第02講微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用

i.學會如何配置培養(yǎng)基，明確培養(yǎng)基的成分及分類；掌握無菌技術(shù)中消毒與滅菌的運用；熟悉微生物酵母菌

的純培養(yǎng)過程。

2.通過對滅菌技術(shù)及實驗步驟的學習，粉認實驗器具，提高實驗操作能力。

3.通過學習微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)，了解微生物的培養(yǎng)條件，更加透徹地理解生物實驗，從而喜歡上這門學

科。

4.學會如何配置選擇培養(yǎng)基；掌握稀釋涂布平板法的操作細節(jié)；熟悉土壤中分解尿素的細菌的分離計數(shù)過程。

5.學會操作涂布器分離細菌；理解對細菌計數(shù)的算法。

6.通過學習微生物的選擇培養(yǎng)和數(shù)量測定，了解生物科研工作的價值和意義。

jg【基礎(chǔ)知識】

一、培養(yǎng)基

1.培養(yǎng)基的配制

1.培養(yǎng)基的配制原則

(1)目的要明確：配制時應(yīng)根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制的培養(yǎng)基種類。

(2)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。

(3)pH要適宜：細菌為6.5?7.5,放線菌為7.5?8.5,真菌為5.()?6.0,培養(yǎng)不同微生物所需pH不同。

(4)認清不同生物需要的營養(yǎng)物質(zhì)不同

①微生物需要的營養(yǎng)成分有水、無機鹽、碳源、氮源，有些微生物還需要特殊營養(yǎng)物質(zhì)，如生長因子。

②在人和動物中，營養(yǎng)物質(zhì)包括水、無機鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。

③在植物中，營養(yǎng)物質(zhì)包括礦質(zhì)元素、水、二氧化碳三類。

2.培養(yǎng)基的成分

胃養(yǎng)物質(zhì)含義作用主要來源

無機物：C02.NaHCOn釘機物：

構(gòu)成生物體的物質(zhì),異養(yǎng)生物

碳源能提供硅元素?的物質(zhì)柢類、脂肪酸、石油、花生松桃

的能源物質(zhì)

等

無機物：Nz、NH“氨盤、硝酸鹽；

合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氯代

氮源能提供氮元素的物質(zhì)有機物：尿素、牛肉軒、送白膝

謝產(chǎn)物

等

生長必不可少的微貴有

生長因子悵和核酸的成分維生素'額基酸、威基等

機物

細胞生命活動必不可少不僅是良好的溶劑，還是結(jié)

水培養(yǎng)基、大氣、代謝產(chǎn)物

的物質(zhì)構(gòu)物質(zhì)

提供除璘、氮元素以外細胞內(nèi)內(nèi)織或成分.生理調(diào)

無機鹽的各種題要元素，包括節(jié)物偵：某些化能自養(yǎng)型細培養(yǎng)拓、大氣

某些大盤元素菌的能源：酣的激活劑

3.培養(yǎng)基的分類

種類特點應(yīng)用

液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)

物理性質(zhì)微生物的分離、鑒定、

固體培養(yǎng)基加凝固劑

活菌計數(shù)、保藏

天然培養(yǎng)基含化學成分不明的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)

化學成分培養(yǎng)基成分明確或用一定化學

合成培養(yǎng)基分類、鑒定

物質(zhì)配制

添加某物質(zhì)，抑制雜菌生長，

選捶培養(yǎng)基培養(yǎng)分離出

促進所需微牛物牛長

用途

特定微生物鑒別根據(jù)微生物的代謝特點，在培

鑒別微生物

培養(yǎng)基養(yǎng)基中加入某種指示劑

特別提醒

幾種微生物的營養(yǎng)和能量來源

微生物碳源氮源能源

藍細菌NH2、NO3■等光能

co2

硝化細菌NHNH的氧化

co233

根瘤菌糖類等有機物有機物

N2

酵母菌糖類、蛋白質(zhì)等有機物蛋白質(zhì)等有機物

二、無菌技術(shù)

I.目的：獲得純凈的微生物培養(yǎng)物。

2.關(guān)鍵：防止雜菌污染。

3.兩種無菌技術(shù)的比較

比較項目條件結(jié)果常用方法應(yīng)用范圍

消毒較為溫和的僅殺死物體表面煮沸消毒法日常用品

物理、化學或內(nèi)部一部分微

巴氏消毒法不耐高溫的液體

方法生物

操作空間、操作者的衣物

化學藥物消毒法

和手等

接種室、接種箱或超凈工

紫外線消毒法

作臺

殺死物體內(nèi)外所濕熱滅菌法培養(yǎng)基、容器等

強烈的理化

滅菌有的微生物，包括干熱滅菌法玻璃器皿、金屬用具等

方法

芽狗和抱子灼燒滅菌法接種工具等

特別提醒:

1.消毒和滅菌后避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸；

2.消毒和滅菌的實驗操作都應(yīng)在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。

三、培養(yǎng)基的制備

1.培養(yǎng)基制備的步驟:

