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1山羊痘病毒和綿羊痘病毒通用型熒光PCR檢測方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范NY/T3186羊冷凍精液生產(chǎn)技術規(guī)程4縮略語實時熒光PCR：實時熒光聚合酶鏈式反應（Real-timepolymerasechaiCt值：每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)DNA：脫氧核糖核苷酸（DeoxyribonucleicacGPTV：山羊痘病毒（goatpoxviPBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebufferedsaline)25.1.375%乙醇，無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃預冷。5.1.48mMNaOH溶液，配制見附羊痘病毒的細胞懸液或者含有山羊痘和綿羊痘病5.1.12山羊痘和綿羊痘病毒陰性對照樣品：采用綿羊羔睪6.3高速臺式冷凍離心機：可控溫至4℃、離37.2.3鼻拭子采集：用棉拭子取受檢山羊或綿羊鼻腔分泌物，置于2mLPBS上述采集的樣本可立即用于檢測，樣本在2℃~8℃下保存應不超過24h，-20℃±5℃可山羊痘和綿羊痘病毒熒光PCR檢測的實驗8.2.1DNA抽提使用DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化試劑盒提取，在核酸提取區(qū)操作。48.2.2取n個滅菌的1.5mL離心管，其中n為min。反復洗滌兩次后，將離心管倒扣于吸8.2.6用30μL8mMNaOH之和，每個反應的體系見附錄C，為了避免移液器取樣損失，建議按n+1個反應進行配制。配制反應液于96孔板上，按順序加樣并做好標識，轉(zhuǎn)移至在核酸提取區(qū)進行。在每個PCR反應管內(nèi)加入5μLDNA模板，并分別加入本文件中710μLDNA溶液，蓋上蓋子，500r/min~1000r/min離心30s。轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。在檢測區(qū)進行。將8.3.3中離心后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，設置9結(jié)果判定9.2質(zhì)量控制9.2.1陰性對照：無Ct值或無典型的特異性擴9.2.39.2.1和9.2.2要求須在同一次試驗中同時滿足，否則，本次試驗無效，59.3結(jié)果判定9.3.3可疑核酸陽性，否則判定為山羊痘和綿羊痘病毒核6溶液配置將8.0gNaCl、0.2gKCl，1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4依次加入到800mL蒸于室溫。75’-CAGGAGGTGTTGAAAATTTTACAG-3’5’-CCGCATCGGCATACGATTTCC-3’5’-6-FAMACAAAGAGCATTACATAAT-3’-MGB’

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