實(shí)驗(yàn)二、動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取和含量測(cè)定

2014.9.27

主要內(nèi)容概述實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)原理試劑與器材操作流程概述蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，是生物體最重要的組成部分。因此，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究，是生命科學(xué)的核心問(wèn)題。要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，往往從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)開(kāi)始，而對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定則是蛋白質(zhì)相關(guān)研究中的必備技術(shù)。蛋白質(zhì)的定性、定量分析是臨床診斷疾病的最重要技術(shù)手段：比如體檢血清白蛋白，甲胎蛋白水平。生物制品、食品質(zhì)量檢測(cè)的手段，比如牛奶中總蛋白含量。因此，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定性定量分析，是一項(xiàng)非常重要的工作。蛋白質(zhì)定性分析

(qualitativeanalysis)

確定樣品中是否有蛋白質(zhì)存在，以及存在的是何種蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)定量分析

(quantitativeanalysis)

確定樣品中總蛋白含量，或者某種單一蛋白成分的含量實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握從動(dòng)物樣品中提取細(xì)胞總蛋白的基本方法掌握三種常用的蛋白質(zhì)定量分析方法，并了解各自的優(yōu)缺點(diǎn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容小鼠肝臟細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取三種蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)原理

（一）小鼠肝臟細(xì)胞蛋白的提取1.材料的選擇：動(dòng)物肝臟細(xì)胞比較脆弱，易于破碎，故本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝臟細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。2.提取方法的選擇：采用勻漿法將其破碎，然后加入樣品提取液使蛋白質(zhì)溶解，用高速離心法棄去細(xì)胞碎片。收集上清液后可進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。3.如何提取高質(zhì)量的蛋白蛋白質(zhì)提取中最常見(jiàn)的問(wèn)題是目的蛋白質(zhì)發(fā)生變性和被蛋白酶降解?；镜姆婪洞胧罕M可能縮短提取時(shí)間和在盡可能低溫下提取。為了防止蛋白酶的破壞，可在提取液中加入蛋白酶抑制劑。例如:加入苯甲磺酰氟（PMSF）可以抑制絲氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制劑，可抑制酸性蛋白酶；乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制金屬蛋白酶。防止蛋白變性：

為了防止蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生氧化，可加入一定量的還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇?？紤]到溶液中如存在重金屬離子（如鋁、銅、鐵離子）可能會(huì)與蛋白質(zhì)形成不溶復(fù)合物，可在溶液中加入一定濃度的EDTA。（二）蛋白含量的測(cè)定方法蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法有很多種物理性質(zhì)：紫外分光光度法化學(xué)性質(zhì)：目前蛋白質(zhì)的含量測(cè)定常用的方法有定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）其中Bradford法和Lowry法靈敏度較高，比紫外吸收法靈敏高10～20倍，比Biuret法靈敏100倍。測(cè)定方法的選擇：上述這些方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這幾種方法測(cè)定，有可能得出幾種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。1.Lowry法

首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量所需時(shí)間40min優(yōu)點(diǎn)一種可靠的蛋白質(zhì)定量方法不同蛋白質(zhì)之間差別很小缺點(diǎn)某些試劑不穩(wěn)定靈敏度5ug/ml～100ug/ml干擾物質(zhì)多：K+,Na+等離子，蔗糖，甘油，EDTA等都影響測(cè)定反應(yīng)速度慢使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性2.考馬斯亮蘭法考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物在595nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)快速（反應(yīng)時(shí)間僅需3min）敏感，幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)損失缺點(diǎn)用這種測(cè)定方法對(duì)蛋白質(zhì)引起不可逆的變性靈敏度