計算T稱量T溶化T滅菌T倒平板。

歸納總結(jié)

①配制培養(yǎng)基：稱取去皮的馬鈴薯2C0g、切塊-加水1000mL、

加熱煮沸一紗布過濾加20通萄糖一加15~20戰(zhàn)

脂一用蒸儲水定容至1000mL

fa.培養(yǎng)基滅菌：將培養(yǎng)基移至錐形瓶T加棉塞、包上

牛皮紙，并用皮筋勒緊放入高壓蒸汽滅菌鍋一

壓力100kPa、溫度121t、時間15?30min

②滅菌4

b.培養(yǎng)皿滅菌:將5~8套培養(yǎng)皿包成一包—用幾層

牛皮紙包緊f放入干熱滅菌箱-溫度160770T、

時間2h

「乩條件：待培養(yǎng)基冷卻至50t左右時，在酒精燈火

焰附近倒平板

b.操作步驟:

③倒平

板

I.將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面h,右手拿

裝有培養(yǎng)基的錐形瓶,左手拔出棉塞。

口.右手拿錐形瓶,將瓶口迅速通過火焰。

III.用左手拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口

的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(10~20ml)倒入

培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

M等培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒過來放置。

四、純化培養(yǎng)的兩種接種方法

項目平板劃線法稀釋涂布平板法

接種操作在接種的固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線一系列的梯度稀釋后進行涂布平板

注意事項每次劃線前后均需灼燒接種環(huán)稀釋度要足夠高，為確保實驗成功可以增加稀釋度

的范圍

菌體獲取在具有顯著的菌落特征的區(qū)域菌落中挑從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑去菌體

起菌體

優(yōu)點可以通過觀察菌落特征，對混合菌進行分可以計數(shù)，可以觀察菌落特征，可以分離混合菌

離

缺點不能計數(shù)操作較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延

施用范圍適用于好氧菌適用于厭氧菌和兼性厭氧菌

特別提醒

1.平板劃線操作的注意事項

(I)操作第一步即取菌種之前及每次劃線之前都需要對接種環(huán)進行火焰灼燒滅菌，劃線操作結(jié)災(zāi)時，仍需灼

燒接種環(huán)，每次灼燒目的不同：

①第一次操作目的是殺死接種環(huán)上原有的微生物。

②每次劃線之間操作H的是殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線

的末端，使每次劃線菌種數(shù)口減少。

③劃線結(jié)束操作目的是殺死接種環(huán)上殘存的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。

(2)灼燒接種環(huán)，待其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。

(3)第二次及其以后的劃線操作總是從上一次劃線末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減

少，最終得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

(4)劃線時最后一區(qū)不要與第一區(qū)相連。

(5)劃線用力大小要適當，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。

2.稀釋涂布平板法：10倍系列稀釋操作。

①將分別盛有9mL水的6支試管滅菌，并按101?106的順序編號。

②進行梯度稀釋時，從菌液開始，每次從前一試管中取ImL溶液注入到下一試管中混勻。(如圖丙)

③進行涂布平板操作。(如圖丁)

將沾布少hi酒精用涂布器將箱液

的涂布器在火餡均勻地涂布住培

上引燃，待酒精燃芥基表面。馀布

盡后，冷卻8~10H時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)肌,

使菌液涂布均勻

圖丙圖丁

五、接種和分離酵母菌

操作步驟操作內(nèi)容

①接種環(huán)滅菌將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒直至燒紅

a在酒精燈火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開盛有菌液的試管的棉塞

b將試管口通過火焰，以防止試管口雜菌污染

②取菌種

c將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，蘸取一環(huán)菌液

d將試管口通過火焰，并塞上棉塞

左手將fll蓋打開一條縫隙，右手把接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，

a

③平板劃蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基

線灼燒接種環(huán)，冷卻后從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重更上述操作，作

b

第三、四、五次劃線。注意不要將最后一次的劃線與第一次的劃線相連

特別提醒:

培養(yǎng)酵母菌：待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和?個未接種的平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養(yǎng)

箱中培養(yǎng)24?48h.

六、微生物的篩選和計數(shù)

1.土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

(1)分離原理：土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成服酶，這種物質(zhì)在把尿素分解成無機物

的過程中起到催化作用。

(2)統(tǒng)計菌落數(shù)目一般用稀釋涂布平板法。

ImLImLImL

Q—且—且—Q

101

9mL

無蔭水

小土樣嘉歌

領(lǐng)—@)

領(lǐng)一6j

?—(€>

①統(tǒng)U菌落數(shù)目時，培養(yǎng)基表面生長的I個菌落，來源「樣品稀釋液中1個活菌。為了保證結(jié)果準確,

般選擇菌落數(shù)在30?300的平板進行計數(shù)。

②從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)的計算方法是(平均菌落數(shù)?涂布的稀釋液體積)x稀釋倍數(shù)。

③利用稀釋涂布平板法成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵是恰當?shù)南♂尪取?/p>

