5g脯氨酸、30g麥芽糖、3g植物凝膠、0、5mgNAA、1、5mg6-BA,PH為5、8)上,在26℃環(huán)境中12小時光照及12小時避光得條件下,培養(yǎng)至愈傷變綠,長出少量根,且分化出莖葉。(5)生根培養(yǎng)當分化得小苗生長到4-5cm時,將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(每升中含25mLMS大量元素、5mLMS微量元素混合液、5mL鐵鹽、30g蔗糖、3g植物凝膠、0、1mg/LNAA、0、1g肌醇、0、3g酪蛋白、0、5g谷氨酰胺及0、5g脯氨酸,調(diào)節(jié)PH至5、8)上,上述溫度和光照得條件下繼續(xù)培養(yǎng)30天左右。(6)壯苗與煉苗

將小苗經(jīng)7天溫室煉苗后,轉(zhuǎn)移到人工氣候室水培20天,再轉(zhuǎn)移至隔離得網(wǎng)室中種植。(7)轉(zhuǎn)基因后代得表型檢測與分子檢測當植株生長到分蘗盛期時,用針刺法接種毒性Xoc小種,分別在第3天、第5天、第7天及第10天觀察記錄接種點得反應表型。DNA提取:CTAB法提取轉(zhuǎn)移至網(wǎng)室種植得基因工程苗得基因組DNA(經(jīng)液氮速凍后研磨得約0、1g葉片粉末中加入400μLCTAB提取液;65℃水浴40分鐘,期間搖晃混勻2次;8000rpm離心10分鐘后吸取上清;上清中加入等體積得24:1氯仿:異戊醇,搖床上100rpm5min;10000rp離心10分鐘;吸取轉(zhuǎn)移上清至新管,加入2/3體積預冷得異丙醇后混勻;-20℃下放置30min以上;10,000rpm離心5min,棄廢液;用酒精洗兩遍,室溫下風干,加入200μL溶解DNA;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量)?；驒z測為了檢測所轉(zhuǎn)基因得拷貝數(shù),采用了Nothern雜交得方法(雜交步驟見地高辛試劑盒說明):提取經(jīng)PCR檢測為陽性得植株及受體對照得DNA,用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切后于1%瓊脂糖凝膠電泳中低電壓條件下過夜。雜交操作參照試劑盒所述方法。

所用得探針為Rxo1-pCAMBIA1305-1質(zhì)粒為模板Rxo1-1F和Rxo1-1R為引物擴增出得約1、45kb得Rxo1片段。

細菌性條斑病菌株得分離培養(yǎng)與接種鑒定

菌株分離:以從田間取具有細條病表型(水浸狀條斑,有菌膿)且無其余病害(特別就是白葉枯病)導致得癥狀得葉片為標本,經(jīng)75%酒精表面消毒10s,放入滅菌水中清洗2min,重復3次;在滅菌水中剪碎,放置3分鐘;用滅菌接種針蘸取游離有病原細菌得處理液,在PSA培養(yǎng)基(300g土豆煮出得水中加入5g蛋白胨、15g蔗糖、0、5g硝酸鈣、0、78g磷酸氫二鈉及15g瓊脂粉,定容至1000mL)上劃線;置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天;挑取從形態(tài)與外觀上看為黃單胞菌得單菌落,擴繁培養(yǎng),并經(jīng)接種鑒定為正確得菌株在20%甘油得條件下置于-70℃中保存。菌體培養(yǎng)與接種:用接種針蘸取保存菌株得菌液,在上述培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)2-3天;挑取單菌落擴繁培養(yǎng)2天;用無菌水將菌體洗下,混勻成濃度為108cells/mL;在吸滿菌液得海綿上用大頭針針刺接種不同水稻葉片;接種后3-15