1T/FJBR000-2021果蔬中多菌靈、苯菌靈和噻菌靈的快速檢測拉曼光譜法本標準規(guī)定了使用便攜式拉曼光譜儀快速檢測上海青、春菜、四季豆、黃瓜、蘋果、梨、葡萄等果蔬中多菌靈、苯菌靈和噻菌靈的方法。本標準適用于上海青、春菜、四季豆、黃瓜、蘋果、梨、葡萄等果蔬中多菌靈、苯菌靈和噻菌靈的篩選檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB2763-2021食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量GB40219-2021拉曼光譜儀通用規(guī)范3術(shù)語和定義GB/T40219—2021規(guī)定的術(shù)語和定義適用于本文件。4原理通常，不同物質(zhì)具有與其分子結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的特征拉曼（Raman）光譜。當引入具有表面增強拉曼光譜（簡稱SERS）效應(yīng)的納米增強試劑時，物質(zhì)的拉曼信號將得到顯著性增強。取適量粉碎后的豆芽樣品，經(jīng)溶劑提取、凈化與富集，加SERS增強試劑后，進行拉曼光譜掃描。根據(jù)多菌靈、苯菌靈和噻菌靈的拉曼特征譜峰（參見附錄A）進行結(jié)果判定：有特征峰出現(xiàn)為陽性，否則為陰性或含量低于檢出限。5試劑和材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，SERS增強試劑合成用水應(yīng)符合GB/T6682-2008中的一級要求，其他實驗用水應(yīng)符合GB/T6682—2008中二級水要求，具體試劑與材料如下：——二氯甲烷(CH2Cl2——乙醇(C2H6O)：色譜純；——硫酸（H2SO4——硫酸溶液（0.01mol/L）：移取0.54mL硫酸加水定容至1L；——硫酸鈉溶液（Na2SO4——硫酸鈉溶溶液（0.1mol/L）：稱取1.42g硫酸鈉加水定容至100mL；2T/FJBR000-2021——檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7——檸檬酸三鈉（1%）：取1g檸檬酸三鈉加水定容至100mL；——氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）；——氯金酸（0.01%）：取0.01g氯金酸加水定容至100mL；——SERS增強試劑：納米金濃縮液，或相當者；——納米金濃縮液：取100mL0.01%氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）水溶液加熱至沸，劇烈攪拌下準確加入1.0mL1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）水溶液，金黃色的氯金酸水溶液在2min內(nèi)變?yōu)榧t色，煮沸1h，冷卻至室溫。取1.5mL納米金溶膠于1.5mL離心管中，采用高檔轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液，吸取底層紅褐色濃縮液體50μL，即為納米金溶膠濃縮液。——多菌靈標準品（Carbendazim，10605-21-7，C9H9N3O2，純度≥99%——苯菌靈標準品（Benomyl，17804-35-2，C14H18N4O3，純度≥99%）；——噻菌靈標準品（Thiabendazole，148-79-8，C10H7N3S，純度≥99%）；——多菌靈標準工作液（10μg/mL取100μL濃度為1000μg/mL的多菌靈標準品于10mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10μg/mL的標準工作液。于4℃避光保存，有效期一個月；——苯菌靈標準工作液（10μg/mL取100μL濃度為1000μg/mL的苯菌靈標準品于10mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10μg/mL的標準工作液。于4℃避光保存，有效期一個月；——噻菌靈標準工作液（50μg/mL取500μL濃度為1000μg/mL的噻菌靈標準品于10mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為10μg/mL的標準工作液。于4℃避光保存，有效期一個月；6儀器和設(shè)備6.1便攜式拉曼光譜儀：發(fā)射波長為785±0.5nm，線寬＜0.1nm，能量≥250mW；光譜分辨率≤12cm-1；光譜響應(yīng)范圍300cm-1～1800cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。