用稀釋涂布平板法統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，這是因為當兩個或多個細胞在一起時，平板上

觀察到的只是一個菌落。

(3)實驗流程：

①土壤取樣一富含有機質(zhì)的土壤表層土

I

②樣品的稀釋一通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30?300之間、

適于計數(shù)的平板

I

③接種f用稀粒涂布平板法接種

［細菌：30?37℃培養(yǎng)1?2天

④培養(yǎng)(放線菌：25?④C培養(yǎng)5-7天

〔霉菌：25?28C培養(yǎng)3?4天

I

⑤觀察一根據(jù)菌落的特征區(qū)分微生物

I

⑥計數(shù)一統(tǒng)計整的數(shù)目

⑦計算一根據(jù)公式“每克樣品中的菌落數(shù)=(C+V)XM［C代表某一稀釋度下平板上生長的平均

菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL),M代表稀釋倍數(shù)］”進行計算。

方法總結(jié)

用顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)：血細胞計數(shù)板法

小方格中方格■

■

■

?

二

==三三

三

三三

_一

=一

=一一

=

=

A

?

(I丫一》倡

123

B

小細胞計數(shù)板構(gòu)造(一)

16x25

A.正面圖；B.縱切面圖血細胞計數(shù)板構(gòu)造(二)

1.血細庖計數(shù)板：2.玄玻片；放大后的方網(wǎng)格.中間大方

3.計數(shù)室格為計數(shù)室

①結(jié)構(gòu)：常用的是1mmxlmmxO.lmm方格的計數(shù)板(如圖)。每個計數(shù)板上有兩個計數(shù)室，每個計數(shù)室上

刻有9個大方格，其中只有中間的大方格為計數(shù)室，大方格的長和寬各為1mm,深度為().1mm,其容積為

0.1mm3：大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格，即大方格是由400個小方格組成,

②操作：將清潔干燥的血球計數(shù)板的計數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的菌液，滴于蓋玻片

邊緣，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，充滿計數(shù)室。

③計數(shù)：在顯微鏡下計數(shù)4?5個中方格內(nèi)的菌體數(shù)，求出每個小方格所含有的細菌的平均數(shù)，按照以下公

式計算：每亳升原液含有的菌數(shù)=每小格平均細菌數(shù)x400xl0"x原液被稀釋倍數(shù)。

七、微生物的篩選與鑒別

1.纖維素酶

(1)組成：纖維素酶是一種復合酶，它包括Ci酶、Cx酶和葡萄糖昔酶。

(2)作用

「纖維索稅(復命W)q

纖維索里?纖維二糖幽典絲葡萄糖

2.菌種篩選

(1)方法：剛果紅染色法。

(2)原理

纖維素分解菌

I

剛果紅］纖維素

5加上一紅色復合物**'紅色消失、出現(xiàn)透明圈

纖維素J

即：使用以纖維素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

3.篩選流程

土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境

I

選擇培養(yǎng)：用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，以增加纖維素分解菌的數(shù)量

I

梯度稀釋

I

涂布平板：將樣品涂布于含CR的鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上

I

挑選產(chǎn)生透明圈的菌落：產(chǎn)生纖維素酶的菌落周圍出現(xiàn)透明圈

歸納總結(jié)

1.微生物的鑒別方法

(1)菌落特征鑒別法：根據(jù)微生物在固體平板培養(yǎng)基表面形成的菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征

進行鑒別。

⑵者示劑鑒別法：如以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種微生物后，培養(yǎng)基變紅說明

該種微生物能夠分解尿素。

(3)染色鑒別法：如利用剛果紅染色法，根據(jù)培養(yǎng)基中出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈來篩選分解纖維

素的微生物。

2.篩選微生物的三種方法

(1)單菌落挑取法：利用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種到固體平板培養(yǎng)基表面，直接根據(jù)微生物菌落的