1ug/ml～10ug/ml

由于不同蛋白的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，所以該方法測(cè)定不同的蛋白質(zhì)會(huì)有偏差一些化合物干擾反應(yīng)，比如TritonX-100,SDS,0.1N的NaOH3.紫外分光光度法蛋白質(zhì)中普遍含有酪氨酸與色氨酸，由于這兩種芳香族氨基酸分子中含有大π鍵，它們?cè)?80nm紫外光附近有光吸收。因而使蛋白質(zhì)在上述紫外波長(zhǎng)附近產(chǎn)生較強(qiáng)的光吸收，利用蛋白質(zhì)的這一特性可對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。芳香族氨基酸的紫外吸收優(yōu)點(diǎn)快速缺點(diǎn)核酸可引起強(qiáng)干擾作用靈敏度

相對(duì)較低對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)破壞性（蛋白純化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)）不是嚴(yán)格的定量，適用于測(cè)定蛋白質(zhì)粗提液測(cè)定所需時(shí)間幾分鐘操作步驟1．用頸椎脫臼法處死小鼠，切開(kāi)腹腔，取下完整肝臟，小心去掉膽囊（不要弄破），放入盛冷生理鹽水的燒杯中漂洗干凈。2．取小鼠肝組織0.5g，在濾紙上剪碎，放入玻璃勻漿管中。3．按1：15的比例往玻璃勻漿管中加入勻漿緩沖液（即每份樣品需加預(yù)冷的提取緩沖液7.3mL，蛋白酶抑制劑0.2mL），手動(dòng)勻漿。注意用力均勻，以免損壞勻漿管。4．勻漿完成后，取兩只1.5mL

eppendorf管，各加入1.2mL勻漿液后，置入冷凍離心機(jī)中。5．于4℃，13000rpm離心20分鐘后，小心取出上清液至1.5mL

eppendorf管中，上清液需低溫保存，作為待測(cè)樣品備用。Lowry法取16mm*150mm試管16支，標(biāo)明號(hào)碼，放置在試管架，在1～6號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.5mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入待測(cè)樣品25、50μL，并用雙蒸水補(bǔ)足至0.5mL（即將待測(cè)樣品稀釋20或10倍）。9～16號(hào)重復(fù)1～8號(hào)。各管加入2.5mL新配制的堿性銅溶液，立即搖勻，在室溫下放置10min。各管加入0.5mL

Folin酚試劑應(yīng)用液，邊加入邊立即充分混合（用震蕩混合器），然后在室溫下放置30～60min（不要超過(guò)60min）。將標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測(cè)樣品在可見(jiàn)光光度計(jì)上在550nm波長(zhǎng)下比色。根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量?？捡R斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度取16mm*150mm試管16支，標(biāo)明號(hào)碼，放置在試管架，在1～6號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取貯液用雙蒸水稀釋至0.5mg/mL）0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.1mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入稀釋20、10倍的待測(cè)樣品0.1mL。9～16號(hào)重復(fù)1～8號(hào)。每管加入考馬斯亮蘭G250染料試劑3mL,搖勻，室溫靜置3分鐘。分光光度計(jì)于波長(zhǎng)595nm比色。根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量。紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度取16mm*150mm試管16支，標(biāo)明號(hào)碼，放置在試管架，在1～6號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（2mg/mL）0、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積3mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入稀釋100、50倍的待測(cè)樣品3mL。9～16號(hào)重復(fù)1～8號(hào)。以1號(hào)管為參比，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)280nm處比色。根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算小鼠肝提取液的蛋白質(zhì)含量。1.加入RNase除RNA是在加入蛋白酶消化液之后進(jìn)行的，那么RNase不會(huì)被剩余的蛋白酶消化液破壞嗎？2.加入蛋白酶消化液不是已經(jīng)破壞了蛋白質(zhì)了嗎，那么為什么加入苯酚-氯仿之后還會(huì)有這么多可以看得到的一層蛋白質(zhì)？3.異戊醇是用來(lái)減少產(chǎn)生的氣泡的，為什么會(huì)有氣泡產(chǎn)生呢？4.加入蛋白酶消化液之后，為什么要在50度保溫，是因?yàn)檫@種蛋白酶的最適溫度是50度嗎？5.加入酚-氯仿