6.2組織搗碎機。6.3電子天平：感量為0.01g。6.4具塞聚丙烯離心管：1.5mL、50mL。6.5渦旋振蕩器。6.6具塞聚丙烯凍存管：5mL、10mL。6.7可調(diào)移液器：50μL、200μL、1mL和5mL。6.8樣品池：8×30mm玻璃管，1.0mL。7分析步驟7.1樣品前處理7.1.1試樣制備水果、蔬菜樣品取樣部位按GB2763附錄A執(zhí)行，將樣品切碎混勻均一化制成勻漿，制備好的試樣均分成兩份，裝入潔凈的盛樣容器內(nèi)，密封并標明標記。將試樣置于-18℃冷凍保存。7.1.2提取上清液作為處理液備用。移取5mL處理液于凍存管中，加入3mL二氯甲烷，振蕩10~20s，靜置分層。3T/FJBR000-2021移取2mL下層溶液于另一凍存管中，加入1mL0.01mol/L硫酸溶液，振蕩10~20s，靜置分層，上層溶液備用。7.2樣品測定7.2.1拉曼光譜參考條件以下分析條件可供參考，采用其他條件應(yīng)驗證其適用性：激光能量≥250mW，數(shù)據(jù)采集時間≥2s。7.2.2測定在樣品池中依次加入200μL樣品，50μL納米金溶膠濃縮液，50μL0.1mol/L硫酸鈉溶液，快速搖晃均勻后置于拉曼光譜儀的樣品室內(nèi)開始檢測（檢測需在增強試劑加入后2min內(nèi)完成）。7.3質(zhì)控實驗每批樣品應(yīng)做平行試驗并同時進行空白試驗和加標質(zhì)控試驗。7.3.1平行試驗按樣品前處理（7.1）和樣品測定（7.2）步驟對同一試樣進行平行試驗測定。7.3.2空白實驗用經(jīng)確證的陰性樣品，其余均按樣品制備步驟（7.1和7.2）進行。7.3.3加標質(zhì)控實驗準確稱取兩份空白試樣5g置于燒杯中，依次加入適量的標準工作液（多菌靈、苯菌靈10μg/mL；噻菌靈50μg/mL），使多菌靈和苯菌靈濃度為0.2mg/kg，噻菌靈濃度為0.5mg/kg，按照7.1和7.2步驟與樣品同法操作。8結(jié)果判定將測試結(jié)果與標準譜圖庫中的多菌靈、苯菌靈和噻菌靈進行比對，當拉曼譜圖中出現(xiàn)多菌靈（或苯菌靈）的特征峰616cm-1、731cm-1、1006cm-1、1223cm-1、1263cm-1、1316cm-1和1370cm-1(±6cm-1）七個特征峰出現(xiàn)五個或以上時，可定性判斷樣品為陽性，否則為陰性。陰性代表該樣品不含多菌靈（或苯菌靈）或含量低于檢出限，陽性則代表該樣品含有多菌靈（或苯菌靈）。當拉曼譜圖中出現(xiàn)噻菌靈的特征峰786cm-1和1012cm-1(±6cm-1）可定性判斷樣品為陽性，否則為陰性。陰性代表該樣品不含噻菌靈或含量低于檢出限，陽性則代表該樣品含有噻菌靈。果蔬中多菌靈（或苯菌靈）和噻菌靈表面增強拉曼光譜譜圖參見附錄A。9性能指標9.1檢測限：多菌靈、苯菌靈：0.2mg/kg；噻菌靈：0.5mg/kg。9.2靈敏度：靈敏度應(yīng)≥99%。9.3特異性：特異性應(yīng)≥85%。9.4假陰性率：假陰性率應(yīng)≤1%。9.5假陽性率：假陽性率應(yīng)≤15%。4T/FJBR000-2021本方法為初篩方法，當檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)對結(jié)果進行確證。（資料性附錄）——多菌靈（苯菌靈）和噻菌靈表面增強拉曼光譜譜圖多菌靈、苯菌靈和噻菌靈標準溶液表面增強拉曼光譜譜圖見圖A.1。圖A.1多菌靈、苯菌靈和噻菌靈標準溶液表面增強拉曼光譜譜圖果蔬樣品中多菌靈（苯菌靈）和噻菌靈表面增強拉曼光譜譜圖見圖A.2～圖A.4。圖A.2春菜中多菌靈表面增強拉曼光譜譜圖T/FJBR000-2021圖A.3四季豆中苯菌靈表面增強拉曼光譜譜圖圖A.4蘋果中噻菌靈表面增強拉曼光譜譜圖6T/FJBR000-2021（資料性附錄）SERS增強試劑性能指標SERS增強試劑性能指標的計算按表B.1的方法進行計算。表B.1性能指標計算方法樣品情況a檢測結(jié)果b總數(shù)N11N12N1.=N11+N12N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(х2)x2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度T/FJBR000-2021假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準確度，%c（N11+N22）/(N1