特征利用單菌落挑取的方法獲得目的微生物。

⑵選擇培養(yǎng)法：利用選擇培養(yǎng)基對微生物進行選擇培養(yǎng)，直接獲得目的微生物。

(3)鑒定培養(yǎng)法；利用鑒別培養(yǎng)基使H的微生物菌落呈現(xiàn)特有的特征，然后篩選FI的微生物。

3.選擇培養(yǎng)基四種常見制備方法或?qū)嵗?/p>

依據(jù)某些微生物對某些物質(zhì)的抗性，在培養(yǎng)基

曾中加入某些物質(zhì)，以“抑制”不需要的微生物，

c“促進”所需要的微生物生長。

深痣到培養(yǎng)電中加入高濃度食鹽時可抑制多種細

9迪拳例L長菌的，從生而長可，但將不該影菌響分金離黃出色來葡；萄球菌的生

在培養(yǎng)耳中加入青寄素時可抑制細菌、放

」線菌的生長，從而分離得到酹母菌和霉菌。

培養(yǎng)基中缺乏覦源時，可分離自生固氮微生物,

A廠非自生固赳微生物因缺乏氮源而無法生存；

方、改變培養(yǎng)基

者晨黑培養(yǎng)基中若缺乏有機碳源則異養(yǎng)微生物無法

/月養(yǎng)成分「生存，而自養(yǎng)微生物可利用空氣中的co?制造

有機物生存。

利用培養(yǎng)基的當石油是唯一碳源時，可抑制不能利用石

油的微生物的生長，使能夠利用石油的微

“特定化學成分”生物生存，從而分離已能消除石油污染的

?分離微生物。

在高鹽環(huán)境中可分離耐鹽菌，其他菌在鹽濃

余.專程￡,L度高時易失水而不能生存；

陽分離微生物在高溫環(huán)境中可分向得到耐高溫的微生物，

1-其他微生物在高溫環(huán)境中因醉失活而無法

生存C

Ite【考點剖析】

考點一：培養(yǎng)基的配制

1.下列關(guān)于微生物培養(yǎng)基的敘述，錯誤的是（)

A.制備固體培養(yǎng)基，一般需在液體培養(yǎng)基中加入壕脂

B.微生物在固體培養(yǎng)基表面生長形成的菌落，可以用肉眼觀察到

C.根據(jù)微生物對碳源需要的差別，使川不同碳源的培養(yǎng)基

D.培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度越高，對微生物的增殖越有利

【答案】D

【解析】制備固體培養(yǎng)基，一般需在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑——瓊脂，A正確：菌落是由微

生物在固體培養(yǎng)基表面生長形成的肉眼可見的具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的細胞群體，R正確：大多數(shù)微生物培養(yǎng)基

都含有水、碳源、氮源和無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基可以沒有碳源，固氮微生物的培養(yǎng)基

可以沒有氮源，C正確；培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度過高，微生物會通過滲透作用失水，對微生物的增殖不利,

D錯誤。

考點二：無菌技術(shù)

2.關(guān)于滅菌和消毒的理解，正確的是（）

A.滅菌是指殺滅物體內(nèi)外的一切微生物，但不包括芽泡和抱子

B.消毒和滅菌實質(zhì)上是相同的

C.常用的滅菌法有灼燒滅菌、干熱滅菌、酒精滅菌

D.常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線消毒法、化學藥物法

【答案】D

【解析】滅菌是指使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有微生物，包括芽胞和胞子：消毒是指用較為

溫和的物理、化學等方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物，它們的本質(zhì)不同，A、B項錯誤。常用的滅菌

方法有灼燒滅菌、干熱滅菌和濕熱滅菌，C項錯誤。常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線消

毒法或化學藥物消毒法等，D項正確。

考點三、微生物的純培養(yǎng)

勺3.有關(guān)平板劃線操作的說法，正確的是（）

A.使用已滅菌的接種環(huán)、培養(yǎng)皿，操作過程中不再滅菌

B.打開含菌種的試管需通過火焰滅菌，取出菌種后需馬上塞上棉塞

C.要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)的劃線相連

D.最后將平板倒置，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

【答案】D

【解析】接種環(huán)在使用過程中需要多次滅菌，第一次滅菌是為了殺死接種環(huán)上原有的微生物，每次劃線結(jié)

束后需要滅菌是為了殺死上次殘留的菌種，A錯誤。打開含菌種的試管需要通過火焰滅菌，取出菌種后還

需要通過火焰滅菌再塞上棉塞，B錯誤。劃線時最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)的劃線不能相連，因為最后一區(qū)是

細菌最稀少的,而第一區(qū)是細菌最致密的,如果連在一起則有可能影響單個菌落的分離效果,C錯誤.最后

將平板倒置，防止皿蓋上的水滴落引起污染，D正確。

考點四、微生物的選擇培養(yǎng)

|例4.隨著手機和網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展，外賣由于其便捷性，廣受普通大眾青睞。為檢測外賣食品的質(zhì)量

狀況，食品監(jiān)管人員利用稀釋涂布平板法對外賣食品中的微生物進行了調(diào)查。在稀釋涂布平板法對微生物

進行計數(shù)時的錯誤操作是（）

A.將1n】L樣品稀釋10倍，需加入10n】L無菌水

B.吸取菌液的移液管需要干熱滅菌避免雜菌污染

C.將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃

D.每一個稀釋度涂布多個平板，計算各組平均值

【答案】A

【解析】將ImL樣品稀釋10倍，需加入9mL無菌水，A錯誤：吸取菌液的移液管需要干熱滅菌避免雜菌

污染，B正確：涂布器滅菌時，將沾有少量酒精的涂布器在酒棒燈火焰上引燃，待酒精燃盡、冷卻后再用，

CE確；每一個稀釋度涂布多個平板，計算各組平均值，D正確。

考點五、微生物的計數(shù)

［、一］例5.用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為lxl（）6的培養(yǎng)基中,

得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是（）

A.涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230

B.涂布了兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260,取平均值238

C.涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212和256,取平均值163

D.涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、240和250,取平均值233

【答案】D

【解析】在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少3個平板作為重兔組，才能增強實驗結(jié)果的說服力與準確性，A、

B錯誤。C項雖涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另兩個相差太遠，說明在操作過程中可

能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值，C錯誤，D正確。

考點六、微生物的接種方法

例6.分解尿素的微生物廣泛存在于農(nóng)田等土壤中，某生物實驗小組嘗試對分解尿素

的微生物進行分離與計數(shù)。請回答下列問題：

（1）分解尿素的微生物含有的酶是________，為篩選出能分解尿素的微生物，配制培養(yǎng)基

時應(yīng)以作為唯一氮源，因此該培養(yǎng)基屬于培養(yǎng)基。

（2）常用來統(tǒng)計樣品中活前數(shù)目的方法是_________0

（3）該小組對分解尿素的微生物進行計數(shù)時，在接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先

培養(yǎng)一段時間，這樣做的目的是________________________,然后將1mL樣液稀釋10000倍,

在3個平板上用涂布法分別涂布0.1mL稀釋液；經(jīng)適當培養(yǎng)后，統(tǒng)計活菌數(shù)目，每隔一個“時

間間隔”統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，最后選取作為結(jié)果；3個平板的菌落數(shù)分別為39、

42和45。據(jù)此可得出每亳升樣液中分解尿素的微生物活菌數(shù)為個。

【答案】（1）麻酶尿素選擇（2）稀釋涂布平板法（3）檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格菌落

數(shù)目穩(wěn)定時的記錄4.2x106

【解析】（1）分解尿素的微生物含有麻酶；培養(yǎng)基的成分一般包括水、無機鹽、碳源、氮源等,

利用培養(yǎng)基對分解尿素的微生物進行篩選，應(yīng)該用選擇培養(yǎng)基，配制培養(yǎng)基時應(yīng)以尿素作為唯

一氮源等。（2）常用的微生物接種方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法，其中稀釋涂布平板法

可以用于活菌的計數(shù)。（3）為了檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格，應(yīng)該在接種前隨機取若干滅菌

后的空白平板先培養(yǎng)一段時間。在用稀釋涂布平板法計數(shù)時，應(yīng)該選擇菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄

作為結(jié)果；3個平板的菌落數(shù)的平均值為（39+42+45）/3=42（個），則每毫升樣液中分解尿素的

微生物活菌數(shù)為42:0.1x10000=4.2x106（個）。

e【真題演練】

1.（2023?遼寧高考，15）為避免航天器在執(zhí)行載人航天任務(wù)時出現(xiàn)微生物污染風險，需要對航天器及潔凈的

組裝車間進行環(huán)境微生物檢測。下列敘述錯誤的是（）

A.航天器上存在適應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)匱乏等環(huán)境的極端微生物

B.細菌形成菌膜粘附于航天器設(shè)備表面產(chǎn)生生物腐蝕

C.在組裝車間地面和設(shè)備表面采集環(huán)境微生物樣品

D.采用平板劃線法等分離培養(yǎng)微生物，觀察菌落特征

【答案】D

【解析】嗜極微生物適應(yīng)極端環(huán)境的特性使它們有在空間暴露環(huán)境或地外星球環(huán)境中存活的可能，因此航

天器上存在適應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)匱乏等環(huán)境的極端微生物，A正確：細菌形成菌膜粘附于航天器設(shè)備表面產(chǎn)生生

物腐蝕，會腐蝕艙內(nèi)材料以及設(shè)備線路、元器件，B正確；對航天器及潔凈的組裝車間進行環(huán)境微生物檢測,

需要在組裝車間地面和設(shè)備表面采集環(huán)境微生物樣品，C正確；航天器及潔凈的組裝車間環(huán)境微生物很少,

分離培養(yǎng)微生物，觀察菌落特征，不需要采用平板劃線法，D錯誤。

2.（2023?江蘇高考，3）下列是某同學分離高產(chǎn)胭酶菌的實驗設(shè)計，不合理的是（）

A.選擇農(nóng)田或公園土壤作為樣品分離忖的菌株

B.在選擇培養(yǎng)基中需添加尿素作為唯一氮源

C.適當稀釋樣品是為了在平板上形成單菌落

D.可分解酚紅指示劑使其褪色的菌株是產(chǎn)胭睡菌

【答案】D

【解析】農(nóng)田或公園土壤中含有較多的含服酶的微生物，A正確；為了篩選可分解尿素的細菌，配置的培

養(yǎng)基應(yīng)選擇尿素作為唯一氮源，含麻酶的微生物在該培養(yǎng)基上能生長，B正確；當樣品的稀釋度足夠高時,

培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，C正確；在細菌分解尿素的化學反應(yīng)中，細

菌合成的眼酸將尿素分解成氨，氨會使培養(yǎng)基的pH升高，酚紅指示劑將變紅，因此在以尿素為唯一氮源的

培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，能對分離的菌種做進一步鑒定，D錯誤。

3.（2023?海南高考，12）為探究校內(nèi)植物園土壤中的細菌種類，某興趣小組采集園內(nèi)十.壤樣本并開展相關(guān)實驗。

下列有關(guān)敘述箱用的是（）

A.采樣時應(yīng)隨機采集植物園中多個不同地點的土壤樣本

B.培養(yǎng)細菌時，可選用牛肉膏蛋白腺固體培養(yǎng)基

C.土壤溶液稀釋倍數(shù)越低，越容易得到單菌落

D.鑒定細菌種類時，除形態(tài)學鑒定外，還可借助生物化學的方法

【答案】C

【解析】采集植物園中土壤樣本的原則之一是要隨機采樣，A正確；牛肉營蛋白陳固體培養(yǎng)基中含有細菌

生長所需的碳源、氮源、水、無機鹽等，可用于細菌的培養(yǎng)，B正確；土壤溶液稀釋倍數(shù)足夠高時，才能

將聚集的細菌分散開，有助于在培養(yǎng)基表面形成單菌落，C錯誤：不同種類細菌的理化特性-?般不同，鑒定

細菌種類時，除根據(jù)菌落特征進行形態(tài)學鑒定外，還可以借助生物化學的方法進行鑒定，D正確。

4.（2023?湖北高考,5）滅菌、消毒、無菌操作是生物學實驗中常見的操作。下列敘述正確的是（）

A.動、植物細胞DNA的提取必須在無菌條件下進行

B.微生物、動物細胞培養(yǎng)基中需添加一定量的抗生素以防止污染

C.為防止蛋白質(zhì)變性，不能用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基進行滅菌

D.可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養(yǎng)瓶等進行滅菌

【答案】D

【解析】動、植物細胞DNA的提取不需要在無菌條件下進行，A錯誤：動物細胞培養(yǎng)基中需添加一定量的

抗生素?以防止污染，保證無菌環(huán)境，而微生物的培養(yǎng)不能加入抗生素，B錯誤：一般用濕熱滅菌法對牛肉膏

蛋白陳培養(yǎng)基進行滅菌，以防止雜菌污染，C錯誤；可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培

養(yǎng)瓶等進行滅菌，以防止雜菌污染，D正確。

5.[2023?全國甲卷，37）某同學從被石油污染的土壤中分禽得到A和B兩株可以降解石油的細菌，在此基

礎(chǔ)上采用平板培養(yǎng)法比較二者降解石油的能力，并分析兩個菌株的其他生理功能。

實驗所用的培養(yǎng)基成分如下。

培養(yǎng)基I:K2HPO4,MgSO4,NH4NO3,石油。

培養(yǎng)基H：K2HPO4,MgSO4,石油。

操作步驟：

①將A、B菌株分別接種在兩瓶液體培養(yǎng)基【中培養(yǎng)，得到A、B菌液；

②液體培養(yǎng)基1、II口中添加瓊脂，分別制成平板I、H,并按圖中所示在平板上打甲、乙兩孔。

回答下列問題。

透明圈大小

菌株

平板I平板n

A+++++

3++-

（1）實驗所用培養(yǎng)基中作為碳源的成分是。培養(yǎng)基中NKNO3的作用是為菌株的生長提供氮

源，氮源在菌體內(nèi)可以參與合成（答出2種即可）等生物大分子。

（2）步驟①中，在資源和空間不受限制的階段，若最初接種N。個A細菌，繁殖n代后細菌的數(shù)量是

（3）為了比較A、B降解石油的能力，某同學利用步驟②所得到的平板I、II進行實驗，結(jié)果如表所示（“+”

表示有透明圈，越多表示透明羽越大，表示無透明圈），推測該同學的實驗思路是_________.

（4）現(xiàn)有一貧氮且被石油污染的土壤，根據(jù)上表所示實驗結(jié)果，治理石油污染應(yīng)選用的菌株是

,理由是___________O

【答案】⑴①.石油②.DNA、RNA、蛋白質(zhì)

（2）No-2n（3）在無菌條件下，將等量等濃度的A菌液和B菌液分別接種到平板I的甲和乙兩孔處，

平板II也進行同樣的操作，在相同且適宜條件下培養(yǎng)一段時間，比較兩個平板的兩孔處的透明圈大小并作

記錄，根據(jù)透明圈大降解能力強，透明圈小降解能力弱，進而比較A、B降解石油的能力

（4）①.A②.A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在沒有添加氮源的培養(yǎng)基中也能生長

【解析】（1）培養(yǎng)基的成分有碳源、氮源、無機鹽和水，從組成培養(yǎng)基的物質(zhì)所含化學元素可知，作為碳

源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白質(zhì)都含有N元素，故氮源在菌體內(nèi)可以參與合成這此物質(zhì)。

（2）由題意“資源和空間不受限制”可知，細菌的增殖呈J型曲線增長，由于DNA的半保留復制，細菌每

繁殖一代就是上一代的2倍，根據(jù)公式N尸No?不，2=2,繁殖n代后細菌的數(shù)量是No"九

（3）分析表格數(shù)據(jù)可知，實驗的結(jié)果是；在平板I上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板H上，

A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根據(jù)實驗的單一變量和對照原則，推測該同學的思路是：在

無菌條件下，將等量等濃度的A菌液和B菌液分別接種到平板I的甲和乙兩孔處，平板0也進行同樣的操

作，在相同且適宜條件下培養(yǎng)一段時間，比較兩個平板的兩孔處的透明圈大小并作記錄。

（4）由表格數(shù)據(jù)可知，在平板H（無氮源的培養(yǎng)基）上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所

以要治理貧氮且被石油污染的土壤，應(yīng)該選用A菌株，因為A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且不需

要在培養(yǎng)基中添加氮源也能生長。

6.12023?全國乙卷,37）化合物S被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化工工業(yè)、用菌株C可生產(chǎn)S,S的產(chǎn)量與菌

株C培養(yǎng)所利用的碳源關(guān)系密切。為此，某小組通過實驗比較不同碳源對菌體生長和S產(chǎn)量的影響，結(jié)果

見表。

生長和S產(chǎn)量的影響，結(jié)果見表。

碳源細胞干重（g/L）S產(chǎn)量（g/L）

葡萄糖3.120.15

淀粉0.010.00

制糖廢液2.300.18

回答下列問題。

（1）通常在實驗室培養(yǎng)微生物時，需要對所需玻璃器皿進行滅菌，滅菌的方法有（答出2點即可）。

（2）由實驗結(jié)果可知，菌株C生長的最適碳源是_____；用菌株C生產(chǎn)S的最適碳源是______。菌株C

的生長除需要碳源外，還需要（答出2點即可）等營養(yǎng)物質(zhì)。

（3）由實驗結(jié)果可知，碳源為淀粉時菌株C不能生長，其原因是o

（4）若以制糖廢液作為碳源，為進一步確定生產(chǎn)S的最適碳源濃度，某同學進行了相關(guān)實驗。請簡要寫出

實驗思路：。

（5）利用制糖廢液生產(chǎn)S可以實驗廢物利用，其意義是______（答出1點即可）。

【答案】（I）高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌

（2）①.葡萄糖②.制糖廢液③.氮源、無機鹽、生長因子

（3）缺少淀粉酶（4）分別配制一系列不同濃度梯度的以制糖廢液為唯?碳源的培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌株C,

其他條件相同且適宜，一段時間后，測定并比較不同濃度制糖廢液中的S的產(chǎn)量，S產(chǎn)量最高時對應(yīng)的制糖

廢液濃度

（5）減少污染、節(jié)省原料、降低生產(chǎn)成本

【解析】（1）通常在實驗室培養(yǎng)微生物時，為防止實驗用的玻赭器皿等物品中原有的微生物污染培養(yǎng)物，

需要使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外一切微生物的細胞、芽狗和泡子，即對所需的玻璃器皿進行滅菌，

玻理器皿常用的滅菌的方法有干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等。

（2）由實驗結(jié)果可知，與以制糖廢液為碳源相比，以葡萄糖為碳源時菌株C的細胞干重最大，說明最適于

菌株C生長的碳源是前蜀糖；而以制糖廢液為碳源時，用菌株C生產(chǎn)S的產(chǎn)量高于以葡萄糖為碳源時的產(chǎn)

量，說明最適于生產(chǎn)S的碳源是制糖廢液。微生物的生長一般都需要水、碳源、氮源和無機鹽，還需要滿

足微生物生長對pH、氧氣以及特殊營養(yǎng)物質(zhì)的要求，故菌株C的生長除需要碳源外，還需要氮源、無機鹽、

生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)。

（3）分析題圖表格可以看出在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中，菌株C不能生長，原因可能是菌株C中缺少分解

淀粉的酶，不能利用淀粉。

（4）要測定生產(chǎn)S的最適制糖廢液為碳源的濃度，實驗自變后為制糖廢液的濃度，可分別配制一系列不同

濃度梯度的以制糖廢液為唯一碳源的培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌株C,其他條件相同且適宜，一段時間后，測定并比較

不同濃度制糖廢液中的S的產(chǎn)量，S產(chǎn)量最高時對應(yīng)的制糖廢液濃度，即為生產(chǎn)S的最適碳源濃度。

（5）利用制糖廢液生產(chǎn)S可以實驗廢物利用，既有利于減少污染、節(jié)省原料，又能降低生產(chǎn)成本。

7.（2023?廣東高考,21）研究深海獨特的生態(tài)環(huán)境對于開發(fā)海洋資源具有重要意義。近期在“科學號”考察船對南

中國海科考中，中國科學家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉積物樣品，分離、鑒定得到新的微生物菌

株并進一步研究了其生物學特性。

c

.

mI

or

)-

?

?

思

回答下列問題：

（1）研究者先制備富集培養(yǎng)基，然后采用法滅菌，冷卻后再接入沉積物樣品，28℃厭氧

培養(yǎng)一段時間后，獲得了含擬桿菌的混合培養(yǎng)物，為了獲得純種培養(yǎng)，除了稀釋涂布平板法，還可采用

法。據(jù)圖分析，擬桿菌新菌株在以為碳源時生長狀況最好。

（2）研究發(fā)現(xiàn)，將采集的樣品置于各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，仍有很多微生物不能被分離篩選出來，推測其原因

可能是_________________。（答一點即可）

（3）藻類細胞解體后難度解多糖物質(zhì)，通常會聚集形成碎屑沉降到深海底部。從生態(tài)系繪組成成分的角

度考慮，擬桿菌對深海生態(tài)系統(tǒng)健循環(huán)的作用可能是________________o

（4）深海冷泉環(huán)境特殊，推測此環(huán)境下生存的擬桿菌所分泌物各種多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，

其特性可能還有o

【答案】（1）①.高壓蒸汽滅菌②.平板劃線③.纖維素

（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物質(zhì)才能生存（或需要在深海冷泉的特定環(huán)境中才能存活）

（3）擬桿菌作為分解者，將沉降到深海底部的難降解多糖物質(zhì)分解為無機物，歸還到無機環(huán)境中，有利于

碳循環(huán)的順利進行（4）耐低溫

【解析】（1）培養(yǎng)基通常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌?？梢圆捎孟♂屚坎计桨宸ɑ蚱桨鍎澗€法，將單個

微生物分散在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)得到單菌落，從而獲得純凈培養(yǎng)物。分析圖12可知，在以纖維索為

碳源的培養(yǎng)基中，細胞數(shù)量最多，可推知擬桿菌新菌株在以纖維素為碳源時生長狀況最好。

（2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物質(zhì)才能生存（或需要在深海冷泉的特定環(huán)

境中才能存活），故將采集的樣品置于各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，仍瓦能有很多微生物不能被分離篩選出來。

（3）擬桿菌為異養(yǎng)生物，作為該生態(tài)系統(tǒng)的分解者，能將沉降到深海底部的難降解多糖物質(zhì)分解為無機物,

歸還到無機環(huán)境中，有利于碳循環(huán)的順利進行。

（4）深海冷泉溫度較低，故生活在其中的擬桿菌所分泌的各種多糖降解的，應(yīng)具有耐低溫的特性，才能高

效降解多糖，保證擬桿菌的正常生命活動所需。

8.（2023?浙江6月選考,29）回答下列（一）、（二）小題：

（-）回答與產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌育種有關(guān)的問題：

（1）為快速分離產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌，可將土樣用制成懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80℃

的中保溫一段時間，其目的是o

（2）為提高篩選效率，可將菌種的過程與菌種的產(chǎn)酶性能測定一起進行：將上述懸液稀釋后

涂布于淀粉為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，采用__________顯色方法，根據(jù)透明圈與菌落直徑比值的大

小，可粗略估計出菌株是否產(chǎn)酶及產(chǎn)酶性能。

（3）為了獲得高產(chǎn)淀粉酶的拈草桿菌，可利用現(xiàn)有菌種，通過__________后再篩選獲得，或利用轉(zhuǎn)基因、

等技術(shù)獲得。

【答案】（I）①.無菌水②.水浴③.殺死不耐熱微生物

（2）①.分離KI-I2

（3）①.人工誘變②.原生質(zhì)體融合

【解析】（1）產(chǎn)生淀粉酶的枯草桿菌的最適溫度為50-75℃,要快速分離枯草桿菌，先將土樣加入無菌水

制成枯草桿菌懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80℃的水浴中保溫一段時間，殺死不耐熱的微生物。

（2）將菌種的分離過程與菌種的產(chǎn)能性能測定同時進行可以提高篩選效率用稀稀涂布平板法可以分離枯

草桿菌，在培養(yǎng)基中添加淀粉作為唯一碳源，并且在培養(yǎng)基中添加KI-L,能合成淀粉酶的枯草桿菌因為能

利用淀粉而存活，同時淀粉由于被分解在菌落周圍會出現(xiàn)透明圈，比較透明圈與菌落直徑比值的大小，比

值大的說明該菌株產(chǎn)酶性能較高。

（3）要獲得高產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌，可利用誘變育利由于變異的不定向性，人工誘變后還需要再篩選力

能獲得高產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌。也可以利用轉(zhuǎn)基因、原生質(zhì)體融合等技術(shù)，從其他生物那里獲得與高產(chǎn)淀

粉酶有關(guān)的基因，進而獲得相應(yīng)的高產(chǎn)性狀。

9.（2023?湖南高考,21）黃酒源于中國，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大發(fā)酵酒。發(fā)酵酒的釀造過程中除了產(chǎn)生乙

醇外，也產(chǎn)生不利于人體健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素與乙醇反應(yīng)形成，各國對酒中的EC

含量有嚴格的限量標準。問答下列問